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Biology

Coleta de espermatozoides e análise de espermatozoides assistida por computador no modelo Teleost japonês Medaka (Oryzias latipes)

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/64326
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Preclinical Sciences and Pathology, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences, 2Department of Production Animal Clinical Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences

Summary

Este artigo descreve dois métodos rápidos e eficientes para a coleta de espermatozoides do pequeno modelo de medaka de peixe (Oryzias latipes), bem como um protocolo para avaliar de forma confiável a qualidade do esperma usando a análise de espermatozoides assistida por computador (CASA).

Abstract

A medaka japonesa (Oryzias latipes) é um peixe teleósteo e um modelo emergente de vertebrados para pesquisa em ecotoxicologia, desenvolvimento, genética e fisiologia. Medaka também é usado extensivamente para investigar a reprodução de vertebrados, que é uma função biológica essencial, pois permite que uma espécie se perpetue. A qualidade do esperma é um importante indicador da fertilidade masculina e, portanto, do sucesso da reprodução. Técnicas para extração de espermatozoides e análise de espermatozoides estão bem documentadas para muitas espécies, incluindo peixes teleósteos. A coleta de espermatozoides é relativamente simples em peixes maiores, mas pode ser mais complicada em peixes modelo pequeno, pois produzem menos espermatozoides e são mais delicados. Este artigo, portanto, descreve dois métodos de coleta de espermatozoides no pequeno modelo de peixe, o medaka japonês: dissecção dos testículos e massagem abdominal. Este artigo demonstra que ambas as abordagens são viáveis para o medaka e mostra que a massagem abdominal pode ser realizada repetidamente várias vezes à medida que o peixe se recupera rapidamente do procedimento. Este artigo também descreve um protocolo para análise de espermatozoides assistida por computador em medaka para avaliar objetivamente vários indicadores importantes da qualidade do esperma de medaka (motilidade, progressividade, duração da motilidade, concentração relativa). Esses procedimentos, especificados para este modelo útil de teleósteo pequeno, aumentarão muito a compreensão dos fatores ambientais, fisiológicos e genéticos que influenciam a fertilidade em vertebrados do sexo masculino.

Introduction

Medaka japonês é um pequeno peixe teleósteo de água doce que põe ovos nativo do leste da Ásia. Medaka tornou-se um excelente sistema modelo de vertebrados para estudos de ecotoxicologia, genética do desenvolvimento, genômica e biologia evolutiva e fisiologia 1,2. Semelhante ao popular peixe-zebra, eles são relativamente fáceis de reproduzir e altamente resistentes a muitas doenças comuns de peixes 1,2. Existem várias vantagens em usar a medaka como modelo, incluindo um curto tempo de geração, embriões transparentes 1,2 e um genoma sequenciado3. Ao contrário do peixe-zebra, o medaka tem um gene4 que determina o sexo, bem como uma alta temperatura (de 4-40 °C) e tolerância à salinidade (espécie euryhalina)5. Além disso, muitas ferramentas genéticas e anatômicas, bem como protocolos 6,7,8,9,10,11,12, foram desenvolvidos em Medaka para facilitar o estudo de sua biologia.

A reprodução é uma função fisiológica essencial, pois permite que uma espécie se perpetue. A reprodução de vertebrados requer uma miríade de eventos precisamente orquestrados, incluindo a produção de ovócitos nas fêmeas e a produção de espermatozoides nos machos. Os espermatozoides são células únicas, produzidas através do complexo processo de espermatogênese, no qual existem vários pontos de verificação para garantir a entrega de um produto de alta qualidade13. A qualidade dos gametas tornou-se um foco em estudos de aquicultura e população de peixes devido ao seu impacto no sucesso da fertilização e na sobrevivência larval. A qualidade dos espermatozoides é, portanto, um importante indicador da fertilidade masculina em vertebrados.

Três fatores úteis para avaliar a qualidade do esperma de peixes são motilidade, progressividade e longevidade. A porcentagem de motilidade e a motilidade progressiva são indicadores comuns da qualidade espermática, pois o movimento progressivo é necessário e se correlaciona fortemente com o sucesso da fertilização14,15. A duração do movimento também é um indicador importante nos peixes, pois os espermatozoides permanecem totalmente móveis por menos de 2 minutos na maioria das espécies de teleósteos e a trajetória dos espermatozoides é geralmente menos linear do que nos mamíferos15. No entanto, muitos estudos que avaliaram a motilidade espermática no passado se basearam em métodos subjetivos ou semiquantitativos de análise espermática15,16. Por exemplo, a motilidade espermática na medaka foi estimada no passado visualmente sob um microscópio17. Também foi estimada por meio do registro do movimento espermática e do uso de software de imagem para mesclar quadros e medir o caminho e a velocidade de natação18,19,20. Tais abordagens muitas vezes carecem de robustez, proporcionando resultados diferentes de acordo com a pessoa que realiza a análise15,21.

A análise de esperma assistida por computador (CASA) foi inicialmente desenvolvida para mamíferos. O CASA é um método quantitativo rápido para avaliar a qualidade dos espermatozoides por meio do registro e mensuração da velocidade e trajetória de forma automatizada15. Em peixes, tem sido utilizado em diferentes espécies para monitorar os efeitos de diversos poluentes da água sobre a qualidade dos espermatozoides, para identificar progenitores interessantes para melhorar o reprodutor, melhorar a eficiência da criopreservação e armazenamento e otimizar as condições de fertilização15. Portanto, é uma ferramenta poderosa para avaliar de forma confiável a qualidade do esperma em diferentes espécies de vertebrados. No entanto, devido à importante diversidade nas estratégias reprodutivas entre os peixes, o esperma dos peixes teleósteos difere do dos mamíferos e de uma espécie de peixe para outra. Os peixes teleósteos, que fertilizam principalmente os óvulos externamente liberando gametas na água, possuem espermatozoides altamente concentrados que são relativamente simples em estrutura, sem acrossoma, ao contrário dos mamíferos, que fertilizam internamente e, portanto, não precisam compensar a diluição na água, mas têm que suportar fluidos mais viscosos14. Além disso, os espermatozoides da maioria dos peixes se movem rapidamente, mas ficam totalmente móveis por menos de 2 minutos após a ativação, embora existam várias exceções15,22. Como a motilidade pode diminuir rapidamente na maioria dos peixes, deve-se tomar extremo cuidado com o momento da análise após a ativação ao determinar um protocolo de análise de espermatozoides para peixes.

