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Biology

टेलोस्ट मॉडल जापानी मेडाका (ओरीज़ियास लैटिप्स) में शुक्राणु संग्रह और कंप्यूटर-सहायक शुक्राणु विश्लेषण

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/64326
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Preclinical Sciences and Pathology, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences, 2Department of Production Animal Clinical Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences

Summary

यह लेख छोटे मॉडल मछली मेडाका (ओरिज़ियास लैटिप्स) से शुक्राणु एकत्र करने के लिए दो त्वरित और कुशल तरीकों का वर्णन करता है, साथ ही कंप्यूटर-सहायता प्राप्त शुक्राणु विश्लेषण (सीएएसए) का उपयोग करके शुक्राणु की गुणवत्ता का विश्वसनीय रूप से आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल भी है।

Abstract

जापानी मेडाका (ओरिज़ियास लैटिप्स) एक टेलोस्ट मछली है और इकोटॉक्सिकोलॉजी, विकास, आनुवंशिकी और शरीर विज्ञान अनुसंधान के लिए एक उभरता हुआ कशेरुक मॉडल है। मेडाका का उपयोग कशेरुक प्रजनन की जांच के लिए भी बड़े पैमाने पर किया जाता है, जो एक आवश्यक जैविक कार्य है क्योंकि यह एक प्रजाति को बनाए रखने की अनुमति देता है। शुक्राणु की गुणवत्ता पुरुष प्रजनन क्षमता का एक महत्वपूर्ण संकेतक है और इस प्रकार, प्रजनन की सफलता। शुक्राणु और शुक्राणु विश्लेषण निकालने की तकनीक कई प्रजातियों के लिए अच्छी तरह से प्रलेखित हैं, जिसमें टेलोस्ट मछली भी शामिल है। शुक्राणु एकत्र करना बड़ी मछली में अपेक्षाकृत सरल है, लेकिन छोटी मॉडल मछली में अधिक जटिल हो सकता है क्योंकि वे कम शुक्राणु का उत्पादन करते हैं और अधिक नाजुक होते हैं। इसलिए, यह लेख छोटे मॉडल मछली, जापानी मेडाका में शुक्राणु संग्रह के दो तरीकों का वर्णन करता है: वृषण विच्छेदन और पेट की मालिश। यह पेपर दर्शाता है कि मेडका के लिए दोनों दृष्टिकोण संभव हैं और दिखाता है कि पेट की मालिश को बार-बार किया जा सकता है क्योंकि मछली प्रक्रिया से जल्दी से ठीक हो जाती है। यह लेख मेडाका में कंप्यूटर-सहायता प्राप्त शुक्राणु विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल का भी वर्णन करता है ताकि मेडाका शुक्राणु की गुणवत्ता (गतिशीलता, प्रगति, गतिशीलता की अवधि, सापेक्ष एकाग्रता) के कई महत्वपूर्ण संकेतकों का निष्पक्ष रूप से आकलन किया जा सके। इस उपयोगी छोटे टेलोस्ट मॉडल के लिए निर्दिष्ट ये प्रक्रियाएं, कशेरुक पुरुषों में प्रजनन क्षमता को प्रभावित करने वाले पर्यावरणीय, शारीरिक और आनुवंशिक कारकों की समझ को बहुत बढ़ाएंगी।

Introduction

जापानी मेडाका एक छोटी, अंडे देने वाली मीठे पानी की टेलोस्ट मछली है जो पूर्वी एशिया की मूल निवासी है। मेडाका इकोटॉक्सिकोलॉजी, विकासात्मक आनुवंशिकी, जीनोमिक्स, और विकासवादी जीव विज्ञान और शरीर विज्ञान अध्ययन 1,2 के लिए एक उत्कृष्ट कशेरुक मॉडल प्रणाली बन गया है। लोकप्रिय ज़ेबराफ़िश के समान, वे प्रजनन करने में अपेक्षाकृत आसान हैं और कई सामान्य मछली रोगों के लिए अत्यधिक प्रतिरोधी हैं 1,2. एक मॉडल के रूप में मेडाका का उपयोग करने के कई फायदे हैं, जिसमें एक छोटी पीढ़ी का समय, पारदर्शी भ्रूण 1,2 और एक अनुक्रमित जीनोम3 शामिल हैं। ज़ेबराफिश के विपरीत, मेडाका में एक लिंग-निर्धारण जीन4 के साथ-साथ एक उच्च तापमान (4-40 डिग्री सेल्सियस से) और लवणता (यूरीहैलाइन प्रजाति) सहिष्णुता5 है। इसके अलावा, कई आनुवंशिक और शारीरिक उपकरण, साथ ही प्रोटोकॉल 6,7,8,9,10,11,12, इसके जीव विज्ञान के अध्ययन की सुविधा के लिए मेडाका में विकसित किए गए हैं।

प्रजनन एक आवश्यक शारीरिक कार्य है क्योंकि यह एक प्रजाति को बनाए रखने की अनुमति देता है। कशेरुक प्रजनन के लिए सटीक रूप से योजनाबद्ध घटनाओं के असंख्य की आवश्यकता होती है, जिसमें महिलाओं में अंडाणुओं का उत्पादन और पुरुषों में शुक्राणु का उत्पादन शामिल है। शुक्राणु अद्वितीय कोशिकाएं हैं, जो शुक्राणुजनन की जटिल प्रक्रिया के माध्यम से निर्मित होती हैं, जिसमें उच्च गुणवत्ता वाले उत्पाद13 के वितरण की गारंटी देने के लिए कई चेकपॉइंट होते हैं। निषेचन की सफलता और लार्वा अस्तित्व पर इसके प्रभाव के कारण गैमेट गुणवत्ता जलीय कृषि और मछली की आबादी के अध्ययन में एक फोकस बन गई है। इसलिए, शुक्राणु की गुणवत्ता कशेरुक में पुरुष प्रजनन क्षमता का एक महत्वपूर्ण संकेतक है।

मछली शुक्राणु की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए तीन उपयोगी कारक गतिशीलता, प्रगति और दीर्घायु हैं। प्रतिशत गतिशीलता और प्रगतिशील गतिशीलता शुक्राणु की गुणवत्ता के सामान्य संकेतक हैं क्योंकि प्रगतिशील गति के लिए आवश्यक है और निषेचन सफलता14,15 के साथ दृढ़ता से संबंधित है। मछली में आंदोलन की अवधि भी एक महत्वपूर्ण संकेतक है क्योंकि अधिकांश टेलोस्ट प्रजातियों में शुक्राणु 2 मिनट से कम समय तक पूरी तरह से गतिशील रहते हैं और शुक्राणु का प्रक्षेपवक्र आमतौर पर स्तनधारियों15 की तुलना में कम रैखिक होता है। हालांकि, अतीत में शुक्राणु गतिशीलता का आकलन करने वाले कई अध्ययन शुक्राणु15,16 का विश्लेषण करने के व्यक्तिपरक या अर्ध-मात्रात्मक तरीकों पर निर्भर थे। उदाहरण के लिए, मेडाका में शुक्राणु गतिशीलता का अनुमान अतीत में माइक्रोस्कोप17 के तहत नेत्रहीन रूप से लगाया गया है। यह शुक्राणु आंदोलन को रिकॉर्ड करके और फ्रेम को विलय करने और तैराकी पथ और वेग 18,19,20 को मापने के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके भी अनुमान लगाया गया है। इस तरह के दृष्टिकोणों में अक्सर मजबूती की कमी होती है, विश्लेषण करने वाले व्यक्ति के अनुसार अलग-अलग परिणाम प्रदान करते हैं15,21।

कंप्यूटर-सहायता प्राप्त शुक्राणु विश्लेषण (CASA) शुरू में स्तनधारियों के लिए विकसित किया गया था। CASA स्वचालित तरीके से वेग और प्रक्षेपवक्र को रिकॉर्ड और मापकर शुक्राणु की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए एक तेज मात्रात्मक विधिहै। मछलियों में, इसका उपयोग विभिन्न प्रजातियों में शुक्राणु की गुणवत्ता पर कई जल प्रदूषकों के प्रभावों की निगरानी के लिए किया गया है, ब्रूडस्टॉक में सुधार के लिए दिलचस्प पूर्वजों की पहचान करने के लिए, क्रायोप्रिजर्वेशन और भंडारण की दक्षता में सुधार करने के लिए, और निषेचन के लिए स्थितियों को अनुकूलित करने केलिए। इसलिए, यह विभिन्न कशेरुक प्रजातियों में शुक्राणु की गुणवत्ता का विश्वसनीय रूप से आकलन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। हालांकि, मछलियों के बीच प्रजनन रणनीतियों में महत्वपूर्ण विविधता के कारण, टेलोस्ट मछली के शुक्राणु स्तनधारियों से और एक मछली प्रजातियों से दूसरे में भिन्न होते हैं। टेलोस्ट मछली, जो मुख्य रूप से पानी में युग्मकों को छोड़कर बाहरी रूप से अंडे को निषेचित करती है, में अत्यधिक केंद्रित शुक्राणु होते हैं जो स्तनधारियों के विपरीत, बिना किसी एक्रोसोम के संरचना में अपेक्षाकृत सरल होते हैं, जो आंतरिक रूप से निषेचित होते हैं और इसलिए पानी में कमजोर पड़ने की भरपाई नहीं करनी पड़ती है, लेकिन अधिक चिपचिपे तरलपदार्थों का सामना करना पड़ता है। इसके अतिरिक्त, अधिकांश मछलियों से शुक्राणु तेजी से चलते हैं लेकिन सक्रियण के बाद 2 मिनट से भी कम समय के लिए पूरी तरह से गतिशील होते हैं, हालांकि कई अपवाद15,22 हैं। क्योंकि अधिकांश मछलियों में गतिशीलता तेजी से कम हो सकती है, मछली के लिए शुक्राणु विश्लेषण प्रोटोकॉल निर्धारित करते समय सक्रियण के बाद विश्लेषण के समय के साथ अत्यधिक देखभाल की जानी चाहिए।

