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Biology

Recolección de espermatozoides y análisis de espermatozoides asistido por computadora en el modelo teleósteo japonés Medaka (Oryzias latipes)

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/64326
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Preclinical Sciences and Pathology, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences, 2Department of Production Animal Clinical Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences

Summary

Este artículo describe dos métodos rápidos y eficientes para recolectar esperma del pequeño pez modelo medaka (Oryzias latipes), así como un protocolo para evaluar de manera confiable la calidad del esperma utilizando el análisis de esperma asistido por computadora (CASA).

Abstract

La medaka japonesa (Oryzias latipes) es un pez teleósteos y un modelo emergente de vertebrados para la investigación en ecotoxicología, desarrollo, genética y fisiología. Medaka también se utiliza ampliamente para investigar la reproducción de vertebrados, que es una función biológica esencial, ya que permite que una especie se perpetúe. La calidad del esperma es un indicador importante de la fertilidad masculina y, por lo tanto, del éxito de la reproducción. Las técnicas para extraer espermatozoides y el análisis de espermatozoides están bien documentadas para muchas especies, incluido el pez teleósteo. La recolección de esperma es relativamente simple en peces más grandes, pero puede ser más complicada en peces modelo pequeños, ya que producen menos espermatozoides y son más delicados. Este artículo, por lo tanto, describe dos métodos de recolección de esperma en el pequeño pez modelo, la medaka japonesa: disección de testículos y masaje abdominal. Este documento demuestra que ambos enfoques son factibles para medaka y muestra que el masaje abdominal se puede realizar un número repetido de veces a medida que los peces se recuperan rápidamente del procedimiento. Este artículo también describe un protocolo para el análisis de espermatozoides asistido por computadora en medaka para evaluar objetivamente varios indicadores importantes de la calidad del esperma medaka (motilidad, progresividad, duración de la motilidad, concentración relativa). Estos procedimientos, especificados para este útil modelo de teleósteos pequeños, mejorarán en gran medida la comprensión de los factores ambientales, fisiológicos y genéticos que influyen en la fertilidad en los machos vertebrados.

Introduction

La medaka japonesa es un pequeño pez teleósteos de agua dulce nativo del este de Asia. Medaka se ha convertido en un excelente sistema modelo de vertebrados para ecotoxicología, genética del desarrollo, genómica y biología evolutiva y estudios de fisiología 1,2. Al igual que el popular pez cebra, son relativamente fáciles de criar y altamente resistentes a muchas enfermedades comunes de los peces 1,2. Hay varias ventajas de usar medaka como modelo, incluyendo un corto tiempo de generación, embriones transparentes 1,2 y un genoma secuenciado3. A diferencia del pez cebra, la medaka tieneun gen 4 determinante del sexo, así como una alta tolerancia a la temperatura (de 4-40 °C) y a la salinidad (especies eurihalinas)5. Además, muchas herramientas genéticas y anatómicas, así como los protocolos 6,7,8,9,10,11,12, se han desarrollado en medaka para facilitar el estudio de su biología.

La reproducción es una función fisiológica esencial, ya que permite que una especie se perpetúe. La reproducción de vertebrados requiere una miríada de eventos orquestados con precisión, incluida la producción de ovocitos en las hembras y la producción de esperma en los machos. Los espermatozoides son células únicas, producidas a través del complejo proceso de espermatogénesis, en el que existen una serie de puntos de control para garantizar la entrega de un producto de alta calidad13. La calidad de los gametos se ha convertido en un foco en la acuicultura y los estudios de poblaciones de peces debido a su impacto en el éxito de la fertilización y la supervivencia larval. La calidad del esperma es, por lo tanto, un indicador importante de la fertilidad masculina en vertebrados.

Tres factores útiles para evaluar la calidad del esperma de los peces son la motilidad, la progresividad y la longevidad. El porcentaje de motilidad y la motilidad progresiva son indicadores comunes de la calidad del esperma, ya que el movimiento progresivo es necesario y se correlaciona fuertemente con el éxito de la fertilización14,15. La duración del movimiento también es un indicador importante en los peces, ya que los espermatozoides permanecen completamente móviles durante menos de 2 minutos en la mayoría de las especies de teleósteos y la trayectoria de los espermatozoides es generalmente menos lineal que en los mamíferos15. Sin embargo, muchos estudios que evaluaron la motilidad de los espermatozoides en el pasado se basaron en métodos subjetivos o semicuantitativos para analizar los espermatozoides15,16. Por ejemplo, la motilidad de los espermatozoides en medaka ha sido estimada visualmente en el pasado bajo un microscopio17. También se ha estimado mediante el registro del movimiento de los espermatozoides y el uso de software de imágenes para fusionar marcos y medir la trayectoria y la velocidad de natación18,19,20. Tales abordajes muchas veces carecen de robustez, proporcionando resultados diferentes según la persona que realiza el análisis15,21.

El análisis de esperma asistido por computadora (CASA) se desarrolló inicialmente para mamíferos. CASA es un método cuantitativo rápido para evaluar la calidad del esperma mediante el registro y la medición de la velocidad y la trayectoria de manera automatizada15. En peces, se ha utilizado en diferentes especies para monitorear los efectos de varios contaminantes del agua en la calidad del esperma, para identificar progenitores interesantes para mejorar los reproductores, para mejorar la eficiencia de la criopreservación y almacenamiento, y para optimizar las condiciones para la fertilización15. Por lo tanto, es una herramienta poderosa para evaluar de manera confiable la calidad del esperma en diferentes especies de vertebrados. Sin embargo, debido a la importante diversidad en las estrategias reproductivas entre los peces, el esperma de los peces teleósteos difiere del de los mamíferos y de una especie de pez a otra. Los peces teleósteos, que fertilizan principalmente los huevos externamente liberando gametos en el agua, tienen espermatozoides altamente concentrados que son relativamente simples en estructura sin acrosoma, a diferencia de los mamíferos, que fertilizan internamente y, por lo tanto, no tienen que compensar la dilución en el agua, pero sí tienen que soportar fluidos más viscosos14. Además, los espermatozoides de la mayoría de los peces se mueven rápidamente, pero son completamente móviles durante menos de 2 minutos después de la activación, aunque hay varias excepciones15,22. Debido a que la motilidad puede disminuir rápidamente en la mayoría de los peces, se debe tener extremo cuidado con el momento del análisis después de la activación al determinar un protocolo de análisis de esperma para peces.