A reprodução é um dos campos da biologia em que os teleósteos e o medaka têm sido amplamente utilizados como organismos modelo. De fato, os machos medaka apresentam comportamentos reprodutivos e sociais interessantes, como a guarda do acasalamento23,24. Além disso, existem diversas linhagens transgênicas para estudar o controle neuroendócrino da reprodução nessa espécie25,26,27. A amostragem de espermatozoides, um procedimento que é relativamente simples em peixes maiores, pode ser mais complicada em peixes pequenos modelos, pois produzem menos espermatozoides e são mais delicados. Por esse motivo, a maioria dos estudos envolvendo amostragem espermática em extrato de medaka milt (sêmen de peixe) por esmagamento dissecou testículos 17,28,29,30. Alguns estudos também utilizam uma massagem abdominal modificada para expressar o milt diretamente no meio ativador18,19,20; no entanto, com este método é difícil visualizar a quantidade e a cor do milt extraído. No peixe-zebra, a massagem abdominal é comumente utilizada para expressar o milt, que é imediatamente coletado em um tubo capilar31,32,33. Esse método permite estimar o volume de milt, bem como a observação da cor ejaculada, que é um indicador rápido e simples da qualidade espermática32,33. Portanto, falta um protocolo claro e bem descrito para coleta e análise de espermatozoides para o medaka.

Este artigo, portanto, descreve dois métodos de coleta de espermatozoides no pequeno modelo de peixe japonês medaka: dissecção de testículos e massagem abdominal com tubos capilares. Isso demonstra que ambas as abordagens são viáveis para o medaka e mostra que a massagem abdominal pode ser realizada repetidamente várias vezes, à medida que o peixe se recupera rapidamente do procedimento. Ele também descreve um protocolo para análise de espermatozoides assistida por computador em medaka para medir de forma confiável vários indicadores importantes da qualidade do esperma de medaka (motilidade, progressividade, longevidade e concentração relativa de espermatozoides). Esses procedimentos, especificados para este modelo útil de teleósteo pequeno, aumentarão muito a compreensão dos fatores ambientais, fisiológicos e genéticos que influenciam a fertilidade em vertebrados do sexo masculino.

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Protocol

Toda a experimentação e manuseio de animais foram conduzidos de acordo com as recomendações sobre o bem-estar animal experimental da Universidade Norueguesa de Ciências da Vida (NMBU). Os experimentos foram realizados com medaka japonesa macho adulto (6-9 meses de idade) (cepa Hd-rR) criado no NMBU (Ås, Noruega). Os métodos também foram brevemente testados em medaka japonesa macho de 9 meses de idade (cepa CAB) criada no Instituto Nacional de Pesquisa para Agricultura, Alimentação e Meio Ambiente (INRAE, Rennes, França).

1. Preparação do instrumento e da solução

  1. Preparar solução anestésica (tricaína a 0,6%).
    1. Diluir 0,6 g de Tricaína (MS-222) em 100 mL de 10x Tampão Fosfato Salino (PBS).
    2. Aliquot 2 mL da solução anestésica estoque em tubos de plástico 50 2 mL e armazenar a -20 °C até o uso para anestesia ou eutanásia.
  2. Prepare a água de recuperação (solução de cloreto de sódio [NaCl] a 0,9%).
    1. Adicione 27 g de NaCl em 3 L de água do aquário.
    2. Conservar a solução à temperatura ambiente (RT) até à utilização.
  3. Ajuste o meio de ativação, se necessário (solução salina balanceada de Hank [HBSS]).
    NOTA: O HBSS pode ser adquirido comercialmente ou fabricado em laboratório (Tabela de Materiais).
    1. Meça o pH do HBSS usando um medidor de pH. Ajuste o pH, se necessário, usando ácido clorídrico ou hidróxido de sódio, de modo que o pH final seja 7,1-7,3.
    2. Meça a osmolalidade do HBSS usando um osmômetro para relatórios futuros.
      NOTA: A gama no produto comercial é de 266-294 mOsmol/kg; no presente estudo, a osmolalidade foi de 287 mOsmol/kg. Pode ser diluído com água destilada para reduzir a osmolalidade, se desejado, mas isso não é necessário, pois não há uma grande diferença na ativação do esperma medaka em 150-300 mOsmol / kg HBSS.
    3. Armazene a solução no RT até o uso.
  4. Prepare a esponja de retenção.
    1. Corte uma esponja macia para caber confortavelmente em uma placa de Petri.
    2. Corte uma linha reta no meio da esponja que seja longa o suficiente para receber o peixe (3-4 cm) e cerca de 1 cm de profundidade (Figura 1A). Esta fenda na esponja irá segurar o lado ventral do peixe para cima para expor a cloaca.

2. Coleta de espermatozoides

NOTA: A coleta de espermatozoides pode ser alcançada por dois métodos diferentes: massagem abdominal ou dissecção dos testículos.

