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Immunology and Infection

Kontaktüberempfindlichkeit als murines Modell der allergischen Kontaktdermatitis

Published: September 26, 2022 doi: 10.3791/64329
Automatic Translation
1, 2, 1, 3
1Department of Clinical Immunology, Wroclaw Medical University, 2Department of Medical Physiology, Chair of Biomedical Sciences, Institute of Physiotherapy, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, 3Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College

ERRATUM NOTICE

Summary

Kontaktüberempfindlichkeit (CHS) ist ein murines experimentelles Modell der allergischen Kontaktdermatitis (ACD). CHS basiert auf der Sensibilisierung mit reaktivem Hapten durch Lackieren der rasierten Haut von Brust und Bauch, mit einer anschließenden Ohrhautherausforderung mit einem verdünnten Hapten, was eine Schwellungsreaktion verursacht, die auf verschiedene Arten beurteilt wird.

Abstract

Kontaktüberempfindlichkeit (CHS) ist ein experimentelles Modell der allergischen Kontaktdermatitis (ACD), das an Mäusen untersucht werden kann. Diese Studie zielt darauf ab, eine objektive Labormethode vorzustellen, die helfen kann, die CHS-Reaktion in Mäusen zu untersuchen, die durch verschiedene Tests gemessen und quantifiziert werden kann. Um CHS zu induzieren, wurden Mäuse am Tag "0" an einer zuvor rasierten Stelle durch Bauchhautmalerei mit dem hapten 2,4,6-Trinitrochlorbenzol (TNCB) in einem Aceton-Ethanol-Gemisch sensibilisiert, während Negativkontrollmäuse mit Vehikel-Alone-Aceton-Ethanol-Gemisch scheinsensibilisiert wurden. Am Tag "4" wurde die Grundohrendicke mit einem Mikrometer vor der Auslösung von CHS (Challenge) gemessen, indem beide Ohren mit verdünntem TNCB sowohl in der Test- als auch in der Kontrollgruppe lackiert wurden. Nach 24 h wurde die Ohrschwellung mit einem Mikrometer gemessen. CHS ist ein Beispiel für eine T-Zell-vermittelte Immunantwort, die Schwellungen in entzündetem Gewebe verursacht und 24 Stunden nach der Hautherausforderung mit der gleichen Hapten ihren Höhepunkt erreicht. Eine Zunahme des Ohrödems korrelierte mit erhöhtem Ohrgewicht, Myeloperoxidase (MPO) -Aktivität, entzündungsfördernder Zytokinkonzentration in den Ohrextrakten, erhöhter Verdickung der ödematösen Dermis in der histologischen Untersuchung und Ohrvaskulärpermeabilität. Es gab auch einen Anstieg der Konzentration von TNP-spezifischen IgG1-Antikörpern in den Seren der Testgruppe im Vergleich zu den Kontrollmäusen. Darüber hinaus kann CHS erfolgreich mit den CHS-Effektorzellen übertragen werden, die von Spendern erhalten wurden, die zuvor mit TNCB sensibilisiert wurden. Die CHS-Effektorzellen wurden intravenös in naive Empfängermäuse verabreicht, die anschließend mit dem gleichen verdünnten Hapten herausgefordert wurden. Die Ohrschwellung wurde 24 Stunden später mit einem Mikrometer gemessen.

Introduction

Allergische Kontaktdermatitis (ACD) ist eine häufige entzündliche Hauterkrankung in Industrieländern, die durch eine Typ-IV-Überempfindlichkeitsreaktion verursacht wird, die sich aus der Exposition gegenüber niedermolekularen Chemikalien, den sogenannten Hapenten, ergibt. Zu den Substanzen, die beim Menschen eine Kontaktsensibilisierung verursachen, gehören Schwermetallionen (Chrom, Nickel, Eisen, Kobalt), Terpentin, Duftstoffe, Farbstoffe und Konservierungsstoffe, die in Kosmetika enthalten sind (z. B. p-Phenylendiamin), einige Medikamente (z. B. Neomycin, Benzocain), β-Lactam-Antibiotika (dh Penicillin), von Pflanzen hergestellte Chemikalien (Penadecacatechol, eine Substanz, die in Giftefeu vorhanden ist) sowie Hydrochinon, das in der Fotoindustrie verwendet wird1,2 . Die ätiologischen Wirkstoffe der ACD sind sehr hoch, da allein in der Industrie über 100.000 Chemikalien verwendet werden und jedes Jahr 2.000 neue synthetisiert werden. Bis heute wurden mehr als 3.700 Moleküle identifiziert, bei denen es sich um Kontakthapten/Allergene handelnkönnte 3. Die Kontaktüberempfindlichkeitsreaktion (CHS) ist ein experimentelles Modell von ACD, das an Mäusen, Meerschweinchen und Ratten untersucht werden kann und durch die topische Hautanwendung von reaktiven chemischen Hapten, die in organischen Lösungsmitteln gelöst sind, induziert werdenkann 4,5,6. Diese Studie zielt darauf ab, eine objektive Labormethode zu beschreiben, die helfen kann, die CHS-Reaktion in Mäusen zu untersuchen, die durch verschiedene Tests gemessen und quantifiziert werden kann.

Das CHS besteht aus Sensibilisierungs- (Induktions-) und Effektor- (Challenge) Phasen. In Tiermodellen binden Hapten zunächst kovalent an Proteine im Körper, um Neoantigene zu bilden. Während der Sensibilisierungsphase fördern aktivierte Keratinozyten die Migration und Reifung von dendritischen Hautzellen (sDCs), indem sie proinflammatorische Zytokine-Tumornekrosefaktor α (TNF-α) und Interleukin 1β (IL-1β)7 produzieren. Epidermale Langerhans-Zellen (LCs) präsentieren Antigene während der CHS-Induktions- und Effektorphase8. LCs, die während der Sensibilisierung Hapten ausgesetzt sind, fördern die Induktion von Regulations- und Effektorzellen9. Zunehmende Beweise aus mehreren Studien deuten darauf hin, dass CHS-Reaktionen entweder durch CD4 + MHC-Klasse II-eingeschränkte Th1-Zellen vermittelt werden können, die lokal Interferon-γ (IFN-γ) freisetzen, um ein charakteristisches entzündliches Infiltrat, CD8 + MHC-Klasse I-eingeschränkte Tc1-Lymphozyten zu verwenden, die auch IFN-γ freisetzen können, aber hauptsächlich zytotoxische Schäden an Keratinozyten vermitteln, und jetzt auch Interleukin 17 (IL-17) produzierendeTh17-Zellen 10, 11 .

Es wurden mehrere verschiedene CHS-Modelle mit verschiedenen Spezies 1 2,13,14 und Hatagen entwickelt (ein detaillierter Vergleich der verschiedenen Halate, Lösungsmittel und des Anwendungszeitpunkts ist in Tabelle 1 zusammengefasst). Die Maus, eine häufig verwendete Laborart, bietet einige Vorteile bei der Untersuchung von CHS. Es gibt mehr Stämme, Knockouts (KO) und transgene Tiere unter Mäusen im Vergleich zu anderen Arten, was sie zu einem sehr attraktiven Tier15 macht. Darüber hinaus erfordert das CHS-Modell viele Tiere, und Mäuse sind hier sparsamer. Tiermodelle ahmen ACD nicht in allen Aspekten nach; Insbesondere zeigen sie Krustenbildung und Desquamation, was für Menschen nicht üblich ist16,17. Die Merkmale chronischer Erkrankungen sind schwierig zu reproduzieren, vor allem, weil das beschriebene Modell die Anwendung des Hapten über einen längeren Zeitraum nicht annimmt. Es wurde hier jedoch bestätigt, dass viele der wesentlichen Aspekte von ACD reproduziert werden. Es wurde auch gezeigt, dass diese Merkmale, wie beim Menschen, mit lokalen allergischen Reaktionen verbunden sind. Die Wahl des Hapten, seines Lösungsmittels und seiner Anwendung, die in diesem Protokoll beschrieben sind, wurden durch die Tatsache bestimmt, dass die Ergebnisse durch zahlreiche In-vitro-Tests bestätigt wurden und dass es viele Jahre lang im Labor getestet und modifiziert wurde, bis die aktuelle Version etabliert wurde. Murine Modelle ermöglichen die Analyse der Zelluntergruppen oder Zytokine, die an der Entwicklung von ACD beteiligt sind und für die präklinische Bewertung neuer Behandlungen unerlässlich sind.

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Protocol

Alle in diesem Artikel vorgestellten Experimente wurden nach den Richtlinien des 1. Lokalen Ethikkomitees für Tierversuche in Krakau durchgeführt. Alle beschriebenen Verfahren wurden gemäß den lokalen Empfehlungen durchgeführt, insbesondere in Bezug auf die Verwendung von Ketamin / Xylazin als Anästhetikum, die Verwendung beider Seiten der Ohren zum Auftragen der Substanz / des Hapten, das Abschneiden des Ohrs und das Sammeln von Blut durch Augapfelentfernung. BALB/c (Haplotyp H-2d), CBA/J (H-2 k) und C57BL/6 (H-2b) männliche und weibliche Mäuse, 6-12 Wochen alt, wurden für die vorliegende Studie verwendet (siehe Materialtabelle). Für die statistische Signifikanz ist es am besten, wenn jede Gruppe von Mäusen aus 10-12 Tieren besteht.

1. Tierpräparation

  1. Reinigen Sie den Operationstisch vor und nach allen Verfahren mit einer 70% igen Ethanollösung. Wenn Sie Mäuse verwenden, die sterile Bedingungen erfordern, führen Sie alle Operationen in einer Biosicherheitskabine durch.

2. Markieren von Mäusen zur Identifizierung

  1. Beschriften Sie die Mäuse, indem Sie die Haut mit einer Rasierklinge rasieren: #0 - unmarkiert, #2 - auf der rechten Vorderpfote, #3 - auf der rechten Seite, #4 - auf der rechten Hinterpfote, #5 - an der Basis des Schwanzes, #6 - auf der linken Hinterpfote, #7 - auf der linken Seite, #8 - auf der linken Vorderpfote.
    HINWEIS: Aufgrund der induzierten Reaktion können Mäuse nicht klassisch durch Ohrstanzen oder -markieren markiert werden. Die Mäuse wurden während der Beschriftung nicht betäubt.

3. Induktion von CHS

HINWEIS: Dieses Verfahren ist in Abbildung 1 dargestellt.

  1. Führen Sie die Sensibilisierung (Induktion) gemäß den folgenden Schritten durch.
    1. Rasieren Sie am Tag "0" Mäuse auf Brust und Bauch (quadratisch 2 cm x 2 cm), indem Sie graue Seife mit Wasser auftragen und mit einer Rasierklinge rasieren.
      HINWEIS: Warten Sie vor dem Auftragen von Hapten 6 h, damit die Haut nicht gereizt wird.
    2. 5% Hapten: 2,4,6-Trinitrochlorbenzol (TNCB, siehe Materialtabelle) in einem Aceton-Ethanol-Gemisch (Verhältnis 1:3) oder Vehikel allein (Aceton-Ethanol) herstellen. Bereiten Sie Lösungen kurz vor dem Gebrauch in einer Durchstechflasche aus Glas vor und schützen Sie sie vor Licht, indem Sie die Durchstechflasche mit Aluminiumfolie abdecken.
    3. Sensibilisieren Sie die Mäuse am selben Tag, indem Sie 150 μL 5% Hapten auf die zuvor rasierte Stelle auftragen. Wenden Sie in der Gruppe der Kontrollmäuse das Vehikel allein an, um die unspezifische Entzündungsreaktion zu beurteilen. Bevor Sie das Tier wieder in den Käfig stecken, warten Sie 30 Sekunden und lassen Sie das Hapten trocknen.
      ACHTUNG: Verwenden Sie Handschuhe; TNCB verursacht bei den meisten Menschen eine schwere allergische Reaktion.
  2. Führen Sie eine Auslöse- (Herausforderung) und Ohrschwellungsmessung durch.
    1. Am Tag "4" bereiten Sie 0,4% Hapten zu: TNCB in einem Aceton-Ethanol-Gemisch (Verhältnis 1: 1). Bereiten Sie die Lösung kurz vor der Verwendung in einer Durchstechflasche aus Glas vor und schützen Sie sie vor Licht, indem Sie die Durchstechflasche mit Aluminiumfolie abdecken.
    2. Anästhesieren Sie die Mäuse mit einer intraperitonealen (i.p.) Injektion einer Mischung aus Ketamin (90-120 mg/kg) und Xylazin (5-10 mg/kg) (siehe Materialtabelle) für die Tiefenanästhesie. Stellen Sie sicher, dass die Maus mindestens 5 Minuten lang vollständig betäubt ist.
    3. Messen Sie die Ohrdicke (0 h Messung, Basislinie) mit einem Mikrometer (siehe Tabelle der Materialien) von einem Beobachter, der die experimentellen Gruppen nicht kennt.
    4. Tragen Sie 10 μL 0,4% Hapten auf beiden Seiten der Ohren in beiden Gruppen auf (Test und Kontrolle) auf. Bevor Sie das Tier wieder in den Käfig stecken, warten Sie 30 Sekunden und lassen Sie das Hapten trocknen.
    5. Wiederholen Sie am Tag "5", 24 h nach der hapten Anwendung, die Schritte 3.2.2-3.2.3 für die 24-Stunden-Messung.
    6. Bewerten Sie die CHS-Antwort, indem Sie die Differenz der Ohrmuscheldicke vor und nach der Herausforderung mit dem Hapten berechnen: 24 h Ohrdicke (μm) - 0 h Ohrdicke (μm). Zählen Sie jedes Ohr als separate Messung. Als nächstes drücken Sie die Ohrschwellung in Mikrometern (μm) ± Standardfehler des Mittelwerts (REM) aus (Tabelle 2, Abbildung 3).

4. Ohrbiopsien

  1. Schneiden Sie direkt nach der 24-Stunden-Messung der Ohrdicke (wenn die Maus noch unter Tiefnarkose steht) die Ohren so nah wie möglich am Schädel mit einer Schere ab. Sammeln Sie die Biopsien von der distalen Seite der Ohren, indem Sie einen Stempel mit einem Durchmesser von 6 mm mit einem Biopsiestempel herstellen (siehe Materialtabelle).
    1. Messen Sie das Ohrgewicht (Schritt 4.2) und führen Sie zusätzlich einen der folgenden Tests an derselben Ohrbiopsie durch: Myeloperoxidase (MPO)-Assay (Schritt 4.3) oder In-vitro-Messung der Zytokinkonzentration in den Ohrenextrakten (z. B. IFN-γ, IL-17A, TNF-α [Schritt 4.4]).
      HINWEIS: Schneiden Sie die Ohren vor der Blutentnahme ab. Nach diesem Eingriff müssen die Mäuse eingeschläfert werden (z.B. durch Zervixdislokation).
  2. Messen Sie das Gewicht jeder Ohrbiopsie auf der Analysenwaage und drücken Sie es in Milligramm (mg) aus (Abbildung 4).
  3. Führen Sie einen MPO-Assay durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    1. Homogenisierungspuffer werden hergestellt, indem 0,5% Hexadecyltrimethylammoniumbromid in 50 mmol Phosphoratpuffer KH 2 PO 4 / Na2HPO4 gelöst und der pH-Wert auf 6,0 eingestellt wird (Verwendung bei Raumtemperatur, RT).
    2. Homogenisieren Sie die Biopsien in 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 μL vorbereitetem Puffer für 10 min mit einem Homogenisator mit Edelstahlperlen mit einem Durchmesser von 5 mm (fügen Sie zwei Perlen / Durchstechflaschen hinzu) (siehe Materialtabelle). Als nächstes kühlen Sie die Probe für 15 min bei 4 °C ab und homogenisieren sie für weitere 10 min.
      HINWEIS: Mikrozentrifugenröhrchen haben einen runden Boden, so dass sich die Perlen leicht bewegen können.
    3. Die Homogenate bei −20 °C 30 min einfrieren. Tauwetter und Wirbel (stellen Sie sicher, dass die Proben aufgetaut sind). Wiederholen Sie diesen Vorgang 3x.
    4. Zentrifugieren Sie die Homogenate bei 3.000 x g für 30 min bei 4 °C. Die Überstände mit einer Pipette ernten. Drücken Sie die MPO-Aktivität in Einheiten (U) pro 1 mg Protein aus.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Die Proben sind 3 Monate lang bei −20 °C stabil.
    5. Um die MPO-Aktivität zu messen, führen Sie eine enzymatische Reaktion durch, indem Sie 20 μL Überstand und 200 μL MPO-Substrat (0,167 mg/ml Ortho-Dianisin-Dihydrochlorid in 50 mmol KH 2 PO4 / Na 2 HPO 4-Puffer mit 5 x 10-4% H 202) mischen und in 96-Well-Flachbodenplatten geben. Inkubieren Sie die Platten für 20 min bei RT.
    6. Bereiten Sie die Standardkurve vor, indem Sie 20 μL des MPO-Standards bei Konzentrationen von 0,008 U bis 0,5 U in 200 μL des MPO-Substrats verwenden. Bereiten Sie die leere Probe allein mit dem MPO-Substrat vor.
      ACHTUNG: Verwenden Sie eine Maske, während Sie mit Ortho-Dianisin-Dihydrochlorid arbeiten.
      HINWEIS: Die Platten müssen aus Polypropylen bestehen, das eine geringere Bindungskapazität hat, so dass Proteine oder DNA nicht binden.
    7. Messen Sie die optische Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von λ = 460 nm. Die enzymatische Reaktion ist 10 min stabil. Lesen Sie die MPO-Aktivität in getesteten Stichproben aus der Standardkurve.
    8. Um die Proteinkonzentration zu messen, verwenden Sie 20 μL des Überstandes, führen Sie einen Test mit einem Bicinchoninsäure-Kit zur Proteinbestimmung durch (siehe Materialtabelle) und messen Sie die OD bei λ = 562 nm (Abbildung 5).
  4. Führen Sie eine In-vitro-Messung von Zytokinen im Ohrenextrakt durch.
    1. Homogenisieren Sie die Ohrbiopsien bei RT in 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 μL Gewebeproteinextraktionsreagenz (T-PER) für 10 min mit einem Homogenisator mit Edelstahlperlen mit 5 mm Durchmesser (fügen Sie zwei Perlen / Durchstechflasche hinzu). Als nächstes kühlen Sie die Probe für 15 min bei 4 °C ab und homogenisieren sie für weitere 10 min.
      HINWEIS: Mikrozentrifugenröhrchen haben einen runden Boden, so dass sich die Perlen leicht bewegen können.
    2. Zentrifugieren Sie die Homogenate bei 3.000 x g für 30 min bei 4 °C.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Die Proben sind 6 Monate lang bei −80 °C stabil.
    3. Bewerten Sie die Zytokinwerte mit einem handelsüblichen ELISA-Set (z. B. IFN-γ) (siehe Materialverzeichnis) gemäß den Anweisungen des Herstellers (Abbildung 6).

5. Histologie des Ohrgewebes

  1. Direkt nach der 24-Stunden-Messung der Ohrdicke, wenn die Maus noch tief betäubt ist, schneiden Sie die Ohren mit der Schere so nah wie möglich am Schädel ab (Schritt 4.1).
    HINWEIS: Nach diesem Eingriff müssen die Mäuse eingeschläfert werden (z.B. durch Zervixdislokation).
  2. Führen Sie eine Paraffineinbettung der Gewebeblöcke durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    1. Legen Sie das Ohr direkt nach der Entfernung für 24 Stunden in ~ 10 ml 10% Formalin.
    2. Legen Sie die Ohren in eine Gewebeverarbeitungskassette. Legen Sie die Kassetten in einen automatisierten Prozessor (siehe Tabelle der Materialien) für Dehydratisierungszyklen (Alkohol 70%, 90%, 100%, jeweils 30 min bei RT), Reinigungszyklen (Xylol 3x, jeweils 30 min bei RT) und Wachsinfiltrationszyklen (Paraffin 3x, jeweils 30 min bei 56 ° C).
    3. Entfernen Sie die Kassetten aus dem automatisierten Prozessor und halten Sie die Warmhalteplatte fest, bis dies erforderlich ist. Füllen Sie die Wachsform mit warmem Wachs (aus dem Spender).
    4. Entfernen Sie die Abschnitte von der Kassette mit der erwärmten Pinzette und legen Sie sie in die Form; Als nächstes legen Sie den Kassettenboden auf die Oberseite der Form und füllen Sie ihn dann mit mehr Wachs. Legen Sie es in gekühltem Wasser auf eine kalte Platte für 30 Minuten, so dass das Paraffin erstarrt und einen Block bildet, der die Probe enthält.
    5. Verwenden Sie ein rotierendes Mikrotom (siehe Materialtabelle), um Abschnitte mit einer Dicke von ~ 5 μm zu schneiden. Schweben Sie die Abschnitte in einem warmen Bad, um sie abzuflachen. Nehmen Sie die Abschnitte auf einem Glasmikroskopobjektträger auf. Lassen Sie sie bei RT trocknen, um sicherzustellen, dass die Abschnitte an der Folie haften.
      HINWEIS: Verwenden Sie Objektträger, die das Auftragen von Klebematerialien oder Proteinbeschichtungen überflüssig machen, um den Verlust von Gewebeabschnitten während der Färbung zu verhindern.
  3. Führen Sie Hämatoxylin und Eosin (H & E) -Färbung durch.
    1. Bereiten Sie 17 Färbegerichte mit den folgenden zu: Xylol (vier Schüsseln), 100% Ethanol (absoluter Alkohol) (vier Schalen), 90% Ethanol, 80% Ethanol, 70% Ethanol, 50% Ethanol, PBS (drei Gerichte), Hämatoxylinlösung, Eosinlösung. Übertragen Sie die Folien gemäß den folgenden Schritten von einer Schüssel zur nächsten und führen Sie alle bei RT aus.
      HINWEIS: Der Vorgang in jeder Schale kann ungefähr 10x wiederholt werden (z. B. wenn eine 20-Objektträger-Schale verwendet wird, können 200 Flecken gemacht werden, ohne die Flüssigkeiten zu wechseln).
    2. Deparaffinisieren Sie die Abschnitte durch Inkubation bei 65 °C für 30 min im Inkubator. Tauchen Sie die Dias 30 min in Xylol ein. Wiederholen Sie 1x in neuem Xylol für 30 min.
    3. Tauchen Sie die Objektträger 5 min in 100% Ethanol ein. Wiederholen Sie 1x in neuem 100% Ethanol für 5 min. Tauchen Sie die Objektträger in die Ethanolreihe, 90%, 80%, 70% und 50%, für 2 Minuten in jeder Verdünnung.
    4. Tauchen Sie die Objektträger 5 min in phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) ein. Wischen Sie überschüssige Flüssigkeit um das Gewebe und die Rückseite von Objektträgern ab.
    5. Färben Sie die Abschnitte in Hämatoxylinlösung (siehe Materialtabelle) für 7-8 min. Waschen Sie fließendes Wasser für 30 s von der Rückseite ein, um die Abschnitte nicht zu beschädigen. Wiederholen Sie Schritt 5.3.4.
    6. Färben Sie die Abschnitte mit Eosinlösung (siehe Materialverzeichnis) für 30 s. Waschen Sie wie in Schritt 5.3.5 erwähnt und wiederholen Sie dann Schritt 5.3.4.
    7. Tauchen Sie die Objektträger für 2 min in 100 % Ethanol (absoluter Alkohol) ein. Wiederholen Sie 1x in neuem 100% Ethanol für 2 min.
    8. Tauchen Sie die Dias für 5 min in Xylol ein. Wiederholen Sie 1x in neuem Xylol für 5 min.
    9. Lassen Sie die Abschnitte bei RT 15 min an der Luft trocknen. Fügen Sie einen Tropfen Montagemedium (siehe Materialtabelle) auf ein Deckglas und legen Sie es dann an den oberen Rand des Abschnitts.
  4. Untersuchen Sie den Schnitt unter einem Lichtmikroskop unter einer Vergrößerung von 20x oder 40x und nehmen Sie Bilder auf (Abbildung 7).

6. Gefäßpermeabilitätstest

HINWEIS: Alternativ zur Messung der Ohrdicke kann ein Gefäßpermeabilitätstest durchgeführt werden.

  1. Sensibilisieren Sie die Mäuse am Tag "0" (Schritte 3.1.1-3.1.3) und betäuben Sie dann am Tag "4" die Mäuse (Schritt 3.2.2) und tragen Sie Hapten direkt auf die Ohren auf (Schritt 3.2.4), wobei die 0-h-Ohrmessung weggelassen wird.
  2. Um 23 Uhr nach der Herausforderung die Mäuse betäuben (Schritt 3.2.2).
  3. Injizieren Sie intravenös (i.v.) 8,3 μL/g Körpergewicht von 1% Evans blauem Farbstoff (siehe Materialtabelle) in Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS).
  4. Betäuben Sie die Mäuse erneut-Tiefenanästhesie (Schritt 3.2.2)-1 h nach der blauen Injektion von Evans.
  5. Ohrbiopsien sammeln (Schritt 4.1).
    HINWEIS: Nach diesem Eingriff müssen die Mäuse eingeschläfert werden (z.B. durch Zervixdislokation).
  6. Extrahieren Sie den Farbstoff aus dem Gewebe, legen Sie Ohrstempel in die Röhrchen mit 1 ml Formamid und inkubieren Sie bei 37 ° C in der Atmosphäre von 5% CO2 für 18 h.
  7. Zentrifugieren Sie die Biopsien bei 3.000 x g für 3 min bei RT. Sammeln Sie die Überstände mit einer Pipette.
  8. Messen Sie die OD bei einer Wellenlänge von λ = 565 nm in 96-Well-Flat-Bottom-Platten gegen einen Rohling, der Formamid enthält. Die Farbe ist 24 h stabil. Lesen Sie die Konzentration der Testproben aus der Standardkurve ab (verwenden Sie die Konzentrationen von Evans blue im Bereich von 0,2-30 μg Farbstoff/ml Formamid) (Abbildung 8).
    HINWEIS: Die Platten müssen aus Polypropylen bestehen, das eine geringere Bindungskapazität hat, so dass Proteine oder DNA nicht binden.

7. Serumentnahme und Anti-TNP-Immunglobulin (IgG1)-Antikörpermessung

  1. Nach dem Sammeln von Ohrbiopsien (Schritt 4.1), wenn die Maus noch unter tiefer Betäubung steht, entfernen Sie den Augapfel mit einer Pinzette, üben Sie sanften Druck auf die Maus aus und sammeln Sie Blut aus dem retro-orbitalen Sinus in die Röhre (Durchstechflasche mit Gel zur Gewinnung von Serum, siehe Materialtabelle). Eine alternative Methode zum Sammeln von Blut könnte darin bestehen, das Herz mit einer Spritze zu punktieren und das Blut zu sammeln.
    HINWEIS: Das Blut muss nach dem Entfernen der Ohren gesammelt werden. Die gleiche Blutungsmethode muss aufgrund möglicher Unterschiede in den Blutparametern18 über eine gesamte Studie hinweg angewendet werden. Nach diesem Verfahren müssen Mäuse eingeschläfert werden (z. B. durch Zervixdislokation).
  2. Kehren Sie ein Minimum von 6x um, warten Sie 30 Minuten, bis das Blut gerinnt, und zentrifugieren Sie dann bei 1.300-2.000 x g für 10 Minuten bei RT.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Die Probe ist 6 Monate lang bei −20 °C stabil.
  3. Beschichten Sie eine 96-Well-Flachbodenplatte mit 50 μL Rinderserumalbumin, konjugiert mit 2,4,6-Trinitrophenyl (TNP-BSA), gelöst in DPBS bei einer Konzertierung von 10 μg/ml. Als nächstes beschichten Sie die zweite Platte mit Rinderserumalbumin (BSA), das allein in DPBS (Hintergrund) in einer Konzentration von 10 μg/ml gelöst ist. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
    HINWEIS: Mausserum enthält Antikörper (Abs) gegen BSA, daher müssen die Proben auf beiden Platten getestet werden, und als nächstes muss eine Berechnung durchgeführt werden (OD TNP-BSA - OD BSA).
  4. Waschen Sie die Platten mit 300 μL DPBS, die 0,05% Tween 20 enthalten. 3x wiederholen.
  5. Assay-Verdünnungsmittel (AD) vorbereiten: DPBS mit 1% BSA. Blockieren Sie die Bohrlöcher mit AD für 1 h bei RT. Waschen Sie erneut (Schritt 7.4).
  6. Bereiten Sie einen internen Standard (iSTD) vor: Sensibilisieren Sie die Mäuse mit TNCB (Schritte 3.1.1-3.1.3) und sammeln und befragen Sie 10 Tage nach der Sensibilisierung das Serum von allen Spendern (Schritt 7.1 und Schritt 7.2).
  7. Der Platte sind 50 μL abgestufte iSTD-Konzentrationen zugesetzt, die mit AD verdünnt sind, um die Standardkurve zu bilden (beschrieben in Tabelle 3). Auf die Platte 50 μL Serumproben geben. Testen Sie jede Probe und Standardkurve auf beiden Platten (TNP-BSA- und BSA-beschichtet). Inkubieren Sie für 2 Stunden bei RT. Waschen Sie die Platten (Schritt 7.4).
  8. 50 μL biotinylierter monoklonaler Anti-Maus-IgG1-Antikörper (mAb, siehe Materialtabelle) zugeben, der 1:250 mit AD verdünnt wurde, und 1 h bei RT inkubieren. Erneut waschen (Schritt 7.4).
  9. Fügen Sie 50 μL Meerrettichperoxidase-Streptavidin (HRD-Streptavidin, siehe Materialtabelle) hinzu, verdünnt 1:2000 mit AD, und inkubieren Sie für 30 Minuten bei RT im Dunkeln. Waschen Sie die Platte (Schritt 7.4).
  10. Fügen Sie 50 μL TMB-Substrat hinzu (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie für 30 Minuten bei RT im Dunkeln.
  11. Stoppen Sie die enzymatische Reaktion durch Zugabe von 25 μL von 1 MH2SO4; Die Reaktion ist 30 min stabil.
  12. Messen Sie die OD bei einer Wellenlänge von λ = 450 nm und einem Hintergrund von 570 nm (der Hintergrund muss von jeder 450-nm-Messung subtrahiert werden). Subtrahieren Sie bei der Präsentation der Ergebnisse die BSA-Messungen von der TNP-BSA für Proben und der Standardkurve. Berechnen Sie dann die Einheit (U) der Antikörper gemäß der Standardkurve (Abbildung 9).

8. Adoptiver Transfer der CHS-Effektorzellen

HINWEIS: Dieses Verfahren ist in Abbildung 2 dargestellt.

  1. Spender (im Verhältnis eines Spenders:1 Empfänger): Sensibilisieren Sie Mäuse mit TNCB am Tag "0" (Schritte 3.1.1-3.1.3).
  2. Betäuben Sie am Tag "4" die Tiefenanästhesie der Mäuse (Schritt 3.2.2).
  3. Isolieren Sie mit einer Pinzette die axillären und inguinalen Lymphknoten (ALNs) und Milz (SPLs). Fassen Sie die ALNs in einer Durchstechflasche und die SPLs in einer anderen zusammen.
    HINWEIS: In jeder Achselhöhle befindet sich ein axillärer Lymphknoten hinter dem Brustmuskel. Ein Leistenlymphknoten in der Hüftregion befindet sich neben drei Blutgefäßen. Die Milz befindet sich auf der linken Seite des Körpers hinter Darm und Magen19. Arbeiten Sie mit sterilen Werkzeugen in einer Biosicherheitskabine, um sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten. Nach diesem Eingriff müssen die Mäuse eingeschläfert werden (z.B. durch Zervixdislokation).
  4. Maische Gewebe zwischen den mattierten Enden zweier Objektträger. Führen Sie die Zellsuspension durch ein Zellsieb mit einer Porengröße von 70 μm (siehe Materialtabelle).
  5. Waschen Sie die Zellen mit DPBS, ergänzt mit 1% fetalem Rinderserum (FBS). Zentrifuge bei 300 x g für 10 min bei 4 °C. Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das verbleibende Zellpellet in 1-5,0 ml DPBS.
  6. Zählen Sie die lebenden Zellen mit einem Hämozytometer20 mit Trypanblau und mischen Sie 10 μL der Zellsuspension mit 90-990 μL (abhängig von der Zellzahl) Trypanblau. Berücksichtigen Sie die Verdünnung bei der Berechnung der Zellzahl (10x-100x).
  7. Bereiten Sie eine Mischung aus ALNs und SPLs (Verhältnis 1:1) vor: 8,0 x 106 bis zu 7,0 x 107/Maus in 200 μL DPBS.
  8. Empfänger (naive syngene Mäuse): Betäubung naiver Empfängermäuse (Schritt 3.2.2) und Injektion i.v. mit einer vorbereiteten Mischung der CHS-Effektorzellen (Schritt 8.7). Injizieren Sie in der Kontrollgruppe der Mäuse keine Zellen.
  9. Messen Sie die Ohrdicke vor (0 h) und nach (24 h) der Herausforderung (Schritte 3.2.1-3.2.6) (Abbildung 10).
  10. Zusätzlich werden Tests an isolierten CHS-Effektorzellen durchgeführt (z. B. Zellphänotypisierung oder die Messung der produzierten Zytokine durch die CHS-Effektorzellen durch Durchflusszytometrie). Es können auch Zellkulturen etabliert werden, und die Fähigkeit der CHS-Effektorzellen, sich in Gegenwart des Antigens oder der Menge an sezernierten Zytokinen in den Kulturüberständen zu vermehren, kann beurteilt werden21,22 (Daten nicht dargestellt).
    HINWEIS: Die Durchführung zusätzlicher Tests erfordert entsprechend mehr Zellspender.

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Representative Results

Für die CHS-Induktion wurden die Tiere durch Hautmalerei (abdominal) mit 150 μL von 5% TNCB sensibilisiert oder mit dem Vehikel allein scheinsensibilisiert. Am Tag "4" wurden die Ohrschwellungsreaktionen beider Ohren durch Kontaktmalerei (Challenge) mit 10 μL von 0,4% TNCB in beiden Mäusen induziert, die zuvor mit TNCB (Testgruppe) und den Kontrollgruppenmäusen (scheinsensibilisiert) sensibilisiert waren. Die vorgestellten Daten zeigen, dass die mit TNCB sensibilisierten und 4 Tage später herausgeforderten Mäuse eine signifikant erhöhte Ohrschwellung im Vergleich zu den scheinsensibilisierten Mäusen entwickelten, die ähnlich herausgefordert wurden (Abbildung 3, Tabelle 2, Test- vs. Kontrollgruppe). Die Ergebnisse der Ohrschwellung wurden in weiteren Studien vollständig validiert, wobei hervorgehoben wurde, dass eine Zunahme des Ohrödems mit einem Mikrometer bestimmt wurde, das mit dem erhöhten Ohrgewicht (Abbildung 4), der MPO-Aktivität (Abbildung 5), der IFN-γ-Konzentration in den Ohrextrakten (Abbildung 6), einer erhöhten Verdickung der ödematösen Dermis in der histologischen Untersuchung (Abbildung 7) und der Gefäßpermeabilität der Ohren (Abbildung 8) übereinstimmte (Abbildung 8 ). Eine Erhöhung der Konzentration von TNP-spezifischen IgG1-Antikörpern wurde auch in den Seren der Testmäuse im Vergleich zu den Kontrolltieren festgestellt (Abbildung 9).

Als Beispiel für eine T-Zell-vermittelte Immunantwort kann CHS auch in naive syngene Empfängermäuse übertragen werden. Die Spender wurden durch TNCB-Anwendung sensibilisiert, und anschließend wurden die CHS-Effektorzellen i.v. in die naiven Empfängermäuse verabreicht, die mit dem Hapten herausgefordert und 24 h später auf CHS getestet wurden (Abbildung 10). Die Tiere, die die CHS-Effektorzellen von zuvor mit TNCB sensibilisierten Spendern erhielten, zeigten eine signifikant erhöhte Ohrschwellung im Vergleich zu Tieren, die nur herausgefordert wurden (keine Zellen erhielten).

Die CHS-Reaktion hat einen komplexen Mechanismus und betrifft verschiedene Zellen. Antigenpräsentation und T/B-Zellaktivierung treten in den peripheren Lymphorganen (z. B. ALNs und SPL) auf. Es wurde festgestellt, dass CHS-Effektorzellen, die vor dem adoptiven Zelltransfer von CD4+- , aber nicht von CD8+ -Zellen erschöpft waren, dazu führten, dass die CHS-Reaktion bei den Empfängermäusen fehlte. Es wurde festgestellt, dass diese Zellen positiv für IFN-γ (T-Box-Transkriptionsfaktor TBX21, Tbet+) und IL-17A (Retinsäurerezeptor-bezogener orphan nuclear receptor gamma, RORγT+) (ergänzende Abbildung 1) sind.

Die vorgestellten Ergebnisse der repräsentativen Experimente wurden an männlichen und weiblichen Mäusen von C57BL/6 und CBA/J im Alter von 8-12 Wochen durchgeführt. Nach den 3R-Regeln bei der Verwendung von Tieren23, insbesondere der Reduktion, werden für die Zwecke dieses Artikels die Ergebnisse von Versuchen an kleinen Tiergruppen gezeigt. Die Daten in den Diagrammen werden als Mittelwert ± REM dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde auf p < 0,05 festgelegt. Die Diagramme wurden mit der Prism-Software gezeichnet (siehe Materialverzeichnis).

Figure 1
Abbildung 1: Induktion von CHS. Sensibilisierung, Herausforderung und Ohrmessung. Abkürzungen: CHS = Kontaktüberempfindlichkeitsreaktion; TNCB = 2,4,6-Trinitrochlorbenzol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Adoptiver Transfer der CHS-Effektorzellen. Abkürzungen: ALNs = axilläre und inguinale Lymphknoten; CHS = Kontaktüberempfindlichkeitsreaktion; i.v. = intravenös; SPLs = Milz; TNCB = 2,4,6-Trinitrochlorbenzol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Repräsentative Auswertung von CHS zu TNCB durch Messung der Ohrschwellung mit einem Mikrometer. Mäuse wurden TNCB (Testgruppe) oder Scheingruppe (Kontrollgruppe) sensibilisiert und anschließend herausgefordert. Die Dicke der Ohrmuschel wurde vor und nach der Herausforderung gemessen, und Unterschiede in der Ohrschwellung wurden berechnet, indem die 0 h Ohrdicke (μm) von der 24 h Ohrdicke (μm) subtrahiert wurde. Die Ohrschwellung wurde als Mittelwert ± REM, ****p < 0,0001, n = 10 Mäuse/Gruppe ausgedrückt (Daten aus Tabelle 2). Abkürzungen: CHS = Kontaktüberempfindlichkeitsreaktion; SEM = Standardfehler des Mittelwerts; TNCB = 2,4,6-Trinitrochlorbenzol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Repräsentative Bewertung von CHS durch Messung des Ohrgewichts. Das Ohrgewicht ist einer der Parameter, die der Ohrschwellung entsprechen. Mäuse wurden TNCB (Testgruppe) oder Scheingruppe (Kontrollgruppe) sensibilisiert und anschließend herausgefordert. Bei 24 h nach der Herausforderung wurden Stempel mit einem Durchmesser von 6 mm aus den entfernten Ohren entnommen. Die Stempel wurden auf einer analytischen Laborwaage gewogen. Das Ohrgewicht wurde in Milligramm (mg) als Mittelwert ± REM, ***p < 0,001 , n = 10 Mäuse/Gruppe ausgedrückt. Abkürzungen: CHS = Kontaktüberempfindlichkeitsreaktion; SEM = Standardfehler des Mittelwerts; TNCB = 2,4,6-Trinitrochlorbenzol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Repräsentative Bewertung der MPO-Aktivität. Eine erhöhte MPO-Aktivität in Gewebeextrakten korreliert mit einer Ohrentzündung. TNCB-sensibilisierte Mäuse (Testgruppe) und scheinsensibilisierte Mäuse (Kontrollgruppe) wurden herausgefordert. Bei 24 h nach der Herausforderung wurden die Ohren entfernt und Stempel des Ohres mit einem Durchmesser von 6 mm extrahiert und verarbeitet. Die MPO-Aktivität wird in U pro Proteingehalt (U/g Protein) exprimiert. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± REM, **p < 0,01, n = 5-6 Mäuse/ Gruppe angezeigt. Abkürzungen: CHS = Kontaktüberempfindlichkeitsreaktion; MPO = Myeloperoxidase; SEM = Standardfehler des Mittelwerts; TNCB = 2,4,6-Trinitrochlorbenzol; U = Einheiten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6: Repräsentative Bewertung der Zytokinproduktion-IFN-γ-Konzentration in Ohrenextrakten. Mäuse wurden TNCB (Testgruppe) oder Scheingruppe (Kontrollgruppe) sensibilisiert und anschließend herausgefordert. Bei 24 h nach der Herausforderung wurden die Ohren entfernt und Stempel des Ohres mit einem Durchmesser von 6 mm aufgenommen. Die Konzentration von IFN-γ wurde in Gewebehomogenaten von ELISA bestimmt. Ergebnisse dargestellt als Mittelwert ± REM, *p < 0,05, n = 5 Mäuse/Gruppe. Abkürzungen: CHS = Kontaktüberempfindlichkeitsreaktion; IFN-γ = Interferon gamma; SEM = Standardfehler des Mittelwerts; TNCB = 2,4,6-Trinitrochlorbenzol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 7
Abbildung 7: Repräsentative Histologie des Ohrgewebes. Hämatoxylin- und Eosinfärbung. Mäuse wurden TNCB (Testgruppe) oder Scheingruppe (Kontrollgruppe) sensibilisiert und anschließend herausgefordert. (A-C) Die histologische Untersuchung in der Testgruppe manifestierte sich in einer signifikant erhöhten Konzentration von Entzündungszellen (mononukleäre und polymorphkernige Zellen), hauptsächlich in der Dermis, mit Mikroabszessbildung in der Epidermis. Eine Verdickung der ödematösen Dermis und eine verdickte, hyperplastische Epidermis wurden ebenfalls bemerkt. (D-E) Kontrollgruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 8
Abbildung 8: Repräsentativer Gefäßpermeabilitätstest. Das beobachtete Ohrgewebeödem ist eine Folge einer erhöhten Gefäßpermeabilität. Um Veränderungen der Gefäßpermeabilität zu bestimmen, wurden Mäuse TNCB (Testgruppe) oder Scheingruppe (Kontrollgruppe) sensibilisiert und 4 Tage später herausgefordert. Um 23 Uhr nach der Herausforderung wurde Evans Blau injiziert, und 1 Stunde nach der blauen Injektion von Evans wurden die Tiere eingeschläfert und Stempel des Ohres mit einem Durchmesser von 6 mm gemacht. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± REM, **p < 0,01, n = 5 Mäuse/Gruppe angezeigt. Abkürzungen: CHS = Kontaktüberempfindlichkeitsreaktion; SEM = Standardfehler des Mittelwerts; TNCB = 2,4,6-Trinitrochlorbenzol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 9
Abbildung 9: Repräsentative Anti-TNP-IgG1-Antikörpermessung. Die Konzentration von Anti-TNP-IgG1-Antikörpern im Serum wurde 24 h nach der Challenge mit hapten TNCB in scheinsensibilisierten (Kontrolle) und in TNCB-sensibilisierten (Testgruppe) Mäusen gemessen. Die gesammelten Seren wurden von ELISA auf Antikörperkonzentration getestet. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± REM, ***p < 0,001, n = 10 Mäuse/Gruppe angezeigt. Abkürzungen: CHS = Kontaktüberempfindlichkeitsreaktion; IgG1 = Immunglobulin G Unterklasse 1; SEM = Standardfehler des Mittelwerts; TNCB = 2,4,6-Trinitrochlorbenzol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 10
Abbildung 10: Repräsentativer adoptiver Transfer der CHS-Effektorzellen. Die CHS-Effektorzellen wurden von Spendern gewonnen, die mit TNCB sensibilisiert waren. Als nächstes wurden die gesammelten Immunzellen, i.v., in naive syngene Empfänger injiziert, die zur Auslösung der CHS-Effektorphase herausgefordert wurden. Die Kontrollgruppe der Mäuse erhielt vor der Herausforderung keine Zellen. Die Dicke der Ohrmuschel wurde vor und nach der Herausforderung gemessen. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± REM, ***p < 0,001, n = 7 Mäuse/Gruppe angezeigt. Abkürzungen: CHS = Kontaktüberempfindlichkeitsreaktion; SEM = Standardfehler des Mittelwerts; TNCB = 2,4,6-Trinitrochlorbenzol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Belastung der Maus Sensibilisierungslösung (Dosis)
auf rasiertem Bauch		 Auslöselösung (Dosis)
auf beiden Seiten der Ohren		 Sensibilisierungs- / Auslösetag Refs
BALB/c (H-2d); C57BL/6 (H-2b)
TCRδ-/-, β2m-/-, CD1d-/- (B10 PL (H-2 u Hintergrund)		 25 μL 0,5 % DNFB im Aceton-Olivenöl-Gemisch (Verhältnis 4:1) 5 μL 0,1 % DNFB im Aceton-Olivenöl-Gemisch (Verhältnis 4:1) 0 / 5 22
C57BL/6 (H-2b) 50 μL 0,5 % DNFB im Aceton-Olivenöl-Gemisch (Verhältnis 4:1) 25 μL 0,2 % DNFB im Aceton-Olivenöl-Gemisch (Verhältnis 4:1) 0 / 5 32
C57BL/6 (H2b); IL-17A-/- (C57BL/6 Hintergrund) 150 μL 5% TNCB im Aceton-Ethanol-Gemisch (Verhältnis 1:3) 10 μL 0,4 % TNCB in Olivenöl-Aceton-Gemisch (Verhältnis 1:1) 0 / 4 33
CBA/J (H-2k); C57BL/6 (H-2b)
TLR2-/-, MyD88-/-, IL-17A-/- (C57BL/ 6 Hintergrund)		 150 μL 5 % TNP-Cl (TNCB) in einem Aceton-Ethanol-Gemisch (Verhältnis 1:3) 10 μl 0,4 % TNP-Cl (TNCB) im Olivenöl-Aceton-Gemisch (Verhältnis 1:1) 0 / 4 21
C57BL/6 (H-2b); BALB/c (H-2d) 25 μL von 1 % TNCB in einem Aceton 10 μL 0,1 oder 0,2 % TNCB in einem Aceton (und höher bis zu 1 %) 0 / 7 34
C57BL/6 (H-2b); TLR2-/-/ TLR4-/-
(Double-Knockout-Mäuse auf C57BL/6 Hintergrund)		 100 μL 3 % TNCB in einem Aceton 20 μL von 1 % TNCB in einem Aceton (nur auf der Rückseite der Ohren) 0 / 5 31
C57BL/6 (H-2b)
MHC-Klasse-II-defiziente Mäuse (C57BL/6 Hintergrund)		 100 μL 3 % TNCB in Aceton-Olivenöl-Gemisch (Verhältnis 4:1) 20 μL 0,5 oder 1 % TNCB im Aceton-Olivenöl-Gemisch (Verhältnis 4:1) 0 / 6 35
C57BL/6 (H-2b) 100 μL von 7 % TNCB in einem Aceton 20 μL 1 % TNCB in einem Aceton 0 / 5 36
C57BL/6 (H-2b) 100 μL 3 % OX in Ethanol 20 μL 1 % OX in einem Ethanol 0 / 5
C57BL/6 (H-2b); CD4-/-, CD8-/- (C57BL/ 6 Hintergrund) 25 μL von 0,5 % DNFB in Aceton-Olivenöl (Verhältnis 4:1) 10 μL 0,2 % DNFB in Aceton-Olivenöl (Verhältnis 4:1) 0 / 5 10
C57BL/6 (H-2b); CD4-/-, CD8-/- (C57BL/ 6 Hintergrund) 150 μL von 3 % OX in Alkohol-Aceton (Verhältnis 3:1) 10 μL 1% OX in Alkohol-Aceton (Verhältnis 3:1) 0 / 5
C57BL/6 (H-2b); C3H/HeN (H-2k); TLR4-/ - (C3H/HeJ-Hintergrund); MyD88-/- (C57BL/6 Hintergrund) 100 mg/ Ohr von 10 % NiCl2 in weißer Petrolatine auf der dorsalen Seite beider Ohren 10 %NiCl2 in weißer Petrolatine 0,1,2 / 23, 24 37
NOD (H-2g7) MyD88-/- (NOD-Hintergrund) 400 μL 0,5 % FITC in Aceton und Dibutylphthalat 10 μL 0,1 % FITC in Aceton und Dibutylphthalat 0 / 5 25

Tabelle 1: Vergleich des CHS-Modells in verschiedenen Studien. Abkürzungen: DNFB = 1-Fluor-2,4-dinitrobenzol; FITC = Fluoresceinisothiocyanat; NiCl2 = Nickel(II)-chlorid; TNCB = 2,4,6-Trinitrochlorbenzol; TNP-Cl = Trinitrophenylchlorid; OX = Oxazolon. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Kontrollgruppe (negativ) Testgruppe (CHS-Reaktion)
Maus # Ohr: L, R 0 h Ohrstärke [μm] 24 h Ohrdicke [μm] 24 h – 0 h Ohrdicke [μm] Maus # Ohr: L, R 0 h Ohrstärke [μm] 24 h Ohrdicke [μm] 24 h – 0 h Ohrdicke [μm]
1 l 365 380 15 1 l 345 427.5 82.5
1 R 335 380 45 1 R 340 455 115
2 l 345 355 10 2 l 355 475 120
2 R 327.5 352.5 25 2 R 342.5 457.5 115
3 l 340 370 30 3 l 340 460 120
3 R 325 355 30 3 R 345 495 150
4 l 335 380 45 4 l 357.5 432.5 75
4 R 340 350 10 4 R 335 402.5 67.5
5 l 350 380 30 5 l 335 387.5 52.5
5 R 337.5 360 22.5 5 R 335 425 90
6 l 335 365 30 6 l 350 430 80
6 R 340 375 35 6 R 342.5 405 62.5
7 l 345 337.5 0 7 l 340 502.5 162.5
7 R 345 335 0 7 R 327.5 447.5 120
8 l 370 380 10 8 l 327.5 515 187.5
8 R 375 355 0 8 R 327.5 540 212.5
9 l 385 370 0 9 l 330 415 85
9 R 342.5 362.5 20 9 R 327.5 390 62.5
10 Liter 307.5 340 32.5 10 Liter 337.5 445 107.5
10 R 325 350 25 10 R 352.5 455 102.5
Bedeuten 20.75 Bedeuten 108.5
± SEM 3.245 ± SEM 9.565

Tabelle 2: Repräsentatives Beispiel für die Berechnung der Differenz der Ohrdicke in der Effektorphase von CHS. Berechnung der Differenz in der Ohrmuscheldicke vor und nach der Herausforderung mit dem Hapten: 24 h Ohrdicke (μm) - 0 h Ohrdicke (μm). Jedes Ohr zählt als separates Maß. Ohrschwellung ausgedrückt in Mikrometern (μm) ± REM, n = 20. Abkürzungen: L = links; R = rechts. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

iSTD-Verdünnung mit AD Anti-TNP IgG1 Ab (U/ml)
100x 250
200x 125
400-fach 62.5
800-fach 31.25
1600x 15.63
3200-fach 7.8
nur AD 0

Tabelle 3: Aufbereitung der verschiedenen iSTD-Konzentrationen für die Standardkurve zur Anti-TNP-IgG1-Ab-Messung. Die 100-fache iSTD-Verdünnung wurde mit 250 U Anti-TNP-IgG1-Ab angenommen. Abkürzungen: Ab = Antikörper; AD = Assay-Verdünnungsmittel; iSTD = interner Standard; IgG1 = Immunglobulin G Unterklasse 1; TNP = 2,4,6-Trinitrophenyl; U = Einheiten. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 1: Der Phänotyp der CHS-Effektorzellen. Die CHS-Effektorzellen wurden aus ALNs und SPLs der Spender gewonnen, die zuvor mit TNCB sensibilisiert wurden. (A) Unter Verwendung der MACS-Technik waren die CHS-Effektorzellen (ganze ALNs und SPLs) entweder um CD4+- oder CD8+-Zellen erschöpft. Anschließend wurde der adoptive Zelltransfer vor der Auslösung der CHS-Effektorphase durchgeführt. Die Ohrschwellung wurde als Mittelwert ± REM ausgedrückt. (B-E) Unter Verwendung einer Durchflusszytometrie-Technik wurden der CHS-Effektor und naive (von naiven Mäusen gewonnene) Zellen vor der Analyse auf IFN-γ, Tbet, IL-17A und RORγt gefärbt. Die Zellen wurden für die TCRβ+CD4+-Population eingezäunt. Ergebnisse dargestellt als Mittelwert ± REM, ***p < 0,001, **p < 0,01, * p < 0,05, n = 4-6 Mäuse/Gruppe. Abkürzungen: ALNs = axilläre und inguinale Lymphknoten; CD4 = Differenzierungscluster 4; CHS = Kontaktüberempfindlichkeitsreaktion; IFN-γ = Interferon gamma; IL = Interleukin; MACS = magnetisch aktivierte Zellsortierung; ns = nicht signifikant; RORγt = Retinsäure-Säure-Rezeptor-bezogener orphan nuclear receptor gamma; SEM = Standardfehler des Mittelwerts; SPLs = Milz; Tbet = T-Box-Transkriptionsfaktor TBX21; TCRβ = T-Zell-Rezeptor beta; TNCB = 2,4,6-Trinitrochlorbenzol. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

CHS wird über Hapten induziert, die an Selbstproteinantigene in der Haut binden und Neoantigene bilden. CHS wird durch lokale extravaskuläre Rekrutierung von zirkulierenden antigenspezifischen CHS-Effektor-T-Zellen vermittelt, was zu einer Schwellung im herausgeforderten Gewebe führt, die 24 Stunden nach der Exposition der Sekundärhaut gegenüber dem gleichen Hapten6 ihren Höhepunkt erreicht. Die Schwellung des Gewebes wird hauptsächlich durch die Infiltration von Leukozyten und die leukozytenabhängige Fibrinablagerung24 verursacht. Diese Veränderungen können mit einem Mikrometer erkannt werden, das die Ohrschwellung von hapten-sensibilisierten und herausgeforderten Mäusen im Vergleich zu scheinsensibilisierten und herausgeforderten Mäusen misst.

CHS kann auch durch den Vergleich des Ohrgewichts bestimmt werden. Dann können die Ohrstempel, die für die Bestimmung des Ohrgewichts verwendet werden, für weitere Tests verwendet werden. Die Zellinfiltrate in den entzündeten Ohren bestehen aus Zytokin-produzierenden T-Lymphozyten und MPO-positiven Neutrophilen. In den Homogenaten des Ohrgewebes können verschiedene Parameter gemessen werden, wie z.B. die MPO-Aktivität oder die Konzentration von proinflammatorischen Zytokinen (z.B. TNF-α, IFN-γ, IL-17A oder andere) mit dem ELISA-Test oder die Expression der Zytokin-mRNA in der Haut mit dem qPCR-Test25. Zusätzlich können Änderungen der Gefäßpermeabilität mit dem Evans Blue Test21,26 bewertet werden.

Im entzündeten Ohrgewebe können die beobachteten Veränderungen auch durch In-vitro-Tests ergänzt werden, die die T-Zellproliferation und die Zytokinproduktion hervorheben. Dies kann leicht erreicht werden, indem ALNs in Gegenwart von haptenkonjugierten Proteinantigenen kultiviertwerden 22,27. Die Bewertung der Zytokinsekretion durch ALNs, die aus sensibilisierten, aber nicht herausgeforderten Mäusen isoliert wurden, liefert Details zur Zytokinproduktion durch die CHS-Effektorzellen an der Stelle ihrer Induktion.

Begrenzungen
Viele Mikrometer messen Ohrschwellungen mit unterschiedlicher Genauigkeit. Zum Beispiel wird der niedrigste Druck von einem Federsattel ausgeübt, so dass es scheint, dass die Ergebnisse die tatsächliche Dickenohrmessung am besten widerspiegeln. Mikrometer, die mehr Druck ausüben, wie Mitutoyo, werden jedoch wahrscheinlich die Flüssigkeit, die sich in der frühen Phase der Ödembildung in den Ohren ansammelt, enger komprimieren. Die biphasische Natur von CHS kann mit solchen Mikrometern deutlicher sichtbar gemacht werden, da mehr Druck ausgeübt wird. Dies ist schwieriger, wenn ein Federsattel mit leichtem Druck28 verwendet wird. Dennoch wurde in einigen Studien die Dicke der Ohren mit einem Bremssattel29 gemessen. Auch die Erfahrung des Beobachters gewährleistet genaue Messungen, die durch subjektive Gefühle beeinflusst werden können, auch wenn der Beobachter sich der experimentellen Gruppen nicht bewusst ist.

Hier wurden alternative Methoden beschrieben, die helfen können, die Messungen der Ohrschwellung mit einem Mikrometer zu bestätigen, wodurch die präsentierten Daten zuverlässiger und weniger subjektiv werden. Diese alternativen Strategien zur Bewertung von CHS können jedoch nur zu einem bestimmten Zeitpunkt verwendet werden. Mikrometermessungen können zu verschiedenen Zeitpunkten wiederholt werden, so dass die CHS-Kinetik untersucht werden kann.

Änderungen
Das Protokoll zur Untersuchung der CHS-Reaktion, das wir in unserem Labor verwenden, unterscheidet sich erheblich von denen, die in anderen Labors verwendet werden, einschließlich der Haptendosis und der Lösungsmittelzusammensetzung, die sowohl für die Hervorhebung als auch für die Sensibilisierung verwendet wird, sowie des Zeitpunkts, zu dem die Reaktion beurteilt wird. Die Ohrdicke kann zu verschiedenen Zeitpunkten gemessen werden (z. B. 2 h, 24 h, 48 h und 72 h nach der Herausforderung)10,30. Tabelle 1 zeigt verschiedene experimentelle Modelle, insbesondere die Unterschiede in den Tierstämmen, der Hapten und den Sensibilisierungs- / Provokationszeiten, die in verschiedenen Studien verwendet wurden 10,21,22,26,31,32,33,34,35,36,37 . Das CHS-Protokoll kann auch ohne vorherige Rasur des Abdomens der Mäuse durchgeführt werden.

Der nächste Unterschied betrifft die Durchführung der Auslösung (Herausforderung) selbst. Wie es typisch ist, erfolgt die Sensibilisierung, indem die Bauchhaut rasierter Mäuse mit dem Hapten oder Vehikel allein bemalt wird. Anschließend wird in beiden Gruppen ein Ohr mit verdünntem Hapten auf jeder Ohrseite herausgefordert. Als Steuerung wird das gegenüberliegende Ohr mit einer identischen Fahrzeugmengeallein 10,31 lackiert.

Kritische Schritte
Der kritischste Moment ist das Auslösen von CHS, da die Testergebnisse davon abhängen. (1) Haptenlösung ist sehr flüchtig und lichtempfindlich, daher muss sie fest verschlossen und vor Licht geschützt werden, und wenn sie verwendet wird, muss sie schnell auf die Haut der Tiere aufgetragen werden, damit sie nicht verdunstet. (2) Nach dem Auftragen des Hapten auf die Haut des Abdomens muss es getrocknet werden, bevor das Tier in den Käfig zurückkehrt, da Mäuse es gegen die Einstreu schmieren oder mit ihren Pfoten auf die Ohren auftragen können (dann kann die Messung der Dicke der Ohrmuschel unzureichend sein). (3) Verschiedene Methoden zur Kennzeichnung von Tieren, wie z.B. das Markieren von Mausschwänzen mit einem lösungsmittelresistenten Marker, sind ebenfalls bekannt. Die im Marker vorhandenen Farbstoffe können jedoch (nicht untersucht) zu einem Hapten werden und CHS auslösen. Daher wurde in dieser Studie eine Markierungsmethode gewählt, die die Reaktion nicht beeinflusst. (4) Die Wahl einer Rasiermethode ist sehr wichtig, da sie die Haut reizen kann. In diesem Protokoll wurde eine graue Seife verwendet, weil sie beruhigende Eigenschaften hat; Es beschleunigt die Behandlung von kleineren Schnitten und eiternden Wunden, was durch seine antibakterielle Wirkung unterstützt wird. Es lindert Schwellungen und Entzündungen der Haut.

Weitere Untersuchungen und die Standardisierung der experimentellen Verfahren, einschließlich der Tiernutzung (Stamm und Geschlecht), sind erforderlich, um die Ergebnisse aus verschiedenen Studien zu vergleichen.

Viele verschiedene Umweltfaktoren und neue Substanzen mit biologischen Funktionen können im CHS-Modell getestet werden. Dieses Modell kann nützlich sein, wenn Forscher zeigen wollen, ob getestete Faktoren T-Zell-abhängige Immunantworten modulieren.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgments

Diese Studie wurde durch die Subvention SUBZ unterstützt. A020.22.060 der Medizinischen Universität in Breslau, Polen, und durch Zuschüsse des Ministeriums für Wissenschaft und Hochschulbildung N N401 545940 an MS und IP2012 0443 72 an MMS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% ethanol Merck KGaA, Darmstadt, Germany 65350-M for surface disinfection
96-well flat-bottom plates, polypropylene Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria 655101 for MPO and Evans blue measurement - plates should be made of polypropylene, that has a lower binding capacity so proteins or DNA will not bind
Acetone (ACS reagent, ≥99.5%) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 179124
Aluminum foil Merck KGaA, Darmstadt, Germany Z185140
Analytical balance Sartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, Germany PRACTUM224-1s, 29105177
Automated tissue processor MediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, India MTP-E-212 automatically prepare tissue samples by fixing, dehydrating, clearing, and infiltrating them with paraffin
BD Vacutainer SST II Advance (tube with gel for obtaining serum) Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, USA BD 366882
Bicinchoninic acid kit for protein determination Merck KGaA, Darmstadt, Germany BCA1-1KT
Biotin Rat Anti-Mouse IgG1 Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA 553441
BSA (bovine serum albumine) Merck KGaA, Darmstadt, Germany A9418 protein assays & analysis, 2 mg/mL
Cell strainer, pore size 70 μm BIOLOGIX, China 15-1070 suitable for 50 mL tubes
Coverslip VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 631-1583 24 mm, but it possible to use different size
Disposable pipettes capacity: 5 mL, 10 mL, 25 mL Merck KGaA, Darmstadt, Germany Z740301, Z740302, Z740303
DPBS (Dulbecco′s phosphate buffered saline) ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA 14190144 no calcium, no magnesium, mammalian cell culture
DPX Mountant for histology Merck KGaA, Darmstadt, Germany 6522 mounting media for H-E, might be used some other e.g, Canada balsam
Dumont 5 tweezers - straight Animalab, Poznan, Poland 11251-10FST surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Dumont 7 tweezers - bent Animalab, Poznan, Poland 11272-50FST surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Eosin Y solution, alcoholic Merck KGaA, Darmstadt, Germany HT110116
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL Eppenforf, Germany 3,01,20,086 polypropylene
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL Eppenforf, Germany 3,01,20,094 polypropylene, round bottom (the homogenization beads can easily move)
Ethanol 100% (absolute alkohol) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.07017
Ethanol 96% Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.59010
Evans blue Merck KGaA, Darmstadt, Germany E2129
FBS (fetal bovine serum) ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA A3160802
Formalin solution, neutral buffered, 10% Merck KGaA, Darmstadt, Germany HT501128
Formamide 99.5% (GC) Merck KGaA, Darmstadt, Germany F7503
Freezer -20 °C Bosch, Germany GSN54AW30
Fridge +4 °C / freezer -20 °C Bosch, Germany KGV36V10 mammalian Cell Culture, qualified, Brazil, 10 x 50 mL
Glass microskope slides, SuperFrost Plus VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449 Slides that eliminates the need to apply adhesive materials or protein coatings, to preventing any tissue sections loss during staining.
Graph Pad Prism GraphPad Software Inc. v. 9.4.0
Grey soap Pollena Ostrzeszów, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., Poland Bialy jelen soap bar grey Soap Bar Natural Hypoallergenic. Generally available product
H2SO4 (sulfuric acid) 1 mol/l (1 M) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.60313
Harris hematoxylin solution Merck KGaA, Darmstadt, Germany HHS16
Hemocytometer VWR, Avantor, U.S.A 612-5719 manual counting chamber is recommend, which is more accurate
Hexadecyltrimethylammonium bromide Merck KGaA, Darmstadt, Germany H5882
Homogenizer QIAGEN Hilden, Germany Tissue Lyser LT, SN 23.1001/05234 homogenizer with stainless steel beads (diameter 5 mm) for 2 mL centrifuge tubes
Horseradish peroxidase streptavidin (HRP streptavidin) Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA SA-5004-1
Hydrogen peroxide solution (H202) Merck KGaA, Darmstadt, Germany H1009
Incubator Heracell 150i Thermo Electron LED Gmbh, Germany 41071068 37 oC in the atmosphere of 5 % CO2, and 65 0C for deparaffinization the sections for histology
Ketamine 100 mg/mL, solution for injection Biowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Poland cat.# not avaliable
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) 99.995% anhydrous basis Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.05108
Laboratory Centrifuge Heraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, Germany B00013899 speed to 300 x g, with cooling to 4 0C
Laboratory Centrifuge Heraeus Fresco 21, Thermo Scientific, Germany 75002425 speed to 3,000 x g, with cooling to 4 0C
Mask (FFP2) VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 111-0917 for working with ortho-dianisine dihydrochloride
Mice Breeding unit of the Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, Krakow, Poland CBA/J, C57BL/6
Micrometer Mitutoyo, Tokyo, Japan 193-111 digit Outside Micrometer, Ratchet Stop, 0-25mm Range, 0.001mm Graduation, +/-0.002mm Accuracy, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml  
microplate, 96 well, microlon, high binding (for ELISA test) Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria 655061 with maxi-sorp binding surfaces for reliable and reproducible results in colormetric assays
Microscope with objectives Leica Microsystems CMS GmbH, Germany DM1000, 294011-082007 histology presented in the paper was performed under ThermoFisher Scientific EVOS M5000 Imaging System, with objectives: FL 20X LWDPH, 0.40NA/3.1WD and FL 40X LWDPH 0.65NA/1.79WD
Myeloperoxidase from human leukocytes (MPO standard) Merck KGaA, Darmstadt, Germany M6908
Na2HPO4 x 7 H2O (sodium phosphate dibasic heptahydrate) Merck KGaA, Darmstadt, Germany S9390
Olive-oil Merck KGaA, Darmstadt, Germany 75343 pure, natural
OptEIA Mouse IFN-γ ELISA Set Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA 555138
Ortho-dianisine dihydrochloride Merck KGaA, Darmstadt, Germany D3252
Paraffin wax Merck KGaA, Darmstadt, Germany 76242 beads, waxy solid
PBS (phosphate buffered saline) ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA 20012027 pH 7.2, mammalian cell culture
ph meter Elmetron, Poland CP-401
Pipettes, variable volume with tips Merck KGaA, Darmstadt, Germany EP3123000900-1EA 3-pack, Option 1, 0.5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL, includes epT.I.P.S.
Razor blade VWR, Radnor, Pennsylvania, United States PERS94-0462 scraper and cutter blades, single edge, aluminium spine, 100 blades per box, individually wrapped
Rotary microtome MRC Laboratory-Instruments, Essex, CM20 2HU UK HIS-202A
Scissors - straight, sharp / sharp Animalab, Poznan, Poland 14060-10FST Surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Screw cap (open top) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 27056 black polypropylene hole cap, for use with 22 mL vial with 20-400 thread
Spectrophotometer BioTek Instruments, U.S.A 201446 universal microplate spectrophotometer: λ range: 200 - 999 nm, absorbance measurement range: 0.000 - 4.000 Abs
Staining dish 20 slides with rack Merck KGaA, Darmstadt, Germany S6141 e.g. 20 slide staining dishes complete with covers, slide rack and handle
Sterile Disposable Biopsy Punch 6mm Integra LifeSciences, Princeton, NJ, USA 33-36
Surgical scissors Animalab, Poznan, Poland 52138-46 surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Tissue processing cassettes Merck KGaA, Darmstadt, Germany Z672122 tissue processing/ embedding cassettes with lid
TMB Substrate Reagent Set Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA 555214
TNCB (2,4,6-trinitrochlorobenzene) Tokyo Chemical Industry CO., LTD, Japan C0307
TNP-BSA (bovine serum albumin conjugated with 2,4,6-trinitrophenyl) Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, USA T-5050
T-PER (tissue protein extration reagent) ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA 78510
Tubes 15 mL sterile Merck KGaA, Darmstadt, Germany CLS430055 (Corning) polypropylene, conical bottom
Tubes 50 mL, sterile Merck KGaA, Darmstadt, Germany CLS430290 (Corning) polypropylene, conical bottom
Tween 20 Merck KGaA, Darmstadt, Germany P1379
Vials, screw top, clear glass (vial only) 22 mL Merck KGaA, Darmstadt, Germany 27173 for the preparation of hapten, screwed on so that it does not evaporate
Water bath AJL Electronic, Poland LW102
Wax (paraffin) dispenser VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 114-8737
Xylazine (xylapan 20 mg/mL) solution for injection Vetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Poland cat.# not avaliable
Xylene (histological grade) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 534056

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References

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Immunologie und Infektion Ausgabe 187 Murines Modell allergische Kontaktdermatitis (ACD) Kontaktüberempfindlichkeit (CHS) Ohrschwellung Gefäßpermeabilität Myeloperoxidase (MPO) Zytokine 2,4,6-Trinitrochlorbenzol (TNCB) Hapten

Erratum

Formal Correction: Erratum: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis
Posted by JoVE Editors on 01/19/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis. The Protocol and Representative Results sections were updated.

Step 3.2.1 of the Protocol has been updated from:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone-ethanol mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

to:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone: olive oil mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

Figure 1 of the Representative Results has been updated from:

Figure 1
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 1
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 2 of the Representative Results has been updated from:

Figure 2
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 2
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

Kontaktüberempfindlichkeit als murines Modell der allergischen Kontaktdermatitis
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Zemelka-Wiacek, M.,… More

Zemelka-Wiacek, M., Majewska-Szczepanik, M., Gajdanowicz, P., Szczepanik, M. Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis. J. Vis. Exp. (187), e64329, doi:10.3791/64329 (2022).

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