Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Spermieuppsamling och datorstödd spermieanalys i teleostmodellen japansk medaka (Oryzias latipes)

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/64326
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Preclinical Sciences and Pathology, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences, 2Department of Production Animal Clinical Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences

Summary

Denna artikel beskriver två snabba och effektiva metoder för att samla spermier från den lilla modellen fisk medaka (Oryzias latipes), samt ett protokoll för tillförlitlig bedömning av spermiekvalitet med hjälp av datorstödd spermieanalys (CASA).

Abstract

Japansk medaka (Oryzias latipes) är en teleostfisk och en framväxande ryggradsdjursmodell för ekotoxikologi, utvecklings-, genetik- och fysiologiforskning. Medaka används också i stor utsträckning för att undersöka ryggradsdjurens reproduktion, vilket är en viktig biologisk funktion eftersom det gör att en art kan fortsätta. Spermiekvalitet är en viktig indikator på manlig fertilitet och därmed reproduktionsframgång. Tekniker för att extrahera spermier och spermieanalys är väl dokumenterade för många arter, inklusive teleostfisk. Att samla spermier är relativt enkelt i större fiskar men kan vara mer komplicerat i små modellfiskar eftersom de producerar mindre spermier och är mer känsliga. Denna artikel beskriver därför två metoder för spermauppsamling i den lilla modellfisken, japansk medaka: testiklardissektion och bukmassage. Detta dokument visar att båda tillvägagångssätten är möjliga för medaka och visar att bukmassage kan utföras ett upprepat antal gånger eftersom fisken snabbt återhämtar sig från proceduren. Denna artikel beskriver också ett protokoll för datorstödd spermieanalys i medaka för att objektivt bedöma flera viktiga indikatorer på medaka spermiekvalitet (rörlighet, progressivitet, varaktighet av rörlighet, relativ koncentration). Dessa procedurer, specificerade för denna användbara lilla teleostmodell, kommer att öka förståelsen för de miljömässiga, fysiologiska och genetiska faktorer som påverkar fertiliteten hos ryggradsdjur.

Introduction

Japansk medaka är en liten, äggläggande sötvattensteleostfisk som är infödd i Östasien. Medaka har blivit ett utmärkt modellsystem för ryggradsdjur för ekotoxikologi, utvecklingsgenetik, genomik och evolutionsbiologi och fysiologistudier 1,2. I likhet med den populära zebrafisken är de relativt lätta att odla och mycket resistenta mot många vanliga fisksjukdomar 1,2. Det finns flera fördelar med att använda medaka som modell, inklusive en kort generationstid, transparenta embryon 1,2 och ett sekvenserat genom3. Till skillnad från zebrafisk har medaka en könsbestämmande gen 4 samt en hög temperatur (från4-40 °C) och salthalt (euryhalinarter) tolerans5. Dessutom har många genetiska och anatomiska verktyg, liksom protokoll 6,7,8,9,10,11,12, utvecklats i medaka för att underlätta studien av dess biologi.

Reproduktion är en viktig fysiologisk funktion eftersom det gör det möjligt för en art att fortsätta. Ryggradsdjurens reproduktion kräver en myriad av exakt orkestrerade händelser, inklusive produktion av oocyter hos kvinnor och produktion av spermier hos män. Spermier är unika celler, producerade genom den komplexa processen med spermatogenes, där det finns ett antal kontrollpunkter på plats för att garantera leverans av en högkvalitativ produkt13. Könscellskvalitet har blivit ett fokus i vattenbruks- och fiskpopulationsstudier på grund av dess inverkan på gödslingsframgång och larvöverlevnad. Spermiekvalitet är därför en viktig indikator på manlig fertilitet hos ryggradsdjur.

Tre användbara faktorer för att bedöma fiskspermakvalitet är rörlighet, progressivitet och livslängd. Procentmotilitet och progressiv rörlighet är vanliga indikatorer på spermiekvalitet eftersom progressiv rörelse är nödvändig för och korrelerar starkt med befruktningsframgång14,15. Rörelsens varaktighet är också en viktig indikator hos fisk eftersom spermierna förblir helt rörliga i mindre än 2 minuter hos de flesta teleostarter och spermiernas bana i allmänhet är mindre linjär än hos däggdjur15. Många studier som bedömde spermiernas rörlighet förlitade sig emellertid tidigare på subjektiva eller semikvantitativa metoder för att analysera spermier15,16. Till exempel har spermiernas rörlighet i medaka tidigare uppskattats visuellt under ett mikroskop17. Det har också uppskattats genom att registrera spermiernas rörelse och använda bildprogramvara för att slå samman ramar och mäta simväg och hastighet18,19,20. Sådana tillvägagångssätt saknar ofta robusthet, vilket ger olika resultat beroende på den person som utför analysen15,21.

Datorstödd spermieanalys (CASA) utvecklades ursprungligen för däggdjur. CASA är en snabb kvantitativ metod för att bedöma spermiekvaliteten genom att registrera och mäta hastighet och bana på ett automatiserat sätt15. Hos fiskar har den använts i olika arter för att övervaka effekterna av flera vattenföroreningar på spermiekvaliteten, för att identifiera intressanta förfäder för att förbättra stamstocken, för att förbättra effektiviteten i kryokonservering och lagring och för att optimera förhållandena för befruktning15. Därför är det ett kraftfullt verktyg för att på ett tillförlitligt sätt bedöma spermiekvaliteten hos olika ryggradsdjur. På grund av den viktiga mångfalden i reproduktionsstrategier mellan fiskar skiljer sig dock spermierna från teleostfisk från däggdjur och från en fiskart till en annan. Teleostfisk, som främst befruktar ägg externt genom att släppa ut könsceller i vatten, har högkoncentrerade spermier som är relativt enkla i struktur utan akrosom, till skillnad från däggdjur, som gödslar internt och därför inte behöver kompensera för utspädning i vatten, men måste tåla mer viskösa vätskor14. Dessutom rör sig spermier från de flesta fiskar snabbt men är helt rörliga i mindre än 2 minuter efter aktivering, även om det finns flera undantag15,22. Eftersom rörligheten kan minska snabbt hos de flesta fiskar, bör extrem försiktighet iakttas med tidpunkten för analys efter aktivering vid bestämning av ett spermieanalysprotokoll för fisk.

Reproduktion är ett av de områden inom biologin där teleostar och medaka har använts i stor utsträckning som modellorganismer. Faktum är att medaka-män visar intressanta reproduktiva och sociala beteenden, till exempel kompisvakt23,24. Dessutom finns flera transgena linjer för att studera den neuroendokrina kontrollen av reproduktion i denna art25,26,27. Spermieprovtagning, ett förfarande som är relativt enkelt i större fiskar, kan vara mer komplicerat i små modellfiskar eftersom de producerar mindre spermier och är mer känsliga. Av denna anledning, de flesta studier som involverar spermieprovtagning i medaka extrakt milt (fisksperma) genom att krossa dissekerade testiklar 17,28,29,30. Några studier använder också en modifierad bukmassage för att uttrycka milten direkt till aktiverande medium18,19,20; Men med denna metod är det svårt att visualisera mängden och färgen på milt extraherad. I zebrafisk används bukmassage vanligtvis för att uttrycka milt, som omedelbart samlas i ett kapillärrör31,32,33. Denna metod möjliggör uppskattning av volymen av milt, samt observation av ejakulerad färg, vilket är en snabb och enkel indikator på spermiekvalitet32,33. Därför saknas ett tydligt och väl beskrivet protokoll för spermauppsamling och analys för medaka.

Denna artikel beskriver därför två metoder för spermieuppsamling i den lilla modellen fisk japansk medaka: testiklar dissektion och bukmassage med kapillärrör. Det visar att båda metoderna är möjliga för medaka och visar att bukmassage kan utföras ett upprepat antal gånger eftersom fisken snabbt återhämtar sig från proceduren. Det beskriver också ett protokoll för datorstödd spermieanalys i medaka för att på ett tillförlitligt sätt mäta flera viktiga indikatorer på medaka spermiekvalitet (rörlighet, progressivitet, livslängd och relativ spermiekoncentration). Dessa procedurer, specificerade för denna användbara lilla teleostmodell, kommer att öka förståelsen för de miljömässiga, fysiologiska och genetiska faktorer som påverkar fertiliteten hos ryggradsdjur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla försök och djurhantering utfördes i enlighet med rekommendationerna om försöksdjurens välbefinnande vid Norges biovetenskapliga universitet (NMBU). Experimenten utfördes med vuxen (6-9 månader gammal) manlig japansk medaka (Hd-rR-stam) uppvuxen vid NMBU (Ås, Norge). Metoderna testades också kort i 9 månader gammal manlig japansk medaka (CAB-stam) uppvuxen vid National Research Institute for Agriculture, Food, and the Environment (INRAE, Rennes, Frankrike).

1. Beredning av instrument och lösning

  1. Förbered bedövningsstamlösning (0,6% trikain).
    1. Späd 0,6 g trikain (MS-222) i 100 ml 10x fosfatbuffertsaltlösning (PBS).
    2. Alikvotera 2 ml av stamlösningen för bedövningsmedel i 50 2 ml plaströr och förvara vid -20 °C tills det används för anestesi eller eutanasi.
  2. Förbered återvinningsvatten (0,9% natriumklorid [NaCl] lösning).
    1. Tillsätt 27 g NaCl i 3 liter akvariumvatten.
    2. Förvara lösningen i rumstemperatur (RT) tills den används.
  3. Justera aktiveringsmediet vid behov (Hanks balanserade saltlösning [HBSS]).
    HBSS kan köpas kommersiellt eller tillverkas i laboratoriet (materialförteckning).
    1. Mät hbss pH med en pH-mätare. Justera pH om det behövs med saltsyra eller natriumhydroxid, så det slutliga pH-värdet är 7,1-7,3.
    2. Mät osmolaliteten för HBSS med hjälp av en osmometer för framtida rapportering.
      OBS: Sortimentet på den kommersiella produkten är 266-294 mOsmol / kg; I den aktuella studien var osmolalitet 287 mOsmol/kg. Det kan spädas med destillerat vatten för att minska osmolalitet om så önskas, men detta är inte nödvändigt eftersom det inte finns någon stor skillnad i aktiveringen av medaka spermier i 150-300 mOsmol / kg HBSS.
    3. Förvara lösningen på RT tills den används.
  4. Förbered hållsvampen.
    1. Skär en mjuk svamp så att den sitter tätt i en petriskål.
    2. Skär en rak linje i mitten av svampen som är tillräckligt lång för att ta emot fisken (3-4 cm) och ca 1 cm djup (figur 1A). Denna slits i svampen kommer att hålla fiskens ventrala sida uppåt för att exponera cloaca.

2. Spermieuppsamling

OBS: Spermieuppsamling kan uppnås med två olika metoder: bukmassage eller testikeldissektion.

  1. Spermsamling genom bukmassage
    1. Förbered 0,03% bedövningslösning genom att späda ett rör trikainstam (0,6%) i 38 ml akvarievatten i en 100 ml glasbehållare.
    2. Förbered instrumenten, inklusive släta pincett med trubbig ände och en 10 μL engångskalibrerad glasmikropipett och sugrörsmontering (figur 1A). Fukta hållsvampen som beretts i steg 1.4 med bedövningslösningen.
    3. Förbered rören med 36 μl av aktiveringslösningen för omedelbar analys. Förvärm den aktiverande lösningen i ett vattenbad eller inkubatorset till 27 °C i minst 5 minuter.
      OBS: Även om prover kan analyseras från enskilda fiskar, kan individuell variation minskas genom att slå samman prover från flera hanar i samma aktiverande lösning. När du samlar prover från flera fiskar, använd 36 μl aktiveringslösning per fisk. Denna utspädning kan behöva justeras beroende på stam- eller uppfödningsförhållandena för den medaka som används eftersom dessa faktorer kan påverka spermiernas koncentration och volym. CASA-programmet kommer att indikera om koncentrationen är för hög för att identifiera spermier.
    4. Bedöva fisken genom att lägga den i bedövningslösning i 30-90 s.
      OBS: Narkosens varaktighet måste anpassas eftersom den varierar beroende på fiskens storlek. För att säkerställa att fisken är helt bedövad, kläm försiktigt den kaudala peduncle med pincett. Om fisken inte reagerar kan massagen startas.
    5. Ta fisken ur bedövningslösningen och använd en pappershandduk eller torka försiktigt för att torka fiskens buk. Placera fisken i tråget på den fuktiga svampens ventrala sida uppåt så att dess gälar utsätts för bedövningslösningen i svampen (figur 1B).
    6. Om området runt cloaca är vått, torka försiktigt undersidan av fisken med en engångsvävnadstork.
    7. Placera fisken i hållsvampen under ett dissekerande mikroskop och placera mikropipetten med ett sugrör fäst mot fiskens cloaca (figur 1C).
    8. Massera fiskens buk genom att försiktigt klämma med trubbiga änd släta tångar i en rostral till caudal rörelse samtidigt som du suger för att samla den utvisade milten i pipetten (figur 1D).
    9. Släpp fisken från svampen i återhämtningsvattnet. Låt dem återhämta sig i lösningen i minst 15 minuter innan de återförs till akvariesystemet.
    10. Överför milten till ett förberedt rör med förvärmd aktiveringslösning och pipettera upp och ner flera gånger genom att suga och blåsa på sugrörsenheten.
    11. Homogenisera de utspädda spermierna försiktigt genom att snärta rören före analys.
      OBS: För bästa resultat, analysera prover omedelbart (t.ex. 5 s) efter aktivering. I medaka kan analysen fördröjas, om det behövs, eftersom spermierna förblir rörliga i flera timmar, men tiden bör förbli konsekvent mellan proverna eftersom rörligheten minskar med tiden.
  2. Spermsamling genom testiklar dissektion
    1. Förbered 0,08% eutanasilösning genom att späda två rör trikainlager (0,6%) i 26 ml akvarievatten i en 100 ml glasbehållare.
    2. Förbered dissektionsverktyg, inklusive trubbiga och fina tångar och små dissekerande saxar (figur 1E).
    3. Bered ett rör för varje prov med 120 μl aktiveringslösning för omedelbar analys. Förvärm den aktiverande lösningen i ett vattenbad eller inkubatorset till 27 °C i minst 5 minuter.
      OBS: Även om prover kan analyseras från enskilda fiskar, kan individuell variation minskas genom att slå samman prover från flera hanar i samma aktiverande lösning. För att samla prover från flera fiskar, använd 120 μl aktiveringslösning per fisk. Denna utspädning kan behöva justeras beroende på stam- eller uppfödningsförhållandena för den medaka som används eftersom dessa faktorer kan påverka spermiernas koncentration och volym. CASA-programmet kommer att indikera om koncentrationen är för hög för att identifiera spermier.
    4. Euthanize fisken genom att lägga den i 0,08% bedövningslösning i 30-90 s.
      OBS: Varaktigheten beror på fiskens storlek. För att säkerställa att fisken avlivas, vänta tills operculumrörelserna upphör. Fisken ska inte reagera på beröring av pincett.
    5. Ta bort fisken från eutanasilösningen och torka försiktigt fisken med en pappershandduk eller torka försiktigt.
      OBS: I detta steg kan fisken vägas för att senare beräkna det gonadosomatiska indexet (GSI, gonadal vikt / kroppsvikt).
    6. Placera fisken under ett dissekerande mikroskop med vänster sidosida uppåt (figur 1F).
    7. Använd en liten dissekerande sax, skär en flik dorsalt från cloaca och sedan över revbenen till gälarna för att exponera de inre organen (Figur 1G).
    8. Leta reda på testiklarna, skär fästet i båda ändarna med fina pincett och ta bort testiklarna (figur 1H).
      OBS: För att beräkna GSI kan testiklarna vägas i detta steg. Arbeta snabbt för att undvika torkning av vävnaden.
    9. Överför testiklarna till ett berett rör med den förvärmda aktiveringslösningen.
    10. Använd pincett för att krossa testiklarna flera gånger mot sidan av röret för att frigöra spermierna. Spermfrisättning kan vanligtvis visualiseras och gör lösningen något grumlig.
    11. Homogenisera de utspädda spermierna försiktigt genom att snärta rören före analys.
      OBS: För bästa resultat, analysera prover omedelbart (t.ex. 5 s) efter aktivering. I medaka kan analysen fördröjas, om det behövs, eftersom spermierna förblir rörliga i flera timmar, men tiden bör förbli konsekvent mellan proverna eftersom rörligheten minskar med tiden.