प्रजनन जीव विज्ञान में उन क्षेत्रों में से एक है जिसमें टेलोस्ट और मेडाका को बड़े पैमाने पर मॉडल जीवों के रूप में उपयोग किया गया है। दरअसल, मेडाका पुरुष दिलचस्प प्रजनन और सामाजिक व्यवहार दिखाते हैं, जैसे कि साथी की रखवाली23,24। इसके अलावा, इस प्रजाति25,26,27 में प्रजनन के न्यूरोएंडोक्राइन नियंत्रण का अध्ययन करने के लिए कई ट्रांसजेनिक लाइनें मौजूद हैं। शुक्राणु नमूनाकरण, एक प्रक्रिया जो बड़ी मछली में अपेक्षाकृत सरल है, छोटी मॉडल मछली में अधिक जटिल हो सकती है क्योंकि वे कम शुक्राणु का उत्पादन करते हैं और अधिक नाजुक होते हैं। इस कारण से, अधिकांश अध्ययनों में 17,28,29,30 विच्छेदित वृषणको कुचलकर मेडाका अर्क मिल्ट (मछली वीर्य) में शुक्राणु के नमूने शामिल हैं। कुछ अध्ययनों में मध्यम18,19,20 को सक्रिय करने में सीधे मिल्ट को व्यक्त करने के लिए एक संशोधित पेट की मालिश का भी उपयोग किया जाता है; हालांकि, इस विधि के साथ निकाले गए मिल्ट की मात्रा और रंग की कल्पना करना मुश्किल है। ज़ेबराफ़िश में, पेट की मालिश का उपयोग आमतौर पर मिल्ट को व्यक्त करने के लिए किया जाता है, जिसे तुरंत एक केशिका ट्यूब 31,32,33 में एकत्र किया जाता है। यह विधि मिल्ट की मात्रा का अनुमान लगाने में सक्षम बनाती है, साथ ही स्खलन रंग का अवलोकन, जो शुक्राणु की गुणवत्ता32,33 का एक त्वरित और सरल संकेतक है। इसलिए, मेडाका के लिए शुक्राणु संग्रह और विश्लेषण के लिए एक स्पष्ट और अच्छी तरह से वर्णित प्रोटोकॉल की कमी है।

इसलिए यह लेख छोटे मॉडल मछली जापानी मेडाका में शुक्राणु संग्रह के दो तरीकों का वर्णन करता है: वृषण विच्छेदन और केशिका ट्यूबों के साथ पेट की मालिश। यह दर्शाता है कि मेडाका के लिए दोनों दृष्टिकोण संभव हैं और दिखाता है कि पेट की मालिश बार-बार की जा सकती है क्योंकि मछली प्रक्रिया से जल्दी से ठीक हो जाती है। यह मेडाका में कंप्यूटर-सहायता प्राप्त शुक्राणु विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल का भी वर्णन करता है ताकि मेडाका शुक्राणु की गुणवत्ता (गतिशीलता, प्रगति, दीर्घायु और सापेक्ष शुक्राणु एकाग्रता) के कई महत्वपूर्ण संकेतकों को मज़बूती से मापा जा सके। इस उपयोगी छोटे टेलोस्ट मॉडल के लिए निर्दिष्ट ये प्रक्रियाएं, कशेरुक पुरुषों में प्रजनन क्षमता को प्रभावित करने वाले पर्यावरणीय, शारीरिक और आनुवंशिक कारकों की समझ को बहुत बढ़ाएंगी।

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Protocol

नॉर्वेजियन यूनिवर्सिटी ऑफ लाइफ साइंसेज (एनएमबीयू) में प्रयोगात्मक पशु कल्याण पर सिफारिशों के अनुसार सभी प्रयोग और पशु हैंडलिंग आयोजित किए गए थे। प्रयोगों को एनएमबीयू (एएस, नॉर्वे) में उठाए गए वयस्क (6-9 महीने के) पुरुष जापानी मेडाका (एचडी-आरआर स्ट्रेन) का उपयोग करके किया गया था। इन विधियों का संक्षिप्त परीक्षण नेशनल रिसर्च इंस्टीट्यूट फॉर एग्रीकल्चर, फूड एंड एनवायरनमेंट (आईएनआरएई, रेनेस, फ्रांस) में उठाए गए 9 महीने के पुरुष जापानी मेडाका (सीएबी स्ट्रेन) में भी किया गया था।

1. उपकरण और समाधान तैयार करना

  1. एनेस्थेटिक स्टॉक समाधान (0.6% ट्राइकेन) तैयार करें।
    1. 10x फॉस्फेट बफर सेलाइन (PBS) के 100 एमएल में ट्राइकेन (MS-222) के 0.6 ग्राम को पतला करें।
    2. एनेस्थेटिक स्टॉक समाधान के 2 एमएल को 50 2 एमएल प्लास्टिक ट्यूबों में डालें और एनेस्थीसिया या इच्छामृत्यु के लिए उपयोग किए जाने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. रिकवरी पानी तैयार करें (0.9% सोडियम क्लोराइड [NaCl] समाधान)।
    1. मछलीघर के 3 लीटर पानी में 27 ग्राम NaCl जोड़ें।
    2. उपयोग होने तक समाधान को कमरे के तापमान (आरटी) पर स्टोर करें।
  3. यदि आवश्यक हो तो सक्रियण माध्यम समायोजित करें (हांक का संतुलित नमक समाधान [एचबीएसएस])।
    नोट: एचबीएसएस व्यावसायिक रूप से खरीदा जा सकता है या प्रयोगशाला (सामग्री की तालिका) में बनाया जा सकता है।
    1. पीएच मीटर का उपयोग करके एचबीएसएस के पीएच को मापें। हाइड्रोक्लोरिक एसिड या सोडियम हाइड्रॉक्साइड का उपयोग करके यदि आवश्यक हो तो पीएच समायोजित करें, इसलिए अंतिम पीएच 7.1-7.3 है।
    2. भविष्य की रिपोर्टिंग के लिए ऑस्मोमीटर का उपयोग करके एचबीएसएस की ऑस्मोलैलिटी को मापें।
      नोट: वाणिज्यिक उत्पाद पर सीमा 266-294 mOsmol / kg है; वर्तमान अध्ययन में, ऑस्मोलैलिटी 287 mOsmol / kg थी। यदि वांछित हो तो ऑस्मोलैलिटी को कम करने के लिए इसे आसुत जल के साथ पतला किया जा सकता है, लेकिन यह आवश्यक नहीं है क्योंकि 150-300 mOsmol / kg HBSS में मेडाका शुक्राणु की सक्रियता में बड़ा अंतर नहीं है।
    3. उपयोग होने तक समाधान को आरटी पर स्टोर करें।
  4. होल्डिंग स्पंज तैयार करें।
    1. पेट्री डिश में स्निग्ली फिट करने के लिए एक नरम स्पंज काटें।
    2. स्पंज के बीच में एक सीधी रेखा काटें जो मछली (3-4 सेमी) और लगभग 1 सेमी गहरी (चित्रा 1 ए) प्राप्त करने के लिए पर्याप्त लंबी है। स्पंज में यह स्लिट क्लोआका को उजागर करने के लिए मछली के उदर पक्ष को पकड़ लेगा।

2. शुक्राणु संग्रह

नोट: शुक्राणु संग्रह दो अलग-अलग तरीकों से प्राप्त किया जा सकता है: पेट की मालिश या वृषण विच्छेदन।