La reproducción es uno de los campos de la biología en los que los teleósteos y medaka se han utilizado ampliamente como organismos modelo. De hecho, los machos medaka muestran comportamientos reproductivos y sociales interesantes, como la protección de la pareja23,24. Además, existen varias líneas transgénicas para estudiar el control neuroendocrino de la reproducción en esta especie25,26,27. El muestreo de esperma, un procedimiento que es relativamente simple en peces más grandes, puede ser más complicado en peces modelo pequeños, ya que producen menos espermatozoides y son más delicados. Por esta razón, la mayoría de los estudios que involucran muestreo de espermatozoides en extracto de medaka (semen de pescado) mediante aplastamiento de testículos disecados 17,28,29,30. Algunos estudios también utilizan un masaje abdominal modificado para expresar la lecha directamente en el medio activador18,19,20; Sin embargo, con este método es difícil visualizar la cantidad y el color de la lecha extraída. En el pez cebra, el masaje abdominal se usa comúnmente para expresar la lecha, que se recoge inmediatamente en un tubo capilar31,32,33. Este método permite estimar el volumen de la leche, así como la observación del color de la eyaculación, que es un indicador rápido y simple de la calidad del esperma32,33. Por lo tanto, falta un protocolo claro y bien descrito para la recolección y análisis de espermatozoides para medaka.

Por lo tanto, este artículo describe dos métodos de recolección de esperma en el pequeño pez modelo japonés medaka: disección de testículos y masaje abdominal con tubos capilares. Demuestra que ambos enfoques son factibles para medaka y muestra que el masaje abdominal se puede realizar un número repetido de veces a medida que el pez se recupera rápidamente del procedimiento. También describe un protocolo para el análisis de espermatozoides asistido por computadora en medaka para medir de manera confiable varios indicadores importantes de la calidad del esperma medaka (motilidad, progresividad, longevidad y concentración relativa de espermatozoides). Estos procedimientos, especificados para este útil modelo de teleósteos pequeños, mejorarán en gran medida la comprensión de los factores ambientales, fisiológicos y genéticos que influyen en la fertilidad en los machos vertebrados.

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Protocol

Toda la experimentación y el manejo de animales se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones sobre el bienestar animal experimental en la Universidad Noruega de Ciencias de la Vida (NMBU). Los experimentos se realizaron utilizando medaka japonesa adulta (6-9 meses de edad) macho (cepa Hd-rR) criada en NMBU (Ås, Noruega). Los métodos también se probaron brevemente en medaka japonesa macho de 9 meses de edad (cepa CAB) criada en el Instituto Nacional de Investigación para la Agricultura, la Alimentación y el Medio Ambiente (INRAE, Rennes, Francia).

1. Preparación del instrumento y de la solución

  1. Preparar solución madre anestésica (0,6% de tricocaína).
    1. Diluir 0,6 g de tricocaína (MS-222) en 100 ml de solución salina tampón fosfato (PBS) 10x.
    2. Alícuota 2 ml de la solución madre anestésica en tubos de plástico de 50 2 ml y conservar a -20 °C hasta su uso para anestesia o eutanasia.
  2. Prepare agua de recuperación (solución de cloruro de sodio [NaCl] al 0,9%).
    1. Agregue 27 g de NaCl en 3 L de agua de acuario.
    2. Guarde la solución a temperatura ambiente (RT) hasta su uso.
  3. Ajuste el medio de activación si es necesario (solución salina balanceada de Hank [HBSS]).
    NOTA: HBSS se puede comprar comercialmente o hacer en el laboratorio (Tabla de materiales).
    1. Mida el pH del HBSS usando un medidor de pH. Ajuste el pH si es necesario, utilizando ácido clorhídrico o hidróxido de sodio, para que el pH final sea 7.1-7.3.
    2. Mida la osmolalidad del HBSS utilizando un osmómetro para futuros informes.
      NOTA: El rango en el producto comercial es de 266-294 mOsmol / kg; en el presente estudio, la osmolalidad fue de 287 mOsmol/kg. Se puede diluir con agua destilada para reducir la osmolalidad si se desea, pero esto no es necesario ya que no hay una gran diferencia en la activación de los espermatozoides medaka en 150-300 mOsmol / kg HBSS.
    3. Guarde la solución en RT hasta su uso.
  4. Prepare la esponja de sujeción.
    1. Corte una esponja suave para que quepa perfectamente en una placa de Petri.
    2. Corte una línea recta en el centro de la esponja que sea lo suficientemente larga como para recibir al pez (3-4 cm) y aproximadamente 1 cm de profundidad (Figura 1A). Esta hendidura en la esponja sostendrá el lado ventral del pez hacia arriba para exponer la cloaca.

2. Recolección de esperma

NOTA: La recolección de espermatozoides se puede lograr mediante dos métodos diferentes: masaje abdominal o disección de testículos.