  1. Coleta de espermatozoides por massagem abdominal
    1. Preparar solução anestésica a 0,03% diluindo um tubo de Tricaína (0,6%) em 38 mL de água de aquário em um recipiente de vidro de 100 mL.
    2. Preparar os instrumentos, incluindo pinças lisas de extremidade romba e uma micropipeta de vidro calibrada descartável de 10 μL e um conjunto de tubo aspirador (Figura 1A). Umedeça a esponja de retenção preparada no passo 1.4 com a solução anestésica.
    3. Preparar tubos com 36 μL da solução activadora para análise imediata. Pré-aqueça a solução activadora num banho-maria ou incubadora regulada para 27 °C durante, pelo menos, 5 minutos.
      NOTA: Embora as amostras possam ser analisadas a partir de peixes individuais, a variação individual pode ser reduzida pelo agrupamento de amostras de vários machos na mesma solução ativadora. Ao agrupar amostras de vários peixes, use 36 μL de solução ativadora por peixe. Essa diluição pode precisar ser ajustada dependendo da tensão ou das condições de criação do medaka usado, pois esses fatores podem afetar a concentração e o volume do esperma. O programa CASA indicará se a concentração é muito alta para identificar espermatozoides.
    4. Anestesiar o peixe, colocando-o em solução anestésica por 30-90 s.
      NOTA: A duração da anestesia deve ser adaptada, pois varia de acordo com o tamanho do peixe. Para garantir que o peixe esteja totalmente anestesiado, aperte suavemente o pedúnculo caudal com fórceps. Se o peixe não reagir, a massagem pode ser iniciada.
    5. Retire o peixe da solução anestésica e use uma toalha de papel ou limpe suavemente para secar o abdômen do peixe. Colocar o peixe no cocho da esponja úmida do lado ventral da esponja para cima, de modo que suas brânquias fiquem expostas à solução anestésica na esponja (Figura 1B).
    6. Se a área ao redor da cloaca estiver molhada, seque suavemente a parte inferior do peixe com um lenço de papel descartável.
    7. Colocar o peixe na esponja de retenção sob um microscópio de dissecação e colocar a micropipeta com um tubo aspirador preso contra a cloaca do peixe (Figura 1C).
    8. Massageie o abdômen do peixe apertando suavemente com pinças lisas de extremidade romba em movimento rostral a caudal enquanto suga simultaneamente para coletar o milt expelido na pipeta (Figura 1D).
    9. Solte o peixe da esponja na água de recuperação. Deixe-os se recuperar na solução por pelo menos 15 minutos antes de devolvê-los ao sistema do aquário.
    10. Transfira o milt para um tubo preparado com solução ativadora pré-aquecida e pipeta para cima e para baixo várias vezes, sugando e soprando no conjunto do tubo aspirador.
    11. Homogeneizar o esperma diluído suavemente agitando os tubos antes da análise.
      NOTA: Para obter melhores resultados, analise as amostras imediatamente (por exemplo, 5 s) após a ativação. Em medaka, a análise pode ser atrasada, se necessário, pois os espermatozoides permanecem móveis por várias horas, mas o tempo deve permanecer consistente entre as amostras, pois a motilidade diminui com o tempo.
  2. Coleta de espermatozoides por dissecção dos testículos
    1. Preparar solução de eutanásia a 0,08% diluindo dois tubos de Tricaína (0,6%) em 26 mL de água de aquário em um recipiente de vidro de 100 mL.
    2. Prepare ferramentas de dissecação, incluindo pinças contundentes e finas e pequenas tesouras de dissecação (Figura 1E).
    3. Preparar um tubo para cada amostra com 120 μL de solução activadora para análise imediata. Pré-aqueça a solução activadora num banho-maria ou incubadora regulada para 27 °C durante, pelo menos, 5 minutos.
      NOTA: Embora as amostras possam ser analisadas a partir de peixes individuais, a variação individual pode ser reduzida pelo agrupamento de amostras de vários machos na mesma solução ativadora. Para o agrupamento de amostras de vários peixes, use 120 μL de solução ativadora por peixe. Essa diluição pode precisar ser ajustada dependendo da tensão ou das condições de criação do medaka usado, pois esses fatores podem afetar a concentração e o volume do esperma. O programa CASA indicará se a concentração é muito alta para identificar espermatozoides.
    4. Eutanasie o peixe, colocando-o na solução anestésica a 0,08% por 30-90 s.
      NOTA: A duração depende do tamanho do peixe. Para garantir que o peixe seja sacrificado, espere que os movimentos do opérculo cessem. O peixe não deve reagir ao toque da pinça.
    5. Retire o peixe da solução de eutanásia e seque suavemente o peixe com uma toalha de papel ou limpe suavemente.
      NOTA: Nesta etapa, o peixe pode ser pesado para posteriormente calcular o índice gonadossomático (GSI, peso gonadal / peso corporal).
    6. Colocar o peixe sob um microscópio de dissecação com o lado lateral esquerdo voltado para cima (Figura 1F).
    7. Usando uma pequena tesoura dissecante, corte um retalho dorsalmente da cloaca e, em seguida, atravesse as costelas até as brânquias para expor os órgãos internos (Figura 1G).
    8. Localize os testículos, corte o acessório em ambas as extremidades com pinça fina e remova os testículos (Figura 1H).
      NOTA: Para calcular o GSI, os testículos podem ser pesados nesta etapa. Trabalhe rapidamente para evitar a secagem do tecido.
    9. Transfira os testículos para um tubo preparado com a solução ativadora pré-aquecida.
    10. Use fórceps para esmagar os testículos várias vezes contra o lado do tubo para liberar o esperma. A liberação de espermatozoides geralmente pode ser visualizada e tornará a solução ligeiramente turva.
    11. Homogeneizar o esperma diluído suavemente agitando os tubos antes da análise.
      NOTA: Para obter melhores resultados, analise as amostras imediatamente (por exemplo, 5 s) após a ativação. Em medaka, a análise pode ser atrasada, se necessário, pois os espermatozoides permanecem móveis por várias horas, mas o tempo deve permanecer consistente entre as amostras, pois a motilidade diminui com o tempo.

