Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Сбор спермы и компьютерный анализ спермы в модели Teleost японская медака (Oryzias latipes)

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/64326
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Preclinical Sciences and Pathology, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences, 2Department of Production Animal Clinical Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences

Summary

В данной статье описаны два быстрых и эффективных метода сбора спермы у мелкомодельных рыбок медака (Oryzias latipes), а также протокол достоверной оценки качества спермы с помощью компьютерного анализа спермы (CASA).

Abstract

Японская медака (Oryzias latipes) — телеостная рыба и новая модель позвоночных для экотоксикологии, развития, генетики и физиологических исследований. Медака также широко используется для исследования размножения позвоночных, что является важной биологической функцией, поскольку оно позволяет виду увековечиваться. Качество спермы является важным показателем мужской фертильности и, таким образом, успешности размножения. Методы извлечения спермы и анализ спермы хорошо документированы для многих видов, включая телеостных рыб. Сбор спермы относительно прост у более крупных рыб, но может быть более сложным у мелких модельных рыб, поскольку они производят меньше спермы и являются более деликатными. В данной статье, таким образом, описаны два метода сбора спермы у маленькой образцовой рыбки, японской медаки: рассечение яичек и массаж живота. Эта статья демонстрирует, что оба подхода возможны для медаки и показывает, что массаж живота может быть выполнен повторно несколько раз, поскольку рыба быстро восстанавливается после процедуры. В данной статье также описан протокол компьютерного анализа спермы в медаке для объективной оценки нескольких важных показателей качества сперматозоидов медака (подвижность, прогрессивность, продолжительность подвижности, относительная концентрация). Эти процедуры, указанные для этой полезной модели малого телеоста, значительно улучшат понимание экологических, физиологических и генетических факторов, влияющих на фертильность у самцов позвоночных.

Introduction

Японская медака - это небольшая, откладывающая яйца пресноводная рыба, родом из Восточной Азии. Medaka стала отличной модельной системой позвоночных для экотоксикологии, генетики развития, геномики и эволюционной биологии и физиологических исследований 1,2. Подобно популярным рыбкам данио, они относительно просты в разведении и очень устойчивы ко многим распространенным заболеваниям рыб 1,2. Существует несколько преимуществ использования медаки в качестве модели, включая короткое время генерации, прозрачные эмбрионы 1,2 и секвенированный геном3. В отличие от рыбок данио, медака имеет определяющий пол ген4, а также толерантность к высокой температуре (от 4-40 °C) и солености (эвригалинные виды)5. Кроме того, многие генетические и анатомические инструменты, а также протоколы 6,7,8,9,10,11,12 были разработаны в медаке для облегчения изучения ее биологии.

Размножение является важной физиологической функцией, поскольку оно позволяет виду увековечиваться. Размножение позвоночных требует множества точно организованных событий, включая производство ооцитов у самок и производство спермы у самцов. Сперматозоиды являются уникальными клетками, полученными в результате сложного процесса сперматогенеза, в котором существует ряд контрольных точек, гарантирующих доставку высококачественного продукта13. Качество гамет стало центром внимания в аквакультуре и исследованиях популяций рыб из-за его влияния на успех оплодотворения и выживание личинок. Поэтому качество спермы является важным показателем мужской фертильности у позвоночных.

Тремя полезными факторами для оценки качества спермы рыб являются подвижность, прогрессивность и долговечность. Процент подвижности и прогрессирующая подвижность являются общими показателями качества спермы, поскольку прогрессивное движение необходимо и сильно коррелирует с успехом оплодотворения14,15. Продолжительность движения также является важным показателем у рыб, поскольку сперматозоиды остаются полностью подвижными менее 2 мин у большинства видов телеостов, а траектория сперматозоидов, как правило, менее линейна, чем у млекопитающих15. Однако многие исследования, оценивающие подвижность сперматозоидов в прошлом, опирались на субъективные или полуколичественные методы анализа сперматозоидов15,16. Например, подвижность сперматозоидов в медаке оценивалась в прошлом визуально под микроскопом17. Он также был оценен путем регистрации движения сперматозоидов и использования программного обеспечения для визуализации для слияния кадров и измерения траектории плавания и скорости 18,19,20. Таким подходам часто не хватает надежности, обеспечивая различные результаты в зависимости от человека, выполняющего анализ15,21.

Компьютерный анализ спермы (CASA) был первоначально разработан для млекопитающих. CASA - это быстрый количественный метод оценки качества спермы путем регистрации и измерения скорости и траектории автоматическим способом15. У рыб он использовался у различных видов для мониторинга воздействия нескольких загрязнителей воды на качество спермы, для выявления интересных прародителей для улучшения маточного поголовья, для повышения эффективности криоконсервации и хранения, а также для оптимизации условий для оплодотворения15. Поэтому он является мощным инструментом для достоверной оценки качества спермы у разных видов позвоночных. Однако из-за важного разнообразия репродуктивных стратегий между рыбами сперма телеостных рыб отличается от спермы млекопитающих и от одного вида рыб к другому. Телеостные рыбы, которые в основном оплодотворяют икру внешне, выпуская гаметы в воду, имеют высококонцентрированные сперматозоиды, которые относительно просты по структуре без акросом, в отличие от млекопитающих, которые оплодотворяются внутренне и поэтому не должны компенсировать разбавление в воде, но должны выдерживать больше вязких жидкостей14. Кроме того, сперматозоиды большинства рыб движутся быстро, но полностью подвижны менее чем через 2 минуты после активации, хотя есть несколько исключений15,22. Поскольку подвижность может быстро снижаться у большинства рыб, следует проявлять крайнюю осторожность со сроками анализа после активации при определении протокола анализа спермы для рыб.

Размножение является одной из областей в биологии, в которой телеосты и медака широко используются в качестве модельных организмов. Действительно, самцы медаки демонстрируют интересное репродуктивное и социальное поведение, такое как мат, охраняющий23,24 человека. Кроме того, существует несколько трансгенных линий для изучения нейроэндокринного контроля размножения у этого вида 25,26,27. Отбор проб спермы, процедура, которая относительно проста у более крупных рыб, может быть более сложной у мелких моделей рыб, поскольку они производят меньше спермы и являются более деликатными. По этой причине большинство исследований, связанных с отбором проб спермы в медаке, извлекают milt (сперму рыбы) путем дробления рассеченных яичек 17,28,29,30. В нескольких исследованиях также используется модифицированный массаж живота для экспрессии молока непосредственно в активирующую среду 18,19,20; однако с помощью этого метода трудно визуализировать количество и цвет извлеченного молока. У рыбок данио массаж живота обычно используется для сцеживания молока, которое сразу собирается в капиллярную трубку 31,32,33. Этот метод позволяет оценить объем молока, а также наблюдать цвет эякулята, который является быстрым и простым показателем качества спермы32,33. Поэтому для медаки отсутствует четкий и хорошо описанный протокол сбора и анализа спермы.