  1. पेट की मालिश द्वारा शुक्राणु संग्रह
    1. 100 एमएल ग्लास कंटेनर में 38 एमएल मछलीघर के पानी में ट्राइकेन स्टॉक (0.6%) की एक ट्यूब को पतला करके 0.03% एनेस्थेटिक समाधान तैयार करें।
    2. उपकरणों को तैयार करें, जिसमें कुंद अंत चिकनी बल और 10 μL डिस्पोजेबल कैलिब्रेटेड ग्लास माइक्रोपिपेट और एस्पिरेटर ट्यूब असेंबली (चित्रा 1 ए) शामिल हैं। एनेस्थेटिक घोल के साथ चरण 1.4 में तैयार किए गए होल्डिंग स्पंज को कम करें।
    3. तत्काल विश्लेषण के लिए सक्रिय समाधान के 36 μL के साथ ट्यूब तैयार करें। कम से कम 5 मिनट के लिए 27 डिग्री सेल्सियस पर सेट पानी के स्नान या इनक्यूबेटर में सक्रिय घोल को पहले से गर्म करें।
      नोट: हालांकि नमूनों का विश्लेषण व्यक्तिगत मछली से किया जा सकता है, एक ही सक्रिय समाधान में कई पुरुषों के नमूने एकत्र करके व्यक्तिगत भिन्नता को कम किया जा सकता है। कई मछलियों से नमूने एकत्र करते समय, प्रति मछली सक्रिय समाधान के 36 μL का उपयोग करें। इस कमजोर पड़ने को मेडाका के तनाव या पालन की स्थिति के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है क्योंकि ये कारक शुक्राणु एकाग्रता और मात्रा को प्रभावित कर सकते हैं। CASA कार्यक्रम इंगित करेगा कि शुक्राणु की पहचान करने के लिए एकाग्रता बहुत अधिक है या नहीं।
    4. मछली को 30-90 सेकंड के लिए एनेस्थेटिक घोल में डालकर एनेस्थेटाइज करें।
      नोट: संज्ञाहरण अवधि को अनुकूलित किया जाना चाहिए क्योंकि यह मछली के आकार के अनुसार भिन्न होता है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि मछली पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड है, धीरे से पुच्छल पेडुनकल को बल के साथ चुटकी लें। यदि मछली प्रतिक्रिया नहीं करती है, तो मालिश शुरू की जा सकती है।
    5. मछली को एनेस्थेटिक घोल से बाहर निकालें और मछली के पेट को सुखाने के लिए एक पेपर तौलिया या धीरे से पोंछने का उपयोग करें। मछली को स्पंज वेंट्रल साइड को नम रखने वाले गर्त में रखें ताकि इसके गलफड़े स्पंज में एनेस्थेटिक घोल के संपर्क में आ जाएं (चित्रा 1 बी)।
    6. यदि क्लोआका के आसपास का क्षेत्र गीला है, तो धीरे से डिस्पोजेबल ऊतक पोंछे के साथ मछली के नीचे के हिस्से को सुखाएं।
    7. मछली को एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत होल्डिंग स्पंज में रखें और माइक्रोपिपेट को मछली के क्लोका के खिलाफ जुड़े एक एस्पिरेटर ट्यूब के साथ रखें (चित्रा 1 सी)।
    8. मछली के पेट की मालिश धीरे-धीरे एक रोस्ट्रल से पुच्छल गति में कुंद सिरे के चिकनी बल के साथ निचोड़कर करें, जबकि साथ ही साथ निष्कासित मिल्ट को पिपेट में इकट्ठा करने के लिए चूसें (चित्र 1 डी)।
    9. स्पंज से मछली को रिकवरी पानी में छोड़ दें। उन्हें मछलीघर प्रणाली में लौटने से पहले कम से कम 15 मिनट के लिए समाधान में ठीक होने दें।
    10. मिल्ट को पहले से गर्म सक्रिय घोल के साथ एक तैयार ट्यूब में स्थानांतरित करें और एस्पिरेटर ट्यूब असेंबली पर चूसकर और उड़ाकर कई बार ऊपर और नीचे करें।
    11. विश्लेषण से पहले ट्यूबों को फ्लिक करके पतला शुक्राणु को धीरे से समरूप करें।
      नोट: सर्वोत्तम परिणामों के लिए, सक्रियण के तुरंत बाद नमूने का विश्लेषण करें (उदाहरण के लिए, 5 एस)। मेडाका में, यदि आवश्यक हो, तो विश्लेषण में देरी हो सकती है, क्योंकि शुक्राणु कई घंटों तक गतिशील रहते हैं, लेकिन समय नमूनों के बीच सुसंगत रहना चाहिए क्योंकि समय के साथ गतिशीलता कम हो जाती है।
  2. वृषण विच्छेदन द्वारा शुक्राणु संग्रह
    1. 100 एमएल ग्लास कंटेनर में 26 एमएल मछलीघर के पानी में ट्राइकेन स्टॉक (0.6%) के दो ट्यूबों को पतला करके 0.08% इच्छामृत्यु समाधान तैयार करें।
    2. विच्छेदन उपकरण तैयार करें, जिसमें कुंद और ठीक बल और छोटे विच्छेदन कैंची शामिल हैं (चित्रा 1 ई)।
    3. तत्काल विश्लेषण के लिए 120 μL सक्रिय समाधान के साथ प्रत्येक नमूने के लिए एक ट्यूब तैयार करें। कम से कम 5 मिनट के लिए 27 डिग्री सेल्सियस पर सेट पानी के स्नान या इनक्यूबेटर में सक्रिय घोल को पहले से गर्म करें।
      नोट: हालांकि नमूनों का विश्लेषण व्यक्तिगत मछली से किया जा सकता है, एक ही सक्रिय समाधान में कई पुरुषों के नमूने एकत्र करके व्यक्तिगत भिन्नता को कम किया जा सकता है। कई मछलियों से नमूने एकत्र करने के लिए, प्रति मछली सक्रिय समाधान के 120 μL का उपयोग करें। इस कमजोर पड़ने को मेडाका के तनाव या पालन की स्थिति के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है क्योंकि ये कारक शुक्राणु एकाग्रता और मात्रा को प्रभावित कर सकते हैं। CASA कार्यक्रम इंगित करेगा कि शुक्राणु की पहचान करने के लिए एकाग्रता बहुत अधिक है या नहीं।
    4. मछली को 30-90 सेकंड के लिए 0.08% एनेस्थेटिक घोल में डालकर इच्छामृत्यु करें।
      नोट: अवधि मछली के आकार पर निर्भर करती है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि मछली को इच्छामृत्यु दी गई है, ऑपरकुलम आंदोलनों के बंद होने की प्रतीक्षा करें। मछली को बल के स्पर्श पर प्रतिक्रिया नहीं करनी चाहिए।
    5. इच्छामृत्यु के घोल से मछली निकालें और धीरे से मछली को पेपर टॉवल से सुखाएं या धीरे से पोंछ लें।
      नोट: इस चरण में, मछली को बाद में गोनाडोसोमैटिक इंडेक्स (जीएसआई, गोनाडल वजन / शरीर के वजन) की गणना करने के लिए तौला जा सकता है।
    6. मछली को एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे रखें, जिसके बाएं पार्श्व पक्ष का सामना ऊपर की ओर हो (चित्र 1 एफ)।
    7. छोटी विच्छेदन कैंची का उपयोग करके, क्लोआका से पृष्ठीय रूप से एक फ्लैप काटें, और फिर आंतरिक अंगों को उजागर करने के लिए पसलियों के पार गिल्स तक (चित्रा 1 जी)।
    8. वृषण का पता लगाएं, बारीक बल के साथ दोनों सिरों पर अनुलग्नक काटें, और वृषण को हटा दें (चित्रा 1 एच)।
      नोट: जीएसआई की गणना करने के लिए, इस चरण में वृषण को तौला जा सकता है। ऊतक के सूखने से बचने के लिए जल्दी से काम करें।
    9. पहले से गर्म सक्रिय समाधान के साथ वृषण को एक तैयार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    10. शुक्राणु को छोड़ने के लिए ट्यूब के किनारे के खिलाफ कई बार वृषण को कुचलने के लिए बल का उपयोग करें। शुक्राणु रिलीज को आमतौर पर देखा जा सकता है और समाधान को थोड़ा धुंधला बना देगा।
    11. विश्लेषण से पहले ट्यूबों को फ्लिक करके पतला शुक्राणु को धीरे से समरूप करें।
      नोट: सर्वोत्तम परिणामों के लिए, सक्रियण के तुरंत बाद नमूने का विश्लेषण करें (उदाहरण के लिए, 5 एस)। मेडाका में, यदि आवश्यक हो, तो विश्लेषण में देरी हो सकती है, क्योंकि शुक्राणु कई घंटों तक गतिशील रहते हैं, लेकिन समय नमूनों के बीच सुसंगत रहना चाहिए क्योंकि समय के साथ गतिशीलता कम हो जाती है।

Figure 1
(ए) पेट की मालिश के लिए उपकरण: स्पंज, कुंद चिकनी बल, और 10 μL डिस्पोजेबल कैलिब्रेटेड ग्लास माइक्रोपिपेट को एस्पिरेटर ट्यूब असेंबली के साथ पकड़ना; (बी) होल्डिंग स्पंज में मछली की स्थिति, स्पंज में संज्ञाहरण के संपर्क में आने वाले गलफड़े और क्लोआका का सामना करना; (सी) पेट पर कुंद चिकनी बल की स्थिति और क्लोआका के खिलाफ माइक्रोपिपेट; (डी) सौम्य मालिश और चूसने के बाद माइक्रोपिपेट में मिल्ट। (ई) वृषण विच्छेदन के लिए उपकरण: कुंद बल, बारीक बल, और छोटे विच्छेदन कैंची; (च) वृषण विच्छेदन के लिए मछली की स्थिति; (छ) आंतरिक अंगों का पार्श्व दृश्य; (एच) बारीक बल के साथ दोनों सिरों पर संलग्नक को काटकर वृषण को हटा दें। स्केल पट्टी: 2 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