  1. Recogida de espermatozoides mediante masaje abdominal
    1. Prepare una solución anestésica al 0,03% diluyendo un tubo de cepas de tricocaína (0,6%) en 38 ml de agua de acuario en un recipiente de vidrio de 100 ml.
    2. Prepare los instrumentos, incluidas las pinzas lisas de extremo romo y un conjunto de micropipeta de vidrio calibrado desechable de 10 μL y un conjunto de tubo aspirador (Figura 1A). Humedezca la esponja de sujeción preparada en el paso 1.4 con la solución anestésica.
    3. Preparar tubos con 36 μL de la solución activadora para su análisis inmediato. Precaliente la solución activadora en un baño maría o incubadora a 27 °C durante al menos 5 minutos.
      NOTA: Aunque las muestras se pueden analizar de peces individuales, la variación individual se puede reducir agrupando muestras de varios machos en la misma solución activadora. Al agrupar muestras de varios peces, use 36 μL de solución activadora por pez. Esta dilución puede necesitar ser ajustada dependiendo de la cepa o las condiciones de crianza de la medaka utilizada, ya que estos factores pueden afectar la concentración y el volumen de los espermatozoides. El programa CASA indicará si la concentración es demasiado alta para identificar los espermatozoides.
    4. Anestesiar el pescado poniéndolo en solución anestésica durante 30-90 s.
      NOTA: La duración de la anestesia debe adaptarse ya que varía según el tamaño del pez. Para asegurarse de que el pez esté completamente anestesiado, pellizque suavemente el pedúnculo caudal con fórceps. Si el pez no reacciona, se puede iniciar el masaje.
    5. Saque el pescado de la solución anestésica y use una toalla de papel o limpie suavemente para secar el abdomen del pez. Coloque el pez en el canal de la esponja húmeda con el lado ventral hacia arriba para que sus branquias queden expuestas a la solución anestésica en la esponja (Figura 1B).
    6. Si el área alrededor de la cloaca está húmeda, seque suavemente la parte inferior del pescado con una toallita desechable.
    7. Colocar el pez en la esponja de retención bajo un microscopio de disección y colocar la micropipeta con un tubo aspirador unido contra la cloaca del pez (Figura 1C).
    8. Masajear el abdomen del pez apretando suavemente con pinzas lisas de extremo romo en un movimiento rostral a caudal mientras se succiona simultáneamente para recoger la lecha expulsada en la pipeta (Figura 1D).
    9. Suelte el pez de la esponja en el agua de recuperación. Permítales recuperarse en la solución durante al menos 15 minutos antes de devolverlos al sistema del acuario.
    10. Transfiera la lecha a un tubo preparado con solución activadora precalentada y pipete hacia arriba y hacia abajo varias veces succionando y soplando el conjunto del tubo aspirador.
    11. Homogeneice suavemente los espermatozoides diluidos moviendo los tubos antes del análisis.
      NOTA: Para obtener los mejores resultados, analice las muestras inmediatamente (por ejemplo, 5 s) después de la activación. En medaka, el análisis puede retrasarse, si es necesario, ya que los espermatozoides permanecen móviles durante varias horas, pero el tiempo debe permanecer constante entre las muestras a medida que la motilidad disminuye con el tiempo.
  2. Recolección de espermatozoides por disección de testículos
    1. Prepare una solución de eutanasia al 0,08% diluyendo dos tubos de caldo de tricocaína (0,6%) en 26 ml de agua de acuario en un recipiente de vidrio de 100 ml.
    2. Prepare herramientas de disección, incluyendo pinzas romas y finas y tijeras pequeñas para disección (Figura 1E).
    3. Preparar un tubo para cada muestra con 120 μL de solución activadora para su análisis inmediato. Precaliente la solución activadora en un baño maría o incubadora a 27 °C durante al menos 5 minutos.
      NOTA: Aunque las muestras se pueden analizar de peces individuales, la variación individual se puede reducir agrupando muestras de varios machos en la misma solución activadora. Para agrupar muestras de varios peces, use 120 μL de solución activadora por pez. Esta dilución puede necesitar ser ajustada dependiendo de la cepa o las condiciones de crianza de la medaka utilizada, ya que estos factores pueden afectar la concentración y el volumen de los espermatozoides. El programa CASA indicará si la concentración es demasiado alta para identificar los espermatozoides.
    4. Eutanasia del pescado poniéndolo en la solución anestésica al 0,08% durante 30-90 s.
      NOTA: La duración depende del tamaño del pez. Para asegurarse de que el pez sea sacrificado, espere a que cesen los movimientos del opérculo. El pez no debe reaccionar al tacto de los fórceps.
    5. Retire el pescado de la solución de eutanasia y séquelo suavemente con una toalla de papel o limpie suavemente.
      NOTA: En este paso, se puede pesar el pez para posteriormente calcular el índice gonadosomático (GSI, peso gonadal / peso corporal).
    6. Coloque el pez bajo un microscopio de disección con su lado lateral izquierdo hacia arriba (Figura 1F).
    7. Usando pequeñas tijeras de disección, corte un colgajo dorsalmente desde la cloaca, y luego a través de las costillas hasta las branquias para exponer los órganos internos (Figura 1G).
    8. Localice los testículos, corte el accesorio en ambos extremos con pinzas finas y retire los testículos (Figura 1H).
      NOTA: Para calcular el GSI, los testículos se pueden pesar en este paso. Trabaje rápidamente para evitar el secado del tejido.
    9. Transfiera los testículos a un tubo preparado con la solución activadora precalentada.
    10. Use fórceps para aplastar los testículos varias veces contra el costado del tubo para liberar los espermatozoides. La liberación de espermatozoides generalmente se puede visualizar y hará que la solución sea ligeramente turbia.
    11. Homogeneice suavemente los espermatozoides diluidos moviendo los tubos antes del análisis.
      NOTA: Para obtener los mejores resultados, analice las muestras inmediatamente (por ejemplo, 5 s) después de la activación. En medaka, el análisis puede retrasarse, si es necesario, ya que los espermatozoides permanecen móviles durante varias horas, pero el tiempo debe permanecer constante entre las muestras a medida que la motilidad disminuye con el tiempo.

Figure 1
Figura 1: Recolección de lecha mediante masaje abdominal (A-D) y disección testicular (E-H). (A) Instrumentos para masaje abdominal: esponja de sujeción, pinzas lisas romas y micropipeta de vidrio calibrada desechable de 10 μL con conjunto de tubo aspirador; (B) Posición de los peces en la esponja de retención, con las branquias expuestas a anestesia en la esponja y la cloaca hacia arriba; C) Colocación de fórceps lisos romos en el abdomen y micropipeta contra la cloaca; (D) Suave en micropipeta después de un suave masaje y succión. (E) Instrumentos para la disección de testículos: fórceps romos, fórceps finos y tijeras pequeñas de disección; (F) Posición de los peces para la disección de testículos; G) Vista lateral de los órganos internos; (H) Retire los testículos cortando el accesorio en ambos extremos con pinzas finas. Barra de escala: 2 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Análisis de espermatozoides con sistema CASA

  1. El sistema CASA (SCA Evolution) debe configurarse de acuerdo con el manual con un microscopio utilizando un filtro verde y un objetivo 10x con contraste de fase.
  2. Preparar portaobjetos desechables de cámara de conteo de 20 μm precalentando en una placa de calentamiento o en una incubadora a 27 °C durante al menos 5 min.
  3. Abra el software de análisis de esperma y seleccione el módulo de motilidad.
  4. Establezca la configuración para el medaka como se muestra en la Figura 2B.
  5. Coloque un portaobjetos desechable precalentado de la cámara de conteo de 20 μm bajo el microscopio en una platina calentada ajustada a 27 °C.
  6. Pipete la muestra en la cámara del portaobjetos hasta que llene la cámara sin sobrellenarla. Limpie cuidadosamente el exceso de muestras de la entrada de la cámara con una punta de algodón o limpie suavemente para evitar que queden células flotantes.
  7. Seleccione Analizar para observar la muestra bajo el microscopio.
    NOTA: Si el icono del microscopio es rojo, la iluminación del microscopio debe ajustarse para que el programa rastree los espermatozoides con precisión. Ajuste el brillo del microscopio, para que el movimiento de la cola de los espermatozoides se vea claramente. El icono debe ser azul.
  8. Asegúrese de que el microscopio esté enfocado y seleccione Analizar nuevamente para registrar los espermatozoides en el campo. Mueva la diapositiva para que quede una nueva área de la muestra en el marco y repita para capturar de 3 a 5 campos de visión diferentes. Evite los campos con burbujas de aire, masas celulares o artefactos.
  9. Seleccione Resultados para ver los resultados.
    NOTA: Si los campos de la página de resultados están delineados en rojo, siga las indicaciones del sistema para eliminar los campos que varían demasiado en concentración o motilidad.
  10. Haga doble clic en un campo para ver los resultados del campo individual o para comprobar manualmente si hay espermatozoides mal etiquetados o no rastreados. Haga clic derecho en los espermatozoides individuales para volver a etiquetar la motilidad, si es necesario (Figura 2A).

Figure 2
Figura 2: Captura de pantalla del software SCA Evolution . (A) Resultados de seguimiento de espermatozoides para un campo. Ver datos de campo en el lado derecho y hacer doble clic en los espermatozoides para ver los datos individuales; (B) Resumen de resultados para todos los campos con el menú de configuración abierto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Representative Results

Tipo de datos obtenidos
El análisis de la motilidad de los espermatozoides del software SCA Evolution proporciona datos sobre la motilidad (porcentaje de espermatozoides móviles e inmóviles), así como la progresividad (porcentaje de espermatozoides progresivos y no progresivos) y la velocidad (porcentaje de espermatozoides de movimiento rápido, medio y lento). También combina progresividad y velocidad (progresiva rápida, progresiva media, no progresiva). Estas etiquetas se basan en mediciones (Figura 3A) y cálculos (Fig. ure 3B) del movimiento de los espermatozoides, que proporciona el programa (Tabla suplementaria 1). Para medaka, los siguientes umbrales se adaptaron de los parámetros recomendados del pez cebra basados en la literatura previa 19,34,35 y la distribución de los datos de medaka de18 individuos. La motilidad se basa en la velocidad curvilínea (VCL) con < inmóvil de 10 μm/s ≤ lenta < 20 μm/s ≤ medio ≤ 40 μm/s < rápido. Los espermatozoides se consideran progresivos si el índice de rectitud (STR) es > 68%.

SCA Evolution también calcula la concentración de espermatozoides si se proporciona el volumen de la muestra y la dilución. Si bien el método de masaje abdominal es útil para visualizar la coloración y confirmar la presencia de la lecha, el volumen recolectado es demasiado pequeño para ser medido con precisión. Si el volumen de la lecha se mejora mediante las condiciones de cría o el uso de una cepa diferente y se puede medir, entonces el programa se puede utilizar para calcular la concentración. Sin embargo, la concentración relativa también se puede calcular para comparar peces o grupos de tratamiento para muestras tomadas por disección de testículos, siempre que todo el testículo se disecone y diluya en el mismo volumen de líquido.

Figure 3
Figura 3: Análisis del movimiento del espermatozoide. (A) Los datos registrados por el sistema CASA incluyen la velocidad curvilínea (VCL, velocidad calculada utilizando la distancia a lo largo de la trayectoria real), la velocidad media de la trayectoria (VAP, velocidad calculada utilizando la distancia de la trayectoria media), la velocidad en línea recta (VSL, velocidad calculada utilizando la distancia entre el inicio y el final de la trayectoria de los espermatozoides), amplitud del desplazamiento lateral de la cabeza (ALH, magnitud del desplazamiento lateral de la cabeza de un espermatozoide sobre su trayectoria promedio), frecuencia cruzada de latido (BCF, velocidad a la que la trayectoria curvilínea cruza la trayectoria media); (B) Los valores calculados del sistema CASA incluyen el índice de rectitud (STR, linealidad de la trayectoria media), el índice de linealidad (LIN, linealidad de la trayectoria curvilínea) y el bamboleo (WOB, oscilación de la trayectoria real sobre la trayectoria media). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Evaluación de la motilidad de los espermatozoides: Diferentes soluciones activadoras
Sorprendentemente, los espermatozoides muestreados tanto por masaje abdominal como por disección de testículos fueron inmóviles en agua de acuario (16 mOsmol / kg) (Figura 4A) y en agua de acuario ajustada con solución de NaCl a 34 mOsmol / kg. Tampoco hubo motilidad en el agua desionizada (-1 mOsmol/kg), ni en el agua desionizada ajustada a 23 mOsmol/kg. Los espermatozoides fueron móviles en HBSS (287 mOsmol/kg) (Figura 4B), así como en HBSS diluido con agua desionizada a 36 mOsmol/kg y 113 mOsmol/kg, aunque el porcentaje de motilidad se redujo significativamente a 36 mOsmol/kg (Figura 4C).

Figure 4
Figura 4: Motilidad por osmolalidad de la solución activadora. Espermatozoides muestreados por disección de testículos en (A) agua de acuario (16 mOsmol/kg) y (B) HBSS no ajustado (287 mOsmol/kg). Los círculos amarillos etiquetan los espermatozoides inmóviles y las líneas de color indican el movimiento de los espermatozoides: rojo (progresivo rápido), verde (progresivo medio), azul (no progresivo). Barra de escala: 100 μm. (C)Motilidad espermática activada con HBSS a 36, 113 y 287 mOsmol/kgH2O. Para 36 y 113, n = 4 con dos peces agrupados por muestra. Para 287, n = 9 con dos peces agrupados por muestra. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando un ANOVA con prueba post-hoc de Tukey y las diferencias significativas se indican con diferentes letras. Los datos se representan como media ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Métodos de muestreo: masaje abdominal versus disección testicular
Los espermatozoides muestreados por disección de testículos son significativamente más móviles en comparación con las muestras de masaje abdominal del mismo pez (Figura 5A). De los espermatozoides móviles, un mayor porcentaje también son progresivos y de movimiento medio o rápido. En los espermatozoides muestreados por masaje abdominal, los espermatozoides más móviles son de movimiento lento y no progresivos (Figura 5B-C). Sin embargo, se pueden obtener resultados diferentes utilizando una cepa diferente de medaka (CAB) o condiciones de crianza alternativas (Tabla suplementaria 2).

Figure 5
Figura 5: Masaje abdominal versus disección testicular. Porcentaje de (A) espermatozoides inmóviles y móviles muestreados mediante masaje abdominal o disección de testículos. Porcentaje de espermatozoides móviles que son (B) espermatozoides no progresivos y progresivos, y (C) lentos, medios y de movimiento rápido. Todas las muestras de semen se activaron en HBSS (287 mOsmol/kgH2O). Los análisis estadísticos se realizaron mediante una prueba U de Mann-Whitney y las diferencias significativas se indican con asteriscos. Los datos se representan como media ± SEM, n = 9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Duración de la motilidad según condición de almacenamiento
Los espermatozoides muestreados por disección testicular y mantenidos a 27 °C tuvieron una reducción del 50% en la motilidad en los primeros 30 minutos después de la activación. Después de 2,5 h, menos del 5% de los espermatozoides eran móviles. Cuando se almacenó a 4 °C, la motilidad se redujo solo en un 14% en los primeros 30 minutos, y se necesitaron 5 h para ver una reducción del 50% de la motilidad inicial. El hielo tuvo un efecto de extensión similar, pero fue menos efectivo, con una reducción de la motilidad del 26% en los primeros 30 minutos (Figura 6A). La progresividad también disminuyó un 52% en los primeros 30 minutos en hielo, en comparación con el 65% a 27 °C y el 33% a 4 °C (Figura 6B). Tanto en hielo como a 4 °C, algunos espermatozoides (<3%) seguían moviéndose 42 h después de la activación.

Figure 6
Figura 6: Longevidad de los espermatozoides según condiciones de almacenamiento. Porcentaje (A) de motilidad y (B) progresividad a lo largo del tiempo para muestras activadas con HBSS (287 mOsmol/kgH2O) y almacenadas a 27 °C, 4 °C o en hielo. Los puntos de datos son medias ± SEM, n = ≥4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Importancia de las condiciones ambientales y de vivienda
Los machos co-alojados con las hembras fueron muestreados por disección de testículos en la mañana antes de tener la oportunidad de desovar (antes de que se encendieran las luces) o después de que las luces se encendieran y las hembras en el tanque tuvieran huevos. No hubo diferencias significativas en la motilidad de los espermatozoides. También se muestrearon machos alojados sin hembras durante un mes, y aunque hubo una tendencia de mayor motilidad, la diferencia tampoco fue significativa (Figura 7).

Sin embargo, cuando la medaka de la cepa CAB se crió en una instalación diferente con machos separados de las hembras durante al menos un mes, los peces eran más grandes y se recolectaron 5-7 μL de lecha mediante masaje abdominal. Las muestras recogidas de cinco peces por masaje abdominal tuvieron motilidad de 68,34% cuando se activaron con 300 mOsmol/kg HBSS. Cuando se mantuvo en las mismas condiciones pero con hembras, el volumen de lecha recolectada fue de aproximadamente 2 μL, y la motilidad promedio fue de 46.2% de tres machos (Tabla suplementaria 2).

Figure 7
Figura 7. Efecto de las condiciones ambientales sobre la motilidad de los espermatozoides. Porcentaje de motilidad de los espermatozoides muestreados antes (n = 5) y después (n = 4) del desove de los machos que fueron co-alojados con las hembras, y los espermatozoides de los machos alojados sin hembras (n = 6). Todas las muestras fueron muestreadas por disección testicular y activadas con HBSS (287 mOsmol/kgH2O). Los análisis estadísticos se realizaron mediante pruebas t y las diferencias no fueron significativas. Los datos se muestran como media ± SEM con círculos que representan peces individuales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla suplementaria 1: Cálculos de velocidad media y movimiento para espermatozoides muestreados por masaje abdominal y disección de testículos (n = 9). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 2: Datos de análisis de espermatozoides de la cepa CAB (también llamada Carbio) medaka criada en INRAE en Rennes, Francia. Todas las muestras se activaron en 300 mOsmol/kg HBSS. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

La osmolalidad es un factor importante en la activación de los espermatozoides de peces36,37. Generalmente, los espermatozoides son inmóviles en los testículos y se vuelven móviles en medios que son hiperosmóticos en relación con el líquido seminal para los peces marinos, e hipoosmóticos en relación con el líquido seminal para los peces de agua dulce37. Al igual que en la sangre, el plasma seminal en los peces de agua dulce es típicamente más bajo que el de los peces marinos (alrededor de 300 mOsmol / kg en comparación con 400 mOsmol / kg)22,37. Por lo tanto, los espermatozoides de los peces generalmente se activan al contacto con el agua en la que viven, y esta agua sirve como el mejor y más biológico medio de activación para el análisis de espermatozoides. Sin embargo, los espermatozoides de medaka muestreados por masaje abdominal y disección de testículos no fueron móviles en el agua del acuario (Figura 4A) en medaka de cepa Hd-rR o CAB criada en dos laboratorios diferentes. Además, la motilidad fue mayor en 287 mOsmol/kg HBSS que en 36 mOsmol/kg HBSS (Figura 4C), lo cual es inusual para un pez de agua dulce.

La mayoría de los estudios previos que involucran análisis de esperma en medaka utilizaron HBSS 28,29,38 o solución de Yamamoto 18,19 como medios de activación para los espermatozoides de medaka sin discutir la osmolalidad. Si bien HBSS es un buen medio activador para los espermatozoides medaka, la variación en la osmolalidad puede afectar la motilidad. Por lo tanto, es esencial que los estudios de análisis de espermatozoides revelen la osmolalidad de su solución activadora para la comparación entre experimentos. Un estudio que investigó la osmolalidad ideal del medio activador encontró que el espermatozoide medaka es móvil en agua desionizada (25 mOsmol/kg) y HBSS con valores de osmolalidad < 686 mOsmol/kg, con la motilidad más alta entre 25 y 227 mOsmol/kg17. Sin embargo, en el estudio actual, los espermatozoides tampoco eran móviles en agua desionizada. Como pez eurihalino, los medaka son muy adaptables a diferentes ambientes e incluso pueden vivir y reproducirse en agua salada39, por lo que es posible que diferentes condiciones de cría sean responsables de esta discrepancia. Curiosamente, ningún otro estudio ha reportado probar la motilidad de los espermatozoides medaka en el agua del acuario (o similar, como el agua del grifo envejecida), aunque es el medio estándar de activación de espermatozoides para peces de agua dulce.

Una posible explicación para esta activación atípica de los espermatozoides en medaka es la interacción con el líquido ovárico. Mientras que el esperma de los peces generalmente se activa en el agua circundante, el líquido ovárico aumenta o extiende la duración de la motilidad de los espermatozoides en muchas especies40,41. Aunque los medaka están fertilizando externamente a los peces de agua dulce, su comportamiento de desove, que incluye envoltura de aletas y temblores, los coloca mucho más cerca que los reproductores de transmisión23. Como la osmolalidad del líquido ovárico en peces de agua dulce (aproximadamente 300 mOsmol / kg) está cerca de HBSS40, es posible que el líquido liberado por la hembra active el esperma, no el agua del acuario. Dado que la osmolalidad del plasma seminal y ovárico son similares, es posible que la composición iónica del líquido ovárico medaka juegue un papel importante40,42. El papel del líquido ovárico y los iones en la activación de los espermatozoides medaka justifica una mayor investigación.

En estudios previos, el esperma medaka ha sido recolectado sólo por aplastamiento de testículos disecados 17,28,29,30 o por masaje abdominal para expresar la lecha directamente en medio activador 18,19,20; Ningún estudio ha reportado datos con espermatozoides recolectados por masaje abdominal en un tubo capilar, aunque es una práctica común en el pez cebra y otros peces teleósteos33,43,44. Este método también es factible en medaka. La lecha se visualiza fácilmente en el tubo capilar, y aunque el volumen es demasiado pequeño para ser medido con precisión, este método permite la confirmación de la recolección y el análisis exitosos del color como un indicador rápido de calidad32. Evitar la contaminación fecal también es más fácil con la recolección en un tubo capilar en comparación con en el medio. Aunque las muestras de esperma recogidas por disección de testículos tienen mejor motilidad en medaka que las muestras recogidas por masaje abdominal (Figura 5) y, por lo tanto, son preferibles para experimentos en los que los peces pueden ser sacrificados, el masaje abdominal es un procedimiento mínimamente invasivo que no requiere eutanasia y puede repetirse en el mismo pez. Por lo tanto, es útil para experimentos que siguen al mismo pez a lo largo del tiempo. Además, las muestras recolectadas con masaje abdominal contienen solo células maduras liberadas con plasma seminal44, mientras que las muestras de disección de testículos pueden incluir espermatozoides inmaduros y otros desechos. El sistema CASA descuenta las células redondas y los desechos más grandes que el área máxima, pero si este parámetro se establece demasiado alto, los resultados de motilidad podrían verse afectados.

Debido a la baja cantidad de espermatozoides recolectados con la técnica de masaje abdominal en estos medaka, fue imposible medir con precisión el volumen de espermatozoides en el capilar y, por lo tanto, calcular las concentraciones de espermatozoides utilizando enfoques regulares. Sin embargo, para las muestras tomadas por disección de testículos, manteniendo el volumen del medio de activación constante y pesando los testículos, se puede calcular una concentración relativa basada en la concentración de espermatozoides dada por el sistema CASA para comparar entre individuos o grupos de tratamiento. Además del análisis de calidad, la concentración relativa también es útil para determinar las diluciones óptimas de la muestra para la criopreservación. Si el volumen recogido por el masaje abdominal se mejora mediante las condiciones de crianza o el uso de una tensión diferente, el volumen se puede calcular midiendo la altura de la lecha en el tubo capilar e ingresado en el programa para calcular la concentración. En estos casos, en los que se pueden obtener varios microlitros, la motilidad puede ser mayor por el masaje abdominal que por la disección testicular (Tabla complementaria 2). Cuando se recogen volúmenes bajos, las muestras son más propensas a la contaminación, lo que puede afectar la motilidad, aunque estos efectos parecen ser consistentes cuando los volúmenes son similares, por lo que aún se pueden hacer comparaciones entre los grupos de tratamiento. Sin embargo, no se deben hacer comparaciones entre muestras que varían mucho en volumen o coloración de la leche.

El bajo volumen de lecha obtenido de medaka mediante masaje abdominal puede ser una limitación para experimentos que requieren un gran volumen de lecha. En tales casos, la disección de los testículos puede ser preferible, como se muestra en un estudio que recolectó lecha de pez cebra y espada verde tanto por disección como por masaje, pero solo por disección en medaka debido al bajo volumen30. La disección de testículos suele ser mejor para las comparaciones con otras especies por la misma razón. El volumen limitado por masaje abdominal en comparación con otros peces de tamaño similar puede deberse a testículos más pequeños (1,9 ± 0,6 mg en medaka en comparación con 7,0 ± 2,5 mg en pez cebra 45) y menos espermatozoides producidos (2,0 ± 0,4 x 10 6 espermatozoides/mg testículos en medaka en comparación con 7,7 ± 2,0 x 106 espermatozoides/mg testículos en pez cebra46), o a otros factores biológicos desconocidos que limitan la técnica, como se sugiere en el bagre africano criado en criaderos47. La diferencia podría ser fisiológica, según la tensión o las condiciones ambientales, o anatómica, ya que a diferencia del pez cebra, los testículos medaka están fusionados y ubicados más medialmente, y por lo tanto podrían ser más difíciles de acceder mediante masaje abdominal, aunque también hay otros peces con testículos fusionados.

Para algunas especies, como el pez cebra, es mejor tomar muestras de esperma antes de que los peces tengan la oportunidad de desovar por la mañana48 o aislar a los machos en tanques individuales la noche anterior para evitar el desove32. Con Hd-rR medaka de este estudio, las condiciones ambientales como el momento del muestreo (antes o después del desove) y las condiciones de alojamiento (con o sin hembras durante 1 mes) no tuvieron un efecto significativo sobre la motilidad de los espermatozoides (Figura 7). Es posible que un tamaño de muestra más grande o aislar a los machos de las hembras durante un período de tiempo más largo pueda producir una mayor cantidad de espermatozoides y / o motilidad. En la cepa CAB medaka de otra instalación, se observó una tendencia similar con una mejor calidad y volumen de esperma de los machos alojados solos en comparación con los machos alojados con hembras (se analizaron muy pocos peces para sacar conclusiones estadísticas). También fue posible con estos peces recolectar volúmenes relativamente altos de lecha mediante masaje abdominal (Tabla suplementaria 2), aunque se obtuvieron volúmenes muy pequeños de lecha utilizando la cepa medaka Hd-rR, y otros también han reportado volúmenes pequeños por la misma técnica en la cepa CAB medaka30. Sin embargo, aún no está claro si estas diferencias se deben a la cepa (que es una cepa comercial en lugar de endogámica) o debido a diferencias de cría (hay muchas entre instalaciones). En estos peces, se podrían recolectar varios microlitros de milta, lo que limita la contaminación y mejora la calidad. Pero, para experimentos en los que es importante cohabitar ambos sexos, no parece necesario separarlos para dar resultados. Tampoco parece necesario muestrear machos a la vez antes del desove.

Aunque se requieren más estudios para determinar exactamente cómo difiere el esperma medaka según la población y los factores ambientales, la cepa y las condiciones de cría deben tenerse en cuenta al diseñar la configuración experimental, y se debe tener precaución al comparar entre poblaciones que producen diferentes cantidades de esperma. Si se obtienen volúmenes mayores de milt, se debe ajustar la dilución de la solución activadora (por ejemplo, 1:60, aunque la concentración preferida puede variar con el sistema CASA). Del mismo modo, si los testículos disecados son mucho más grandes de lo típico (2 mg) debido a la tensión o las condiciones de crianza, será necesario aumentar la dilución para que el programa CASA pueda etiquetar con precisión todos los espermatozoides.

Los métodos de análisis de esperma varían ampliamente para la medaka y a menudo son subjetivos, lo que dificulta la comparación de los resultados entre los estudios. Un estudio que comparó métodos subjetivos y objetivos utilizados por técnicos con diferentes niveles de experiencia encontró que los técnicos altamente experimentados pueden estimar la motilidad de los espermatozoides de peces dentro de los 10 puntos porcentuales de los datos proporcionados por un programa de motilidad CASA, mientras que los técnicos de experiencia media y baja sobreestiman los valores de motilidad de CASA con amplitudes de hasta 30 puntos porcentuales21 . Sin embargo, la falta de estandarización de los parámetros que determinan la motilidad en medaka también puede causar variación entre aquellos que usan métodos más objetivos. Por ejemplo, un estudio que registró espermatozoides a 33 cuadros por segundo (fps), analizó 30 cuadros y consideró que los espermatozoides que se movían más rápido que 2 μm / s móviles tenían una velocidad promedio de aproximadamente 60 μm / s y una motilidad de aproximadamente 70% para sus peces control18. Otro estudio que utilizó el mismo protocolo tuvo una velocidad promedio de 40 μm/s para el control de espermatozoides y un porcentaje de motilidad superior al 80%19. Otro grupo, que analizó 200 fotogramas a 47 fps, tenía un VCL promedio de más de 100 mmm / s para los peces de control, pero una motilidad promedio por debajo del 50%. No revelaron qué parámetros determinaban la motilidad. Por lo tanto, en este protocolo, el software de análisis de espermatozoides asistido por computadora se utiliza para analizar los espermatozoides de manera objetiva, rápida y confiable en función de un conjunto de parámetros que se han personalizado para las características de los espermatozoides medaka. Como es fundamental que los parámetros de motilidad sean consistentes para las comparaciones entre laboratorios, la configuración completa utilizada en este estudio está disponible (Figura 2B), por lo que este protocolo puede ser replicado de manera confiable en un laboratorio diferente por diferentes investigadores.

Los peces teleósteos muestran una amplia diversidad de características de espermatozoides, por lo que aunque este protocolo se probó inicialmente utilizando los parámetros recomendados para el software SCA Evolution, era evidente que los parámetros tendrían que ajustarse para el esperma medaka de menor velocidad y mayor longevidad. Así, los parámetros del pez cebra se adaptaron a medaka utilizando literatura de medaka y otras especies que reportaron características espermáticas similares 19,34,35 y seleccionaron los umbrales que mejor se ajustaban a la distribución de 17.580 huellas de espermatozoides analizadas de18 individuos. La motilidad se basa en la velocidad curvilínea (VCL) con < inmóvil de 10 μm/s ≤ lenta < 20 μm/s ≤ medio ≤ 40 μm/s < rápido. Los espermatozoides se consideran progresivos si el índice de rectitud (STR) es > 68%. El umbral que define la motilidad se mantuvo en 10 μm/s en lugar de 2 μm/s, como se usa en algunas publicaciones18,19, ya que muchos espermatozoides que carecen de movimiento flagelar fueron etiquetados erróneamente como móviles con este ajuste. Otras especies de peces con cabezas de esperma de tamaño similar (~2 μm) también usaron 10 μm/s para definir espermatozoides móviles35,43. El área máxima se redujo de la configuración de pez cebra de 90 μm 2 a 20 μm2 para que se ignoraran los grandes desechos celulares de la disección de los testículos.

La duración de la motilidad parece depender de la cantidad de ATP almacenada antes de la activación, ya que el movimiento flagelar requiere un rápido consumo de energía. Probablemente debido a este rápido agotamiento, existe una correlación entre los espermatozoides de alta velocidad inicial y una menor duración de la motilidad49. Si bien generalmente se requiere un choque osmótico para activar el esperma de los peces, también puede provocar daños en la membrana durante el período de motilidad, lo que también puede afectar la longevidad. Este efecto es más crítico en las especies de agua dulce49, lo que puede explicar por qué los espermatozoides marinos son capaces de una mayor duración de la motilidad (alrededor de 550 s en promedio en comparación con aproximadamente 150 s para las especies de agua dulce), a pesar de exhibir una velocidad y motilidad promedio similar a la de los espermatozoides de agua dulce14,22. La duración de la motilidad superior a 30 min no es común, pero ha sido reportada en varias especies marinas22,49. A pesar de ser un pez de agua dulce, los resultados con medaka se ajustan al perfil de los espermatozoides que tienen una velocidad más baja y una mayor duración de las especies marinas. Esto puede estar relacionado con la activación en un medio similar al plasma seminal: sin un shock osmótico, el esperma medaka probablemente no sufre daños en la membrana similar a otros peces de agua dulce.

A menudo es necesaria una solución no activadora y un análisis muy rápido y consistente después de la activación para el análisis de espermatozoides que solo son móviles durante minutos. Sin embargo, la motilidad de los espermatozoides medaka dura naturalmente varias horas y se puede preservar una mayor motilidad almacenándola a 4 °C o en hielo (Figura 6). Por lo tanto, para experimentos en los que no es posible el análisis inmediato, el protocolo puede modificarse de modo que, por ejemplo, los testículos se almacenan en solución activadora en hielo durante una hora, siempre que se registre el tiempo de recolección para que el análisis pueda permanecer consistente. Sin embargo, para obtener resultados óptimos, el análisis inmediato sigue siendo la mejor opción. Si bien la motilidad aún disminuye, debido a que es gradual, los resultados se ven menos afectados por pequeñas diferencias en el tiempo de análisis después de la activación. Aún así, es importante informar tanto la temperatura de almacenamiento de las muestras como el tiempo de análisis después de la activación para que los datos puedan compararse y reproducirse.

También suele ser muy importante en los peces evitar la contaminación de la lecha con orina durante el muestreo, ya que esto puede cambiar la osmolalidad y activar prematuramente los espermatozoides16,50. Sin embargo, esto es menos preocupante en medaka (debido a la mayor duración de la motilidad) y con este protocolo, ya que la muestra se coloca en medio de activación inmediatamente. Los volúmenes bajos de lecha son propensos a la contaminación de la orina, por lo que se puede esperar cierta decoloración con el masaje abdominal de medaka cuando se obtienen volúmenes bajos. Sin embargo, si esto es consistente en la población, entonces todavía se pueden hacer comparaciones entre los grupos de tratamiento. Se debe tener precaución al comparar poblaciones de medaka que varían en el volumen o la coloración de la lecha.

Como los resultados del análisis de esperma dependen en gran medida de los métodos utilizados, los métodos detallados y confiables que se pueden repetir fácilmente en diferentes laboratorios son beneficiosos. También es vital que los documentos divulguen detalles sobre sus métodos para permitir la repetibilidad. Con medaka utilizado cada vez más como modelo para la investigación de la reproducción, falta el cuerpo de información sobre la evaluación de la calidad del esperma. Los dos métodos distintos descritos en este documento para el muestreo de espermatozoides pueden ser beneficiosos para diferentes experimentos. La disección de los testículos generalmente produce espermatozoides de mayor motilidad y permite cálculos de concentración relativa, mientras que el masaje abdominal se puede hacer repetidamente en el mismo pez y es una representación biológica más pura de un evento de desove. Este manuscrito, por lo tanto, proporciona los parámetros para CASA, que es una técnica confiable y objetiva que proporciona amplios datos sobre el movimiento de los espermatozoides, incluida la motilidad, progresividad, velocidad y otros parámetros cinemáticos. Por lo tanto, estos protocolos serán útiles para una variedad de estudios en medaka, incluyendo toxicología, ecología, reproducción y fisiología.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo ha sido financiado por la Universidad Noruega de Ciencias de la Vida y el programa Fulbright de Estados Unidos. Los autores desean agradecer a Anthony Peltier y Lourdes Carreon G Tan en NMBU por el mantenimiento de las instalaciones pesqueras y a Guillaume Gourmelin del ISC LPGP en INRAE (Francia) por proporcionar peces y espacio de laboratorio para probar aún más estos métodos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL tubes Axygen MCT-150-C Any standard brand can be used
10 µL disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assembly Drummond 2-000-010
10x objective with phase contrast Nikon MRP90100
2 mL tubes Axygen MCT-200-c-s Any standard brand can be used
Blunt forceps Fine Science Tools 11000-12
Blunt smooth forceps Millipore XX6200006P
Disposable 20 micron counting chamber slide Microptic 20.2.25  Leja 2 chamber slides
Dissecting microscope Olympus SZX7 Any standard brand can be used
Fine forceps Fine Science Tools 11253-20
HBSS Sigmaaldrich H8264-1L
Holding sponge self-made
Inverted microscope Nikon Eclipse Ts2R
SCA Evolution Microptic
Small dissecting scissors Fine Science Tools 14090-09
Sodium Chloride (NaCl) Sigmaaldrich S9888
Tabletop vortex Labnet C1301B
Tricaine Sigmaaldrich A5040

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Recolección de espermatozoides y análisis de espermatozoides asistido por computadora en el modelo teleósteo japonés Medaka (<em>Oryzias latipes</em>)
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