Поэтому в данной статье описаны два метода сбора спермы у маленькой модели рыбки японской медаки: рассечение яичек и массаж живота капиллярными трубками. Это демонстрирует, что оба подхода осуществимы для медаки и показывает, что массаж живота может быть выполнен повторно несколько раз, так как рыба быстро восстанавливается после процедуры. В нем также описывается протокол компьютерного анализа спермы в медаке для надежного измерения нескольких важных показателей качества спермы медака (подвижность, прогрессивность, долговечность и относительная концентрация сперматозоидов). Эти процедуры, указанные для этой полезной модели малого телеоста, значительно улучшат понимание экологических, физиологических и генетических факторов, влияющих на фертильность у самцов позвоночных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты и обращение с животными проводились в соответствии с рекомендациями по благополучию экспериментальных животных в Норвежском университете естественных наук (NMBU). Эксперименты проводились с использованием взрослого (6-9-месячного) самца японской медаки (штамм Hd-rR), выращенного в NMBU (Ос, Норвегия). Методы также были кратко протестированы на 9-месячном самце японской медаки (штамм CAB), выращенном в Национальном научно-исследовательском институте сельского хозяйства, продовольствия и окружающей среды (INRAE, Ренн, Франция).

1. Подготовка инструмента и раствора

  1. Готовят раствор анестетика (0,6% трикаин).
    1. Развести 0,6 г трикаина (MS-222) в 100 мл 10x фосфатного буферного физиологического раствора (PBS).
    2. Aliquot 2 мл раствора анестетика в пластиковые пробирки по 50 2 мл и хранят при -20 °C до использования для анестезии или эвтаназии.
  2. Приготовьте рекуперационную воду (0,9% раствор хлорида натрия [NaCl]).
    1. Добавьте 27 г NaCl в 3 л аквариумной воды.
    2. Хранить раствор при комнатной температуре (RT) до использования.
  3. При необходимости отрегулируйте среду активации (сбалансированный раствор соли Хэнка [HBSS]).
    ПРИМЕЧАНИЕ: HBSS можно приобрести в коммерческих целях или сделать в лаборатории (Таблица материалов).
    1. Измерьте pH HBSS с помощью рН-метра. Отрегулируйте рН при необходимости, используя соляную кислоту или гидроксид натрия, чтобы конечный рН составлял 7,1-7,3.
    2. Измерьте осмоляльность HBSS с помощью осмометра для будущих отчетов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ассортимент товарного продукта составляет 266-294 мОсмоль/кг; в текущем исследовании осмоляльность составляла 287 мОсмоль/кг. При желании его можно разбавлять дистиллированной водой для снижения осмоляльности, но в этом нет необходимости, так как нет большой разницы в активации сперматозоидов медака в 150-300 мОсмоль/кг HBSS.
    3. Храните раствор в RT до использования.
  4. Подготовьте губку для хранения.
    1. Нарежьте мягкую губку, чтобы плотно поместиться в чашке Петри.
    2. Вырежьте прямую линию в середине губки, которая достаточно длинна, чтобы принять рыбу (3-4 см) и около 1 см глубиной (рисунок 1А). Эта щель в губке будет удерживать вентральную сторону рыбы вверх, чтобы обнажить клоаку.

2. Сбор спермы

ПРИМЕЧАНИЕ: Сбор спермы может быть достигнут двумя различными методами: массаж живота или рассечение яичек.

  1. Сбор спермы методом массажа живота
    1. Приготовить 0,03% раствор анестетика, разбавлив один тюбик запаса трикаина (0,6%) в 38 мл аквариумной воды в стеклянной емкости объемом 100 мл.
    2. Подготовьте инструменты, включая гладкие щипцы с тупым концом и одноразовый калиброванный стеклянный микропипетку 10 мкл и аспираторную трубку в сборе (рисунок 1A). Смочите губку, приготовленную на этапе 1.4, раствором анестетика.
    3. Подготовьте пробирки с 36 мкл активирующего раствора для немедленного анализа. Разогрейте активирующий раствор на водяной бане или в инкубаторе, установив до 27 °C в течение не менее 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя образцы могут быть проанализированы из отдельных рыб, индивидуальные вариации могут быть уменьшены путем объединения образцов от нескольких самцов в одном и том же активирующем растворе. При объединении образцов из нескольких рыб используйте 36 мкл активирующего раствора на рыбу. Это разведение, возможно, потребуется скорректировать в зависимости от деформации или условий выращивания используемой медаки, поскольку эти факторы могут влиять на концентрацию и объем сперматозоидов. Программа CASA укажет, не слишком ли высока концентрация для идентификации сперматозоидов.
    4. Обезболить рыбу, поместив ее в обезболивающий раствор на 30-90 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность анестезии должна быть адаптирована, так как она варьируется в зависимости от размера рыбы. Чтобы убедиться, что рыба полностью обезболена, аккуратно зажмите хвостовую ножку щипцами. Если рыба не реагирует, можно начинать массаж.
    5. Выньте рыбу из раствора анестетика и используйте бумажное полотенце или аккуратно протрите, чтобы высушить брюшко рыбы. Поместите рыбу в корыто влаги, удерживающей губку брюшной стороной вверх, чтобы ее жабры подвергались воздействию раствора анестетика в губке (рисунок 1B).
    6. Если область вокруг клоаки влажная, аккуратно высушите нижнюю сторону рыбы одноразовой салфеткой.
    7. Поместите рыбу в губку под рассекающий микроскоп и поместите микропипетку с трубкой аспиратора, прикрепленной к клоаке рыбы (рисунок 1C).
    8. Массируйте живот рыбы, осторожно сжимая тупым концом гладкие щипцы в ростральном и каудальном движении, одновременно сосая, чтобы собрать вытесненное молоко в пипетку (рисунок 1D).
    9. Выпустите рыбу из губки в восстановительную воду. Дайте им восстановиться в растворе не менее 15 минут, прежде чем возвращать их в аквариумную систему.
    10. Переложите молоко в подготовленную трубку с предварительно нагретым активирующим раствором и пипеткой вверх и вниз несколько раз путем всасывания и продувания на аспираторную трубку в сборе.
    11. Гомогенизируйте разбавленную сперму осторожно, щелкнув трубками перед анализом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов анализируйте образцы сразу (например, через 5 с) после активации. При медаке анализ может быть отложен, если это необходимо, так как сперматозоиды остаются подвижными в течение нескольких часов, но время должно оставаться последовательным между образцами, поскольку подвижность со временем уменьшается.
  2. Забор спермы путем рассечения яичек
    1. Приготовьте 0,08% раствор для эвтаназии, разбавляя две трубки с запасом трикаина (0,6%) в 26 мл аквариумной воды в стеклянной емкости объемом 100 мл.
    2. Подготовьте инструменты для рассечения, включая тупые и тонкие щипцы и небольшие рассекающие ножницы (рисунок 1E).
    3. Подготовьте пробирку для каждого образца со 120 мкл активирующего раствора для немедленного анализа. Разогрейте активирующий раствор на водяной бане или в инкубаторе, установив до 27 °C в течение не менее 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя образцы могут быть проанализированы из отдельных рыб, индивидуальные вариации могут быть уменьшены путем объединения образцов от нескольких самцов в одном и том же активирующем растворе. Для объединения образцов из нескольких рыб используйте 120 мкл активирующего раствора на рыбу. Это разведение, возможно, потребуется скорректировать в зависимости от деформации или условий выращивания используемой медаки, поскольку эти факторы могут влиять на концентрацию и объем сперматозоидов. Программа CASA укажет, не слишком ли высока концентрация для идентификации сперматозоидов.
    4. Усыпить рыбу, поместив ее в 0,08% раствор анестетика на 30-90 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность зависит от размера рыбы. Чтобы убедиться, что рыба усыплена, дождитесь прекращения движений оперкулума. Рыба не должна реагировать на прикосновение щипцов.
    5. Выньте рыбу из раствора для эвтаназии и аккуратно высушите рыбу бумажным полотенцем или аккуратно протрите.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе рыбу можно взвесить, чтобы впоследствии рассчитать гонадосоматический индекс (GSI, гонадная масса / масса тела).
    6. Поместите рыбу под рассекающий микроскоп левой боковой стороной вверх (рисунок 1F).
    7. Используя небольшие рассекающие ножницы, отрежьте лоскут дорсально от клоаки, а затем через ребра к жабрам, чтобы обнажить внутренние органы (рисунок 1G).
    8. Найдите яички, отрежьте насадку с обоих концов тонкими щипцами и удалите яички (рисунок 1H).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для расчета GSI яички можно взвесить на этом этапе. Работайте быстро, чтобы избежать пересыхания тканей.
    9. Переложите яички в подготовленную пробирку с предварительно нагретым активирующим раствором.
    10. Используйте щипцы, чтобы раздавить яички несколько раз о сторону трубки, чтобы выпустить сперму. Высвобождение сперматозоидов обычно можно визуализировать и сделать раствор немного мутным.
    11. Гомогенизируйте разбавленную сперму осторожно, щелкнув трубками перед анализом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов анализируйте образцы сразу (например, через 5 с) после активации. При медаке анализ может быть отложен, если это необходимо, так как сперматозоиды остаются подвижными в течение нескольких часов, но время должно оставаться последовательным между образцами, поскольку подвижность со временем уменьшается.