3. CASA प्रणाली के साथ शुक्राणु विश्लेषण

  1. CASA प्रणाली (SCA Evolution) को एक हरे फिल्टर का उपयोग करके माइक्रोस्कोप के साथ मैनुअल के अनुसार स्थापित किया जाना चाहिए और चरण कंट्रास्ट के साथ 10x उद्देश्य होना चाहिए।
  2. वार्मिंग प्लेट पर या कम से कम 5 मिनट के लिए 27 डिग्री सेल्सियस पर सेट इनक्यूबेटर में प्रीहीटिंग करके डिस्पोजेबल 20 μm काउंटिंग चैंबर स्लाइड तैयार करें।
  3. शुक्राणु विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें और गतिशीलता मॉड्यूल का चयन करें।
  4. चित्रा 2 बी में दिखाए गए अनुसार मेडका के लिए कॉन्फ़िगरेशन सेट करें।
  5. माइक्रोस्कोप के नीचे 27 डिग्री सेल्सियस पर सेट किए गए गर्म मंच पर एक पूर्वनिर्मित डिस्पोजेबल 20 μm गिनती कक्ष स्लाइड रखें।
  6. नमूने को स्लाइड पर कक्ष में तब तक रखें जब तक कि यह ओवरफिलिंग के बिना कक्ष को न भर दे। फ्लोटिंग कोशिकाओं को रोकने के लिए एक कपास की नोक के साथ कक्ष के प्रवेश द्वार से अतिरिक्त नमूनों को सावधानीपूर्वक पोंछें या धीरे से पोंछें।
  7. माइक्रोस्कोप के तहत नमूना देखने के लिए विश्लेषण का चयन करें।
    नोट: यदि माइक्रोस्कोप आइकन लाल है, तो शुक्राणु को सटीक रूप से ट्रैक करने के लिए कार्यक्रम के लिए माइक्रोस्कोप प्रकाश व्यवस्था को समायोजित करने की आवश्यकता है। माइक्रोस्कोप की चमक को समायोजित करें, ताकि शुक्राणु की पूंछ की गति स्पष्ट रूप से दिखाई दे। आइकन नीला होना चाहिए।
  8. सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोप केंद्रित है और क्षेत्र में शुक्राणु रिकॉर्ड करने के लिए फिर से विश्लेषण करें का चयन करें। स्लाइड को स्थानांतरित करें ताकि नमूने का एक नया क्षेत्र फ्रेम में हो और 3-5 विभिन्न क्षेत्रों के दृश्य को कैप्चर करने के लिए दोहराएं। हवा के बुलबुले, सेल द्रव्यमान या कलाकृतियों वाले क्षेत्रों से बचें।
  9. परिणाम देखने के लिए परिणामों का चयन करें.
    नोट: यदि परिणाम पृष्ठ पर फ़ील्ड लाल रंग में उल्लिखित हैं, तो उन फ़ील्ड को हटाने के लिए सिस्टम के संकेतों का पालन करें जो एकाग्रता या गतिशीलता में बहुत अधिक भिन्न होते हैं।
  10. व्यक्तिगत क्षेत्र के लिए परिणाम देखने के लिए या मैन्युअल रूप से किसी भी गलत लेबल या अनट्रैक किए गए शुक्राणुओं की जांच करने के लिए किसी फ़ील्ड पर डबल-क्लिक करें। यदि आवश्यक हो, तो गतिशीलता को फिर से लेबल करने के लिए व्यक्तिगत शुक्राणुओं पर राइट-क्लिक करें (चित्रा 2 ए)।

Figure 2
चित्रा 2: एससीए इवोल्यूशन सॉफ्टवेयर स्क्रीनशॉट. (ए) एक क्षेत्र के लिए शुक्राणु ट्रैकिंग परिणाम. दाईं ओर फ़ील्ड डेटा देखें और व्यक्तिगत डेटा देखने के लिए शुक्राणुओं पर डबल-क्लिक करें; (बी) कॉन्फ़िगरेशन मेनू खुले के साथ सभी फ़ील्ड के लिए परिणाम सारांश। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Representative Results

प्राप्त डेटा का प्रकार
एससीए इवोल्यूशन सॉफ्टवेयर से शुक्राणु गतिशीलता विश्लेषण गतिशीलता (मोटिव और इम्मोटिल शुक्राणु का प्रतिशत), साथ ही प्रगति (प्रगतिशील और गैर-प्रगतिशील शुक्राणु का प्रतिशत), और वेग (तेजी से, मध्यम और धीमी गति से चलने वाले शुक्राणु का प्रतिशत) पर डेटा प्रदान करता है। यह प्रगति और वेग (तेजी से प्रगतिशील, मध्यम प्रगतिशील, गैर-प्रगतिशील) को भी जोड़ती है। ये लेबल शुक्राणु आंदोलन के माप (चित्रा 3 ए) और गणना (चित्रयूरे 3 बी) पर आधारित हैं, जो कार्यक्रम (पूरक तालिका 1) द्वारा प्रदान किया गया है। मेडाका के लिए, पिछले साहित्य19,34,35 और 18 व्यक्तियों से मेडाका डेटा के वितरण के आधार पर अनुशंसित ज़ेब्राफिश मापदंडों से निम्नलिखित थ्रेसहोल्ड को अनुकूलित किया गया था। गतिशीलता सुडौल वेग (वीसीएल) पर आधारित है जिसमें 10 `m/s < धीमी < 20 μm/s ≤ मध्यम ≤ 40 μm/s < तेजी से ≤ है। शुक्राणु को प्रगतिशील माना जाता है यदि स्ट्रेटनेस इंडेक्स (एसटीआर) 68% > है।

एससीए इवोल्यूशन शुक्राणु की एकाग्रता की गणना भी करता है यदि नमूने की मात्रा और कमजोर पड़ने की आवश्यकता होती है। जबकि पेट की मालिश विधि रंग की कल्पना करने और मिल्ट की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए सहायक है, एकत्र की गई मात्रा सटीक रूप से मापने के लिए बहुत छोटी है। यदि पालन की स्थिति या एक अलग तनाव का उपयोग करके मिल्ट की मात्रा में सुधार किया जाता है और इसे मापा जा सकता है, तो कार्यक्रम का उपयोग एकाग्रता की गणना करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, वृषण विच्छेदन द्वारा लिए गए नमूनों के लिए मछली या उपचार समूहों की तुलना करने के लिए सापेक्ष एकाग्रता की गणना भी की जा सकती है, जब तक कि पूरे वृषण को तरल की समान मात्रा में विच्छेदित और पतला किया जाता है।

Figure 3
(A) CASA प्रणाली द्वारा दर्ज आंकड़ों में सुडौल वेग (VCL, वास्तविक पथ के साथ दूरी का उपयोग करके गणना की गई वेग), औसत पथ वेग (VAP, औसत पथ की दूरी का उपयोग करके गणना की गई वेग), सीधी रेखा वेग (VSL, शुक्राणु ट्रैक की शुरुआत और अंत के बीच की दूरी का उपयोग करके गणना की गई वेग) शामिल हैं। पार्श्व सिर विस्थापन का आयाम (एएलएच, शुक्राणु सिर के पार्श्व विस्थापन का परिमाण उसके औसत पथ के बारे में), बीट क्रॉस फ्रीक्वेंसी (बीसीएफ, दर जिस पर सुडौल पथ औसत पथ को पार करता है); (बी) सीएएसए प्रणाली से गणना किए गए मूल्यों में स्ट्रेटनेस इंडेक्स (एसटीआर, औसत पथ की रैखिकता), रैखिकता सूचकांक (एलआईएन, सुडौल पथ की रैखिकता), और लड़खड़ाहट (डब्ल्यूओबी, औसत पथ के बारे में वास्तविक पथ का दोलन) शामिल हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

शुक्राणु गतिशीलता मूल्यांकन: विभिन्न सक्रिय समाधान
हैरानी की बात है, पेट की मालिश और वृषण विच्छेदन दोनों द्वारा नमूना किए गए शुक्राणु मछलीघर के पानी (16 mOsmol / kg) (चित्रा 4A) में और मछलीघर के पानी में NaCl समाधान के साथ 34 mOsmol / kg तक समायोजित थे। विआयनीकृत पानी (-1 mOsmol/kg) में भी कोई गतिशीलता नहीं थी, या विआयनीकृत पानी को 23 mOsmol/kg में समायोजित किया गया था। शुक्राणु HBSS (287 mOsmol/kg) (चित्र 4B) में गतिशील थे, साथ ही एचबीएसएस में विआयनीकृत पानी से पतला 36 mOsmol/kg और 113 mOsmol/kg तक पतला था, हालांकि प्रतिशत गतिशीलता 36 mOsmol/kg (चित्रा 4C) पर काफी कम हो गई थी।