Figure 1
Figura 1: Coleta de leves por massagem abdominal (A-D) e dissecção de testículos (E-H). (A) Instrumentos para massagem abdominal: esponja de contenção, pinça lisa contundente e micropipeta de vidro calibrada descartável de 10 μL com montagem de tubo aspirador; (B) Posição do peixe na esponja de retenção, com brânquias expostas à anestesia na esponja e cloaca voltadas para cima; (C) Posição de pinça lisa romba no abdômen e micropipeta contra cloaca; (D) Suave em micropipeta após massagem suave e sucção. (E) Instrumentos para dissecção de testículos: pinça romba, pinça fina e tesoura de dissecação pequena; (F) Posição do peixe para dissecção dos testículos; (G) Vista lateral dos órgãos internos; (H) Remova os testículos cortando o acessório em ambas as extremidades com pinças finas. Barra de escala: 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Análise espermática com sistema CASA

  1. O sistema CASA (SCA Evolution) deve ser configurado de acordo com o manual com microscópio utilizando filtro verde e objetiva 10x com contraste de fase.
  2. Preparar lâminas descartáveis de câmara de contagem de 20 μm por pré-aquecimento numa placa de aquecimento ou numa incubadora regulada para 27 °C durante, pelo menos, 5 minutos.
  3. Abra o software de análise de espermatozoides e selecione o módulo de motilidade.
  4. Defina a configuração para o medaka, conforme mostrado na Figura 2B.
  5. Coloque uma lâmina de câmara de contagem descartável pré-aquecida de 20 μm sob o microscópio em um palco aquecido ajustado a 27 °C.
  6. Pipetar a amostra para a câmara na lâmina até encher a câmara sem encher em excesso. Limpe cuidadosamente o excesso de amostras da entrada da câmara com uma ponta de algodão ou limpe suavemente para evitar células flutuantes.
  7. Selecione Analisar para examinar a amostra sob o microscópio.
    NOTA: Se o ícone do microscópio estiver vermelho, a iluminação do microscópio precisa ser ajustada para que o programa rastreie o esperma com precisão. Ajuste o brilho do microscópio, de modo que o movimento da cauda do esperma seja claramente visto. O ícone deve ser azul.
  8. Certifique-se de que o microscópio esteja focado e selecione Analisar novamente para registrar o esperma no campo. Mova o slide para que uma nova área da amostra fique no quadro e repita para capturar de 3 a 5 campos de exibição diferentes. Evite campos com bolhas de ar, massas celulares ou artefatos.
  9. Selecione Resultados para exibir os resultados.
    NOTA: Se os campos na página de resultados estiverem descritos em vermelho, siga as instruções do sistema para excluir os campos que variam muito em concentração ou motilidade.
  10. Clique duas vezes em um campo para visualizar os resultados do campo individual ou para verificar manualmente se há espermatozoides rotulados ou não rastreados incorretamente. Clique com o botão direito do mouse em espermatozoides individuais para renomear a motilidade, se necessário (Figura 2A).

Figure 2
Figura 2: Captura de tela do software SCA Evolution . (A) Resultados de rastreamento de esperma para um campo. Visualize dados de campo no lado direito e clique duas vezes em espermatozoides para visualizar dados individuais; (B) Resumo dos resultados para todos os campos com o menu de configuração aberto. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Representative Results

Tipo de dados obtidos
A análise da motilidade espermática do software SCA Evolution fornece dados sobre motilidade (porcentagem de espermatozoides móveis e imóveis), bem como progressividade (porcentagem de espermatozoides progressivos e não progressivos) e velocidade (porcentagem de espermatozoides rápidos, médios e lentos). Também combina progressividade e velocidade (progressiva rápida, progressiva média, não progressiva). Esses rótulos são baseados em medidas (Figura 3A) e cálculos (Fig. 3B) do movimento dos espermatozoides, que são fornecidos pelo programa (Tabela Suplementar 1). Para o medaka, os seguintes limiares foram adaptados dos parâmetros recomendados do peixe-zebra com base na literatura anterior 19,34,35 e na distribuição dos dados de medaka de 18 indivíduos. A motilidade é baseada na velocidade curvilínea (VCL) com < imóveis, 10 μm/s ≤ lentos < 20 μm/s ≤ média ≤ 40 μm/s < rápida. Os espermatozoides são considerados progressivos se o índice de retidão (STR) for > 68%.

A SCA Evolution também calcula a concentração de espermatozoides se fornecido o volume da amostra e a diluição. Embora o método de massagem abdominal seja útil para visualizar a coloração e confirmar a presença do milt, o volume coletado é muito pequeno para ser medido com precisão. Se o volume mais suave é melhorado por condições de criação ou usando uma deformação diferente e pode ser medido, então o programa pode ser usado para calcular a concentração. No entanto, a concentração relativa também pode ser calculada para comparar peixes ou grupos de tratamento para amostras colhidas por dissecção de testículos, desde que todo o testículo seja dissecado e diluído no mesmo volume de líquido.

Figure 3
Figura 3: Análise do movimento dos espermatozoides. (A) Os dados registados pelo sistema CASA incluem a velocidade curvilínea (VCL, velocidade calculada utilizando a distância ao longo do caminho real), a velocidade média do caminho (PAV, velocidade calculada utilizando a distância do caminho médio), a velocidade da linha recta (VSL, velocidade calculada utilizando a distância entre o início e o fim da via espermática), amplitude do deslocamento lateral da cabeça (ALH, magnitude do deslocamento lateral de uma cabeça de espermatozoide em torno de seu caminho médio), frequência cruzada de batida (BCF, taxa na qual o caminho curvilíneo cruza o caminho médio); (B) Os valores calculados do sistema CASA incluem índice de retidão (STR, linearidade do caminho médio), índice de linearidade (LIN, linearidade do caminho curvilíneo) e oscilação (WOB, oscilação do caminho real sobre o caminho médio). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Avaliação da motilidade espermática: Diferentes soluções ativadoras
Surpreendentemente, os espermatozoides amostrados por massagem abdominal e dissecção dos testículos foram imóveis na água do aquário (16 mOsmol/kg) (Figura 4A) e na água do aquário ajustada com solução de NaCl a 34 mOsmol/kg. Também não houve motilidade na água deionizada (-1 mOsmol/kg), ou água deionizada ajustada para 23 mOsmol/kg. Os espermatozoides estavam móveis na HBSS (287 mOsmol/kg) (Figura 4B), bem como na HBSS diluída com água deionizada para 36 mOsmol/kg e 113 mOsmol/kg, embora a porcentagem de motilidade tenha sido significativamente reduzida a 36 mOsmol/kg (Figura 4C).

Figure 4
Figura 4: Motilidade por osmolalidade da solução ativadora. Espermatozoides amostrados por dissecção de testículos em (A) água de aquário (16 mOsmol/kg) e (B) HBSS não ajustado (287 mOsmol/kg). Círculos amarelos rotulam espermatozoides imóveis e linhas coloridas indicam o movimento do esperma: vermelho (progressivo rápido), verde (progressivo médio), azul (não progressivo). Barra de escala: 100 μm. (C)Motilidade espermática ativada com HBSS a 36, 113 e 287 mOsmol/kg H2O. Para 36 e 113, n = 4 com dois peixes agrupados por amostra. Para 287, n = 9 com dois peixes agrupados por amostra. As análises estatísticas foram realizadas por meio de ANOVA com teste post-hoc de Tukey e diferenças significativas são indicadas por diferentes letras. Os dados são representados como média ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Métodos de amostragem: Massagem abdominal versus dissecção dos testículos
Os espermatozoides amostrados por dissecção dos testículos são significativamente mais móveis em comparação com amostras de massagem abdominal do mesmo peixe (Figura 5A). Dos espermatozoides móveis, uma porcentagem maior também é progressiva e de movimento médio ou rápido. Nos espermatozoides amostrados por massagem abdominal, os espermatozoides mais móveis são lentos e não progressivos (Figura 5B-C). No entanto, resultados diferentes podem ser obtidos usando uma cepa diferente de medaka (CAB) ou condições alternativas de criação (Tabela Suplementar 2).

Figure 5
Figura 5: Massagem abdominal versus dissecção dos testículos. Porcentagem de (A) espermatozoides imóveis e móveis amostrados por massagem abdominal ou dissecção dos testículos. Porcentagem de espermatozoides móveis que são (B) espermatozoides não progressivos e progressivos, e (C) lentos, médios e de movimento rápido. Todas as amostras de espermatozoides foram ativadas em HBSS (287 mOsmol/kg H2O). As análises estatísticas foram realizadas por meio do teste U de Mann-Whitney e diferenças significativas são indicadas por asteriscos. Os dados são representados como média ± EPM, n = 9. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Duração da motilidade de acordo com a condição de armazenamento
Os espermatozoides amostrados por dissecção dos testículos e mantidos a 27 °C tiveram uma redução de 50% na motilidade nos primeiros 30 minutos após a ativação. Após 2,5 h, menos de 5% dos espermatozoides estavam móveis. Quando armazenado a 4 °C, a motilidade foi reduzida em apenas 14% nos primeiros 30 min, e demorou 5 h para ver uma redução de 50% em relação à motilidade inicial. O gelo teve efeito extensivo semelhante, mas foi menos efetivo, com redução de 26% da motilidade nos primeiros 30 min (Figura 6A). A progressividade também caiu 52% nos primeiros 30 minutos no gelo, em comparação com 65% a 27 °C e 33% a 4 °C (Figura 6B). Tanto no gelo quanto a 4 °C, alguns espermatozoides (<3%) ainda estavam se movendo 42 horas após a ativação.

Figure 6
Figura 6: Longevidade dos espermatozoides de acordo com a condição de armazenamento. Percentagem (A) de motilidade e (B) de progressividade ao longo do tempo para amostras activadas com HBSS (287 mOsmol/kg H2O) e armazenadas a 27 °C, 4 °C ou sobre gelo. Os pontos de dados são médios ± EPM, n = ≥4. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Importância das condições ambientais e habitacionais
Os machos co-alojados com as fêmeas foram amostrados por dissecção dos testículos pela manhã antes de terem a oportunidade de desovar (antes que as luzes se acendessem) ou depois que as luzes se acendessem e as fêmeas no tanque tivessem ovos. Não houve diferença significativa na motilidade espermática. Machos alojados sem fêmeas por um mês também foram amostrados e, embora houvesse uma tendência de maior motilidade, a diferença também não foi significativa (Figura 7).

No entanto, quando a cepa CAB medaka foi criada em uma instalação diferente com machos separados de fêmeas por pelo menos um mês, os peixes eram maiores e 5-7 μL de milt foram coletados por massagem abdominal. Amostras coletadas de cinco peixes por massagem abdominal apresentaram motilidade de 68,34% quando ativadas com 300 mOsmol/kg de HBSS. Quando mantidos nas mesmas condições, mas com o sexo feminino, o volume de milt coletado foi de cerca de 2 μL, e a motilidade média foi de 46,2% de três machos (Tabela Suplementar 2).

Figure 7
Figura 7. Efeito das condições ambientais na motilidade espermática. Porcentagem de motilidade dos espermatozoides amostrados antes (n = 5) e após (n = 4) desova de machos que foram co-alojados com fêmeas, e espermatozoides de machos alojados sem fêmeas (n = 6). Todas as amostras foram amostradas por dissecção de testículos e ativadas com HBSS (287 mOsmol/kg H2O). As análises estatísticas foram realizadas por meio do teste t e as diferenças não foram significativas. Os dados são mostrados como média ± MEV com círculos representando peixes individuais. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela Suplementar 1: Cálculos médios de velocidade e movimento para espermatozoides amostrados por massagem abdominal e dissecção de testículos (n = 9). Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 2: Dados de análise de espermatozoides da cepa CAB (também chamada de Carbio) medaka criada no INRAE em Rennes, França. Todas as amostras foram ativadas em HBSS de 300 mOsmol/kg. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

A osmolalidade é um fator importante na ativação do espermatozoide de peixes36,37. Geralmente, os espermatozoides são imóveis nos testículos e tornam-se móveis em meios hiperosmóticos em relação ao líquido seminal para peixes marinhos e hipo-osmóticos em relação ao líquido seminal para peixes de água doce37. Semelhante ao sangue, o plasma seminal em peixes de água doce é tipicamente menor do que o de peixes marinhos (cerca de 300 mOsmol/kg em comparação com 400 mOsmol/kg)22,37. Assim, os espermatozoides de peixes geralmente são ativados em contato com a água em que vivem, e essa água serve como o melhor e mais biológico meio de ativação para a análise de espermatozoides. No entanto, os espermatozoides de medaka amostrados por massagem abdominal e dissecção dos testículos não foram móveis na água do aquário (Figura 4A) em medaka de cepa Hd-rR ou CAB criados em dois laboratórios diferentes. Além disso, a motilidade foi maior em 287 mOsmol/kg HBSS do que em 36 mOsmol/kg HBSS (Figura 4C), o que é incomum para um peixe de água doce.

A maioria dos estudos prévios envolvendo análise espermática em medaka utilizou HBSS 28,29,38 ou solução de Yamamoto 18,19 como meios ativadores para espermatozoides de medaka sem discutir a osmolalidade. Enquanto o HBSS é um bom meio ativador para o esperma de medaka, a variação na osmolalidade pode afetar a motilidade. É, portanto, essencial que os estudos de análise de espermatozoides revelem a osmolalidade de sua solução ativadora para comparação entre experimentos. Um estudo que investigou a osmolalidade ideal do meio ativador constatou que o esperma de medaka é móvel em água deionizada (25 mOsmol/kg) e HBSS com valores de osmolalidade < 686 mOsmol/kg, com maior motilidade entre 25 e 227 mOsmol/kg17. No entanto, no presente estudo, os espermatozoides também não eram móveis em água deionizada. Como peixe euryhalina, os medaka são muito adaptáveis a diferentes ambientes e podem até viver e se reproduzir em água salgada39, por isso é possível que diferentes condições de criação sejam responsáveis por essa discrepância. Curiosamente, nenhum outro estudo relatou testar a motilidade do esperma medaka na água do aquário (ou similar, como a água da torneira envelhecida), embora seja o meio padrão de ativação do esperma para peixes de água doce.

Uma possível explicação para essa ativação atípica do esperma no medaka é a interação com o líquido ovariano. Enquanto o esperma de peixe é geralmente ativado na água circundante, o líquido ovariano aumenta ou prolonga a duração da motilidade espermática em muitas espécies40,41. Embora os medaka estejam fertilizando externamente peixes de água doce, seu comportamento de desova, que inclui o envelopamento de barbatanas e o tremor, os coloca muito mais próximos do que os desovadoresde transmissão 23. Como a osmolalidade do fluido ovariano em peixes de água doce (cerca de 300 mOsmol/kg) está próxima do HBSS40, é possível que o fluido liberado pela fêmea ative o esperma, não a água do aquário. Como a osmolalidade do plasma seminal e ovariano são semelhantes, é possível que a composição iônica do líquido ovariano medaka desempenhe um papel importante40,42. O papel do fluido ovariano e dos íons na ativação do esperma de medaka merece uma investigação mais aprofundada.

Em estudos anteriores, o esperma de medaka foi coletado apenas por esmagamento de testículos dissecados 17,28,29,30 ou por massagem abdominal para expressar o milt diretamente no meio ativador 18,19,20; nenhum estudo relatou dados com espermatozoides coletados por massagem abdominal em tubo capilar, embora seja uma prática comum em peixes-zebra e outros peixes teleósteos33,43,44. Este método é viável em medaka também. O milt é facilmente visualizado no tubo capilar e, embora o volume seja muito pequeno para ser medido com precisão, esse método permite a confirmação do sucesso da coleta e análise da cor como um indicador rápido de qualidade32. Evitar a contaminação fecal também é mais fácil com a coleta em um tubo capilar em comparação com o meio. Embora as amostras de espermatozoides coletadas por dissecção dos testículos tenham melhor motilidade na medaka do que as amostras coletadas por massagem abdominal (Figura 5) e, portanto, sejam preferíveis para experimentos em que o peixe pode ser sacrificado, a massagem abdominal é um procedimento minimamente invasivo que não requer eutanásia e pode ser repetido no mesmo peixe. Portanto, é útil para experimentos que seguem o mesmo peixe ao longo do tempo. Além disso, as amostras coletadas com massagem abdominal contêm apenas células maduras liberadas com plasma seminal44, enquanto as amostras da dissecção dos testículos podem incluir espermatozoides imaturos e outros detritos. O sistema CASA desconta células redondas e detritos maiores que a área máxima, mas se esse parâmetro for definido muito alto, os resultados de motilidade podem ser afetados.

Devido à baixa quantidade de espermatozoides coletados com a técnica de massagem abdominal nesses medakas, foi impossível medir com precisão o volume de espermatozoides no capilar e, assim, calcular as concentrações de espermatozoides usando abordagens regulares. No entanto, para amostras colhidas por dissecção de testículos, mantendo o volume do meio de ativação consistente e pesando os testículos, uma concentração relativa pode ser calculada com base na concentração de espermatozoides dada pelo sistema CASA para comparar entre indivíduos ou grupos de tratamento. Além da análise de qualidade, a concentração relativa também é útil para determinar diluições ótimas da amostra para criopreservação. Se o volume coletado pela massagem abdominal for melhorado pelas condições de criação ou usando uma cepa diferente, o volume pode ser calculado medindo a altura do milt no tubo capilar e inserido no programa para calcular a concentração. Nesses casos, em que vários microlitros podem ser obtidos, a motilidade pode ser maior por massagem abdominal do que a dissecção dos testículos (Tabela Suplementar 2). Quando baixos volumes são coletados, as amostras são mais propensas à contaminação, o que pode afetar a motilidade, embora esses efeitos pareçam ser consistentes quando os volumes são semelhantes, de modo que as comparações ainda podem ser feitas entre os grupos de tratamento. No entanto, não devem ser feitas comparações entre amostras que variam muito em volume ou coloração de milt.

O baixo volume de milt obtido de medaka usando massagem abdominal pode ser uma limitação para experimentos que requerem um grande volume de milt. Nesses casos, a dissecção dos testículos pode ser preferível, como demonstrado em um estudo que coletou milt de peixe-zebra e espada verde por dissecção e massagem, mas apenas por dissecção em medaka devido ao baixo volume30. A dissecção dos testículos é tipicamente melhor para comparações com outras espécies pelo mesmo motivo. O volume limitado pela massagem abdominal em comparação com outros peixes de tamanho semelhante pode ser devido a testículos menores (1,9 ± 0,6 mg em medaka em comparação com 7,0 ± 2,5 mg em peixe-zebra 45) e menos espermatozoides produzidos (2,0 ± 0,4 x 10 6 espermatozoides / mg testículos em Medaka em comparação com 7,7 ± 2,0 x 106 espermatozoides / mg testículos em zebrafish46), ou a outros fatores biológicos desconhecidos que limitam a técnica, como sugerido em bagres africanos criados em incubatórios47. A diferença pode ser fisiológica, de acordo com a tensão ou condições ambientais, ou anatômica, pois ao contrário do peixe-zebra, os testículos de medaka são fundidos e localizados mais medialmente e, portanto, podem ser mais difíceis de acessar por massagem abdominal, embora existam outros peixes com testículos fundidos também.

Para algumas espécies, como o peixe-zebra, é melhor coletar amostras de espermatozoides antes que os peixes tenham a chance de desovar pela manhã48 ou isolar os machos em tanques individuais na noite anterior para evitar a desova32. Com o Hd-rR medaka deste estudo, as condições ambientais como o momento da amostragem (antes ou após a desova) e as condições de alojamento (com ou sem fêmeas por 1 mês) não tiveram efeito significativo na motilidade espermática (Figura 7). É possível que um tamanho de amostra maior ou isolar machos de fêmeas por um longo período de tempo possa produzir maior quantidade de espermatozoides e / ou motilidade. Na cepa CAB medaka de outra instalação, uma tendência semelhante foi observada com melhor qualidade e volume de espermatozoides de machos alojados sozinhos em comparação com machos alojados com fêmeas (muito poucos peixes foram testados para tirar conclusões estatísticas). Também foi possível com esses peixes coletar volumes relativamente altos de milt por massagem abdominal (Tabela Suplementar 2), embora volumes muito pequenos de milt tenham sido obtidos usando a cepa Hd-rR medaka, e outros tenham relatado pequenos volumes também pela mesma técnica na cepa CAB medaka30. No entanto, se essas diferenças são devidas à cepa (que é uma cepa comercial em vez de endogâmica) ou devido a diferenças de criação (há muitas entre as instalações), ainda não está claro. Nesses peixes, vários microlitros de milt poderiam ser coletados, o que limita a contaminação e melhora a qualidade. Mas, para experimentos em que é importante coabitar ambos os sexos, não parece necessário separá-los para produzir resultados. Também não parece necessário amostrar machos de cada vez antes da desova.

Embora mais estudos sejam necessários para determinar exatamente como o esperma medaka difere de acordo com a população e fatores ambientais, a tensão e as condições de criação devem, no entanto, ser levadas em consideração ao projetar a configuração experimental, e deve-se ter cautela na comparação entre populações que produzem diferentes quantidades de espermatozoides. Se maiores volumes de milt forem obtidos, a diluição da solução ativadora deve ser ajustada (por exemplo, 1:60, embora a concentração preferida possa variar com o sistema CASA). Da mesma forma, se os testículos dissecados forem muito maiores do que o típico (2 mg) devido à tensão ou condições de criação, a diluição precisará ser aumentada para que o programa CASA possa rotular com precisão todos os espermatozoides.

Os métodos de análise de espermatozoides variam amplamente para medaka e são muitas vezes subjetivos, tornando os resultados difíceis de comparar entre os estudos. Um estudo comparando métodos subjetivos e objetivos utilizados por técnicos com diferentes níveis de especialização descobriu que técnicos altamente experientes podem estimar a motilidade espermática de peixes dentro de 10 pontos percentuais dos dados fornecidos por um programa de motilidade CASA, enquanto técnicos de média e baixa experiência superestimam os valores de motilidade CASA com amplitudes de até 30 pontos percentuais21 . No entanto, a falta de padronização para os parâmetros que determinam a motilidade no medaka também pode causar variação entre aqueles que utilizam métodos mais objetivos. Por exemplo, um estudo que registrou espermatozoides a 33 quadros por segundo (fps), analisou 30 quadros e considerou que os espermatozoides se movendo mais rápido que 2 μm/s móveis apresentaram velocidade média de cerca de 60 μm/s e motilidade de cerca de 70% para seus peixes controle18. Outro estudo utilizando o mesmo protocolo apresentou velocidade média de 40 μm/s para espermatozoides controle e um percentual de motilidade acima de 80%19. Outro grupo, que analisou 200 quadros a 47 fps, teve uma VCL média acima de 100 um/s para peixes controle, mas uma motilidade média abaixo de 50%. Eles não revelaram quais parâmetros determinaram a motilidade. Assim, neste protocolo, o software de análise de esperma assistido por computador é usado para analisar o esperma de forma objetiva, rápida e confiável com base em um conjunto de parâmetros que foram personalizados para as características do esperma de medaka. Como é fundamental que os parâmetros de motilidade sejam consistentes para comparações entre laboratórios, a configuração completa utilizada neste estudo está disponível (Figura 2B), para que esse protocolo possa ser replicado de forma confiável em um laboratório diferente por diferentes pesquisadores.

Os peixes teleósteos mostram uma grande diversidade de características espermáticas, portanto, embora este protocolo tenha sido inicialmente testado usando os parâmetros recomendados do peixe-zebra para o software SCA Evolution, era evidente que os parâmetros precisariam ser ajustados para o esperma medaka de menor velocidade e maior longevidade. Assim, os parâmetros do peixe-zebra foram adaptados ao medaka utilizando literatura do medaka e de outras espécies que relataram características semelhantes dos espermatozoides 19,34,35 e selecionaram os limiares que melhor se ajustaram à distribuição de 17.580 rastros de espermatozoides analisados de18 indivíduos. A motilidade é baseada na velocidade curvilínea (VCL) com < imóveis, 10 μm/s ≤ lentos < 20 μm/s ≤ média ≤ 40 μm/s < rápida. Os espermatozoides são considerados progressivos se o índice de retidão (STR) for > 68%. O limiar que define a motilidade foi mantido em 10 μm/s em vez de 2 μm/s, como utilizado em alguma literatura18,19, pois muitos espermatozoides sem movimento flagelar foram erroneamente rotulados como móveis com esse cenário. Outras espécies de peixes com cabeças de espermatozoides de tamanho semelhante (~2 μm) também utilizaram 10 μm/s para definir espermatozoides móveis35,43. A área máxima foi diminuída a partir da configuração do peixe-zebra de 90 μm 2 para 20 μm2, de modo que grandes detritos celulares da dissecção dos testículos seriam ignorados.

A duração da motilidade parece depender da quantidade de ATP armazenada antes da ativação, pois o movimento flagelar requer um rápido consumo de energia. Provavelmente devido a essa rápida exaustão, existe uma correlação entre espermatozoides de alta velocidade inicial e menor duração da motilidade49. Embora um choque osmótico seja normalmente necessário para ativar o esperma de peixe, ele também pode levar a danos na membrana durante o período de motilidade, o que também pode afetar a longevidade. Esse efeito é mais crítico em espécies de água doce49, o que pode explicar por que os espermatozoides marinhos são capazes de maior duração de motilidade (cerca de 550 s em média em comparação com cerca de 150 s para espécies de água doce), apesar de exibirem uma velocidade e motilidade médias semelhantes às dos espermatozoides de água doce14,22. A duração da motilidade superior a 30 min não é comum, mas tem sido relatada em várias espécies marinhas22,49. Apesar de ser um peixe de água doce, os resultados com medaka se encaixam no perfil de espermatozoides que têm uma velocidade menor e maior duração das espécies marinhas. Isso pode estar relacionado à ativação em meio semelhante ao plasma seminal - sem um choque osmótico, o esperma medaka provavelmente não sofre danos na membrana semelhantes a outros peixes de água doce.

Uma solução não ativadora e uma análise muito rápida e consistentemente cronometrada após a ativação são muitas vezes necessárias para a análise de espermatozoides que são apenas móveis por minutos. No entanto, a motilidade espermática medaka dura naturalmente várias horas e a motilidade mais alta pode ser preservada armazenando-se a 4 °C ou no gelo (Figura 6). Assim, para experimentos em que a análise imediata não é possível, o protocolo pode ser modificado para que, por exemplo, os testículos sejam armazenados em solução ativadora no gelo por uma hora, desde que o tempo de coleta seja registrado para que a análise possa permanecer consistente. No entanto, para obter resultados ótimos, a análise imediata ainda é a melhor opção. Embora a motilidade ainda diminua, por ser gradual, os resultados são menos impactados por pequenas diferenças no tempo de análise após a ativação. Ainda assim, é importante relatar tanto a temperatura de armazenamento das amostras quanto o tempo de análise após a ativação para que os dados possam ser comparados e reproduzidos.

Também é tipicamente muito importante em peixes evitar a contaminação de milt com urina durante a amostragem, pois isso pode alterar a osmolalidade e ativar prematuramente o esperma16,50. No entanto, isso é menos preocupante no medaka (devido à maior duração da motilidade) e com este protocolo, pois a amostra é colocada em meio de ativação imediatamente. Baixos volumes de leves são propensos à contaminação da urina, portanto, alguma descoloração pode ser esperada com massagem abdominal de medaka quando baixos volumes são obtidos. No entanto, se isso for consistente na população, então as comparações ainda podem ser feitas entre os grupos de tratamento. Deve-se ter cuidado na comparação de populações de medaka que variam no volume ou coloração de milt.

Como os resultados da análise de espermatozoides são muito dependentes dos métodos usados, métodos detalhados e confiáveis que podem ser facilmente repetidos em diferentes laboratórios são benéficos. Também é vital que os artigos divulguem detalhes sobre seus métodos para permitir a repetibilidade. Com o medaka usado cada vez mais como modelo para a pesquisa da reprodução, o corpo de informações sobre a avaliação da qualidade do esperma está faltando. Os dois métodos distintos descritos neste artigo para amostragem de espermatozoides podem ser benéficos para diferentes experimentos. A dissecção dos testículos normalmente produz espermatozoides de maior motilidade e permite cálculos de concentração relativa, enquanto a massagem abdominal pode ser feita repetidamente no mesmo peixe e é uma representação biológica mais pura de um evento de desova. Este manuscrito, portanto, fornece os parâmetros para o CASA, que é uma técnica confiável e objetiva que fornece amplos dados sobre o movimento dos espermatozoides, incluindo motilidade, progressividade, velocidade e outros parâmetros cinemáticos. Esses protocolos serão, portanto, úteis para uma variedade de estudos em medaka, incluindo toxicologia, ecologia, reprodução e fisiologia.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pela Universidade Norueguesa de Ciências da Vida e pelo programa Fulbright dos EUA. Os autores gostariam de agradecer a Anthony Peltier e Lourdes Carreon G Tan da NMBU pela manutenção das instalações de pesca e a Guillaume Gourmelin do ISC LPGP da INRAE (França) por fornecer espaço de peixe e laboratório para testar ainda mais esses métodos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL tubes Axygen MCT-150-C Any standard brand can be used
10 µL disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assembly Drummond 2-000-010
10x objective with phase contrast Nikon MRP90100
2 mL tubes Axygen MCT-200-c-s Any standard brand can be used
Blunt forceps Fine Science Tools 11000-12
Blunt smooth forceps Millipore XX6200006P
Disposable 20 micron counting chamber slide Microptic 20.2.25  Leja 2 chamber slides
Dissecting microscope Olympus SZX7 Any standard brand can be used
Fine forceps Fine Science Tools 11253-20
HBSS Sigmaaldrich H8264-1L
Holding sponge self-made
Inverted microscope Nikon Eclipse Ts2R
SCA Evolution Microptic
Small dissecting scissors Fine Science Tools 14090-09
Sodium Chloride (NaCl) Sigmaaldrich S9888
Tabletop vortex Labnet C1301B
Tricaine Sigmaaldrich A5040

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Coleta de espermatozoides e análise de espermatozoides assistida por computador no modelo Teleost japonês Medaka (<em>Oryzias latipes</em>)
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Closs, L., Sayyari, A., Fontaine, R. Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes). J. Vis. Exp. (188), e64326, doi:10.3791/64326 (2022).

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