Figure 1
Рисунок 1: Сбор milt методом массажа живота (A-D) и рассечения яичек (E-H). (A) Инструменты для массажа живота: удерживающие губки, тупые гладкие щипцы и 10 мкл одноразовая калиброванная стеклянная микропипетка с аспираторной трубкой в сборе; (B) Положение рыбы в держащей губке, с жабрами, подвергшимися анестезии в губке, и клоакой, обращенной вверх; (C) Положение тупых гладких щипцов на брюшной полости и микропипетке на фоне клоаки; (D) Молочница в микропипетке после нежного массажа и сосания. (E) Инструменты для рассечения яичек: тупые щипцы, тонкие щипцы и небольшие рассекающие ножницы; F) положение рыбы для рассечения яичек; G) боковой вид внутренних органов; H) Удалите яички, разрезав крепление с обоих концов тонкими щипцами. Шкала: 2 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Анализ спермы с помощью системы CASA

  1. Система CASA (SCA Evolution) должна быть настроена в соответствии с руководством с помощью микроскопа с использованием зеленого фильтра и 10-кратного объектива с фазовым контрастом.
  2. Подготовьте одноразовые слайды счетной камеры 20 мкм путем предварительного нагрева на нагревательной пластине или в инкубаторе, установленном на 27 °C в течение не менее 5 минут.
  3. Откройте программное обеспечение для анализа спермы и выберите модуль подвижности.
  4. Задайте конфигурацию для medaka, как показано на рисунке 2B.
  5. Поместите предварительно расплавленный одноразовый предмет 20 мкм счетной камеры под микроскоп на нагретой сцене, установленной на 27 °C.
  6. Пипетка образца в камеру на слайде до тех пор, пока он не заполнит камеру без переполнения. Тщательно вытрите лишние образцы со входа в камеру хлопковым наконечником или аккуратно протрите, чтобы предотвратить плавающие клетки.
  7. Выберите Анализ , чтобы посмотреть на образец под микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если значок микроскопа красный, освещение микроскопа должно быть отрегулировано, чтобы программа точно отслеживала сперму. Отрегулируйте яркость микроскопа, чтобы движение хвоста сперматозоида было хорошо видно. Значок должен быть синего цвета.
  8. Убедитесь, что микроскоп сфокусирован, и снова выберите «Проанализировать », чтобы записать сперму в поле. Переместите слайд так, чтобы новая область образца оказалась в кадре, и повторите для захвата для 3-5 различных полей зрения. Избегайте полей с пузырьками воздуха, клеточными массами или артефактами.
  9. Выберите Результаты, чтобы просмотреть результаты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если поля на странице результатов выделены красным цветом, следуйте подсказкам системы, чтобы удалить поля, которые слишком сильно различаются по концентрации или подвижности.
  10. Дважды щелкните по полю, чтобы просмотреть результаты для отдельного поля или вручную проверить наличие неправильно маркированных или неотслеженных сперматозоидов. Щелкните правой кнопкой мыши на отдельных сперматозоидах, чтобы при необходимости перемаркировать подвижность (рисунок 2A).

Figure 2
Рисунок 2: Скриншот программного обеспечения SCA Evolution. (A) Результаты отслеживания сперматозоидов для одного поля. Просмотр данных поля с правой стороны и двойной щелчок сперматозоидов для просмотра отдельных данных; (B) Сводка результатов для всех полей с открытым меню конфигурации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Тип полученных данных
Анализ подвижности сперматозоидов с помощью программного обеспечения SCA Evolution предоставляет данные о подвижности (процент подвижных и неподвижных сперматозоидов), а также о прогрессивности (процент прогрессивных и непрогрессирующих сперматозоидов) и скорости (процент быстрых, средних и медленно движущихся сперматозоидов). Он также сочетает в себе прогрессивность и скорость (быстрый прогрессивный, среднепрогрессивный, непрогрессивный). Эти метки основаны на измерениях (фиг.3А) и расчетах (рис.уре 3В) движения сперматозоидов, которые предусмотрены программой (Дополнительная таблица 1). Для медаки следующие пороговые значения были адаптированы из рекомендуемых параметров рыбок данио, основанных на предыдущей литературе 19,34,35 и распределении данных медаки от 18 особей. Подвижность основана на криволинейной скорости (VCL) с иммотилевым < 10 мкм/с ≤ медленной < 20 мкм/с ≤ средней ≤ 40 мкм/с < быстрой. Сперматозоиды считаются прогрессивными, если индекс прямолинейности (STR) составляет > 68%.

SCA Evolution также рассчитывает концентрацию сперматозоидов, если предусмотрен объем образца и разбавление. В то время как метод массажа живота полезен для визуализации окраски и подтверждения присутствия молока, собранный объем слишком мал, чтобы его можно было точно измерить. Если объем молока улучшается условиями выращивания или с использованием другой деформации и может быть измерен, то программа может быть использована для расчета концентрации. Однако относительная концентрация также может быть рассчитана для сравнения рыб или групп обработки для образцов, взятых путем рассечения яичек, при условии, что все яичко рассечено и разбавлено в том же объеме жидкости.

Figure 3
Рисунок 3: Анализ движения сперматозоидов. (A) Данные, записанные системой CASA, включают криволинейную скорость (VCL, скорость, рассчитанную с использованием расстояния по фактическому пути), среднюю скорость пути (VAP, скорость, рассчитанную с использованием расстояния среднего пути), скорость прямой линии (VSL, скорость, рассчитанная с использованием расстояния между началом и концом сперматозоидного трека), амплитуда смещения боковой головки (ALH, величина бокового смещения головки сперматозоида относительно его среднего пути), частота биения поперечного (BCF, скорость, с которой криволинейный путь пересекает средний путь); (B) Вычисляемые значения из системы CASA включают индекс прямолинейности (STR, линейность среднего пути), индекс линейности (LIN, линейность криволинейного пути) и колебание (WOB, колебание фактического пути относительно среднего пути). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Оценка подвижности сперматозоидов: различные активирующие растворы
Удивительно, но сперма, отобранная как абдоминальным массажем, так и рассечением яичек, была бессмертной в аквариумной воде (16 мОсмоль/кг) (Рисунок 4А) и в аквариумной воде, скорректированной раствором NaCl до 34 мОсмоль/кг. Также отсутствовала подвижность в деионизированной воде (-1 мОсмол/кг) или деионизированной воде, доведенной до 23 мОсмоль/кг. Сперматозоиды были подвижными в HBSS (287 мОсмоль/кг) (Рисунок 4B), а также в HBSS, разбавленном деионизированной водой до 36 мОсмоль/кг и 113 мОсмоль/кг, хотя процент подвижности был значительно снижен при 36 мОсмол/кг (Рисунок 4C).

Figure 4
Рисунок 4: Подвижность по осмоляльности активирующего раствора. Сперма, отобранная путем рассечения яичек в (А) аквариумной воде (16 мОсмоль/кг) и (В) нескорректированной HBSS (287 мОсмол/кг). Желтыми кругами метки бессмертных сперматозоидов и цветные линии указывают на движение сперматозоидов: красный (быстрый прогрессирующий), зеленый (среднепрогрессивный), синий (непрогрессивный). Шкала: 100 мкм. (C)Подвижность сперматозоидов, активируемая HBSS при 36, 113 и 287 мОсмол/кгH2O. Для 36 и 113 n = 4 с двумя рыбами, объединенными на образец. Для 287 n = 9 с двумя рыбами, объединенными в одну пробу. Статистический анализ проводился с использованием ANOVA с пост-специальным тестом Tukey, и существенные различия обозначены разными буквами. Данные представлены как среднее ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Методы отбора проб: массаж живота в сравнении с рассечением яичек
Сперма, отобранная путем рассечения яичек, значительно более подвижна по сравнению с образцами абдоминального массажа той же рыбы (рисунок 5А). Из подвижных сперматозоидов более высокий процент также являются прогрессивными и средне- или быстро движущимися. В сперме, отобранной с помощью абдоминального массажа, более подвижные сперматозоиды являются медленно движущимися и непрогрессивными (рисунок 5B-C). Однако различные результаты могут быть получены при использовании другого штамма медака (CAB) или альтернативных условий выращивания (Дополнительная таблица 2).

Figure 5
Рисунок 5: Массаж живота в сравнении с рассечением яичек. Процент (А) бессмертной и подвижной спермы, отобранной путем абдоминального массажа или рассечения яичек. Процент подвижных сперматозоидов, которые являются (B) непрогрессивными и прогрессивными сперматозоидами и (C) медленными, средними и быстро движущимися. Все образцы спермы были активированы в HBSS (287 мОсмол/кгH2O). Статистический анализ проводился с использованием теста Манна-Уитни U, и значительные различия обозначены звездочками. Данные представлены как среднее ± SEM, n = 9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Продолжительность подвижности в зависимости от условий хранения
Сперма, отобранная путем рассечения яичек и поддерживаемая при 27 °C, имела 50% снижение подвижности в первые 30 мин после активации. Через 2,5 ч менее 5% сперматозоидов были подвижными. При хранении при 4 °C подвижность снижалась только на 14% в первые 30 мин, и потребовалось 5 ч, чтобы увидеть снижение на 50% от первоначальной подвижности. Лед имел аналогичный расширяющий эффект, но был менее эффективным, со снижением подвижности на 26% в первые 30 мин (рисунок 6A). Прогрессивность также упала на 52% в первые 30 минут на льду, по сравнению с 65% при 27 °C и 33% при 4 °C (рисунок 6B). Как на льду, так и при 4 °C некоторые сперматозоиды (<3%) все еще двигались через 42 ч после активации.

Figure 6
Рисунок 6: Долговечность сперматозоидов в зависимости от условий хранения. Процент (A) подвижности и (B) прогрессивность с течением времени для образцов, активированных с HBSS (287 мОсмоль/кг H2O) и хранящихся при 27 °C, 4 °C или на льду. Точки данных являются средними ± SEM, n = ≥4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Важность экологических и жилищных условий
Самцы, размещенные совместно с самками, были отобраны путем вскрытия яичек утром, прежде чем у них появилась возможность нереститься (до включения света) или после включения света и у самок в аквариуме были яйца. Существенной разницы в подвижности сперматозоидов не было. Самцы, размещенные без самок в течение месяца, также были отобраны, и, хотя наблюдалась тенденция к более высокой моторике, разница также не была значительной (рисунок 7).

Однако, когда штамм CAB medaka выращивали в другом учреждении с самцами, отделенными от самок в течение по крайней мере одного месяца, рыба была крупнее, и 5-7 мкл милта собирали с помощью абдоминального массажа. Образцы, собранные у пяти рыб методом абдоминального массажа, имели моторику 68,34% при активации 300 мОсмол/кг HBSS. При содержании в тех же условиях, но с самками, объем собранного молока составлял около 2 мкл, а средняя подвижность составляла 46,2% у трех самцов (дополнительная таблица 2).