Figure 4
चित्रा 4: सक्रिय समाधान की ऑस्मोलैलिटी द्वारा गतिशीलता। (ए) मछलीघर के पानी (16 mOsmol / kg) और (B) असमायोजित HBSS (287 mOsmol / kg) में वृषण विच्छेदन द्वारा शुक्राणु का नमूना लिया गया। पीले सर्कल लेबल इम्मोटाइल शुक्राणु और रंगीन रेखाएं शुक्राणु आंदोलन को इंगित करती हैं: लाल (तेजी से प्रगतिशील), हरा (मध्यम प्रगतिशील), नीला (गैर-प्रगतिशील)। स्केल बार: 100 μm. (C) शुक्राणु गतिशीलता 36, 113, और 287 mOsmol / kg H 2 O परHBSSके साथ सक्रिय है। 36 और 113 के लिए, एन = 4 प्रति नमूने दो मछलियों के साथ। 287 के लिए, एन = 9 प्रति नमूने दो मछलियों के साथ। सांख्यिकीय विश्लेषण टुकी पोस्ट-हॉक परीक्षण के साथ एक एनोवा का उपयोग करके किया गया था और विभिन्न अक्षरों द्वारा महत्वपूर्ण अंतर इंगित किए जाते हैं। डेटा को SEM ± माध्य के रूप में दर्शाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

नमूनाकरण विधियां: पेट की मालिश बनाम वृषण विच्छेदन
वृषण विच्छेदन द्वारा नमूना लिया गया शुक्राणु एक ही मछली से पेट की मालिश के नमूनों की तुलना में काफी अधिक गतिशील है (चित्रा 5 ए)। मोटिव शुक्राणु में से, एक उच्च प्रतिशत भी प्रगतिशील और मध्यम या तेजी से चलने वाले होते हैं। पेट की मालिश द्वारा नमूना किए गए शुक्राणु में, अधिक मोटिव शुक्राणु धीमी गति से चलने वाले और गैर-प्रगतिशील होते हैं (चित्रा 5 बी-सी)। हालांकि, मेडाका (सीएबी) या वैकल्पिक पालन स्थितियों (पूरक तालिका 2) के एक अलग तनाव का उपयोग करके विभिन्न परिणाम प्राप्त किए जा सकते हैं।

Figure 5
चित्रा 5: पेट की मालिश बनाम वृषण विच्छेदन। पेट की मालिश या वृषण विच्छेदन द्वारा नमूना लिए गए (ए) इम्मोटिल और मोटिव शुक्राणु का प्रतिशत। मोटिव शुक्राणु का प्रतिशत जो (बी) गैर-प्रगतिशील और प्रगतिशील शुक्राणु हैं, और (सी) धीमी, मध्यम और तेजी से चलते हैं। सभी शुक्राणु नमूने एचबीएसएस (287 mOsmol / kgH2O) में सक्रिय थे। सांख्यिकीय विश्लेषण एक मैन-व्हिटनी यू परीक्षण का उपयोग करके किया गया था और तारांकन द्वारा महत्वपूर्ण अंतर इंगित किए जाते हैं। डेटा को एसईएम, एन = 9 ± माध्य के रूप में दर्शाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

भंडारण की स्थिति के अनुसार गतिशीलता अवधि
वृषण विच्छेदन द्वारा नमूना लिया गया और 27 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया शुक्राणु सक्रियण के बाद पहले 30 मिनट में गतिशीलता में 50% की कमी थी। 2.5 घंटे के बाद, 5% से कम शुक्राणु मोटिव थे। जब 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है, तो पहले 30 मिनट में गतिशीलता केवल 14% कम हो गई थी, और प्रारंभिक गतिशीलता से 50% की कमी देखने में 5 घंटे लगे। बर्फ का एक समान विस्तारित प्रभाव था, लेकिन पहले 30 मिनट में 26% गतिशीलता में कमी के साथ कम प्रभावी था (चित्रा 6 ए)। बर्फ पर पहले 30 मिनट में प्रगति भी 52% गिर गई, जबकि 27 डिग्री सेल्सियस पर 65% और 4 डिग्री सेल्सियस पर 33% (चित्रा 6 बी)। बर्फ पर और 4 डिग्री सेल्सियस दोनों पर, कुछ शुक्राणु (<3%) सक्रियण के 42 घंटे बाद भी आगे बढ़ रहे थे।

Figure 6
चित्रा 6: भंडारण की स्थिति के अनुसार शुक्राणु दीर्घायु। एचबीएसएस (287 mOsmol / kg H 2 O) के साथ सक्रिय नमूनों के लिए समय के साथ प्रतिशत (ए) गतिशीलता और (बी) प्रगति और27डिग्री सेल्सियस, 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर संग्रहीत। डेटा बिंदु एसईएम, एन = ≥4 ± माध्य हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पर्यावरण और आवास की स्थिति का महत्व
मादाओं के साथ सह-रखे गए पुरुषों को सुबह में अंडकोष विच्छेदन द्वारा नमूना लिया गया था, इससे पहले कि उन्हें स्पॉन करने का अवसर मिले (रोशनी चालू होने से पहले) या रोशनी चालू होने के बाद और टैंक में महिलाओं के अंडे थे। शुक्राणु गतिशीलता में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। एक महीने के लिए महिलाओं के बिना रखे गए पुरुषों का भी नमूना लिया गया था, और जबकि उच्च गतिशीलता की प्रवृत्ति थी, अंतर भी महत्वपूर्ण नहीं था (चित्रा 7)।

हालांकि, जब सीएबी स्ट्रेन मेडाका को कम से कम एक महीने के लिए मादाओं से अलग पुरुषों के साथ एक अलग सुविधा में उठाया गया था, तो मछली बड़ी थी और पेट की मालिश द्वारा 5-7 μL milt एकत्र किया गया था। पेट की मालिश द्वारा पांच मछलियों से एकत्र किए गए नमूनों में 300 mOsmol / kg HBSS के साथ सक्रिय होने पर 68.34% की गतिशीलता थी। जब समान परिस्थितियों में लेकिन महिलाओं के साथ आयोजित किया जाता है, तो एकत्र किए गए मिल्ट की मात्रा लगभग 2 μL थी, और औसत गतिशीलता तीन पुरुषों से 46.2% थी (पूरक तालिका 2)।

Figure 7
चित्र 7. शुक्राणु गतिशीलता पर पर्यावरणीय स्थितियों का प्रभाव। (एन = 5) से पहले और बाद में (एन = 4) पुरुषों से नमूना लिए गए शुक्राणु की प्रतिशत गतिशीलता जो महिलाओं के साथ सह-रखे गए थे, और पुरुषों से शुक्राणु महिलाओं के बिना रखे गए थे (एन = 6)। सभी नमूनों को वृषण विच्छेदन द्वारा नमूना लिया गया था और एचबीएसएस (287 mOsmol / kgH2O) के साथ सक्रिय किया गया था। टी-परीक्षणों का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण किए गए थे और अंतर महत्वपूर्ण नहीं थे। डेटा को एसईएम ± औसत के रूप में दिखाया गया है जिसमें व्यक्तिगत मछली का प्रतिनिधित्व करने वाले सर्कल हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक तालिका 1: पेट की मालिश और वृषण विच्छेदन (एन = 9) द्वारा नमूना किए गए शुक्राणु के लिए औसत वेग और आंदोलन गणना। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 2: सीएबी स्ट्रेन (जिसे कार्बियो भी कहा जाता है) मेडका से शुक्राणु विश्लेषण डेटा रेनेस, फ्रांस में आईएनआरएई में पाला गया। सभी नमूने 300 mOsmol / kg HBSS में सक्रिय किए गए थे। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

ऑस्मोलैलिटी मछली शुक्राणु36,37 के सक्रियण में एक महत्वपूर्ण कारक है। आम तौर पर, शुक्राणु वृषण में इम्मोटाइल होते हैं और मीडिया में गतिशील हो जाते हैं जो समुद्री मछलियों के लिए सेमिनल तरल पदार्थ के सापेक्ष हाइपरोस्मोटिक होता है, और मीठे पानी की मछलियों के लिए सेमिनल द्रव के सापेक्ष हाइपो-आसमाटिक होताहै। रक्त के समान, मीठे पानी की मछलियों में सेमिनल प्लाज्मा आमतौर पर समुद्री मछलियों की तुलना में कम होता है (400 mOsmol / kg की तुलना में लगभग 300 mOsmol / kg) 22,37। इस प्रकार, मछली के शुक्राणु आमतौर पर उस पानी के संपर्क में सक्रिय होते हैं जिसमें वे रहते हैं, और यह पानी शुक्राणु विश्लेषण के लिए सबसे अच्छा और सबसे जैविक सक्रियण माध्यम के रूप में कार्य करता है। हालांकि, पेट की मालिश और वृषण विच्छेदन द्वारा नमूना किए गए मेडाका शुक्राणु दो अलग-अलग प्रयोगशालाओं में उठाए गए एचडी-आरआर या सीएबी स्ट्रेन मेडाका में मछलीघर के पानी (चित्रा 4 ए) में गतिशील नहीं थे। इसके अतिरिक्त, 36 mOsmol / kg HBSS (चित्रा 4C) की तुलना में 287 mOsmol / kg HBSS में गतिशीलता अधिक थी, जो मीठे पानी की मछली के लिए असामान्य है।

मेडाका में शुक्राणु विश्लेषण से जुड़े अधिकांश पिछले अध्ययनों ने एचबीएसएस 28,29,38 या यामामोटो समाधान18,19 का उपयोग ऑस्मोलैलिटी पर चर्चा किए बिना मेडाका शुक्राणु के लिए सक्रिय माध्यमों के रूप में किया। जबकि एचबीएसएस मेडाका शुक्राणु के लिए एक अच्छा सक्रिय माध्यम है, ऑस्मोलैलिटी में भिन्नता गतिशीलता को प्रभावित कर सकती है। इसलिए, शुक्राणु विश्लेषण अध्ययनों के लिए प्रयोगों के बीच तुलना के लिए उनके सक्रिय समाधान की ऑस्मोलैलिटी का खुलासा करना आवश्यक है। सक्रिय माध्यम की आदर्श ऑस्मोलैलिटी की जांच करने वाले एक अध्ययन में पाया गया कि मेडका शुक्राणु विआयनीकृत पानी (25 mOsmol / kg) में मोटिव है और HBSS 686 mOsmol / kg < ऑस्मोलैलिटी मान के साथ है, जिसमें 25 और 227 mOsmol / kg17 के बीच उच्चतम गतिशीलता है। हालांकि, वर्तमान अध्ययन में, शुक्राणु विआयनीकृत पानी में भी नहीं थे। यूरीहेलिन मछली के रूप में, मेडाका विभिन्न वातावरणों के लिए बहुत अनुकूलनीय हैं और यहां तक किखारे पानी में भी रह सकते हैं और प्रजनन कर सकते हैं, इसलिए यह संभव है कि विभिन्न पालन स्थितियां इस विसंगति के लिए जिम्मेदार हैं। दिलचस्प बात यह है कि किसी अन्य अध्ययन ने मछलीघर के पानी (या इसी तरह, जैसे वृद्ध नल के पानी) में मेडका शुक्राणु गतिशीलता का परीक्षण करने की सूचना नहीं दी है, हालांकि यह मीठे पानी की मछली के लिए मानक शुक्राणु सक्रियण माध्यम है।

मेडाका में इस एटिपिकल शुक्राणु सक्रियण के लिए एक संभावित स्पष्टीकरण डिम्बग्रंथि द्रव के साथ बातचीत है। जबकि मछली के शुक्राणु आमतौर पर आसपास के पानी में सक्रिय होते हैं, डिम्बग्रंथि द्रव कई प्रजातियों में शुक्राणु गतिशीलता की अवधि को बढ़ाता है या बढ़ाता है 40,41। यद्यपि मेडाका बाहरी रूप से मीठे पानी की मछली को निषेचित कर रहे हैं, उनका स्पॉनिंग व्यवहार, जिसमें फिन रैपिंग और तरकश शामिल हैं, उन्हें प्रसारण स्पॉनर्स23 की तुलना में बहुत करीब रखता है। चूंकि मीठे पानी की मछली (लगभग 300 mOsmol / kg) में डिम्बग्रंथि के तरल पदार्थ की ऑस्मोलैलिटीHBSS 40 के करीब है, इसलिए यह संभव है कि मादा द्वारा जारी तरल पदार्थ शुक्राणु को सक्रिय करता है, मछलीघर के पानी को नहीं। चूंकि सेमिनल और डिम्बग्रंथि प्लाज्मा की ऑस्मोलैलिटी समान है, इसलिए यह संभव है कि मेडाका डिम्बग्रंथि द्रव की आयनिक संरचना40,42 की महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। मेडाका शुक्राणु को सक्रिय करने में डिम्बग्रंथि द्रव और आयनों की भूमिका आगे की जांच की आवश्यकता है।

पिछले अध्ययनों में, मेडाका शुक्राणु केवल विच्छेदित वृषण 17,28,29,30 को कुचलकर या पेट की मालिश द्वारा एकत्र किया गया है ताकि मिल्ट को सीधे मध्यम 18,19,20 में व्यक्त किया जा सके; किसी भी अध्ययन ने एक केशिका ट्यूब में पेट की मालिश द्वारा एकत्र किए गए शुक्राणु के साथ डेटा की सूचना नहीं दी है, हालांकि यह ज़ेब्राफिश और अन्य टेलोस्ट मछली33,43,44 में एक आम अभ्यास है। यह विधि मेडाका में भी संभव है। मिल्ट को आसानी से केशिका ट्यूब में देखा जाता है, और हालांकि मात्रा सटीक रूप से मापने के लिए बहुत छोटी है, यह विधि गुणवत्ता32 के तेज संकेतक के रूप में रंग के सफल संग्रह और विश्लेषण की पुष्टि को सक्षम करती है। माध्यम की तुलना में केशिका ट्यूब में संग्रह के साथ फेकल संदूषण से बचना भी आसान है। यद्यपि वृषण विच्छेदन द्वारा एकत्र किए गए शुक्राणु के नमूनों में पेट की मालिश द्वारा एकत्र किए गए नमूनों की तुलना में मेडाका में बेहतर गतिशीलता होती है (चित्रा 5) और इस प्रकार उन प्रयोगों के लिए बेहतर होते हैं जिनमें मछली का बलिदान किया जा सकता है, पेट की मालिश एक न्यूनतम इनवेसिव प्रक्रिया है जिसे इच्छामृत्यु की आवश्यकता नहीं होती है और इसे उसी मछली में दोहराया जा सकता है। इसलिए, यह उन प्रयोगों के लिए उपयोगी है जो समय के साथ एक ही मछली का पालन करते हैं। इसके अलावा, पेट की मालिश के साथ एकत्र किए गए नमूनों में सेमिनल प्लाज्मा44 के साथ जारी केवल परिपक्व कोशिकाएं होती हैं, जबकि वृषण विच्छेदन के नमूनों में अपरिपक्व शुक्राणु कोशिकाएं और अन्य मलबे शामिल हो सकते हैं। CASA प्रणाली अधिकतम क्षेत्र से बड़े गोल कोशिकाओं और मलबे को छूट देती है, लेकिन अगर यह पैरामीटर बहुत अधिक सेट किया जाता है, तो गतिशीलता परिणाम प्रभावित हो सकते हैं।

इन मेडाका में पेट की मालिश तकनीक के साथ एकत्र किए गए शुक्राणु की कम मात्रा के कारण, केशिका में शुक्राणु की मात्रा को सटीक रूप से मापना असंभव था और इस प्रकार नियमित दृष्टिकोण का उपयोग करके शुक्राणु सांद्रता की गणना करना असंभव था। हालांकि, वृषण विच्छेदन द्वारा लिए गए नमूनों के लिए, सक्रियण की मात्रा को सुसंगत रखकर और वृषण का वजन करके, व्यक्तियों या उपचार समूहों के बीच तुलना करने के लिए सीएएसए प्रणाली द्वारा दिए गए शुक्राणु एकाग्रता के आधार पर एक सापेक्ष एकाग्रता की गणना की जा सकती है। गुणवत्ता विश्लेषण के अलावा, क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए इष्टतम नमूना कमजोर पड़ने का निर्धारण करने के लिए सापेक्ष एकाग्रता भी उपयोगी है। यदि पेट की मालिश द्वारा एकत्र की गई मात्रा को पालन की स्थिति या एक अलग तनाव का उपयोग करके बेहतर बनाया जाता है, तो केशिका ट्यूब में मिल्ट की ऊंचाई को मापकर मात्रा की गणना की जा सकती है और एकाग्रता की गणना करने के लिए कार्यक्रम में दर्ज की जा सकती है। इन मामलों में, जिनमें कई माइक्रोलीटर प्राप्त किए जा सकते हैं, वृषण विच्छेदन की तुलना में पेट की मालिश से गतिशीलता अधिक हो सकती है (पूरक तालिका 2)। जब कम मात्रा एकत्र की जाती है, तो नमूने संदूषण के लिए अधिक प्रवण होते हैं, जो गतिशीलता को प्रभावित कर सकते हैं, हालांकि वॉल्यूम समान होने पर ये प्रभाव सुसंगत प्रतीत होते हैं, इसलिए उपचार समूहों के बीच तुलना अभी भी की जा सकती है। हालांकि, उन नमूनों के बीच तुलना नहीं की जानी चाहिए जो मिल्ट की मात्रा या रंग में बहुत भिन्न होते हैं।

पेट की मालिश का उपयोग करके मेडाका से प्राप्त मिल्ट की कम मात्रा उन प्रयोगों के लिए एक सीमा हो सकती है जिनके लिए बड़ी मात्रा में मिल्ट की आवश्यकता होती है। ऐसे मामलों में, वृषण विच्छेदन बेहतर हो सकता है, जैसा कि एक अध्ययन में दिखाया गया है जिसने विच्छेदन और मालिश दोनों द्वारा ज़ेबराफिश और हरे रंग की तलवार से मिल्ट एकत्र किया था, लेकिन केवल कम मात्रा30 के कारण मेडाका में विच्छेदन द्वारा। वृषण विच्छेदन आमतौर पर एक ही कारण से अन्य प्रजातियों की तुलना के लिए बेहतर होता है। अन्य, समान आकार की मछलियों की तुलना में पेट की मालिश द्वारा सीमित मात्रा छोटे वृषण (जेब्राफिश45 में 7.0 ± 2.5 मिलीग्राम की तुलना में मेडाका में 1.9 ±0.6 मिलीग्राम) और कम शुक्राणु उत्पादन (2.0 ± 0.4 x 10 6 शुक्राणु कोशिकाओं / मिलीग्राम वृषण की तुलना में मेडका में 7.7 ± 2.0 x 106 शुक्राणु कोशिकाओं / मिलीग्राम वृषण) के कारण हो सकतीहै। या अन्य अज्ञात जैविक कारकों के लिए जो तकनीक को सीमित करते हैं, जैसा कि हैचरी-उठाए गए अफ्रीकी कैटफ़िश47 में सुझाव दिया गया है। अंतर शारीरिक हो सकता है, तनाव या पर्यावरणीय परिस्थितियों के अनुसार, या शारीरिक, क्योंकि ज़ेब्राफिश के विपरीत, मेडका वृषण जुड़े हुए हैं और अधिक उपचारात्मक रूप से स्थित हैं, और इसलिए पेट की मालिश द्वारा पहुंचना कठिन हो सकता है, हालांकि फ्यूज्ड वृषण के साथ अन्य मछलियां भी हैं।

कुछ प्रजातियों के लिए, जैसे कि ज़ेब्राफिश, मछली को सुबह48 में पैदा करने का मौका देने से पहले शुक्राणु का नमूना लेना सबसे अच्छा है या स्पॉनिंग को रोकने के लिए रात से पहले अलग-अलगटैंकों में पुरुषों को अलग करना है। इस अध्ययन से एचडी-आरआर मेडाका के साथ, पर्यावरणीय स्थितियों जैसे नमूनाकरण का समय (स्पॉनिंग से पहले या बाद में) और आवास की स्थिति (1 महीने के लिए महिलाओं के साथ या बिना) का शुक्राणु गतिशीलता पर महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पड़ा (चित्रा 7)। यह संभव है कि एक बड़ा नमूना आकार या लंबे समय तक महिलाओं से पुरुषों को अलग करने से उच्च शुक्राणु मात्रा और / या गतिशीलता हो सकती है। एक अन्य सुविधा से सीएबी स्ट्रेन मेडाका में, महिलाओं के साथ रखे गए पुरुषों की तुलना में अकेले रखे गए पुरुषों से बेहतर शुक्राणु गुणवत्ता और मात्रा के साथ एक समान प्रवृत्ति देखी गई (सांख्यिकीय निष्कर्ष निकालने के लिए बहुत कम मछलियों का परीक्षण किया गया था)। इन मछलियों के साथ पेट की मालिश (पूरक तालिका 2) द्वारा अपेक्षाकृत अधिक मात्रा में मिल्ट एकत्र करना भी संभव था, हालांकि एचडी-आरआर स्ट्रेन मेडाका का उपयोग करके बहुत कम मात्रा में मिल्ट प्राप्त किए गए थे, और अन्य ने सीएबी स्ट्रेन मेडाका30 में इसी तकनीक द्वारा छोटी मात्रा की सूचना दी है। हालांकि, क्या ये अंतर तनाव के कारण हैं (जो इनब्रेड के बजाय एक वाणिज्यिक तनाव है) या पालन-पोषण मतभेदों के कारण (सुविधाओं के बीच कई हैं), स्पष्ट नहीं है। इन मछलियों में, मिल्ट के कई माइक्रोलीटर एकत्र किए जा सकते हैं, जो संदूषण को सीमित करता है और गुणवत्ता में सुधार करता है। लेकिन, उन प्रयोगों के लिए जिनमें दोनों लिंगों को सहवास करना महत्वपूर्ण है, परिणाम देने के लिए उन्हें अलग करना आवश्यक नहीं लगता है। स्पॉनिंग से पहले एक समय में पुरुषों का नमूना लेना भी आवश्यक नहीं लगता है।

यद्यपि यह निर्धारित करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है कि मेडाका शुक्राणु जनसंख्या और पर्यावरणीय कारकों के अनुसार कैसे भिन्न होता है, फिर भी प्रयोगात्मक सेटअप को डिजाइन करते समय तनाव और पालन की स्थिति को ध्यान में रखा जाना चाहिए, और विभिन्न मात्रा में शुक्राणु का उत्पादन करने वाली आबादी के बीच तुलना करने में सावधानी बरतनी चाहिए। यदि milt की बड़ी मात्रा प्राप्त की जाती है, तो सक्रिय समाधान के कमजोर पड़ने को समायोजित किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, 1: 60, हालांकि पसंदीदा एकाग्रता CASA प्रणाली के साथ भिन्न हो सकती है)। इसी तरह, यदि विच्छेदित वृषण तनाव या पालन की स्थिति के कारण विशिष्ट (2 मिलीग्राम) से बहुत बड़ा है, तो कमजोर पड़ने को बढ़ाने की आवश्यकता होगी ताकि सीएएसए कार्यक्रम सभी शुक्राणु कोशिकाओं को सटीक रूप से लेबल कर सके।

शुक्राणु विश्लेषण के तरीके मेडाका के लिए व्यापक रूप से भिन्न होते हैं और अक्सर व्यक्तिपरक होते हैं, जिससे अध्ययनों के बीच तुलना करना मुश्किल हो जाता है। विशेषज्ञता के विभिन्न स्तरों के साथ तकनीशियनों द्वारा उपयोग किए जाने वाले व्यक्तिपरक और उद्देश्य विधियों की तुलना करने वाले एक अध्ययन में पाया गया कि अत्यधिक अनुभवी तकनीशियन सीएएसए गतिशीलता कार्यक्रम द्वारा प्रदान किए गए डेटा के 10 प्रतिशत बिंदुओं के भीतर मछली शुक्राणु गतिशीलता का अनुमान लगा सकते हैं, जबकि मध्यम और निम्न अनुभव तकनीशियन 30 प्रतिशत अंक तक आयामों के साथ सीएएसए गतिशीलता मूल्यों को अधिक महत्वदेते हैं। . हालांकि, मेडाका में गतिशीलता निर्धारित करने वाले मापदंडों के लिए मानकीकरण की कमी भी अधिक उद्देश्य विधियों का उपयोग करने वालों के बीच भिन्नता पैदा कर सकती है। उदाहरण के लिए, एक अध्ययन जिसने शुक्राणु को 33 फ्रेम प्रति सेकंड (एफपीएस) पर दर्ज किया, 30 फ्रेम का विश्लेषण किया, और माना कि शुक्राणु 2 μm / s मोटाइल से तेज गति से बढ़ रहेथे, उनके नियंत्रण मछली के लिए औसत वेग लगभग 60 μm / s और गतिशीलता लगभग 70% थी। उसी प्रोटोकॉल का उपयोग करने वाले एक अन्य अध्ययन में शुक्राणु को नियंत्रित करने के लिए 40 μm / s का औसत वेग और 80% 19 से अधिक प्रतिशत गतिशीलता थी। एक अन्य समूह, जिसने 47 एफपीएस पर 200 फ्रेम का विश्लेषण किया, में नियंत्रण मछली के लिए औसत वीसीएल 100 यूएम / एस से अधिक था, लेकिन औसत गतिशीलता 50% से नीचे थी। उन्होंने यह खुलासा नहीं किया कि कौन से पैरामीटर गतिशीलता निर्धारित करते हैं। इसलिए, इस प्रोटोकॉल में, कंप्यूटर-सहायता प्राप्त शुक्राणु विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग शुक्राणु का निष्पक्ष, जल्दी और मज़बूती से विश्लेषण करने के लिए किया जाता है, जो कि मेडाका शुक्राणु की विशेषताओं के लिए अनुकूलित किए गए मापदंडों के एक सेट पर आधारित होता है। चूंकि गतिशीलता मापदंडों के लिए प्रयोगशालाओं में तुलना के लिए सुसंगत होना महत्वपूर्ण है, इस अध्ययन में उपयोग किया जाने वाला पूर्ण विन्यास उपलब्ध है (चित्रा 2 बी), इसलिए इस प्रोटोकॉल को विभिन्न शोधकर्ताओं द्वारा एक अलग प्रयोगशाला में मज़बूती से दोहराया जा सकता है।

टेलोस्ट मछली शुक्राणु विशेषताओं की एक विस्तृत विविधता दिखाती है, इसलिए हालांकि इस प्रोटोकॉल को शुरू में एससीए इवोल्यूशन सॉफ्टवेयर के लिए अनुशंसित ज़ेबराफिश मापदंडों का उपयोग करके परीक्षण किया गया था, यह स्पष्ट था कि मापदंडों को कम-वेग, अधिक दीर्घायु मेडाका शुक्राणु के लिए समायोजित करने की आवश्यकता होगी। इसलिए, ज़ेब्राफिश मापदंडों को मेडाका और अन्य प्रजातियों के साहित्य का उपयोग करके मेडाका के लिए अनुकूलित किया गया था, जिन्होंने समान शुक्राणु विशेषताओं 19,34,35 की सूचना दी थी और उन थ्रेसहोल्ड का चयन किया था जो 18 व्यक्तियों से 17,580 विश्लेषण किए गए शुक्राणु ट्रैक के वितरण के लिए सबसे उपयुक्त थे। गतिशीलता सुडौल वेग (वीसीएल) पर आधारित है जिसमें 10 `m/s < धीमी < 20 μm/s ≤ मध्यम ≤ 40 μm/s < तेजी से ≤ है। शुक्राणु को प्रगतिशील माना जाता है यदि स्ट्रेटनेस इंडेक्स (एसटीआर) 68% > है। गतिशीलता को परिभाषित करने वाली सीमा को 2 μm / s के बजाय 10 μm / s पर रखा गया था, जैसा कि कुछ साहित्य18,19 में उपयोग किया गया था, क्योंकि फ्लैगलर आंदोलन की कमी वाले कई शुक्राणुओं को इस सेटिंग के साथ मोटाइल के रूप में गलत लेबल किया गया था। समान आकार के शुक्राणु सिर (~ 2 μm) वाली अन्य मछली प्रजातियों ने भी मोटिव शुक्राणु35,43 को परिभाषित करने के लिए 10 μm / s का उपयोग किया। अधिकतम क्षेत्र 90 μm2 से 20 μm 2 की ज़ेब्राफिश सेटिंग से कम हो गयाथा ताकि वृषण विच्छेदन से बड़े सेलुलर मलबे को अनदेखा किया जा सके।

गतिशीलता की अवधि सक्रियण से पहले संग्रहीत एटीपी की मात्रा पर निर्भर प्रतीत होती है, क्योंकि फ्लैगलर आंदोलन को ऊर्जा की तेजी से खपत की आवश्यकता होती है। संभवतः इस तेजी से थकावट के कारण, उच्च प्रारंभिक वेग शुक्राणु और गतिशीलता की कम अवधि के बीच एक सहसंबंधहै। जबकि मछली के शुक्राणु को सक्रिय करने के लिए आमतौर पर एक आसमाटिक सदमे की आवश्यकता होती है, इससे गतिशीलता अवधि के दौरान झिल्ली की क्षति भी हो सकती है, जो दीर्घायु को भी प्रभावित कर सकती है। मीठे पानी की प्रजातियों49 में यह प्रभाव अधिक महत्वपूर्ण है, जो यह समझा सकता है कि क्यों समुद्री शुक्राणु लंबी गतिशीलता अवधि (मीठे पानी की प्रजातियों के लिए लगभग 150 एस की तुलना में औसतन लगभग 550 एस) में सक्षम हैं, बावजूद इसके कि मीठे पानी के शुक्राणु14,22 के समान औसत वेग और गतिशीलता का प्रदर्शन किया जाता है। 30 मिनट से अधिक की गतिशीलता अवधि आम नहीं है, लेकिन यह कई समुद्री प्रजातियों22,49 में रिपोर्ट की गई है। मीठे पानी की मछली होने के बावजूद, मेडाका के परिणाम शुक्राणु की प्रोफ़ाइल में फिट होते हैं जिनमें समुद्री प्रजातियों से कम वेग और लंबी अवधि होती है। यह सेमिनल प्लाज्मा के समान माध्यम में सक्रियण से संबंधित हो सकता है- आसमाटिक झटके के बिना, मेडाका शुक्राणु को अन्य मीठे पानी की मछलियों के समान झिल्ली क्षति का सामना नहीं करना पड़ता है।

सक्रियण के बाद एक गैर-सक्रिय समाधान और बहुत त्वरित, लगातार समयबद्ध विश्लेषण अक्सर शुक्राणु के विश्लेषण के लिए आवश्यक होता है जो केवल मिनटों के लिए गतिशील होते हैं। हालांकि, मेडाका शुक्राणु गतिशीलता स्वाभाविक रूप से कई घंटों तक रहती है और उच्च गतिशीलता को 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर संग्रहीत करके संरक्षित किया जा सकता है (चित्रा 6)। इस प्रकार, उन प्रयोगों के लिए जिनमें तत्काल विश्लेषण संभव नहीं है, प्रोटोकॉल को संशोधित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, वृषण को एक घंटे के लिए बर्फ पर समाधान को सक्रिय करने में संग्रहीत किया जाता है, जब तक कि संग्रह समय दर्ज किया जाता है ताकि विश्लेषण सुसंगत रह सके। हालांकि, इष्टतम परिणामों के लिए, तत्काल विश्लेषण अभी भी सबसे अच्छा विकल्प है। जबकि गतिशीलता अभी भी कम हो जाती है, क्योंकि यह क्रमिक है, परिणाम सक्रियण के बाद विश्लेषण के समय में मामूली अंतर से कम प्रभावित होते हैं। फिर भी, नमूनों के भंडारण तापमान और सक्रियण के बाद विश्लेषण के समय दोनों की रिपोर्ट करना महत्वपूर्ण है ताकि डेटा की तुलना और पुन: प्रस्तुत किया जा सके।

आमतौर पर मछली में नमूना लेते समय मूत्र के साथ मिल्ट के संदूषण से बचना भी बहुत महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह ऑस्मोलैलिटी को बदल सकता है और समय से पहले शुक्राणु16,50 को सक्रिय कर सकता है। हालांकि, यह मेडाका में (गतिशीलता की लंबी अवधि के कारण) और इस प्रोटोकॉल के साथ चिंता का विषय कम है, क्योंकि नमूना तुरंत सक्रियण माध्यम में रखा जाता है। मिल्ट की कम मात्रा मूत्र संदूषण से ग्रस्त है, इसलिए कम मात्रा में खरीद होने पर मेडाका से पेट की मालिश के साथ कुछ मलिनकिरण की उम्मीद की जा सकती है। हालांकि, अगर यह आबादी में सुसंगत है, तो उपचार समूहों के बीच तुलना अभी भी की जा सकती है। मेडाका की आबादी की तुलना करने में सावधानी बरतनी चाहिए जो मिल्ट की मात्रा या रंग में भिन्न होती है।

चूंकि शुक्राणु विश्लेषण के परिणाम उपयोग किए गए तरीकों पर बहुत निर्भर हैं, विस्तृत और विश्वसनीय तरीके जो विभिन्न प्रयोगशालाओं में आसानी से दोहराए जा सकते हैं, फायदेमंद हैं। दोहराए जाने को सक्षम करने के लिए कागजात के लिए अपने तरीकों के बारे में बारीकियों का खुलासा करना भी महत्वपूर्ण है। प्रजनन अनुसंधान के लिए एक मॉडल के रूप में मेडाका का तेजी से उपयोग किया जाता है, शुक्राणु की गुणवत्ता के आकलन के बारे में जानकारी की कमी है। शुक्राणु नमूनाकरण के लिए इस पेपर में वर्णित दो अलग-अलग तरीके विभिन्न प्रयोगों के लिए फायदेमंद हो सकते हैं। वृषण विच्छेदन आम तौर पर उच्च गतिशीलता शुक्राणु पैदा करता है और सापेक्ष एकाग्रता गणना की अनुमति देता है, जबकि पेट की मालिश एक ही मछली पर बार-बार की जा सकती है और यह स्पॉनिंग घटना का अधिक शुद्ध, जैविक प्रतिनिधित्व है। इसलिए, यह पांडुलिपि CASA के लिए पैरामीटर प्रदान करती है, जो एक विश्वसनीय, उद्देश्य तकनीक है जो शुक्राणु आंदोलन के बारे में पर्याप्त डेटा प्रदान करती है, जिसमें गतिशीलता, प्रगति, वेग और अन्य किनेमेटिक पैरामीटर शामिल हैं। इस प्रकार ये प्रोटोकॉल मेडाका में विभिन्न प्रकार के अध्ययनों के लिए उपयोगी होंगे, जिसमें विष विज्ञान, पारिस्थितिकी, प्रजनन और शरीर विज्ञान शामिल हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को नॉर्वेजियन यूनिवर्सिटी ऑफ लाइफ साइंसेज और यूएस फुलब्राइट कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित किया गया है। लेखक मछली सुविधा के रखरखाव के लिए एनएमबीयू में एंथनी पेल्टियर और लॉर्डेस कैरियन जी टैन और इन विधियों का परीक्षण करने के लिए मछली और प्रयोगशाला स्थान प्रदान करने के लिए आईएनआरएई (फ्रांस) में आईएससी एलपीजीपी से गिलाउम गोरमेलिन को धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL tubes Axygen MCT-150-C Any standard brand can be used
10 µL disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assembly Drummond 2-000-010
10x objective with phase contrast Nikon MRP90100
2 mL tubes Axygen MCT-200-c-s Any standard brand can be used
Blunt forceps Fine Science Tools 11000-12
Blunt smooth forceps Millipore XX6200006P
Disposable 20 micron counting chamber slide Microptic 20.2.25  Leja 2 chamber slides
Dissecting microscope Olympus SZX7 Any standard brand can be used
Fine forceps Fine Science Tools 11253-20
HBSS Sigmaaldrich H8264-1L
Holding sponge self-made
Inverted microscope Nikon Eclipse Ts2R
SCA Evolution Microptic
Small dissecting scissors Fine Science Tools 14090-09
Sodium Chloride (NaCl) Sigmaaldrich S9888
Tabletop vortex Labnet C1301B
Tricaine Sigmaaldrich A5040

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टेलोस्ट मॉडल जापानी मेडाका (<em>ओरीज़ियास लैटिप्स</em>) में शुक्राणु संग्रह और कंप्यूटर-सहायक शुक्राणु विश्लेषण
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Closs, L., Sayyari, A., Fontaine, R. Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes). J. Vis. Exp. (188), e64326, doi:10.3791/64326 (2022).

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