Figure 1
Figur 1: Miltuppsamling genom bukmassage (A-D) och testikeldissektion (E-H). (A) Instrument för bukmassage: hållsvamp, trubbiga släta pincett och 10 μL engångskalibrerad glasmikropipett med aspiratorrörsmontering; B) Fiskens placering i den hållna svampen, med gälar som utsätts för anestesi i svampen och cloaca uppåt. C) Placering av trubbiga släta tångar på buken och mikropipett mot cloaca. (D) Milt i mikropipett efter mild massage och sugning. (E) Instrument för dissektion av testiklar: trubbiga pincett, fina pincett och små dissekerande saxar. F) Fiskens placering för dissektion av testiklar. (G) Lateral vy av inre organ; (H) Ta bort testiklarna genom att klippa fästet i båda ändarna med fina pincett. Skalstreck: 2 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

3. Spermieanalys med CASA-system

  1. CASA-systemet (SCA Evolution) ska ställas in enligt manualen med mikroskop med ett grönt filter och 10x mål med faskontrast.
  2. Förbered engångsobjekt med 20 μm räknekammare genom att förvärma på en värmeplatta eller i en inkubatoruppsättning till 27 °C i minst 5 minuter.
  3. Öppna programvaran för spermieanalys och välj motilitetsmodulen.
  4. Ställ in konfigurationen för medaka som visas i figur 2B.
  5. Placera en förvärmd engångsdel på 20 μm räknekammare under mikroskopet på ett uppvärmt steg inställt på 27 °C.
  6. Pipettera provet i kammaren på bilden tills det fyller kammaren utan överfyllning. Torka försiktigt bort överflödiga prover från kammarens ingång med en bomullsspets eller torka försiktigt för att förhindra flytande celler.
  7. Välj Analysera för att titta på provet under mikroskopet.
    OBS: Om mikroskopikonen är röd måste mikroskopbelysningen justeras för att programmet ska kunna spåra spermier exakt. Justera mikroskopets ljusstyrka, så att spermiernas svansrörelse tydligt ses. Ikonen ska vara blå.
  8. Se till att mikroskopet är fokuserat och välj Analysera igen för att registrera spermierna i fältet. Flytta bilden så att ett nytt område i exemplet finns i bildrutan och upprepa för att fånga för 3-5 olika synfält. Undvik fält med luftbubblor, cellmassor eller artefakter.
  9. Välj Resultat för att visa resultaten.
    OBS: Om fälten på resultatsidan är markerade med rött, följ systemets anvisningar för att ta bort de fält som varierar för mycket i koncentration eller rörlighet.
  10. Dubbelklicka på ett fält för att se resultaten för det enskilda fältet eller för att manuellt söka efter felmärkta eller ospårade spermier. Högerklicka på enskilda spermier för att vid behov märka om rörligheten (figur 2A).

Figure 2
Bild 2: Skärmbild av SCA Evolution-programvaran . (A) Spermaspårningsresultat för ett fält. Visa fältdata på höger sida och dubbelklicka på spermatozoa för att visa enskilda data; (B) Resultatsammanfattning för alla fält med konfigurationsmenyn öppen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Typ av erhållna data
Spermiemotilitetsanalys från SCA Evolution-programvaran ger data om rörlighet (procentandel rörliga och immotila spermier), samt progressivitet (procentandel progressiva och icke-progressiva spermier) och hastighet (procentandel av snabba, medelstora och långsamma spermier). Den kombinerar också progressivitet och hastighet (snabb progressiv, medium progressiv, icke-progressiv). Dessa etiketter är baserade på mätningar (figur 3A) och beräkningar (Figure 3B) av spermatozoonrörelsen, som tillhandahålls av programmet (kompletterande tabell 1). För medaka anpassades följande tröskelvärden från de rekommenderade zebrafiskparametrarna baserat på tidigare litteratur 19,34,35 och fördelningen av medakadata från18 individer. Motiliteten baseras på krökt linjär hastighet (VCL) med immotil < 10 μm/s ≤ långsam < 20 μm/s ≤ medium ≤ 40 μm/s < snabb. Spermier anses vara progressiva om rakhetsindexet (STR) är > 68%.

SCA Evolution beräknar också koncentrationen av spermier om provets volym och utspädningen tillhandahålls. Medan bukmassagemetoden är till hjälp för att visualisera färgen och bekräfta närvaron av milten, är den uppsamlade volymen för liten för att mätas exakt. Om miltvolymen förbättras genom uppfödningsförhållanden eller med en annan belastning och kan mätas, kan programmet användas för att beräkna koncentrationen. Relativ koncentration kan emellertid också beräknas för att jämföra fisk eller behandlingsgrupper för prover som tagits genom testikeldissektion, så länge hela testiklarna dissekeras och späds ut i samma volym vätska.