Figure 7
Рисунок 7. Влияние условий окружающей среды на подвижность сперматозоидов. Процент подвижности сперматозоидов, отобранных до (n = 5) и после (n = 4) нереста от самцов, которые были размещены совместно с самками, и спермы от самцов, размещенных без самок (n = 6). Все образцы были отобраны путем рассечения яичек и активированы HBSS (287 мОсмол/кг H2O). Статистический анализ проводился с использованием т-тестов, и различия не были существенными. Данные показаны как средние ± SEM с кругами, представляющими отдельных рыб. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительная таблица 1: Расчеты средней скорости и движения сперматозоидов, отобранных с помощью массажа брюшной полости и рассечения яичек (n = 9). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 2: Данные анализа спермы штамма CAB (также называемого Carbio) медаки, выращенной в INRAE в Ренне, Франция. Все образцы были активированы в 300 мОсмол/кг HBSS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Осмоляльность является важным фактором активации сперматозоидов рыб36,37. Как правило, сперматозоиды являются бессодержательными в яичках и становятся подвижными в средах, которые являются гиперосмотическими относительно семенной жидкости для морских рыб и гипоосмотическими относительно семенной жидкости для пресноводных рыб37. Подобно крови, семенная плазма у пресноводных рыб обычно ниже, чем у морских рыб (около 300 мОсмоль/кг по сравнению с 400 мОсмоль/кг)22,37. Таким образом, сперматозоиды рыб обычно активируются при контакте с водой, в которой они живут, и эта вода служит лучшей и наиболее биологической активирующей средой для анализа спермы. Тем не менее, сперматозоиды медаки, отобранные с помощью абдоминального массажа и рассечения яичек, не были подвижными в аквариумной воде (рисунок 4A) в Штамме медака Hd-rR или CAB, выращенном в двух разных лабораториях. Кроме того, подвижность была выше в 287 мОсмоль/кг HBSS, чем в 36 мОсмоль/кг HBSS (Рисунок 4C), что необычно для пресноводной рыбы.

Большинство предыдущих исследований, включающих анализ спермы в медаке, использовали HBSS 28,29,38 или раствор Ямамото18,19 в качестве активирующих сред для спермы медака без обсуждения осмоляльности. В то время как HBSS является хорошей активирующей средой для сперматозоидов медака, изменение осмоляльности может повлиять на подвижность. Поэтому для исследований анализа спермы важно раскрыть осмоляльность их активирующего раствора для сравнения между экспериментами. Одно исследование, изучающее идеальную осмоляльность активирующей среды, показало, что сперматозоиды медака подвижны в деионизированной воде (25 мОсмоль/кг) и HBSS со значениями осмоляльности < 686 мОсмол/кг, с самой высокой подвижностью от 25 до 227 мОсмоль/кг17. Однако в текущем исследовании сперматозоиды также не были подвижными в деионизированной воде. Как эвригалинная рыба, медака очень приспосабливается к различным средам и может даже жить и размножаться в соленой воде39, поэтому возможно, что разные условия выращивания ответственны за это несоответствие. Интересно, что ни в одном другом исследовании не сообщалось о тестировании подвижности сперматозоидов медака в аквариумной воде (или подобной, такой как старая водопроводная вода), хотя это стандартная среда активации сперматозоидов для пресноводных рыб.

Одним из возможных объяснений этой атипичной активации сперматозоидов в медаке является взаимодействие с яичниковой жидкостью. В то время как сперматозоиды рыб обычно активируются в окружающей воде, яичниковая жидкость увеличивает или увеличивает продолжительность подвижности сперматозоидов у многих видов40,41. Хотя медаки внешне удобряют пресноводных рыб, их нерестовое поведение, которое включает в себя обертывание плавников и дрожание, ставит их в гораздо более близкую близость, чем транслируемые нерестовики23. Поскольку осмоляльность яичниковой жидкости у пресноводных рыб (около 300 мОсмоль/кг) близка к HBSS40, возможно, что жидкость, выделяемая самкой, активирует сперму, а не аквариумную воду. Поскольку осмоляльность семенной и яичниковой плазмы сходна, возможно, что ионный состав медака яичниковой жидкости играет важную роль40,42. Роль яичниковой жидкости и ионов в активации сперматозоидов медака требует дальнейшего изучения.

В предыдущих исследованиях сперматозоиды медака собирали только путем дробления рассеченных яичек 17,28,29,30 или массажа живота для экспрессии молока непосредственно в активирующую среду 18,19,20; Ни в одном исследовании не сообщалось о данных о сперме, собранной путем абдоминального массажа в капиллярную трубку, хотя это обычная практика у рыб данио и других телеостных рыб 33,43,44. Этот метод возможен и в медаке. Milt легко визуализируется в капиллярной трубке, и хотя объем слишком мал, чтобы его можно было точно измерить, этот метод позволяет подтвердить успешный сбор и анализ цвета как быстрого показателя качества32. Избежать фекального загрязнения также легче при сборе в капиллярной трубке по сравнению с средой. Хотя образцы спермы, собранные путем рассечения яичек, имеют лучшую подвижность в медаке, чем образцы, собранные абдоминальным массажем (рисунок 5), и, таким образом, предпочтительны для экспериментов, в которых рыба может быть принесена в жертву, абдоминальный массаж является минимально инвазивной процедурой, которая не требует эвтаназии и может быть повторена у одной и той же рыбы. Поэтому он полезен для экспериментов, которые следуют за одной и той же рыбой с течением времени. Кроме того, образцы, собранные с помощью абдоминального массажа, содержат только зрелые клетки, высвобождаемые семенной плазмой44, в то время как образцы из рассечения яичек могут включать незрелые сперматозоиды и другой мусор. Система CASA дисконтирует круглые ячейки и мусор, превышающие максимальную площадь, но если этот параметр установлен слишком высоко, результаты подвижности могут быть затронуты.

Из-за низкого количества спермы, собранной с помощью техники абдоминального массажа в этих медаках, было невозможно точно измерить объем сперматозоидов в капилляре и, таким образом, рассчитать концентрацию сперматозоидов, используя регулярные подходы. Однако для образцов, взятых путем рассечения яичек, путем поддержания постоянного объема активационной среды и взвешивания яичек, относительная концентрация может быть рассчитана на основе концентрации сперматозоидов, заданной системой CASA для сравнения между отдельными лицами или группами лечения. Помимо анализа качества, относительная концентрация также полезна для определения оптимального разбавления образцов для криоконсервации. Если объем, собранный массажем живота, улучшается условиями выращивания или с использованием другого штамма, объем может быть рассчитан путем измерения высоты молока в капиллярной трубке и введен в программу для расчета концентрации. В этих случаях, когда может быть получено несколько микролитров, моторика может быть выше при массаже живота, чем рассечение яичек (Дополнительная таблица 2). При сборе небольших объемов образцы более подвержены загрязнению, что может повлиять на подвижность, хотя эти эффекты кажутся последовательными, когда объемы аналогичны, поэтому сравнения все еще могут проводиться между группами обработки. Однако не следует проводить сравнения между образцами, которые сильно различаются по объему или окраске молока.

Малый объем молока, получаемого из медака с помощью массажа живота, может быть ограничением для экспериментов, требующих большого объема милта. В таких случаях рассечение яичек может быть предпочтительным, как показано в исследовании, которое собирало милт от рыбок данио и зеленого меченосца как путем рассечения, так и массажа, но только путем рассечения в медаке из-за низкого объема30. Рассечение яичек, как правило, лучше для сравнения с другими видами по той же причине. Ограниченный объем массажа живота по сравнению с другими рыбами аналогичного размера может быть обусловлен меньшим количеством яичек (1,9 ± 0,6 мг в медаке по сравнению с 7,0 ± 2,5 мг у рыбок данио45) и меньшим количеством сперматозоидов (2,0 ± 0,4 х 106 сперматозоидов / мг яичек в медаке по сравнению с 7,7 ± 2,0 х 106 сперматозоидов / мг яичек у рыбок данио46), или к другим неизвестным биологическим факторам, которые ограничивают технику, как это предлагается в инкубатории африканского сома47. Разница может быть физиологической, в зависимости от штамма или условий окружающей среды, или анатомической, так как в отличие от рыбок данио, яички медака слиты и расположены более медиально, и поэтому могут быть труднее доступны при массаже живота, хотя есть и другие рыбы со сросшимися яичками.

Для некоторых видов, таких как рыбки данио, лучше всего брать сперму до того, как у рыбы будет шанс нереститься утром48 или изолировать самцов в отдельных аквариумах накануне вечером, чтобы предотвратить нерест32. При применении Hd-rR medaka из этого исследования условия окружающей среды, такие как сроки отбора проб (до или после нереста) и условия содержания (с самками или без них в течение 1 месяца), не оказывали существенного влияния на подвижность сперматозоидов (рисунок 7). Возможно, что больший размер выборки или изоляция самцов от самок в течение более длительного периода времени может привести к более высокому количеству сперматозоидов и / или подвижности. В штамме CAB medaka из другого учреждения аналогичная тенденция наблюдалась с лучшим качеством и объемом спермы от самцов, размещенных в одиночку, по сравнению с самцами, содержащими самок (слишком мало рыб было протестировано, чтобы сделать статистические выводы). С этими рыбами также можно было собирать относительно большие объемы милта путем абдоминального массажа (дополнительная таблица 2), хотя очень небольшие объемы милта были получены с использованием штамма Hd-rR medaka, а другие сообщали о небольших объемах также с помощью той же техники в штамме CAB medaka30. Однако связаны ли эти различия с штаммом (который является коммерческим штаммом, а не инбредным) или с различиями в выращивании (их много между объектами), остается неясным. В этих рыбах может быть собрано несколько микролитров милта, что ограничивает загрязнение и улучшает качество. Но для экспериментов, в которых важно сожительствовать обоим полам, нет необходимости разделять их, чтобы дать результаты. Также нет необходимости отбирать самцов за один раз до нереста.

Хотя необходимы дальнейшие исследования, чтобы точно определить, как сперматозоиды медака отличаются в зависимости от популяционных и экологических факторов, деформация и условия выращивания, тем не менее, должны учитываться при разработке экспериментальной установки, и следует соблюдать осторожность при сравнении между популяциями, которые производят различное количество сперматозоидов. Если получены большие объемы милта, следует регулировать разбавление активирующего раствора (например, 1:60, хотя предпочтительная концентрация может варьироваться в зависимости от системы CASA). Аналогичным образом, если рассеченные яички намного больше, чем типичные (2 мг) из-за деформации или условий выращивания, разбавление необходимо будет увеличить, чтобы программа CASA могла точно маркировать все сперматозоиды.

Методы анализа спермы широко варьируются для медаки и часто субъективны, что затрудняет сравнение результатов между исследованиями. Исследование, сравнивающее субъективные и объективные методы, используемые техническими специалистами с различным уровнем знаний, показало, что высококвалифицированные технические специалисты могут оценить подвижность сперматозоидов рыб в пределах 10 процентных пунктов от данных, предоставляемых программой подвижности CASA, в то время как техники со средним и низким опытом переоценивают значения подвижности CASA с амплитудами до 30 процентных пунктов21 . Однако отсутствие стандартизации параметров, определяющих подвижность в медаке, также может вызвать различия между теми, кто использует более объективные методы. Например, одно исследование, которое регистрировало сперматозоиды со скоростью 33 кадра в секунду (fps), анализировало 30 кадров и считало, что сперматозоиды движутся быстрее, чем 2 мкм / с подвижными, имели среднюю скорость около 60 мкм / с и подвижность около 70% для их контрольной рыбы18. Другое исследование с использованием того же протокола имело среднюю скорость 40 мкм / с для контрольной спермы и процент подвижности более 80% 19. Другая группа, которая проанализировала 200 кадров при 47 кадрах в секунду, имела средний VCL более 100 мкм / с для контрольной рыбы, но среднюю подвижность ниже 50%. Они не раскрыли, какие параметры определяли подвижность. Таким образом, в этом протоколе компьютерное программное обеспечение для анализа спермы используется для объективного, быстрого и надежного анализа спермы на основе набора параметров, которые были настроены для характеристик сперматозоидов медака. Поскольку крайне важно, чтобы параметры подвижности были согласованы для сравнения между лабораториями, доступна полная конфигурация, используемая в этом исследовании (рисунок 2B), поэтому этот протокол может быть надежно воспроизведен в другой лаборатории различными исследователями.

Рыбы Teleost демонстрируют большое разнообразие характеристик сперматозоидов, поэтому, хотя этот протокол был первоначально протестирован с использованием рекомендуемых параметров рыбок данио для программного обеспечения SCA Evolution, было очевидно, что параметры необходимо будет скорректировать для сперматозоидов медака с более низкой скоростью и большей продолжительностью жизни. Так, параметры рыбок данио были адаптированы к медаке с использованием литературы от медаки и других видов, которые сообщили о сходных характеристиках сперматозоидов 19,34,35 и выбрали пороговые значения, которые наилучшим образом соответствуют распределению 17 580 проанализированных следов сперматозоидов от 18 особей. Подвижность основана на криволинейной скорости (VCL) с иммотилевым < 10 мкм/с ≤ медленной < 20 мкм/с ≤ средней ≤ 40 мкм/с < быстрой. Сперматозоиды считаются прогрессивными, если индекс прямолинейности (STR) составляет > 68%. Порог, определяющий подвижность, поддерживался на уровне 10 мкм/с, а не 2 мкм/с, как это используется в некоторых литературных источниках18,19, так как многие сперматозоиды, лишенные жгутикового движения, были ошибочно помечены как подвижные с этой установкой. Другие виды рыб с головками сперматозоидов аналогичного размера (~ 2 мкм) также использовали 10 мкм / с для определения подвижной спермы35,43. Максимальная площадь была уменьшена с 90 мкм2 до20 мкм2, поэтому крупные клеточные обломки от рассечения яичек будут игнорироваться.

Продолжительность моторики, по-видимому, зависит от количества АТФ, хранящегося до активации, поскольку жгутиковое движение требует быстрого расхода энергии. Вероятно, из-за этого быстрого истощения существует корреляция между высокой начальной скоростью сперматозоидов и более короткой продолжительностью подвижности49. Хотя осмотический шок обычно требуется для активации сперматозоидов рыб, он также может привести к повреждению мембраны в период подвижности, что также может повлиять на продолжительность жизни. Этот эффект более критичен у пресноводных видов49, что может объяснить, почему морские сперматозоиды способны к более длительной подвижности (в среднем около 550 с по сравнению с примерно 150 с для пресноводных видов), несмотря на то, что они демонстрируют аналогичную среднюю скорость и подвижность, как пресноводные сперматозоиды14,22. Продолжительность моторики более 30 мин не распространена, но она была зарегистрирована у нескольких морских видов22,49. Несмотря на то, что это пресноводная рыба, результаты с медакой соответствуют профилю сперматозоидов, которые имеют более низкую скорость и большую продолжительность от морских видов. Это может быть связано с активацией в среде, похожей на семенную плазму - без осмотического шока сперматозоиды медака, вероятно, не страдают от повреждения мембраны, как другие пресноводные рыбы.

Неактивирующий раствор и очень быстрый, последовательно синхронизированный анализ после активации часто необходимы для анализа сперматозоидов, которые подвижны только в течение нескольких минут. Тем не менее, подвижность сперматозоидов медака естественным образом длится несколько часов, и более высокая подвижность может быть сохранена путем хранения при 4 ° C или на льду (рисунок 6). Таким образом, для экспериментов, в которых немедленный анализ невозможен, протокол может быть изменен таким образом, чтобы, например, яички хранились в активирующем растворе на льду в течение часа, пока регистрируется время сбора, чтобы анализ мог оставаться последовательным. Однако для достижения оптимальных результатов немедленный анализ по-прежнему является лучшим вариантом. В то время как подвижность все еще снижается, потому что она является постепенной, на результаты меньше влияют незначительные различия во времени анализа после активации. Тем не менее, важно сообщать как о температуре хранения образцов, так и о времени анализа после активации, чтобы данные можно было сравнивать и воспроизводить.

Также, как правило, очень важно у рыб избегать загрязнения молока мочой во время отбора проб, так как это может изменить осмоляльность и преждевременно активировать сперму16,50. Тем не менее, это меньше беспокоит в медаке (из-за большей продолжительности моторики) и с этим протоколом, так как образец помещается в среду активации немедленно. Низкие объемы молока подвержены загрязнению мочи, поэтому можно ожидать некоторого обесцвечивания при массаже живота от медаки при получении небольших объемов. Однако, если это согласуется в популяции, то все еще могут быть проведены сравнения между группами лечения. Следует соблюдать осторожность при сравнении популяций медака, которые различаются по объему или окраске молока.

Поскольку результаты анализа спермы очень зависят от используемых методов, полезны подробные и надежные методы, которые можно легко повторить в разных лабораториях. Также важно, чтобы документы раскрывали подробности об их методах, чтобы обеспечить повторяемость. Поскольку медака все чаще используется в качестве модели для исследований репродукции, объем информации об оценке качества спермы отсутствует. Два различных метода, описанных в этой статье для отбора проб спермы, могут быть полезны для различных экспериментов. Рассечение яичек обычно дает более высокую подвижность сперматозоидов и позволяет рассчитать относительную концентрацию, в то время как массаж живота может быть выполнен многократно на одной и той же рыбе и является более чистым, биологическим представлением нерестового события. Таким образом, эта рукопись предоставляет параметры для CASA, который является надежным, объективным методом, который предоставляет достаточные данные о движении сперматозоидов, включая подвижность, прогрессивность, скорость и другие кинематические параметры. Таким образом, эти протоколы будут полезны для различных исследований в области медаки, включая токсикологию, экологию, размножение и физиологию.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была профинансирована Норвежским университетом естественных наук и американской программой Фулбрайта. Авторы хотели бы поблагодарить Энтони Пелтье и Лурдес Карреон Г Тан в NMBU за обслуживание рыбного хозяйства и Гийома Гурмелина из ISC LPGP в INRAE (Франция) за предоставление рыбы и лабораторных помещений для дальнейшего тестирования этих методов.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL tubes Axygen MCT-150-C Any standard brand can be used
10 µL disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assembly Drummond 2-000-010
10x objective with phase contrast Nikon MRP90100
2 mL tubes Axygen MCT-200-c-s Any standard brand can be used
Blunt forceps Fine Science Tools 11000-12
Blunt smooth forceps Millipore XX6200006P
Disposable 20 micron counting chamber slide Microptic 20.2.25  Leja 2 chamber slides
Dissecting microscope Olympus SZX7 Any standard brand can be used
Fine forceps Fine Science Tools 11253-20
HBSS Sigmaaldrich H8264-1L
Holding sponge self-made
Inverted microscope Nikon Eclipse Ts2R
SCA Evolution Microptic
Small dissecting scissors Fine Science Tools 14090-09
Sodium Chloride (NaCl) Sigmaaldrich S9888
Tabletop vortex Labnet C1301B
Tricaine Sigmaaldrich A5040

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shima, A., Mitani, H. Medaka as a research organism: past, present and future. Mechanisms of Development. 121 (7-8), 599-604 (2004).
  2. Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka - a model organism from the far east. Nature Reviews Genetics. 3 (1), 53-64 (2001).
  3. Kasahara, M., et al. The medaka draft genome and insights into vertebrate genome evolution. Nature. 447 (7145), 714-719 (2007).
  4. Matsuda, M., et al. DMY is a Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish. Nature. 417 (6888), 559-563 (2002).
  5. Sakamoto, T., Kozaka, T., Takahashi, A., Kawauchi, H., Ando, M. Medaka (Oryzias latipes) as a model for hypoosmoregulation of euryhaline fishes. Aquaculture. 193 (3-4), 347-354 (2001).
  6. Royan, M. R., et al. 3D atlas of the pituitary gland of the model fish medaka (Oryzias latipes). Frontiers in Endocrinology. 12, 719843 (2021).
  7. Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy brain-pituitary slices for electrophysiological investigations of pituitary cells in teleost fish. Journal of Visualized Experiments. (138), e57790 (2018).
  8. Fontaine, R., Weltzien, F. -A. Labeling of blood vessels in the teleost brain and pituitary using cardiac perfusion with a dii-fixative. Journal of Visualized Experiments. (148), e59768 (2019).
  9. Ager-Wick, E., et al. Preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
  10. Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. Journal of Visualized Experiments. (46), e1937 (2010).
  11. Wiley-Blackwell. Medaka: Biology, Management, and Experimental Protocols. , Wiley-Blackwell. (2019).
  12. Royan, M. R., et al. Gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (Oryzias latipes). Journal of Visualized Experiments. (166), e62006 (2020).
  13. Bhat, I. A., et al. Testicular development and spermatogenesis in fish: insights into molecular aspects and regulation of gene expression by different exogenous factors. Reviews in Aquaculture. 13 (4), 2142-2168 (2021).
  14. vander Horst, G., Garcia Alvarez, O., Garde, J. J., Soler, A. J., Jones, D. Status of sperm functionality assessment in wildlife species: From fish to primates. Animals. 11 (6), 1491 (2021).
  15. Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 130 (4), 425-433 (2001).
  16. Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234 (1-4), 1-28 (2004).
  17. Yang, H., Tiersch, T. R. Sperm motility initiation and duration in a euryhaline fish, medaka (Oryzias latipes). Theriogenology. 72 (3), 386-392 (2009).
  18. Hashimoto, S., et al. Effects of ethinylestradiol on medaka (Oryzias latipes) as measured by sperm motility and fertilization success. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 56 (2), 253-259 (2009).
  19. Hara, Y., Strüssmann, C. A., Hashimoto, S. Assessment of short-term exposure to nonylphenol in Japanese medaka using sperm velocity and frequency of motile sperm. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 53 (3), 406-410 (2007).
  20. Kawana, R., Strüssmann, C. A., Hashimoto, S. Effect of p-Nonylphenol on sperm motility in Japanese medaka (Oryzias latipes). Fish Physiology and Biochemistry. 28, 213-214 (2003).
  21. Gallego, V., Herranz-Jusdado, J. G., Rozenfeld, C., Pérez, L., Asturiano, J. F. Subjective and objective assessment of fish sperm motility: when the technique and technicians matter. Fish Physiology and Biochemistry. 44 (6), 1457-1467 (2018).
  22. Browne, R. K., et al. Sperm motility of externally fertilizing fish and amphibians. Theriogenology. 83 (1), 1-13 (2015).
  23. Arias Padilla, L. F., et al. Cystic proliferation of germline stem cells is necessary to reproductive success and normal mating behavior in medaka. eLife. 10, 62757 (2021).
  24. Okuyama, T., Yokoi, S., Takeuchi, H. Molecular basis of social competence in medaka fish. Development, Growth, and Differentiation. 59 (4), 211-218 (2017).
  25. Okubo, K., et al. Forebrain Gonadotropin-releasing hormone neuronal development: Insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome. Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).
  26. Hodne, K., Fontaine, R., Ager-Wick, E., Weltzien, F. A. Gnrh1-induced responses are indirect in female Medaka Fsh cells, generated through cellular networks. Endocrinology. 160 (12), 3018-3032 (2019).
  27. Karigo, T., et al. Whole brain-pituitary in vitro preparation of the transgenic Medaka (Oryzias latipes) as a tool for analyzing the differential regulatory mechanisms of LH and FSH release. Endocrinology. 155 (2), 536-547 (2014).
  28. Kowalska, A., Kowalski, R., Zakęś, Z. The effect of selective cyclooxygenase (COX) inhibitors on japanese medaka (Oryzias latipes) reproduction parameters. World Academy of Science, Engineering and Technology. 77, 19-23 (2011).
  29. Kowalska, A., Siwicki, A. K., Kowalski, R. K. Dietary resveratrol improves immunity but reduces reproduction of broodstock medaka Oryzias latipes (Temminck & Schlegel). Fish Physiology and Biochemistry. 43 (1), 27-37 (2007).
  30. Tan, E., Yang, H., Tiersch, T. R. Determination of sperm concentration for small-bodied biomedical model fishes by use of microspectrophotometry. Zebrafish. 7 (2), 233-240 (2010).
  31. Harvey, B., Kelley, R. N., Ashwood-Smith, M. J. Cryopreservation of zebra fish spermatozoa using methanol. Canadian Journal of Zoology. 60 (8), 1867-1870 (1982).
  32. Wasden, M. B., Roberts, R. L., DeLaurier, A. Optimizing sperm collection procedures in Zebrafish. Journal of the South Carolina Academy of Science. 15 (2), 7 (2017).
  33. Draper, B. W., Moens, C. B. A High-throughput method for Zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments. (29), e1395 (2009).
  34. Castellini, C., Dal Bosco, A., Ruggeri, S., Collodel, G. What is the best frame rate for evaluation of sperm motility in different species by computer-assisted sperm analysis. Fertility and Sterility. 96 (1), 24-27 (2011).
  35. Acosta, I. B., et al. Effects of exposure to cadmium in sperm cells of zebrafish, Danio rerio. Toxicology Reports. 3, 696-700 (2016).
  36. Wilson-Leedy, J. G., Kanuga, M. K., Ingermann, R. L. Influence of osmolality and ions on the activation and characteristics of zebrafish sperm motility. Theriogenology. 71 (7), 1054-1062 (2009).
  37. Alavi, S. M. H., Cosson, J. Sperm motility in fishes. (II) Effects of ions and osmolality: A review. Cell Biology International. 30 (1), 1-14 (2006).
  38. Kowalska, A., Kamaszews ki, M., Czarnowska-Kujawska, M., Podlasz, P., Kowalski, R. K. Dietary ARA improves COX activity in broodstock and offspring survival fitness of a model organism (Medaka Oryzias latipes). Animals. 10 (11), 2174 (2020).
  39. Inoue, K., Takei, Y. Asian medaka fishes offer new models for studying mechanisms of seawater adaptation. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 136 (4), 635-645 (2003).
  40. Zadmajid, V., Myers, J. N., Sørensen, S. R., Ernest Butts, I. A. Ovarian fluid and its impacts on spermatozoa performance in fish: A review. Theriogenology. 132, 144-152 (2019).
  41. Poli, F., Immler, S., Gasparini, C. Effects of ovarian fluid on sperm traits and its implications for cryptic female choice in zebrafish. Behavioral Ecology. 30 (5), 1298-1305 (2019).
  42. Cosson, J., Groison, A. L., Suquet, M., Fauvel, C., Dreanno, C., Billard, R. Studying sperm motility in marine fish: An overview on the state of the art. Journal of Applied Ichthyology. 24 (4), 460-486 (2008).
  43. Beirão, J., Soares, F., Herráez, M. P., Dinis, M. T., Cabrita, E. Sperm quality evaluation in Solea senegalensis during the reproductive season at cellular level. Theriogenology. 72 (9), 1251-1261 (2009).
  44. Beirão, J., et al. Sperm handling in aquatic animals for artificial reproduction. Theriogenology. 133, 161-178 (2019).
  45. Yang, H., Tiersch, T. R. Current status of sperm cryopreservation in biomedical research fish models: Zebrafish, medaka, and Xiphophorus. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 149 (2), 224-232 (2009).
  46. Yang, H., Tiersch, T. R. Sperm cryopreservation in biomedical research fish models. Cryopreservation in Aquatic Species. 2, 439-454 (2011).
  47. Viveiros, A., Fessehaye, Y., ter Veld, M., Schulz, R., Komen, H. Hand-stripping of semen and semen quality after maturational hormone treatments, in African catfish Clarias gariepinus. Aquaculture. 213 (1-4), 373-386 (2002).
  48. Ransom, D. G., Zon, L. I. Appendix 3 collection, storage, and use of Zebrafish sperm. Methods in Cell Biology. 60, 365-372 (1998).
  49. Cosson, J. Frenetic activation of fish spermatozoa flagella entails short-term motility, portending their precocious decadence. Journal of Fish Biology. 76 (1), 240-279 (2010).
  50. Kowalski, R. K., Cejko, B. I. Sperm quality in fish: Determinants and affecting factors. Theriogenology. 135, 94-108 (2019).

Tags

Биология выпуск 188 гонады сперма молоко яичко медака рыба размножение casa
Сбор спермы и компьютерный анализ спермы в модели Teleost японская медака (<em>Oryzias latipes</em>)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Closs, L., Sayyari, A., Fontaine, R. … More

Closs, L., Sayyari, A., Fontaine, R. Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes). J. Vis. Exp. (188), e64326, doi:10.3791/64326 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter