Summary
La amplificación de la señal de tiramida durante la tinción inmunofluorescente permite la detección sensible de RIPK3 y MLKL fosforilados durante la necroptosis inducida por ZBP1 después de la infección por HSV-1.
Abstract
La quinasa Receptor-interacción serina/treonina proteína quinasa 3 (RIPK3) y su sustrato mixto de linaje quinasa similar a dominio (MLKL) son reguladores críticos de necroptosis, una forma inflamatoria de muerte celular con importantes funciones antivirales. La autofosforilación de RIPK3 induce la fosforilación y activación de la proteína verdugo formadora de poros de la necroptosis MLKL. El tráfico y oligomerización de MLKL fosforilada en la membrana celular da lugar a la lisis celular, característica de la muerte celular necroptótica. El sensor de ácido nucleico ZBP1 se activa uniéndose al ARN bicatenario zurdo en forma Z (ARN-Z) después de la infección con virus de ARN y ADN. La activación de ZBP1 restringe la infección por virus al inducir la muerte celular regulada, incluida la necroptosis, de las células huésped infectadas. La microscopía de inmunofluorescencia permite la visualización de diferentes pasos de señalización aguas abajo de la necroptosis mediada por ZBP1 por célula. Sin embargo, la sensibilidad de la microscopía de fluorescencia estándar, utilizando anticuerpos fosfoespecíficos disponibles comercialmente contra RIPK3 y MLKL humanos, impide la obtención de imágenes reproducibles de estos marcadores. Aquí, describimos un procedimiento de tinción optimizado para serina (S) fosforiladas RIPK3 (S227) y MLKL (S358) en células humanas HT-29 infectadas con el virus del herpes simple 1 (HSV-1). La inclusión de un paso de amplificación de señal de tiramida (TSA) en el protocolo de tinción inmunofluorescente permite la detección específica de S227 fosforilado RIPK3. Además, TSA aumenta en gran medida la sensibilidad de la detección de MLKL fosforilado S358. Juntos, este método permite la visualización de estos dos eventos críticos de señalización durante la inducción de la necroptosis inducida por ZBP1.
Introduction
La proteína quinasa 3 de serina/treonina que interactúa con receptores (RIPK3) y la quinasa de linaje mixto similar a un dominio (MLKL) son reguladores centrales de la muerte celular necrótica 1,2. La necroptosis es una forma lítica e inflamatoria de muerte celular regulada involucrada en la inmunidad antiviral y la autoinflamación. La necroptosis de las células infectadas por virus detiene inmediatamente la replicación del virus. La lisis celular después de la inducción de necroptosis también libera patrones moleculares asociados al daño, que estimulan la inmunidad antiviral 3,4. La necroptosis se inicia por la activación de RIPK3 después de interacciones mediadas por motivos de interacción homotípica RIP (RHIM) con una de las tres moléculas activadoras aguas arriba: RIPK1 (sobre el compromiso del receptor TNF 1 [TNFR1]), β inductor de interferón inductor de adaptador que contiene dominio TIR (TRIF; en el compromiso de los receptores 3 y 4 tipo Toll), o el sensor antiviral de ácido nucleico Z-DNA proteína de unión al ADN 1 (ZBP1)1,2 . La señalización de necroptosis procede a través de una serie de eventos de fosforilación que comienzan con la autofosforilación de RIPK3. La autofosforilación de RIPK3 humana en serina (S)227 dentro de su dominio quinasa es un requisito previo para la necroptosis al permitir la interacción con MLKL y se usa comúnmente como un marcador bioquímico para la activación de RIPK3 humana y la muerte celular necrótica 1,5. Una vez activado, RIPK3 fosforila el bucle de activación de MLKL en treonina (T)357 y S3581. Esto provoca un cambio en la conformación MLKL, lo que resulta en la exposición del dominio del haz de cuatro hélices N-terminal. MLKL luego oligomeriza y trafica a la membrana celular donde forma un poro a través de la inserción de los cuatro haces helicoidales expuestos en la bicapa lipídica, lo que finalmente conduce a la muerte celular 2,6.
ZBP1 es un sensor de ácido nucleico antiviral que reconoce los ácidos nucleicos zurdos en forma Z, incluido el ARN bicatenario en la conformación Z (ARN Z). La unión al ARN Z se produce a través de dos dominios Zα posicionados en el extremo N de ZBP1. Se cree que el ARN-Z que se acumula durante la infección por virus de ARN y ADN afecta directamente a ZBP1 7,8. ZBP1 activado recluta RIPK3 a través de sus RHIM centrales e induce la muerte celular regulada, incluyendo necroptosis 9,10. Los virus han adoptado numerosos mecanismos de escape para contrarrestar la necroptosis de la célula huésped inducida por ZBP111. Por ejemplo, la subunidad 1 de la ribonucleótido reductasa del virus del herpes simple 1 (HSV-1), conocida como ICP6 y codificada por UL39, alberga RHIM en su extremo N que interfiere con la activación de RIPK3 mediada por ZBP1 en células humanas12,13,14,15. ZBP1 no sólo restringe la replicación viral, sino que los estudios en ratones han demostrado que la activación de ZBP1 causa enfermedades inflamatorias y estimula la inmunidad contra el cáncer 16,17,18,19,20,21. Los protocolos que detectan eventos de señalización que ocurren durante la necroptosis inducida por ZBP1 en células humanas son, por lo tanto, valiosos para evaluar el papel de ZBP1 en estos procesos.
La amplificación de señal de tiramida (TSA), también conocida como deposición catalizada del informador (CARD), se ha desarrollado para mejorar el límite de detección y la relación señal-ruido en inmunoensayos basados en anticuerpos. Durante la TSA, se puede usar cualquier anticuerpo primario para detectar el antígeno de interés. La peroxidasa de rábano picante (HRP), acoplada a un anticuerpo secundario, cataliza la acumulación local de radicales tiramida biotinilados en presencia de peróxido de hidrógeno. Estos radicales de biotina-tiramida activados reaccionan con residuos de tirosina proximales para formar enlaces covalentes. Los sustratos potenciales de tiramida-biotina incluyen el antígeno en sí, los anticuerpos primarios y secundarios y las proteínas vecinas. Por lo tanto, aunque TSA mejora significativamente la sensibilidad del ensayo, parte de su resolución espacial se pierde. En un paso final, las moléculas de biotina se detectan utilizando estreptavidina marcada con fluorescencia. La reacción HRP deposita muchas moléculas de tiramida-biotina en o cerca del antígeno de interés. Esto aumenta en gran medida el número de sitios de unión estreptavidina-fluorocromo, amplificando así en gran medida la sensibilidad del ensayo (Figura 1). Alternativamente, la tiramida se puede acoplar directamente a un fluorocromo, eliminando la necesidad de fluoróforos acoplados a estreptavidina. La inmunohistoquímica de proteínas y la hibridación in situ ADN/ARN estuvieron entre los primeros métodos mediante los cuales se empleó TSA para mejorar las intensidades de señal22,23. Más recientemente, la TSA se ha combinado con la citometría de flujo intracelular24 y la espectrometría de masas25.
Aquí, presentamos un protocolo para detectar serina 227 fosforilada humana RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) y MLKL humana fosforilada (p-MLKL [S358]) tras la activación de ZBP1 por infección por HSV-1 utilizando microscopía de inmunofluorescencia. Utilizamos una línea celular de adenocarcinoma colorrectal humano HT-29 sensible a la necroptosis que se transdució para expresar de manera estable ZBP1 humano. Estas células fueron infectadas con una cepa HSV-1 que expresa una proteína ICP6 mutante (HSV-1 ICP6mutRHIM) en la que cuatro aminoácidos centrales dentro del RHIM viral (VQCG) fueron reemplazados por alaninas (AAAA), lo que hace que el ICP6 no pueda bloquear la necroptosis mediada por ZBP113,14,15. Para superar el problema de la baja relación señal-ruido de los anticuerpos actualmente disponibles comercialmente dirigidos contra p-RIPK3 y p-MLKL en inmunotinción26, realizamos un paso de amplificación de señal de tiramida (TSA) (Figura 1), que resulta en la detección robusta de p-RIPK3 humano (S227) y mejora la sensibilidad de detección de p-MLKL humano (S358) en un orden de magnitud.
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Protocol
1. Preparación de tiramida biotinilada
- Preparar tiramida biotinilada a partir de biotina-tiramida. Para hacer una solución madre de 10 mM, disuelva 3,6 mg de tiramida de biotina en 1 ml de DMSO. Conservar el producto disuelto en alícuotas a -20 °C para preservar la calidad.
2. Mantenimiento de células HT-29 en cultivo
NOTA: Los HT-29 que expresan ZBP1 se generaron por transducción con un lentivector27 que codifica ZBP1 humano.
- Mantenga las células HT-29 que expresan ZBP1 en el medio 5A de McCoy suplementado con L-glutamina, piruvato de sodio y suero bovino fetal al 10% (de ahora en adelante denominado medio completo) y manténgalo en una incubadora a 37 ° C con 5% de dióxido de carbono. Lo ideal es utilizar celdas de un número de paso bajo (menos de 10). Deje que las células se recuperen durante al menos 5 días después del ciclo de descongelación antes del inicio del experimento.
- Para separar las células del matraz de cultivo, retirar el medio y lavar las células con 5 ml de PBS (precalentado a 37 °C). A continuación, añadir la cantidad adecuada de tripsina/EDTA (0,05% tripsina y 0,032% EDTA, respectivamente, precalentado a 37 °C) a las células (2 ml para un matraz T75, 3 ml para un matraz T175).
- Incubar las células con tripsina/EDTA durante un máximo de 10 minutos en una incubadora a 37 °C con 5% de dióxido de carbono. Después, golpee el matraz y compruebe visualmente si las células se desprendieron del matraz con un microscopio con un aumento objetivo de 4x-20x.
- Si las células no están completamente separadas, incubar durante otros 5 minutos a 37 °C. Cuando las células se desprendan, detener la reacción enzimática añadiendo 6 ml de medio completo al matraz.
- Reúna la suspensión celular en un tubo de 15 ml. Contar las células usando una tinción azul de tripano para evaluar la viabilidad; Se recomienda una dilución 1:5. Solo se procede con el experimento si la viabilidad de las células supera el 90%.
3. Inicio del experimento, siembra y estimulación de las células
- Sembrar 90.000 células HT-29 que expresan ZBP1 en medio completo en una placa de pozo de área de superficie de 1 cm² que permite microscopía de alta gama. Utilice un volumen final de 200 μL por pocillo.
- Incubar las células durante la noche a 37 °C con 5% de dióxido de carbono. Tenga en cuenta que es necesario sembrar algunos pozos adicionales para los controles de tinción, lo que se explica con más detalle en el paso 5.6.
- Cuando las células alcancen una confluencia del 70% -80%, agregue un estímulo inductor de necroptosis a las células. Aquí, las células se infectaron con HSV-1 ICP6mutRHIM (multiplicidad de infección [MOI] de 5, definida como unidades formadoras de placa (ufp) divididas por el número de células; la pfu se cuantificó mediante un ensayo de placa en células Vero) durante 6 h, 8 h o 10 h.
- Como control positivo para la inducción de necroptosis, estimular las células durante 4 h con un cóctel inductor de necroptosis que contenga 30 ng/mL de TNF, 20 μM del inhibidor pan-caspasa zVAD-fmk y 5 μM del SMAC mimético BV6.
- Como control negativo para la tinción de p-RIPK3 (S227), incluir GSK'840 (1 μM) para inhibir la actividad de la quinasa RIPK3 y prevenir la autofosforilación de S227. Idealmente, agregue el inhibidor en una condición no tratada y después de la estimulación de la necroptosis. El inhibidor se puede agregar simultáneamente con la infección viral.
- Preparar los estímulos en medio completo, precalentados a 37 °C. Use un volumen final de 200 μL por pocillo para todas las estimulaciones.
4. Fijación de las celdas
- Retire el medio y lave las células con 200 μL de 1x PBS. Luego, agregue 150 μL de PFA al 4% (ya equilibrado a temperatura ambiente) a las células e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos.
NOTA: Si está utilizando celdas que se desprenden fácilmente, la fijación de las celdas se puede optimizar de la siguiente manera. Retire 100 μL de medio del pozo, de modo que quede un volumen de 100 μL en la placa. Agregue 100 μL de PFA al 4% a las células. Incubar las celdas durante 5 min a temperatura ambiente. Después, retire el medio/fijador de los pocillos y reemplácelo con 150 μL de PFA al 4%. Incubar las células durante otros 20 minutos a temperatura ambiente para asegurar la fijación completa de las células. - Después de la fijación, retire el PFA al 4% y lave las células 3x con 200 μL de 1x PBS. Las muestras pueden almacenarse en un exceso (>200 μL) de 1x PBS a 4 °C durante la noche hasta su posterior procesamiento.
5. Permebilización y tinción primaria
- Retire el PBS y agregue 100 μL de tampón de permeabilización (0.5% Triton X-100 en PBS). Incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
- Retirar el tampón de permeabilización y, posteriormente, lavar los pocillos con 100 μL de tampón de lavado (0,1% Triton X-100 en PBS). Incubar la cámara de imágenes con tampón de lavado durante 5 minutos a temperatura ambiente en un agitador de laboratorio basculante (20-30 movimientos de balanceo por minuto).
- Para evitar la unión inespecífica de anticuerpos primarios, añadir 100 μL de medio bloqueador e incubar a temperatura ambiente durante 2 h. Alternativamente, este paso de bloqueo puede ser reemplazado por el bloqueo con BSA al 3%, Triton-X-100 al 0,1% en PBS durante 1 h a temperatura ambiente.
- Lave los pocillos 3 veces con 100 μL de tampón de lavado (0,1% Triton X-100 en PBS). Incubar los pasos de lavado durante 5 minutos a temperatura ambiente en un agitador de laboratorio basculante.
- Después de retirar el tampón de lavado, añadir los anticuerpos primarios a la cámara de imagen e incubar durante la noche a 4 °C. Use un volumen final de 100 μL para cubrir el pozo. Durante la incubación nocturna a 4°C, no coloque la cámara de imágenes sobre un agitador de laboratorio basculante.
NOTA: Anti p-MLKL (S358; dilución: 1:200) y anti-p-RIPK3 (S227; dilución: 1:200) comparten al conejo como especie huésped y, por lo tanto, no deben combinarse en un pozo. Para controlar la infección viral, combine un anticuerpo primario contra una proteína viral de elección con p-MLKL (S358) o p-RIPK3 (S227). Aquí, las células se infectaron con infección por HSV-1 seguida de tinción ICP0 (dilución: 1:50, especie huésped: ratón). - Tenga en cuenta los controles de tinción necesarios en este punto. Siempre incluya una condición sin anticuerpos primarios para visualizar el fondo potencial del paso de amplificación de TSA para establecer el umbral de enmascaramiento (consulte el paso 9).
NOTA: En caso de un protocolo de tinción conjunta (por ejemplo, combinar p-MLKL [S358] o p-RIPK3 [S227] con un anticuerpo contra una proteína viral) use también tinciones individuales. El uso de tinciones individuales es importante para corregir la posible señal de sangrado en otros canales de imagen.
6. Amplificación de señal de tiramida (TSA)
- Retire la mezcla de anticuerpos primarios y lave los pocillos 3 veces con 100 μL de tampón de lavado (0,1% Triton X-100 en PBS). Incubar los pasos de lavado durante 5 minutos a temperatura ambiente en un agitador de laboratorio basculante.
- Retire el tampón de lavado y agregue 100 μL de anticuerpo secundario marcado con HRP reconociendo la especie de anticuerpo primario que necesita ser amplificado. Para amplificar la señal p-RIPK3 (S227) o p-MLKL (S358), añadir 100 μL de anti-conejo-HRP e incubar durante 30 min a temperatura ambiente en un agitador de laboratorio basculante.
NOTA: Solo se amplificarán p-MLKL (S358) o p-RIPK3 (S227). La tinción de una proteína viral se visualizará utilizando un método estándar de tinción indirecta. - Después, lave los pocillos 3 veces con 100 μL de tampón de lavado (0,1% Triton X-100 en PBS). Incubar los pasos de lavado durante 5 minutos a temperatura ambiente en un agitador de laboratorio basculante.
- En los siguientes pasos, agregue la tiramida biotinilada a la placa microscópica. Usando el grupo HRP acoplado a los anticuerpos secundarios, la reacción enzimática desencadenará la formación de radicales tiramida muy cerca del objetivo primario (aquí, p-MLKL [S358] o p-RIPK3 [S227]).
- Para activar la actividad enzimática de HRP, agregue un sustrato oxidante junto con la tiramida biotinilada. Para lograr esto, complemente el tampón TSA (ácido bórico 0.1 M [pH 8.5]) con 0.03 M H 2 O2; específicamente, tomar 5 mL de tampón TSA y agregar 5 μL de 30%H2O2.
- Ahora, diluya la biotina-tiramida en un tampón TSA suplementado conH2O2que va desde 1: 1,000 a 1: 20,000.
NOTA: El factor de dilución de la biotina-tiramida debe optimizarse por lote. - Retire el tampón de lavado de los pocillos y agregue biotina-tiramida diluida a los pocillos hasta un volumen final de 100 μL. Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos en un agitador de laboratorio basculante.
- A continuación, lave los pocillos 3 veces con 100 μL de tampón de lavado (0,1% Triton X-100 en PBS). Incubar los pasos de lavado durante 5 minutos a temperatura ambiente en un agitador de laboratorio basculante.
7. Fluoróforos
NOTA: Dado que la señal del anticuerpo primario se convierte en un grupo biotina, p-MLKL (S358) y p-RIPK3 (S227) se visualizan utilizando estreptavidina acoplada a un fluoróforo (fluoróforo 568, dilución: 1:500). Además, los núcleos se tiñen con DAPI (5 μg/mL). Si se incluye una proteína viral en el protocolo de tinción, incluya un anticuerpo secundario adecuado marcado con fluorescencia contra la especie huésped de su anticuerpo primario. En los resultados representativos, se utilizó un ratón anti-ICP0. Como anticuerpo secundario se incluyó un antiratón de cabra acoplado al fluoróforo 633 (dilución: 1:1.000).
- Hacer la mezcla de tinción en tampón de lavado (0,1% Triton X-100 en PBS) que contiene los anticuerpos y tinciones mencionados anteriormente. Retire el tampón de lavado, agregue 100 μL de mezcla para tinción e incube a temperatura ambiente durante 1 h en un agitador de laboratorio basculante. Mantenga la cámara de imágenes protegida de la luz desde este paso en adelante.
- A continuación, lave los pocillos 2x con tampón de lavado (0.1% Triton X-100 en PBS). Incubar los pasos de lavado durante 5 minutos a temperatura ambiente en un agitador de laboratorio basculante.
- Finalmente, enjuague los pozos 2x con 1x PBS. Almacene las muestras en un exceso (> 200 μL) de 1x PBS hasta obtener imágenes. Alternativamente, sumerja las muestras en un medio de montaje para preservar la tinción. La cámara de imágenes ahora está lista para ser visualizada en un microscopio confocal.
8. Obtención de imágenes con un microscopio confocal
- Encienda el microscopio confocal y los láseres al menos 10 minutos antes de la toma de imágenes.
- Utilice un objetivo de inmersión para la sensibilidad. Preferiblemente, use un aumento objetivo de 40x o 63x. Antes de obtener imágenes, limpie los objetivos de inmersión con un limpiador de lentes utilizando bolas de algodón adecuadas. Los objetivos sucios (por ejemplo, debido al polvo) pueden dar lugar a imágenes de menor calidad.
- Coloque una cantidad excesiva de aceite en la parte inferior de la cámara de imágenes. Además, agregue una gota de aceite en el objetivo de elección.
- Coloque la cámara de imágenes en el microscopio. Encuentre el campo de enfoque mediante la tinción DAPI o mediante imágenes de campo claro. Si es necesario, muévase alrededor de la cámara de imágenes para garantizar la distribución adecuada del aceite de inmersión.
- Configure las pistas de imágenes necesarias en el microscopio. Dependiendo del microscopio, los siguientes pasos pueden variar (Tabla 1).
NOTA: Al configurar las pistas de imágenes, programe las pistas para que la tinción nuclear se mida al final. El láser de 405 nm puede contribuir al fotoblanqueo y, por lo tanto, a la pérdida de señal específica en todos los canales. - Para analizar una celda completa para detectar la presencia de p-RIPK3 (S227) o p-MLKL (S358), mida pilas z que abarquen la altura de la celda. Aquí, las pilas z se hicieron de 40 cortes cada 0,16 μm, lo que resultó en un rango de 6,22 μm.
| Pista | Láser | Divisor de haz | Filtro |
| pRIPK3 (S227) /pMLKL (S358) | 561 | MBS -405 + | BP 570-620 + LP645 |
| MBS 488/561/633 + SBS SP615 | |||
| Gen viral: ICP0 | 633 | MBS -405 + | BP 420-480 + LP605 |
| MBS 488/561/633 + SBS LP570 | |||
| Núcleo: DAPI | 405 | MBS -405 + | BP 420-480 + BP 495-550 |
| MBS 488/561/633 |
Tabla 1: Pistas de imágenes para la visualización celular.
9. Análisis y cuantificación de datos
- Cargue las imágenes microscópicas en el software. Utilice el enfoque extendido para visualizar toda la información de la pila z en una imagen 2D.
- A continuación, programe el protocolo de análisis para extraer la siguiente información: el número de células por imagen, la suma de vóxeles que muestran la tinción p-RIPK3 (S227)+ o p-MLKL (S358)+. Un vóxel representa un volumen tridimensional, definido como el equivalente tridimensional de un píxel.
- Para cuantificar el número de células por imagen, segmente el núcleo. Para reducir el ruido en los resultados de segmentación, agregue una limitación de tamaño a la segmentación (>100 μm³). El número de núcleos segmentados representa el número de células en la imagen.
- Para cuantificar la cantidad de vóxeles p-RIPK3 (S227)+ o p-MLKL (S358)+, programe una segmentación basada en umbrales. Establezca el umbral para que no se capte ninguna señal en las imágenes sin anticuerpos primarios (NP).
- Adapte aún más el umbral utilizando las imágenes de la condición simulada no tratada. Para garantizar la detección sensible del aumento de la señal debido a la estimulación de la necroptosis, limite la captación de vóxeles p-RIPK3 (S227)+ o p-MLKL (S358)+ en condiciones simuladas estableciendo un umbral más alto. Siempre verifique el protocolo de análisis programado en varias imágenes de la condición simulada y la infección viral que induce necroptosis.
- Ejecute el análisis en todos los conjuntos de imágenes. Exporte la cuantificación de vóxel y la segmentación del núcleo en un archivo .txt para su posterior procesamiento en el software de hoja de cálculo.
- Haga una tabla dinámica de los datos que muestre el nombre de la imagen, la cuantificación del núcleo y la suma de los vóxeles detectados.
- A continuación, divida la suma de los vóxeles positivos por el recuento de celdas en la imagen. Esto da como resultado un valor relativo de vóxeles positivos por célula. Para visualizar el aumento del pliegue, divida el valor relativo de p-RIPK3 (S227)+ o p-MLKL (S358)+ vóxeles por celda por la mediana de la condición no tratada (simulacro).
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Representative Results
La detección inmunofluorescente de la fosforilación de MLKL y especialmente de la fosforilación de RIPK3 en células humanas es técnicamente desafiante26. Aquí presentamos un protocolo de tinción mejorado para p-RIPK3 (S227) y p-MLKL (S358) humanos tras la activación de ZBP1. El protocolo incluye un paso TSA para mejorar el límite de detección y la sensibilidad de las señales fluorescentes. Para validar el método, se realizó una comparación lado a lado de la inmunofluorescencia mediada por TSA con la tinción fluorescente indirecta estándar de p-RIPK3 (S227) y p-MLKL (S358).
Las células HT-29 que expresan ZBP1 humano se infectaron durante 9 h con una cepa ICP6 RHIM mutante HSV-1 (HSV-1 ICP6mutRHIM) para inducir necroptosis mediada por ZBP1 y fosforilación de RIPK3. La cepa HSV-1 ICP6mutRHIM porta una mutación VQCG a AAAA dentro de la ICP6 RHIM y es incapaz de bloquear la señalización de necroptosis aguas abajo de ZBP114,15. Como se informó anteriormente26, la inmunofluorescencia indirecta estándar no fue lo suficientemente sensible como para visualizar la fosforilación de RIPK3 S227 con el anticuerpo disponible comercialmente actual, incluso cuando la potencia del láser del microscopio confocal se incrementó al 30% (Figura 2A). Por el contrario, la inclusión de un paso TSA permitió la detección robusta de p-RIPK3 (S227) en el citosol de células infectadas con HSV-1 ICP6mutRHIM. La señal p-RIPK3 (S227) alcanzó la saturación cuando la potencia del láser se estableció en 2% (Figura 2A). La cuantificación de las imágenes tridimensionales de la pila z (ver paso 9) mostró un aumento aproximado de 20 veces en el número de vóxeles que fueron positivos para p-RIPK3 (S227) en HSV-1 ICP6mutRHIM-infectado sobre células tratadas con simulacro (Figura 2B). La omisión del anticuerpo primario anti-p-RIPK3 (S227) del protocolo de tinción mediado por TSA como control no primario (NP) no produjo una señal detectable. Para visualizar las células infectadas conmutRHIM de HSV-1 ICP6, las muestras se tiñeron conjuntamente con un anticuerpo primario dirigido contra la proteína viral temprana inmediata ICP0 (Figura 2A). Una señal p-RIPK3 (S227) baja pero detectable estaba presente en las células tratadas simuladamente, lo que puede representar la autofosforilación constitutiva de RIPK3 humano en este sitio5 (ver la discusión). De acuerdo con un informe anterior28, el RHIM de ICP6 no puede bloquear completamente la fosforilación de RIPK3 S227, ya que detectamos un aumento de la tinción p-RIPK3 (S227) de células infectadas con HSV-1 de tipo salvaje (HSV-1WT; Figura 2A,B). Para validar aún más la especificidad de la señal p-RIPK3 (S227), las células se trataron con el inhibidor de la quinasa RIPK3 GSK'840 antes de la infección. GSK'840 se une al dominio quinasa de RIPK3, impidiendo su actividad e inhibiendo así su autofosforilación29. GSK'840 previno la fosforilación de RIPK3 en S227 tras la activación de ZBP1 (Figura 2A, B), confirmando la especificidad del método de detección p-RIPK3 (S227) mediado por TSA.
Para seguir la fosforilación de MLKL, un marcador en etapa terminal para la necroptosis, las células HT-29 que expresan ZBP1 se infectaron con HSV-1 ICP6mutRHIM durante 8 h y 10 h. Las células se tiñeron con un anticuerpo contra S358 fosforilado MLKL (p-MLKL [S358]) utilizando TSA. Las células tratadas simuladas mostraron una tinción citosólica baja y algo puntiaguda de p-MLKL (S358), mientras que se detectó una fuerte tinción p-MLKL en el citosol, núcleo. y en la membrana plasmática en las células que fueron infectadas con HSV-1 ICP6mutRHIM (Figura 3A). Además, la señal p-MLKL (S358) se observó en grupos. Esto está en línea con las funciones formadoras de poros de los oligómeros MLKL fosforilados activados en la membrana celular y su translocación nuclear recientemente reportada tras la infección por influenza A 1,2,6,30. Como control positivo de tinción p-MLKL (S358), estimulamos células HT-29 que expresan ZBP1 con una combinación de TNF, el SMAC mimético BV6 y el inhibidor pan-caspasa zVAD-fmk para inducir necroptosis mediada por TNFR1 (Figura 3A). La omisión del anticuerpo primario anti-p-MLKL (S358) del protocolo de tinción mediado por TSA como un control primario no produjo una señal detectable.
A continuación, realizamos una comparación lado a lado de la tinción inmunofluorescente p-MLKL (S358) con y sin TSA. Las células HT-29 que expresan ZBP1 se infectaron durante 9 h con HSV-1 ICP6mutRHIM. Mientras que se necesitaba una potencia láser del 40% para detectar una señal específica de p-MLKL (S358) en las células infectadas utilizando inmunofluorescencia indirecta estándar, las muestras tratadas con TSA ya alcanzaban señales de saturación a una potencia láser del 6% sin aumentar la tinción de fondo en las muestras tratadas con simulacro (Figura 3B). Además, la cuantificación de las imágenes tridimensionales de la pila z mostró un aumento de más de 10 veces en el número de vóxeles que fueron positivos para p-MLKL (S358) cuando se usó TSA en comparación con la inmunofluorescencia indirecta estándar. Esto demuestra que la TSA mejora tanto el umbral de detección como la sensibilidad para p-MLKL (S358; Figura 3C).
Finalmente, para validar el protocolo de inmunofluorescencia mediada por TSA para otros estímulos virales de necroptosis dependientes de ZBP1, infectamos células HT-29 que expresan ZBP1 con la cepa PR8 del virus de la influenza A (IAV) durante 9 h. IAV induce tanto la apoptosis mediada por ZBP1 como la necroptosis en células humanas30. De hecho, TSA permitió la detección robusta de p-RIPK3 (S227) y p-MLKL (S358), indicativo de estas células sometidas a necroptosis (Figura 4A-D).
Figura 1: Representación esquemática del protocolo TSA. Las células se siembran y estimulan en una placa de pozo, compatible con microscopía de alta gama. Posteriormente, las muestras se fijan en PFA al 4%, se permeabilizan y bloquean para evitar una unión específica de anticuerpos primarios. Para visualizar RIPK3 fosforilada (p-RIPK3 [S227]) y MLKL (p-MLKL [S358]), los anticuerpos específicos que reconocen estos sitios clave de fosforilación se incuban durante la noche en la cámara de imágenes. A continuación, se agrega un anticuerpo secundario, acoplado a una peroxidasa de rábano picante (HRP). Este grupo HRP permite la activación de la tiramida biotinilada en presencia deH2O2. Posteriormente, la biotina-tiramida activa se acopla covalentemente a los residuos de tirosina muy cerca del anticuerpo secundario marcado con HRP. Estos incluyen tirosinas sobre las proteínas de interés -en este caso p-RIPK3 o p-MLKL, como se indica en la figura- y las de proteínas vecinas y sobre los propios anticuerpos primarios y secundarios (no mostrados). Este paso de amplificación de la señal de tiramida aumenta en gran medida la sensibilidad del protocolo de tinción. En un paso final, se agrega estreptavidina acoplada a un grupo fluorescente para visualizar las moléculas biotiniladas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: HSV-1 ICP6mutRHIM induce la fosforilación dependiente de ZBP1 de RIPK3 humano en S227. (A) Imágenes confocales representativas de células HT-29 humanas que expresan ZBP1, comparando la tinción de TSA con un protocolo estándar de tinción de inmunofluorescencia indirecta (sin TSA) para p-RIPK3 (S227). Las muestras simuladas e infectadas con virus (HSV-1WT o HSV-1 ICP6mutRHIM [MOI = 5]) se incubaron durante 9 h. Como control negativo, se incluyó el inhibidor de la quinasa RIPK3 GSK'840 (1 μM). Se incluye un control de tinción no primaria (NP) de células infectadas con HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) durante 9 h en el que se omitieron los anticuerpos primarios anti-p-RIPK3 (S227) e ICP0. La potencia láser necesaria para detectar la señal específica de p-RIPK3 (S227) se indica en las imágenes. ICP0 se usó para teñir las células infectadas por el virus, y DAPI se usó para teñir el núcleo. Las barras de escala son de 10 μm. (B) Cuantificación relativa de vóxeles p-RIPK3 (S227)+ utilizando el protocolo de tinción TSA. Cada punto representa una imagen, y la barra roja representa la mediana. Los valores de recuento de vóxel se presentan en relación con la mediana del recuento de vóxel de imágenes en la condición simulada. Las estadísticas se realizaron utilizando un ANOVA unidireccional con comparaciones múltiples utilizando la corrección de Tukey. p > 0,05 (n.s.), p≤ 0,05 (*), p≤ 0,01 (**). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: HSV-1 ICP6mutRHIM induce la fosforilación dependiente de ZBP1 de MLKL humana en S358. (A) Imágenes confocales representativas de células HT-29 que expresan ZBP1 humanas. Las células fueron tratadas simuladamente o infectadas con HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) durante 8 h y 10 h. TSA se utilizó para detectar p-MLKL (S358). ICP0 se usó para teñir las células infectadas por el virus, y DAPI se usó para teñir el núcleo. Se muestra un control de tinción no primario (NP) de las células que se infectaron durante 10 h con HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) en el que se omitió el anti-p-MLKL primario (S358). Como control positivo, las células fueron estimuladas durante 4 h con 30 ng/mL TNF, 5 μM BV6 y 20 μM ZVAD-fmk, lo que induce necroptosis vía TNFR1. Las barras de escala son de 10 μm. (B) Imágenes confocales representativas de células HT-29 humanas que expresan ZBP1, comparando la tinción de TSA con un protocolo estándar de tinción de inmunofluorescencia indirecta (sin TSA) para p-MLKL (S358). Las células fueron tratadas simuladamente o infectadas con HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) durante 9 h. Se incluye un control de tinción NP de células infectadas con HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) durante 9 h en el que se omitieron los anticuerpos primarios anti-p-MLKL (S358) e ICP0. La potencia láser necesaria para detectar la señal específica p-MLKL (S358) se indica en las imágenes. (C) Cuantificación relativa de vóxeles p-MLKL (S358)+ utilizando el protocolo estándar (sin TSA) y el protocolo de tinción TSA. Cada punto representa una imagen, y la barra roja representa la mediana. Los valores de recuento de vóxel se presentan en relación con la mediana del recuento de vóxel de imágenes en la condición simulada. Las estadísticas se realizaron utilizando un ANOVA unidireccional con comparaciones múltiples utilizando la corrección de Tukey. p > 0,05 (n.s.), p ≤ 0,0001 (****). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: El virus de la influenza A induce la fosforilación dependiente de ZBP1 de RIPK3 y MLKL humanos. (A,C) Imágenes confocales representativas de células HT-29 humanas que expresan ZBP1. Las células fueron tratadas simuladamente o infectadas con el virus de la influenza A (IAV), cepa PR8 (MOI = 4) durante 9 h y teñidas para p-RIPK3 (S227; A) o p-MLKL (S358; C) utilizando el protocolo TSA. Las barras de escala son de 10 μm. (B,D) Cuantificación relativa de p-RIPK3 (S227)+ (B) o p-MLKL (S358; D) vóxeles. Cada punto en (B, D) representa una imagen, y la barra roja representa la mediana. Los valores de recuento de vóxel se presentan en relación con la mediana del recuento de vóxel de imágenes en la condición simulada. Las estadísticas se realizaron utilizando una prueba de Mann-Whitney. p≤ 0,05 (*), p ≤ 0,01 (**). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo de tinción inmunofluorescente describe el uso de la amplificación de señal de tiramida (TSA) para aumentar la sensibilidad a los eventos de señalización de la vía de señalización necropótica humana que son difíciles de detectar, incluida la fosforilación de RIPK3 y MLKL26. La inclusión de un paso TSA mejora significativamente el umbral de detección de p-RIPK3 (S227) y p-MLKL (S358) y aumenta la sensibilidad del esfuerzo p-MLKL (S358). TSA reveló una señal p-RIPK3 (S227) ya presente en las muestras tratadas simuladamente. En células humanas, la autofosforilación de RIPK3 en S227 es un requisito previo para la activación de la necroptosis al permitir una interacción estable con MLKL. Este proceso ya ocurre a niveles basales y resulta en la formación de un dímero p-RIPK3 (S227)/MLKL inactivo estable antes de la inducción de necroptosis 2,5,31. Del mismo modo, el anticuerpo anti-p-RIPK3 utilizado en este estudio también detecta p-RIPK3 (S227) en células no tratadas por western blot26.
La fosforilación de MLKL por RIPK3 dentro del bucle de activación, en T357 y S358, da como resultado la disociación del complejo inactivo p-RIPK3 (S227)/MLKL e induce un cambio conformacional mediante el cual MLKL expone su dominio N-terminal de cuatro hélices. El p-MLKL activado luego oligomeriza y trafica a la membrana celular donde inserta sus cuatro haces helicoidales en la bicapa lipídica, lo que resulta en la lisis celular 1,2,6. Usando este protocolo de inmunofluorescencia TSA, detectamos un fuerte aumento en la fosforilación de S358 MLKL durante la necroptosis inducida por ZBP1. p-MLKL (S358) se agrupó dentro del citosol y en la membrana plasmática y también se encontró dentro del núcleo tras la activación de ZBP1. De hecho, se ha informado que ZBP1 estimula la perturbación mediada por MLKL de la membrana nuclear en el contexto de la infección por IAV 8,30. Cabe señalar, sin embargo, que TSA no solo deposita biotina-tiramida en el antígeno de interés y los anticuerpos primarios / secundarios, sino también en proteínas vecinas. Por lo tanto, la TSA no es ideal para deducir información sobre la localización subcelular precisa de las proteínas detectadas, y no recomendamos la TSA para estudios de colocalización.
Los ciclos repetidos de congelación-descongelación afectan la estabilidad de la tiramida biotinilada. Para evitar una disminución en la sensibilidad de la señal, recomendamos alícuota la tiramida y usar una alícuota nueva para cada experimento. Se debe tener precaución con las diferencias de lote a lote en las existencias de biotina-tiramida. Si la concentración final de biotina-tiramida es demasiado alta, el fondo no específico de la amplificación de TSA enmascarará la señal específica. Para controlar esto, recomendamos valorar cada nuevo lote de biotina-tiramida e incluir un control de tinción no primaria en el que se omite el anticuerpo primario.
En el protocolo presentado, la TSA se limitó a un objetivo. La detección de RIPK3 fosforilada y MLKL no se combinó en la misma tinción, ya que ambos anticuerpos primarios se elevaron en la misma especie. El protocolo podría adaptarse para detectar múltiples señales amplificadas por TSA (por ejemplo, p-RIPK3 [S227] y p-MLKL [S358]) dentro de la misma muestra utilizando el inmunofluorescente múltiple TSA32,33. Finalmente, la amplificación mediada por TSA para microscopía de inmunofluorescencia se puede utilizar para el reconocimiento de biomarcadores de otras vías de señalización con relaciones señal-ruido deficientes informadas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer al VIB Bioimaging Core por la capacitación, el apoyo y el acceso al parque de instrumentos. J.N. cuenta con el apoyo de una beca de doctorado de la Fundación de Investigación de Flandes (FWO). La investigación en el grupo J.M. fue apoyada por una beca Odysseus II (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), una beca de investigación junior (G031022N) de la Fundación de Investigación de Flandes (FWO), una beca de prueba de concepto para jóvenes investigadores de CRIG y por la Universidad de Gante. La investigación en el grupo P.V. contó con el apoyo de EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO senior research grants (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Foundation against Cancer (F/2016/865, F/2020/1505), CRIG y GIGG consorcios, y VIB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti-rabbit HRP | Agilent Technologies Belgium | K4002 | Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit |
| Goat anti-mouse DyLight 633 | Thermofisher | 35513 | Secundary antibody |
| HSV-1 ICP0 | Santa Cruz | sc-53070 | Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody |
| IAV-PR8 mouse serum | In house production | xx | Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody |
| pMLKL | Abcam | ab187091 | Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody |
| pRIPK3 | Abcam | ab209384 | Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody |
| Fluorophores | |||
| DAPI | Thermofisher | D21490 | To visualise the nucleus of the cells |
| Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568 | Thermofisher | S11226 | To visulalise biotin molecules |
| Compounds | |||
| 30% H2O2 | Sigma | H1009 | Oxidising substrate, necessary for HRP activity |
| 4% PFA | SANBIO | AR1068 | To fix/crosslink the cells |
| Biotinyl-tyramide | R&D Systems | 6241 | To amplify signal, HRP substrate |
| BV-6 | Selleckchem | S7597 | BV6 IAP Inhibitor |
| For cell culture: to detach the cells | |||
| 8.0 g/L NaCl | |||
| 0.4 g/L disodium salt of EDTA | |||
| EDTA 0.04% | In house formulation | 1.1 g/L Na2HPO4 | |
| 0.2 g/L NaH2PO4 | |||
| 0.2 g/L KCl | |||
| 0.2 g/L Glucose | |||
| Fetal Bovine serum | TICO | FBS EU XXX | For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439 |
| GSK'840 | Aobious | AOB0917 | RIPK3 kinase inhibitor |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | For cell culture, maintaining cell culture |
| MAXblock | Active Motif | 15252 | Blocking solution |
| PBS | Gibco | 10444402 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | For cell culture, maintaining cell culture |
| TNF-α | In house production | - | Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | To permeabilise the cells |
| Trypan blue | Merck | 11732 | For cell counting, used as live/dead marker at 0,1% |
| Trypsine | Sigma-Aldrich | T4424 | For cell culture: to detach the cells |
| zVAD | Bachem | BACE4026865.0005 | Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone |
| Material | |||
| µ-Slide 8 well high glass bottom | iBidi | 80807 | To culture the cells |
| Cotton Preping Balls-size medium | Electron Microscopy Sciences | 71001-10 | To clean the objectives |
| Immersol 518 F / 30 °C | ZEISS | 444970-9000-000 | To visualise the sample at high magnifications |
| Lens Cleaner | ZEISS | 000000-0105-200 | To clean the objectives |
| LSM880 Fast Airyscan confocal microscope | To visualise the sample | ||
| Software | |||
| Excel | Office | xx | To process the data |
| Prism 9 | Graphpad | xx | To analyse the data- statistical testing and graph generation |
| Volocity 6.3 | Volocity | xx | To perform quantifications |
| Zen black | ZEISS | xx | To aquire and process images |
| Zen blue | ZEISS | xx | To visualise images |
| Viruses | |||
| HSV-1 (mutRHIM) F strain | produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG>AAAA) |
| HSV-1 (WT) F strain | Produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition) |
| IAV PR8 | in house stock | in house replication | IAV as a trigger for necroptosis |
References
- Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The regulation of necroptosis by post-translational modifications. Cell Death & Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).
- Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The structural basis of necroptotic cell death signaling. Trends in Biochemical Sciences. 44 (1), 53-63 (2019).
- Mocarski, E. S., Guo, H., Kaiser, W. J. Necroptosis: The Trojan horse in cell autonomous antiviral host defense. Virology. 479-480, 160-166 (2015).
- Nailwal, H., Chan, F. K. Necroptosis in anti-viral inflammation. Cell Death & Differentiation. 26 (1), 4-13 (2019).
- Meng, Y., et al. Human RIPK3 maintains MLKL in an inactive conformation prior to cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 6783 (2021).
- Samson, A. L., Garnish, S. E., Hildebrand, J. M., Murphy, J. M. Location, location, location: A compartmentalized view of TNF-induced necroptotic signaling. Science Signalling. 14 (668), (2021).
- Koehler, H., et al. Vaccinia virus E3 prevents sensing of Z-RNA to block ZBP1-dependent necroptosis. Cell Host Microbe. 29 (8), 1266-1276 (2021).
- Balachandran, S., Mocarski, E. S. Viral Z-RNA triggers ZBP1-dependent cell death. Current Opinion in Virology. 51, 134-140 (2021).
- Kuriakose, T., Kanneganti, T. D. ZBP1: Innate sensor regulating cell death and inflammation. Trends in Immunology. 39 (2), 123-134 (2018).
- Maelfait, J., Liverpool, L., Rehwinkel, J. Nucleic acid sensors and programmed cell death. Journal of Molecular Biology. 432 (2), 552-568 (2020).
- Verdonck, S., Nemegeer, J., Vandenabeele, P., Maelfait, J. Viral manipulation of host cell necroptosis and pyroptosis. Trends in Microbiology. 30 (6), 593-605 (2022).
- Guo, H., et al. Herpes simplex virus suppresses necroptosis in human cells. Cell Host & Microbe. 17 (2), 243-251 (2015).
- Yu, X., et al. Herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 mediate species-specific modulations of programmed necrosis through the viral ribonucleotide reductase large subunit R1. Journal of Virology. 90 (2), 1088-1095 (2016).
- Huang, Z., et al. RIP1/RIP3 binding to HSV-1 ICP6 initiates necroptosis to restrict virus propagation in mice. Cell Host & Microbe. 17 (2), 229-242 (2015).
- Guo, H., et al. Species-independent contribution of ZBP1/DAI/DLM-1-triggered necroptosis in host defense against HSV1. Cell Death & Disease. 9 (8), 816 (2018).
- Devos, M., et al. Sensing of endogenous nucleic acids by ZBP1 induces keratinocyte necroptosis and skin inflammation. The Journal of Experimental Medicine. 217 (7), 20191913 (2020).
- Jiao, H., et al. Z-nucleic-acid sensing triggers ZBP1-dependent necroptosis and inflammation. Nature. 580 (7803), 391-395 (2020).
- de Reuver, R., et al. ADAR1 prevents autoinflammation by suppressing spontaneous ZBP1 activation. Nature. 607 (7920), 784-789 (2022).
- Jiao, H., et al. ADAR1 averts fatal type I interferon induction by ZBP1. Nature. 607 (7920), 776-783 (2022).
- Hubbard, N. W., et al. ADAR1 mutation causes ZBP1-dependent immunopathology. Nature. 607 (7920), 769-775 (2022).
- Zhang, T., et al. ADAR1 masks the cancer immunotherapeutic promise of ZBP1-driven necroptosis. Nature. 606 (7914), 594-602 (2022).
- Adams, J. C. Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40 (10), 1457-1463 (1992).
- Speel, E. J., Hopman, A. H., Komminoth, P. Tyramide signal amplification for DNA and mRNA in situ hybridization. Methods in Molecular Biology. 326, 33-60 (2006).
- Clutter, M. R., Heffner, G. C., Krutzik, P. O., Sachen, K. L., Nolan, G. P. Tyramide signal amplification for analysis of kinase activity by intracellular flow cytometry. Cytometry A. 77 (11), 1020-1031 (2010).
- Dopie, J., Sweredoski, M. J., Moradian, A., Belmont, A. S. Tyramide signal amplification mass spectrometry (TSA-MS) ratio identifies nuclear speckle proteins. The Journal of Cell Biology. 219 (9), 201910207 (2020).
- Samson, A. L., et al. A toolbox for imaging RIPK1, RIPK3, and MLKL in mouse and human cells. Cell Death and Differentiation. 28 (7), 2126-2144 (2021).
- De Groote, P., et al. Generation of a new gateway-compatible inducible lentiviral vector platform allowing easy derivation of co-transduced cells. Biotechniques. 60 (5), 252-259 (2016).
- Ali, M., Roback, L., Mocarski, E. S. Herpes simplex virus 1 ICP6 impedes TNF receptor 1-induced necrosome assembly during compartmentalization to detergent-resistant membrane vesicles. The Journal of Biological Chemistry. 294 (3), 991-1004 (2019).
- Mandal, P., et al. RIP3 induces apoptosis independent of pronecrotic kinase activity. Moleular Cell. 56 (4), 481-495 (2014).
- Zhang, T., et al. Influenza virus Z-RNAs induce ZBP1-mediated necroptosis. Cell. 180 (6), 1115-1129 (2020).
- Garnish, S. E., et al. Conformational interconversion of MLKL and disengagement from RIPK3 precede cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 2211 (2021).
- Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
- Parra, E. R., et al. Procedural requirements and recommendations for multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification assays to support translational oncology studies. Cancers. 12 (2), 255 (2020).