Figure 3
Figur 3: Analys av spermatozoonrörelse. (A) Data som registreras av CASA-systemet inkluderar krökt linjär hastighet (VCL, hastighet beräknad med hjälp av avståndet längs den faktiska banan), genomsnittlig banhastighet (VAP, hastighet beräknad med hjälp av avståndet för den genomsnittliga banan), rak linjehastighet (VSL, hastighet beräknad med hjälp av avståndet mellan spermiespårets början och slut), amplitud av lateral huvudförskjutning (ALH, storleken på sidoförskjutningen av ett spermiehuvud om dess genomsnittliga väg), slå korsfrekvens (BCF, hastighet vid vilken den krökta banan korsar den genomsnittliga banan); (B) Beräknade värden från CASA-systemet inkluderar rakhetsindex (STR, linjäritet av den genomsnittliga banan), linjäritetsindex (LIN, linjäritet hos den krökta banan) och wobble (WOB, svängning av den faktiska banan om den genomsnittliga banan). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Utvärdering av spermierörlighet: Olika aktiverande lösningar
Överraskande nog var spermier som provtogs med både bukmassage och testikeldissektion immotila i akvarievatten (16 mOsmol / kg) (figur 4A) och i akvarievatten justerat med NaCl-lösning till 34 mOsmol / kg. Det fanns inte heller någon rörlighet i avjoniserat vatten (-1 mOsmol/kg) eller avjoniserat vatten justerat till 23 mOsmol/kg. Spermierna var rörliga i HBSS (287 mOsmol/kg) (figur 4B), liksom i HBSS utspädda med avjoniserat vatten till 36 mOsmol/kg och 113 mOsmol/kg, även om den procentuella rörligheten minskade signifikant vid 36 mOsmol/kg (figur 4C).

Figure 4
Figur 4: Motilitet genom osmolalitet av aktiverande lösning. Spermier som provtagits genom dissektion av testiklarna i (A) akvarievatten (16 mOsmol/kg) och (B) ojusterat HBSS (287 mOsmol/kg). Gula cirklar märker immotila spermier och färgade linjer indikerar spermiernas rörelse: röd (snabb progressiv), grön (medium progressiv), blå (icke-progressiv). Skalstång: 100 μm. (C)Spermiernas rörlighet aktiverad med HBSS vid 36, 113 och 287 mOsmol/kgH2O. För 36 och 113 är n = 4 med två fiskar poolade per prov. För 287 är n = 9 med två fiskar poolade per prov. Statistiska analyser utfördes med hjälp av en ANOVA med Tukey post-hoc-test och signifikanta skillnader indikeras med olika bokstäver. Uppgifterna representeras som medelvärde ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Provtagningsmetoder: Bukmassage kontra testiklar dissektion
Spermier som provtas genom testiklardissektion är betydligt mer rörliga jämfört med bukmassageprover från samma fisk (figur 5A). Av de rörliga spermierna är en högre andel också progressiva och medelstora eller snabbrörliga. I spermier som provtagits med bukmassage är mer rörliga spermier långsamma och icke-progressiva (figur 5B-C). Olika resultat kan dock erhållas genom att använda en annan stam av medaka (CAB) eller alternativa uppfödningsförhållanden (kompletterande tabell 2).

Figure 5
Figur 5: Magmassage kontra testikeldissektion. Procentandel (A) immotila och rörliga spermier som provtagits genom bukmassage eller dissektion av testiklar. Procentandel rörliga spermier som är (B) icke-progressiva och progressiva spermier och (C) långsamma, medelstora och snabbrörliga. Alla spermaprover aktiverades i HBSS (287 mOsmol/kgH2O). Statistiska analyser utfördes med hjälp av ett Mann-Whitney U-test och signifikanta skillnader indikeras med asterisker. Uppgifterna representeras som medelvärde ± SEM, n = 9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Motilitetens varaktighet enligt lagringsförhållanden
Spermier som provtogs genom dissektion av testiklarna och hölls vid 27 °C hade en 50% minskning av rörligheten under de första 30 minuterna efter aktivering. Efter 2,5 h var mindre än 5% av spermierna rörliga. Vid förvaring vid 4 °C reducerades rörligheten med endast 14 % under de första 30 minuterna, och det tog 5 timmar att se en 50% minskning från den ursprungliga rörligheten. Is hade en liknande utvidgande effekt, men var mindre effektiv, med en 26% motilitetsminskning under de första 30 minuterna (figur 6A). Progressiviteten minskade också med 52 % under de första 30 minuterna på is, jämfört med 65 % vid 27 °C och 33 % vid 4 °C (figur 6B). Både på is och vid 4 °C rörde sig fortfarande vissa spermier (<3 %) 42 timmar efter aktivering.

Figure 6
Figur 6: Spermiernas livslängd enligt lagringsförhållanden. Procentuell (A) rörlighet och (B) progressivitet över tid för prover som aktiverats med HBSS (287 mOsmol/kgH2O) och lagrats vid 27 °C, 4 °C eller på is. Datapunkterna är medelvärde ± SEM, n = ≥4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Betydelsen av miljö- och bostadsförhållandena
Hanar som var inhysta tillsammans med honor provtogs genom testiklardissektion på morgonen innan de fick möjlighet att leka (innan lamporna tändes) eller efter att lamporna tändes och honor i tanken hade ägg. Det fanns ingen signifikant skillnad i spermiernas rörlighet. Män som var inrymda utan honor i en månad provtogs också, och även om det fanns en trend med högre rörlighet var skillnaden inte heller signifikant (figur 7).

Men när CAB-stam medaka höjdes i en annan anläggning med män separerade från honor i minst en månad var fisken större och 5-7 μL milt samlades in genom bukmassage. Prover som samlats in från fem fiskar genom bukmassage hade en rörlighet på 68,34% när de aktiverades med 300 mOsmol/kg HBSS. När den hölls under samma förhållanden men med kvinnor var volymen av milt som samlades in cirka 2 μL och den genomsnittliga rörligheten var 46,2% från tre män (kompletterande tabell 2).

Figure 7
Figur 7. Effekt av miljöförhållanden på spermiernas rörlighet. Procentuell rörlighet hos spermier som provtagits före (n = 5) och efter (n = 4) lek från hanar som var inhysta tillsammans med honor, och spermier från hanar inhysta utan honor (n = 6). Alla prover provtogs genom dissektion av testiklarna och aktiverades med HBSS (287 mOsmol/kgH2O). Statistiska analyser utfördes med hjälp av t-tester och skillnaderna var inte signifikanta. Data visas som medelvärde ± SEM med cirklar som representerar enskilda fiskar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande tabell 1: Beräkningar av medelhastighet och rörelse för spermier som provtagits genom bukmassage och testikeldissektion (n = 9). Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande tabell 2: Spermaanalysdata från CAB-stam (även kallad Carbio) medaka uppfödd vid INRAE i Rennes, Frankrike. Alla prover aktiverades i 300 mOsmol/kg HBSS. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Osmolalitet är en viktig faktor vid aktivering av fisksperma36,37. I allmänhet är spermier immotila i testiklarna och blir rörliga i media som är hyperosmotiska i förhållande till sädesvätska för marina fiskar och hypo-osmotiska i förhållande till sädesvätska för sötvattensfiskar37. I likhet med blod är sädesplasma i sötvattensfiskar vanligtvis lägre än hos marina fiskar (cirka 300 mOsmol/kg jämfört med 400 mOsmol/kg)22,37. Således aktiveras fisksperma vanligtvis vid kontakt med vattnet där de lever, och detta vatten fungerar som det bästa och mest biologiska aktiveringsmediet för spermieanalys. Medaka-spermier som provtogs genom bukmassage och testikeldissektion var dock inte rörliga i akvarievatten (figur 4A) i Hd-rR- eller CAB-stammedaka uppfödda i två olika laboratorier. Dessutom var rörligheten högre i 287 mOsmol/kg HBSS än i 36 mOsmol/kg HBSS (figur 4C), vilket är ovanligt för en sötvattensfisk.

De flesta tidigare studier med spermieanalys i medaka använde HBSS 28,29,38 eller Yamamoto lösning 18,19 som aktiverande medium för medaka-spermier utan att diskutera osmolalitet. Medan HBSS är ett bra aktiverande medium för medaka-spermier, kan variation i osmolalitet påverka rörligheten. Det är därför viktigt för spermieanalysstudier att avslöja osmolalitet hos deras aktiverande lösning för jämförelse mellan experiment. En studie som undersökte den ideala osmolalitet hos aktiveringsmediet fann att medaka-spermier är rörliga i avjoniserat vatten (25 mOsmol / kg) och HBSS med osmolalitet värden < 686 mOsmol / kg, med den högsta rörligheten mellan 25 och 227 mOsmol / kg17. Men i den aktuella studien var spermier inte heller rörliga i avjoniserat vatten. Som en euryhaline fisk är medaka mycket anpassningsbara till olika miljöer och kan till och med leva och reproducera i saltvatten39, så det är möjligt att olika uppfödningsförhållanden är ansvariga för denna skillnad. Intressant nog har inga andra studier rapporterat att man testat medaka spermierörlighet i akvarievatten (eller liknande, såsom åldrat kranvatten), även om det är standardspermaaktiveringsmediet för sötvattensfisk.

En möjlig förklaring till denna atypiska spermieaktivering i medaka är interaktion med äggstocksvätskan. Medan fisksperma vanligtvis aktiveras i det omgivande vattnet, ökar eller förlänger äggstocksvätskan varaktigheten av spermiernas rörlighet hos många arter40,41. Även om medaka externt gödslar sötvattensfisk, sätter deras gytbeteende, som inkluderar finomslagning och darrning, dem i mycket närmare närhet än broadcast spawners23. Eftersom osmolalitet av äggstocksvätska i sötvattenfisk (ca 300 mOsmol / kg) ligger nära HBSS40, är det möjligt att vätska som frigörs av honan aktiverar spermierna, inte akvariet. Eftersom osmolalitet hos seminal och äggstocksplasma är likartade är det möjligt att den joniska sammansättningen av medaka äggstocksvätska spelar en viktig roll40,42. Rollen av äggstocksvätska och joner för att aktivera medaka spermier motiverar ytterligare undersökning.

I tidigare studier har medaka-spermier endast samlats in genom att krossa dissekerade testiklar 17,28,29,30 eller genom bukmassage för att uttrycka milten direkt i aktiverande medium 18,19,20; Inga studier har rapporterat data med spermier som samlats in genom bukmassage i ett kapillärrör, även om det är vanligt hos zebrafiskar och andra teleostfiskar 33,43,44. Denna metod är också möjlig i medaka. Milt visualiseras enkelt i kapillärröret, och även om volymen är för liten för att mätas exakt, möjliggör denna metod bekräftelse av framgångsrik insamling och analys av färg som en snabb indikator på kvalitet32. Undvikande av fekal kontaminering är också lättare med uppsamling i ett kapillärrör jämfört med i medium. Även om spermaprover som samlats in genom testikeldissektion har bättre rörlighet i medaka än prover som samlats in med bukmassage (figur 5) och därför är att föredra för experiment där fisken kan offras, är bukmassage ett minimalt invasivt förfarande som inte kräver eutanasi och kan upprepas i samma fisk. Därför är det användbart för experiment som följer samma fisk över tiden. Prover som samlas in med bukmassage innehåller också endast mogna celler som frigörs med seminalplasma44, medan prover från testikeldissektion kan inkludera omogna spermier och annat skräp. CASA-systemet rabatterar runda celler och skräp som är större än maxområdet, men om denna parameter är inställd för hög kan motilitetsresultaten påverkas.

På grund av den låga mängden spermier som samlats in med bukmassagetekniken i dessa medaka var det omöjligt att exakt mäta spermiernas volym i kapillären och därmed beräkna spermiekoncentrationer med hjälp av regelbundna tillvägagångssätt. För prover som tas genom dissektion av testiklar, genom att hålla volymen av aktiveringsmediet konsekvent och väga testiklarna, kan dock en relativ koncentration beräknas baserat på spermiekoncentrationen som ges av CASA-systemet för att jämföra mellan individer eller behandlingsgrupper. Förutom kvalitetsanalys är relativ koncentration också användbar för att bestämma optimala provutspädningar för kryokonservering. Om volymen som samlas in genom bukmassage förbättras genom uppfödningsförhållanden eller med en annan belastning, kan volymen beräknas genom att mäta miltens höjd i kapillärröret och anges i programmet för att beräkna koncentrationen. I dessa fall, där flera mikroliter kan erhållas, kan rörligheten vara högre genom bukmassage än testikeldissektion (tilläggstabell 2). När låga volymer samlas in är proverna mer benägna att kontamineras, vilket kan påverka rörligheten, även om dessa effekter verkar vara konsekventa när volymerna är likartade, så jämförelser kan fortfarande göras mellan behandlingsgrupper. Jämförelser bör dock inte göras mellan prover som varierar kraftigt i volym eller färgning av milt.

Den låga volymen milt erhållen från medaka med bukmassage kan vara en begränsning för experiment som kräver en stor volym milt. I sådana fall kan testikeldissektion vara att föredra, vilket framgår av en studie som samlade milt från zebrafisk och grön svärdstjärt genom både dissektion och massage, men endast genom dissektion i medaka på grund av låg volym30. Testes dissektion är vanligtvis bättre för jämförelser med andra arter av samma anledning. Den begränsade volymen av bukmassage jämfört med andra fiskar av liknande storlek kan bero på mindre testiklar (1,9 ± 0,6 mg i medaka jämfört med 7,0 ± 2,5 mg i zebrafisk 45) och mindre spermier som produceras (2,0 ± 0,4 x 10 6 spermier/mg testiklar i medaka jämfört med 7,7 ± 2,0 x 106 spermier/mg testiklar i zebrafisk46), eller till andra okända biologiska faktorer som begränsar tekniken, som föreslås i kläckeriuppfödd afrikansk havskatt47. Skillnaden kan vara fysiologisk, beroende på stam- eller miljöförhållanden, eller anatomisk, eftersom medaka-testiklarna till skillnad från zebrafiskar smälts och lokaliseras mer medialt och därför kan vara svårare att komma åt genom bukmassage, även om det också finns andra fiskar med smälta testiklar.

För vissa arter, som zebrafisk, är det bäst att ta prover på spermier innan fisken har en chans att leka på morgonen48 eller att isolera män i enskilda tankar kvällen innan för att förhindra lek32. Med Hd-rR medaka från denna studie hade miljöförhållanden som tidpunkt för provtagning (före eller efter gytning) och bostadsförhållanden (med eller utan honor i 1 månad) ingen signifikant effekt på spermiernas rörlighet (figur 7). Det är möjligt att en större provstorlek eller isolering av män från honor under en längre tid kan ge högre spermiemängd och/eller rörlighet. I CAB-stammedaka från en annan anläggning sågs en liknande trend med bättre spermiekvalitet och volym från män som var ensamma jämfört med män som var inrymda med honor (för få fiskar testades för att dra statistiska slutsatser). Det var också möjligt med dessa fiskar att samla relativt höga volymer milt genom bukmassage (kompletterande tabell 2), även om mycket små volymer milt erhölls med hjälp av Hd-rR-stam medaka, och andra har rapporterat små volymer också med samma teknik i CAB-stam medaka30. Huruvida dessa skillnader beror på stammen (som är en kommersiell stam snarare än inavlad) eller på grund av uppfödningsskillnader (det finns många mellan anläggningar), är dock fortfarande oklart. I dessa fiskar kunde flera mikroliter milt samlas in, vilket begränsar föroreningen och förbättrar kvaliteten. Men för experiment där det är viktigt att sambo båda könen verkar det inte nödvändigt att separera dem för att ge resultat. Det verkar inte heller nödvändigt att prova män åt gången före gytning.

Även om ytterligare studier krävs för att bestämma exakt hur medaka-spermier skiljer sig beroende på befolknings- och miljöfaktorer, bör stam- och uppfödningsförhållandena ändå beaktas vid utformningen av experimentuppställningen, och försiktighet bör iakttas vid jämförelse mellan populationer som producerar olika mängder spermier. Om större volymer milt erhålls bör utspädningen av aktiveringslösningen justeras (t.ex. 1:60, även om den föredragna koncentrationen kan variera med CASA-systemet). På samma sätt, om de dissekerade testiklarna är mycket större än typiskt (2 mg) på grund av stam- eller uppfödningsförhållandena, måste utspädningen ökas så att CASA-programmet kan märka alla spermier exakt.

Metoder för spermieanalys varierar mycket för medaka och är ofta subjektiva, vilket gör resultaten svåra att jämföra mellan studier. En studie som jämförde subjektiva och objektiva metoder som används av tekniker med varierande kompetensnivåer fann att mycket erfarna tekniker kan uppskatta fiskspermans rörlighet inom 10 procentenheter av de data som tillhandahålls av ett CASA-motilitetsprogram, medan tekniker med medelhög och låg erfarenhet överskattar CASA-motilitetsvärdena med amplituder upp till 30 procentenheter21 . En brist på standardisering för de parametrar som bestämmer rörligheten i medaka kan emellertid också orsaka variation mellan dem som använder mer objektiva metoder. Till exempel hade en studie som registrerade spermier med 33 bilder per sekund (fps), analyserade 30 bilder och ansåg att spermier rörde sig snabbare än 2 μm / s rörliga en genomsnittlig hastighet på cirka 60 μm / s och rörlighet på cirka 70% för deras kontrollfisk18. En annan studie med samma protokoll hade en genomsnittlig hastighet på 40 μm/s för kontrollspermier och en procentuell rörlighet över 80%19. En annan grupp, som analyserade 200 bilder vid 47 fps, hade en genomsnittlig VCL över 100 um/s för kontrollfisk, men en genomsnittlig rörlighet under 50%. De avslöjade inte vilka parametrar som bestämde rörligheten. Så i detta protokoll används datorstödd spermaanalysprogramvara för att analysera spermier objektivt, snabbt och pålitligt baserat på en uppsättning parametrar som har anpassats för egenskaperna hos medaka-spermier. Eftersom det är avgörande för motilitetsparametrar att vara konsekventa för jämförelser mellan laboratorier, är den fullständiga konfigurationen som används i denna studie tillgänglig (figur 2B), så detta protokoll kan replikeras på ett tillförlitligt sätt i ett annat laboratorium av olika forskare.

Teleostfisk uppvisar en stor mångfald av spermieegenskaper, så även om detta protokoll ursprungligen testades med de rekommenderade zebrafiskparametrarna för SCA Evolution-programvaran, var det uppenbart att parametrarna skulle behöva justeras för medaka-spermier med lägre hastighet och längre livslängd. Så, zebrafiskparametrar anpassades till medaka med hjälp av litteratur från medaka och andra arter som rapporterade liknande spermieegenskaper 19,34,35 och valde de trösklar som bäst passar fördelningen av 17,580 analyserade spermier spår från18 individer. Motiliteten baseras på krökt linjär hastighet (VCL) med immotil < 10 μm/s ≤ långsam < 20 μm/s ≤ medium ≤ 40 μm/s < snabb. Spermier anses vara progressiva om rakhetsindex (STR) är > 68%. Tröskeln som definierar rörlighet hölls vid 10 μm/s i stället för 2 μm/s, som används i viss litteratur18,19, eftersom många spermier som saknade flagellär rörelse var felmärkta som rörliga med denna inställning. Andra fiskarter med liknande storlek spermiehuvuden (~ 2 μm) använde också 10 μm / s för att definiera rörliga spermier35,43. Den maximala ytan minskades från zebrafiskinställningen på 90 μm 2 till 20 μm2 så att stora cellulära skräp från testiklardissektion skulle ignoreras.

Varaktigheten av rörligheten verkar vara beroende av mängden ATP som lagras före aktivering, eftersom flagellär rörelse kräver en snabb energiförbrukning. Sannolikt på grund av denna snabba utmattning finns det en korrelation mellan spermier med hög initialhastighet och en kortare varaktighet av rörlighet49. Medan en osmotisk chock vanligtvis krävs för att aktivera fisksperma, kan det också leda till membranskador under rörlighetsperioden, vilket också kan påverka livslängden. Denna effekt är mer kritisk hos sötvattensarter49, vilket kan förklara varför marina spermier kan ha längre rörlighetstid (cirka 550 s i genomsnitt jämfört med cirka 150 s för sötvattensarter), trots att de uppvisar en liknande genomsnittlig hastighet och rörlighet som sötvattensperma 14,22. Motilitetstid längre än 30 min är inte vanligt, men det har rapporterats hos flera marina arter22,49. Trots att det är en sötvattensfisk passar resultaten med medaka profilen för spermier som har en lägre hastighet och längre varaktighet från marina arter. Detta kan vara relaterat till aktiveringen i medium som liknar seminal plasma - utan en osmotisk chock, medaka spermier lider sannolikt inte membranskador som liknar andra sötvattensfiskar.

En icke-aktiverande lösning och mycket snabb, konsekvent tidsinställd analys efter aktivering är ofta nödvändig för analys av spermier som bara är rörliga i minuter. Medaka-spermiernas rörlighet varar dock naturligt i flera timmar och högre rörlighet kan bevaras genom förvaring vid 4 °C eller på is (figur 6). För experiment där omedelbar analys inte är möjlig kan protokollet modifieras så att till exempel testiklar lagras i aktiverande lösning på is i en timme, så länge uppsamlingstiden registreras så att analysen kan förbli konsekvent. Men för optimala resultat är omedelbar analys fortfarande det bästa alternativet. Även om rörligheten fortfarande minskar, eftersom den är gradvis, påverkas resultaten mindre av mindre skillnader i analystid efter aktivering. Ändå är det viktigt att rapportera både lagringstemperaturen för prover och analystiden efter aktivering så att data kan jämföras och reproduceras.

Det är också vanligtvis mycket viktigt hos fisk att undvika kontaminering av milt med urin vid provtagning, eftersom detta kan förändra osmolalitet och i förtid aktivera spermierna16,50. Detta är emellertid mindre oroande i medaka (på grund av den längre varaktigheten av rörlighet) och med detta protokoll, eftersom provet placeras omedelbart i aktiveringsmedium. Låga volymer milt är benägna att urinkontaminera, så viss missfärgning kan förväntas med bukmassage från medaka när låga volymer anskaffas. Men om detta är konsekvent i befolkningen kan jämförelser fortfarande göras mellan behandlingsgrupper. Försiktighet bör iakttas vid jämförelse av populationer av medaka som varierar i milts volym eller färg.

Eftersom spermieanalysresultaten är mycket beroende av de metoder som används, är detaljerade och pålitliga metoder som lätt kan upprepas i olika laboratorier fördelaktiga. Det är också viktigt för papper att avslöja detaljer om sina metoder för att möjliggöra repeterbarhet. Eftersom medaka används alltmer som modell för reproduktionsforskning saknas information om bedömning av spermiekvalitet. De två olika metoderna som beskrivs i detta dokument för spermaprovtagning kan vara fördelaktiga för olika experiment. Testiklardissektion ger vanligtvis spermier med högre rörlighet och möjliggör relativa koncentrationsberäkningar, medan bukmassage kan göras upprepade gånger på samma fisk och är en mer ren, biologisk representation av en lekhändelse. Detta manuskript tillhandahåller därför parametrarna för CASA, vilket är en pålitlig, objektiv teknik som ger gott om data om spermierörelser, inklusive rörlighet, progressivitet, hastighet och andra kinematiska parametrar. Dessa protokoll kommer således att vara användbara för en mängd olika studier inom medaka, inklusive toxikologi, ekologi, reproduktion och fysiologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete har finansierats av Norges universitet för livsvetenskaper och det amerikanska Fulbright-programmet. Författarna vill tacka Anthony Peltier och Lourdes Carreon G Tan vid NMBU för underhåll av fiskanläggningar och Guillaume Gourmelin från ISC LPGP vid INRAE (Frankrike) för att ha tillhandahållit fisk- och laboratorieutrymme för att ytterligare testa dessa metoder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL tubes Axygen MCT-150-C Any standard brand can be used
10 µL disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assembly Drummond 2-000-010
10x objective with phase contrast Nikon MRP90100
2 mL tubes Axygen MCT-200-c-s Any standard brand can be used
Blunt forceps Fine Science Tools 11000-12
Blunt smooth forceps Millipore XX6200006P
Disposable 20 micron counting chamber slide Microptic 20.2.25  Leja 2 chamber slides
Dissecting microscope Olympus SZX7 Any standard brand can be used
Fine forceps Fine Science Tools 11253-20
HBSS Sigmaaldrich H8264-1L
Holding sponge self-made
Inverted microscope Nikon Eclipse Ts2R
SCA Evolution Microptic
Small dissecting scissors Fine Science Tools 14090-09
Sodium Chloride (NaCl) Sigmaaldrich S9888
Tabletop vortex Labnet C1301B
Tricaine Sigmaaldrich A5040

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shima, A., Mitani, H. Medaka as a research organism: past, present and future. Mechanisms of Development. 121 (7-8), 599-604 (2004).
  2. Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka - a model organism from the far east. Nature Reviews Genetics. 3 (1), 53-64 (2001).
  3. Kasahara, M., et al. The medaka draft genome and insights into vertebrate genome evolution. Nature. 447 (7145), 714-719 (2007).
  4. Matsuda, M., et al. DMY is a Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish. Nature. 417 (6888), 559-563 (2002).
  5. Sakamoto, T., Kozaka, T., Takahashi, A., Kawauchi, H., Ando, M. Medaka (Oryzias latipes) as a model for hypoosmoregulation of euryhaline fishes. Aquaculture. 193 (3-4), 347-354 (2001).
  6. Royan, M. R., et al. 3D atlas of the pituitary gland of the model fish medaka (Oryzias latipes). Frontiers in Endocrinology. 12, 719843 (2021).
  7. Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy brain-pituitary slices for electrophysiological investigations of pituitary cells in teleost fish. Journal of Visualized Experiments. (138), e57790 (2018).
  8. Fontaine, R., Weltzien, F. -A. Labeling of blood vessels in the teleost brain and pituitary using cardiac perfusion with a dii-fixative. Journal of Visualized Experiments. (148), e59768 (2019).
  9. Ager-Wick, E., et al. Preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
  10. Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. Journal of Visualized Experiments. (46), e1937 (2010).
  11. Wiley-Blackwell. Medaka: Biology, Management, and Experimental Protocols. , Wiley-Blackwell. (2019).
  12. Royan, M. R., et al. Gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (Oryzias latipes). Journal of Visualized Experiments. (166), e62006 (2020).
  13. Bhat, I. A., et al. Testicular development and spermatogenesis in fish: insights into molecular aspects and regulation of gene expression by different exogenous factors. Reviews in Aquaculture. 13 (4), 2142-2168 (2021).
  14. vander Horst, G., Garcia Alvarez, O., Garde, J. J., Soler, A. J., Jones, D. Status of sperm functionality assessment in wildlife species: From fish to primates. Animals. 11 (6), 1491 (2021).
  15. Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 130 (4), 425-433 (2001).
  16. Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234 (1-4), 1-28 (2004).
  17. Yang, H., Tiersch, T. R. Sperm motility initiation and duration in a euryhaline fish, medaka (Oryzias latipes). Theriogenology. 72 (3), 386-392 (2009).
  18. Hashimoto, S., et al. Effects of ethinylestradiol on medaka (Oryzias latipes) as measured by sperm motility and fertilization success. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 56 (2), 253-259 (2009).
  19. Hara, Y., Strüssmann, C. A., Hashimoto, S. Assessment of short-term exposure to nonylphenol in Japanese medaka using sperm velocity and frequency of motile sperm. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 53 (3), 406-410 (2007).
  20. Kawana, R., Strüssmann, C. A., Hashimoto, S. Effect of p-Nonylphenol on sperm motility in Japanese medaka (Oryzias latipes). Fish Physiology and Biochemistry. 28, 213-214 (2003).
  21. Gallego, V., Herranz-Jusdado, J. G., Rozenfeld, C., Pérez, L., Asturiano, J. F. Subjective and objective assessment of fish sperm motility: when the technique and technicians matter. Fish Physiology and Biochemistry. 44 (6), 1457-1467 (2018).
  22. Browne, R. K., et al. Sperm motility of externally fertilizing fish and amphibians. Theriogenology. 83 (1), 1-13 (2015).
  23. Arias Padilla, L. F., et al. Cystic proliferation of germline stem cells is necessary to reproductive success and normal mating behavior in medaka. eLife. 10, 62757 (2021).
  24. Okuyama, T., Yokoi, S., Takeuchi, H. Molecular basis of social competence in medaka fish. Development, Growth, and Differentiation. 59 (4), 211-218 (2017).
  25. Okubo, K., et al. Forebrain Gonadotropin-releasing hormone neuronal development: Insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome. Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).
  26. Hodne, K., Fontaine, R., Ager-Wick, E., Weltzien, F. A. Gnrh1-induced responses are indirect in female Medaka Fsh cells, generated through cellular networks. Endocrinology. 160 (12), 3018-3032 (2019).
  27. Karigo, T., et al. Whole brain-pituitary in vitro preparation of the transgenic Medaka (Oryzias latipes) as a tool for analyzing the differential regulatory mechanisms of LH and FSH release. Endocrinology. 155 (2), 536-547 (2014).
  28. Kowalska, A., Kowalski, R., Zakęś, Z. The effect of selective cyclooxygenase (COX) inhibitors on japanese medaka (Oryzias latipes) reproduction parameters. World Academy of Science, Engineering and Technology. 77, 19-23 (2011).
  29. Kowalska, A., Siwicki, A. K., Kowalski, R. K. Dietary resveratrol improves immunity but reduces reproduction of broodstock medaka Oryzias latipes (Temminck & Schlegel). Fish Physiology and Biochemistry. 43 (1), 27-37 (2007).
  30. Tan, E., Yang, H., Tiersch, T. R. Determination of sperm concentration for small-bodied biomedical model fishes by use of microspectrophotometry. Zebrafish. 7 (2), 233-240 (2010).
  31. Harvey, B., Kelley, R. N., Ashwood-Smith, M. J. Cryopreservation of zebra fish spermatozoa using methanol. Canadian Journal of Zoology. 60 (8), 1867-1870 (1982).
  32. Wasden, M. B., Roberts, R. L., DeLaurier, A. Optimizing sperm collection procedures in Zebrafish. Journal of the South Carolina Academy of Science. 15 (2), 7 (2017).
  33. Draper, B. W., Moens, C. B. A High-throughput method for Zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments. (29), e1395 (2009).
  34. Castellini, C., Dal Bosco, A., Ruggeri, S., Collodel, G. What is the best frame rate for evaluation of sperm motility in different species by computer-assisted sperm analysis. Fertility and Sterility. 96 (1), 24-27 (2011).
  35. Acosta, I. B., et al. Effects of exposure to cadmium in sperm cells of zebrafish, Danio rerio. Toxicology Reports. 3, 696-700 (2016).
  36. Wilson-Leedy, J. G., Kanuga, M. K., Ingermann, R. L. Influence of osmolality and ions on the activation and characteristics of zebrafish sperm motility. Theriogenology. 71 (7), 1054-1062 (2009).
  37. Alavi, S. M. H., Cosson, J. Sperm motility in fishes. (II) Effects of ions and osmolality: A review. Cell Biology International. 30 (1), 1-14 (2006).
  38. Kowalska, A., Kamaszews ki, M., Czarnowska-Kujawska, M., Podlasz, P., Kowalski, R. K. Dietary ARA improves COX activity in broodstock and offspring survival fitness of a model organism (Medaka Oryzias latipes). Animals. 10 (11), 2174 (2020).
  39. Inoue, K., Takei, Y. Asian medaka fishes offer new models for studying mechanisms of seawater adaptation. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 136 (4), 635-645 (2003).
  40. Zadmajid, V., Myers, J. N., Sørensen, S. R., Ernest Butts, I. A. Ovarian fluid and its impacts on spermatozoa performance in fish: A review. Theriogenology. 132, 144-152 (2019).
  41. Poli, F., Immler, S., Gasparini, C. Effects of ovarian fluid on sperm traits and its implications for cryptic female choice in zebrafish. Behavioral Ecology. 30 (5), 1298-1305 (2019).
  42. Cosson, J., Groison, A. L., Suquet, M., Fauvel, C., Dreanno, C., Billard, R. Studying sperm motility in marine fish: An overview on the state of the art. Journal of Applied Ichthyology. 24 (4), 460-486 (2008).
  43. Beirão, J., Soares, F., Herráez, M. P., Dinis, M. T., Cabrita, E. Sperm quality evaluation in Solea senegalensis during the reproductive season at cellular level. Theriogenology. 72 (9), 1251-1261 (2009).
  44. Beirão, J., et al. Sperm handling in aquatic animals for artificial reproduction. Theriogenology. 133, 161-178 (2019).
  45. Yang, H., Tiersch, T. R. Current status of sperm cryopreservation in biomedical research fish models: Zebrafish, medaka, and Xiphophorus. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 149 (2), 224-232 (2009).
  46. Yang, H., Tiersch, T. R. Sperm cryopreservation in biomedical research fish models. Cryopreservation in Aquatic Species. 2, 439-454 (2011).
  47. Viveiros, A., Fessehaye, Y., ter Veld, M., Schulz, R., Komen, H. Hand-stripping of semen and semen quality after maturational hormone treatments, in African catfish Clarias gariepinus. Aquaculture. 213 (1-4), 373-386 (2002).
  48. Ransom, D. G., Zon, L. I. Appendix 3 collection, storage, and use of Zebrafish sperm. Methods in Cell Biology. 60, 365-372 (1998).
  49. Cosson, J. Frenetic activation of fish spermatozoa flagella entails short-term motility, portending their precocious decadence. Journal of Fish Biology. 76 (1), 240-279 (2010).
  50. Kowalski, R. K., Cejko, B. I. Sperm quality in fish: Determinants and affecting factors. Theriogenology. 135, 94-108 (2019).

Tags

Biologi Utgåva 188 könskörtlar spermier milt testiklar medaka fisk reproduktion casa
Spermieuppsamling och datorstödd spermieanalys i teleostmodellen japansk medaka (<em>Oryzias latipes</em>)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Closs, L., Sayyari, A., Fontaine, R. … More

Closs, L., Sayyari, A., Fontaine, R. Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes). J. Vis. Exp. (188), e64326, doi:10.3791/64326 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter