Denne protokollen beskriver en detaljert kirurgisk protokoll for isolering av flytende tarmlymfe som respons på intraduodenale næringsinfusjoner hos mus. Dette muliggjør fysiologisk bestemmelse av total intestinal lipidabsorpsjon og kylomikronsyntese og sekresjon som respons på ulike eksperimentelle næringsstoffer.
Intestinale lipoproteiner, spesielt triglyseridrike kylomikroner, er en viktig driver for metabolisme, betennelse og kardiovaskulære sykdommer. Imidlertid er isolering av intestinale lipoproteiner svært vanskelig in vivo fordi de først utskilles fra tynntarmen til mesenterisk lymfatikk. Lymfe som inneholder kylomikron tømmes deretter i den subklaviske venen fra thoraxkanalen for å levere komponenter av måltidet til hjertet, lungene og til slutt helkroppssirkulasjonen. Isolering av naive kylomikroner er umulig fra blod siden kylomikrontriglyserid gjennomgår hydrolyse umiddelbart etter interaksjon med lipoproteinlipase og andre lipoproteinreseptorer i sirkulasjon. Derfor har den opprinnelige 2-dagers lymfefistelprosedyren, beskrevet av Bollman et al. hos rotter, historisk blitt brukt til å isolere fersk mesenterisk lymfe før den kommer inn i thoraxvenen. Denne protokollen har blitt forbedret og profesjonalisert av laboratoriet til Patrick Tso de siste 45 årene, noe som gjør det mulig å analysere disse kritiske lipoproteinene og sekresjonene fra tarmen. Tso lymfefistelprosedyren er nå oppdatert og presenteres her visuelt for første gang. Denne reviderte prosedyren er en en-dagers kirurgisk teknikk for å installere et duodenalt fôringsrør, kanylere den mesenteriske lymfekanalen og samle lymfe etter et måltid i bevisste mus. De største fordelene med disse nye teknikkene inkluderer evnen til å reproduserbart samle lymfe fra mus (som utnytter kraften til genetiske musemodeller); redusert anestesitid for mus under implantasjonen av duodenalt infusjonsrør og lymfekanylen; evnen til kontinuerlig å prøve lymf gjennom fôring og postprandial periode; evnen til kvantitativt å måle hormoner og cytokiner før fortynning og enzymatisk hydrolyse i blod; og evnen til å samle store mengder lymfe for å isolere intestinale lipoproteiner. Denne teknikken er et kraftig verktøy for direkte og kvantitativt måling av næringsopptak i kosten, intestinal lipoproteinsyntese og kylomikronsekresjon.
Den fysiologiske betydningen av det mesenteriske lymfesystemet
De mesenteriske lymfatene har blitt beskrevet i en eller annen form siden ~300 f.Kr. da Herophilos beskrev det hepatiske portalsystemet og alle de “absorberende venene i tarmene”1,2,3,4,5. I mer enn 1,700 år etter denne første beskrivelsen var et definerende kjennetegn ved tarmlymfe tilstedeværelsen av melkeaktig væske i mesenterisk lymfe kort tid etter et måltid3. Det er nå kjent at melkeaktig, kylomikronholdig lymfe (“chylous” lymfe) ikke drenerer inn i portvenen og leveren, men i stedet beveger seg gjennom cisterna chyli inn i thoraxkanalen og til slutt slutter seg til blodet i venstre subklaviske vene6. På grunn av dette anatomiske arrangementet reiser chylous lymfe først gjennom hjertet og lungene før de sirkulerer gjennom resten av kroppen. Dette betyr at hjertet og lungene får en “first-pass” ved sekretene i mesenterisk lymfe7.
En viktig rolle for mesenterisk lymfe er deres transport av diettlipider fra tynntarmen 8,9,10. Anatomisk, kylomikroner, intestinale immunceller 11,12,13,14, tarmhormoner 15,16,17,18, antigener 19,20,21, ikke-kylomikron lipofile forbindelser22,23 , og overflødig væske kommer inn i laktealene som ligger under enterocyttkjellermembranen og konsentreres deretter gjennom lymfatiske kapillærene til mesenteriske lymfeknuter. Det er sannsynligvis mange ukjente mesenteriske lymfatiske komponenter, inkludert metabolitter, antigener, miljøforurensninger, næringsstoffer og signalmolekyler.
Komponentene i mesenterisk lymf har ikke blitt systematisk identifisert, hovedsakelig på grunn av vanskeligheten med å isolere mesenterisk lymfe. Tilgang til mesenterisk lymfe har alltid vært en alvorlig utfordring fordi lymfekanaler er fargeløse, og bortsett fra etter et fettmåltid når de blir chylous og melkeaktig, inneholder mesenterisk lymfe fargeløs lymfatisk væske 6,8,9,10.
Nåværende og allmenne metoder for isolering av tarmlymfe
Mesenterisk lymfe kan ikke nås hos mennesker (bortsett fra sjeldne og ekstreme omstendigheter der alvorlige GI-traumer har oppstått)24. In vivo lymfekolleksjon er kirurgisk kompleks og krevende. Den opprinnelige 2 dagers lymfefistelprosedyren ble beskrevet av Bollman et al.25 og har blitt forbedret og profesjonalisert av laboratoriet til Patrick Tso de siste 45 årene 26,27. Lymfefistelprosedyren gjør det mulig for etterforskere å samle flytende lymfe fra bevisste dyr i løpet av en 6 timers duodenal lipidinfusjonsperiode.
Lymfefistelmodellen har hovedsakelig blitt brukt hos rotter for å måle lymfestrømningshastighet, utgangen av triglyserid og kolesterol (eller andre duodenalinfuserte forbindelser), kylomikronsammensetning og tarmhormonkonsentrasjoner. I mindre grad kan denne teknikken også brukes på mus, selv om kirurgisk overlevelse og lymfevolum lider. På grunn av vanskelighetene med å se mesenteriske lymfekanaler, har historiske metoder inkludert kanylering av mesenterisk lymfe hos større dyr som minigriser28, sauer29, griser30, hunder31 og rotter17. Å jobbe med disse større modellene er ressurskrevende og tillater ikke studier i knock-in eller knock-out modeller.
Alternative tilnærminger har også blitt brukt. Chylomikroner kan isoleres fra blod i postprandial tilstand (selv om disse vil bli delvis hydrolysert av plasma lipoprotein lipase)32,33,34,35. Thoraxkanalen kan også kanyleres, selv om lymfene samlet der inneholder en blanding av mesenterisk lymfe og ekstra-intestinal lymfedrenasje26,36. In vitro skiller Caco-2-celler ut en kylomikronlignende partikkel som respons på fettsyrebehandling, og disse cellene kan dyrkes sammen med relevante lymfatiske endotel- eller vaskulære celler37,38. Humane og musintestinale organoidkulturer har vist seg å behandle apikale lipider og utskille kylomikroner 39,40,41,42. Disse modellene er svært fordelaktige og muliggjør mekanistisk innsikt i tynntarmsfysiologi, men de kan ikke gjenskape kompleksiteten, fysio-kjemiske gradienter eller dynamisk lymfestrøm av in situ mesenteriske lymfatika.
Fordeler med 1 dag mus lymfe fistel modell presentert her
Med hensyn til disse andre metodene for å isolere intestinale lipoproteiner, har Tso Lab lymfefistelteknikk tradisjonelt blitt ansett som gullstandardteknikken for å måle absorpsjonen av næringsstoffer i mesenterisk lymfe. Denne in vivo-teknikken har fordelen av å fange viktige fysiologiske aspekter ved lipidabsorpsjon i kosten – det dynamiske utseendet av forbindelser over absorpsjonsperioden, noe som krever gjentatt prøvetaking av flytende mesenterisk lymf hos levende dyr med duodenale næringsstoffer. Denne kirurgiske teknikken måler også tarmhormoner og cytokiner direkte i deres fysiologiske rom i stedet for i blod, hvor de fortynnes og enzymatisk nedbrytes17,43.
Hvis det eksperimentelle spørsmålet krever forståelse av lipidsekresjonsdynamikk eller dynamisk absorpsjon og metabolisme av en hvilken som helst hydrofob GI-forbindelse eller medikament, er denne teknikken ikke bare hensiktsmessig, men er også den eneste tilnærmingen som interpolerer bevegelsen av luminalinnhold fra den proksimale til distale tarmen (mage til tykktarm) og fra den apikale til den basolaterale overflaten (luminalinnhold gjennom enterocytt til laktealer og portalsirkulasjon). Siden denne teknikken benytter luminal levering av næringsstoffer gjennom det intraduodenale kateteret, og fordi den flytende mesenteriske lymfen blir avledet og samlet, er hele absorpsjonsapparatet under eksperimentell kontroll og kan brukes til å kvalitativt vurdere små intestinale absorpsjonsprofiler.
Presentert visuelt her for første gang er en stor oppdatering av Tso Lab lymfefistelmodellen, som (1) reduserer eksperimentell tid til en 1 dags kirurgisk implantasjon og eksperimentell innsamlingsperiode; (2) forbedrer museoverlevelse og dyrevelferdshensyn; og (3) øker reproduserbarheten av tilnærmingen hos mus for å utnytte kraften til musegenetiske modeller. Denne teknikken må betraktes som en gullstandard for alle eksperimentelle spørsmål om tarmsekresjoner, lipoproteiner eller diettlipidabsorpsjon og er den beste teknikken for høy-fidelitetsbestemmelse av lipidabsorpsjonskinetikk og kylomikroner.
Den opprinnelige 2-dagers lymfefistelprosedyren ble beskrevet av Bollman et al.25 og praktisert av laboratoriet til Patrick Tso de siste 45 årene 26,27. Protokollen som presenteres her er et kraftig tillegg til denne klassiske, gullstandardmetoden for å identifisere, kvantifisere og forstå tynntarmens unike chylous sekresjoner, samt in vivo-dynamikken i næringsopptak og metabolisme i kosten, tarmhormoner og tarmimmunitet.
Fordelene med denne modellen inkluderer (1) evnen til kontinuerlig å prøve mesenterisk lymfe gjennom fôrings- og postprandial perioden i stedet for statisk prøvetaking på et tidspunkt under enten absorpsjon, fordøyelse eller sekresjon; (2) måling av tarmhormoner og cytokiner direkte i deres fysiologiske rom i stedet for i blod, hvor de fortynnes og enzymatisk nedbrytes17,44; (3) evnen til å isolere, kvantifisere og karakterisere lipoproteinene som utskilles av tynntarmen etter inntak av et lipidmåltid og fraværet av endoteliale lipaser i mesenterisk lymfe, som bevarer chylomikrontriglyseridkonsentrasjoner og naturlig kylomikronstruktur46,47; (4) evnen til direkte å måle lymfestrømningshastighet, utgangen av triglyserid og kolesterol (eller andre duodenalinfiserte forbindelser), kylomikronsammensetning og tarmhormonkonsentrasjoner. Endelig tillater denne protokollen å samle relativt store mengder >50 μL lymfe hver time over en 6 timers periode. Etter hvert som væsken etterfylles med intraduodenal saltvann og glukoseinfusjon, er lymfefistelmodellen betydelig forbedret i forhold til andre lymfeprøvetakingsteknikker og resulterer i flytende i stedet for statiske bassenger av mesenterisk lymfe. Siden volum er en stor hindring for lipidomiske, proteomiske og metabolomiske tilnærminger, er dette en stor styrke.
1-dags muselymfefistelprotokollen beskrevet her har flere fordeler i forhold til den opprinnelige lymfefistelprotokollen, inkludert en reduksjon i totalt eksperimentelt dyretall fra tidligere beskrevne 2-dagers lymfefistelprotokoller26,27 på grunn av en høyere overlevelsesrate etter kirurgi; en reduksjon i den totale eksperimentelle tiden fra 2 dager til en enkelt dag; og til slutt en reduksjon i gjenopprettingsperioden for mus fra over natten (>18 timer), hvor gjennombruddssmerter eller dårlige postkirurgiske utfall kan oppstå, til en mer håndterbar ~ 6 timer etter operasjonsperioden.
Et trekk ved denne 1-dagersprotokollen er fokuset på humane hensyn og endepunkter. Disse må ha høyeste prioritet: (1) dyr må motta intraduodenale eller IV erstatningsvæsker; (2) de må holdes varme og så smertefrie som mulig (med postoperativ Buprenex og/eller karprofen, avhengig av eksperimentell design og behovet for å unngå antiinflammatoriske effekter); (3) blødning, risting, diaré eller tegn på nød er alle overbevisende grunner til et humant endepunkt. I henhold til strenge IACUC-retningslinjer er isofluran etterfulgt av cervikal dislokasjon et godt endepunkt. Kirurgisk overlevelse er ~ 70% for en enkelt dag (sammenlignet med ~ 40% for den opprinnelige 2-dagers operasjonen), men etterforskere bør ikke nøle med å avslutte eksperimentet ved et tegn på nød. Dette bør tas i betraktning ved planlegging av dyrenummer.
Når det gjelder feilsøking av denne teknikken, er vellykket plassering av lymfekanylen den største flaskehalsen i denne kirurgiske prosedyren. Mens du praktiserer operasjonen, hjelper det å gavage musen med 0,3 ml olivenolje ca 2 timer før operasjonen. Dette vil føre til sekresjon av kylomikroner i den mesenteriske lymfekanalen, slik at den virker “melkeaktig” og mer synlig. Methylenblå kan også brukes, men er ofte mindre åpenbar enn melkeaktig lymfekanal. Hvis den mesenteriske lymfen etter plassering av lymfekanylen og dens plassering med lim strømmer vellykket gjennom kanylen inn i et oppsamlingsbeholder, kan man fortsette med plassering av et duodenalt infusjonsrør. Av og til kan lymfene ikke strømme kontinuerlig, men kan begynne å strømme igjen når dyret er plassert på det roterende bordet. Kritisk, se opp for blodpropper i lymfeslangen. Disse bør masseres ut av rørene for å forhindre tilbakestrømningstrykk på lymfekanalen.
I tillegg til triglyseridsekresjon og lymfestrømningshastighet, kan denne teknikken brukes til å bestemme følgende lipidabsorpsjonskinetikk og kylomikronegenskaper:
Chylomikron sekresjon45,48,49
Umiddelbart etter et fettholdig måltid er det en forbigående økning i sirkulerende plasmatriglyserider. Siden triglyserider er iboende hydrofobe, må de først emulgeres for å være løselige i blod50. Små intestinale enterocytter utfører denne rollen og pakker dietttriglyserid i kylomikron-emulsjonspartikler51. Chylomier inneholder kolesterol og dietttriglyserid i kjernen, omgitt av fosfolipider og apolipoproteiner, inkludert apoB-48, apoA-I, apoA-IV og apoC-III52,53,54,55. ApoB-48 er det essensielle strukturelle proteinet, og de andre apolipoproteinene har forskjellige funksjoner som kreves for kylomikronmetabolisme og clearance fra blodet. For å bestemme nøkkelegenskapene til kylomikroner, inkludert triglyserid- og apolipoproteininnhold, bør 1-dags lymfefistelteknikken vist her brukes. Kylomikronsekresjonshastigheten er prosentandelen av infundert 3H-triglyserid som skilles ut i lymfene og måles ved scintillasjon ved å telle lymfeprøver hver time. Dette kan kombineres med detaljert kylomikronkarakterisering 48,49,56,57,58. Lymfeprøver hver time kan kombineres eller oppbevares separat. Lymfe overføres til ultrasentrifugerør, blandet med 0,9% NaCl, og deretter forsiktig overlagt med 300-500 μL på 0,87% NaCl. Prøvene ultrasentrifugeres deretter ved 110 000 x g ved 4 °C i 16 timer. De øverste fraksjonene som inneholder isolerte kylomikroner samles og testes for triglyseridkonsentrasjoner ved bruk av triglyseridanalysesettet. Kort fortalt inkuberes 2 μL av kylomikron (1:10 fortynning) med 200 μL enzymreagens ved romtemperatur i 10 minutter i en 96-brønnsplate. Platen leses av en plateleser ved 500 nm, og standardene og emnene brukes til beregning av triglyseridkonsentrasjoner. Chylomikronstørrelsen kan da bestemmes ved negativ farging og transmisjonselektronmikroskopi (TEM)14,29. Triglyserid og kolesterol kan kvantifiseres ved kjemisk analyse og apolipoproteininnhold (apoB-48, A-I, C-II, C-III) av ELISA-sett eller Western blot.
Bestemmelse av det primære stedet for lipidabsorpsjon 48,59
Ved å isolere luminal- og epitelcellerommene i tolvfingertarmen, jejunum og ileum ved 6 timer etter infusjon av 3 H-triglyserid eller et radiomerket blandet måltid, ekstraheres innholdet for å bestemme hvor mye av de 3H-triglyseridene som absorberes over epitelcellemembranen (normalt) eller beholdes i lumen (unormalt) langs tynntarmens lengde48 . Disse studiene er spesielt virkningsfulle hvis det er potensielle forskjeller i GI-motilitet 60,61,62, hvis det er en hypotese angående gallesyrer (svært aktive gjennom lipidabsorpsjon og selv reabsorbert i ileum)63,64,65,66, eller hvis det er bekymring for at næringsstoffer blir absorbert på feil anatomisk sted (ileum eller til og med kolon)67 ,68,69,70.
Identifisere mekanismer for 3H-triglyserider som trafikkerer til absorberende epitelceller48
Dette utføres ved å beregne prosentandelen av 3 H-triglyserid hydrolysert til 3 H-fri fettsyre i tarmlumen, absorbert i slimhinnen og re-esterifisert til intracellulært 3H-triglyserid før sekresjon som kylomikroner. Dette er en kraftig markør for absorpsjons- / sekresjonsdefekter, siden den kan spores for å vise bevegelsen av dietttriglyserid i nedbrytningsproduktene og påfølgende emballasje i kylomikroner. mRNA-ekspresjon av fettsyreabsorpsjonsmaskineriet (CD36, FABP, ACSL), re-esterifiseringsvei (MGAT, DGAT, MTTP, apoB) og apolipoproteiner (apoC-III, B-48, C-II, A-I, A-IV) kan kvantifiseres videre ved RT-PCR.
Fremtidige anvendelser av denne teknikken er bare begrenset av interesse for tarmorgankrysstale, metabolisme, immunitet, næringsopptak, miljøforurensninger eller annen sykdom med en rolle i GI-systemet. Det er sannsynlig at mange overbevisende eksperimenter og hypoteser har blitt stoppet på grunn av vanskeligheten med å få tilgang til det kritiske mesenteriske lymfesystemet, og målet med denne visualiserte protokollen er å gjøre denne teknikken lettere tilgjengelig. Isolering av kylomikroner og mesenterisk lymfe der de i utgangspunktet bor, er en kritisk del av å forstå helkroppens metabolisme; 1-dags muselymfefistelmodellen er en kraftig fysiologisk modell for å studere disse hendelsene.
The authors have nothing to disclose.
Vi er svært takknemlige til Cystic Fibrosis Foundation (Pilot and Feasibility Award 1810, til ABK), Rainin Foundation (Synergy Award, til PI GJ Randolph og Co-I ABK), og National Institutes of Health (R01DK118239, R03DK116011 til ABK) for deres støtte til disse studiene.
0.9% Sodium Chloride Injection, USP sterile | Hospira, Lake Forest, IL, US | NDC 0409-4888-06 | |
1.7 mL Eppendorf tubes | Fisher Scientific, Waltham, MA, US | 7200184 | |
14C-cholesterol: Cholesterol-[4-14C] (0.1mCi/ mL) | American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, US | ARC 0857 | |
18 G needle | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, US | 305199 | |
2 Dumont micro-dissecting forceps | Fine Science Tools, Foster City, CA, US | 11251-35 | |
2 Forceps | ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US | RS-5130 | |
3H-TAG: Triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG) (1mCi/ mL) | American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, US | ART0199 | |
3H-TG Triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG) | American Radiolabeled Chemicals, INC. St. Louis | MO 63146 | |
50% Dextrode Injection, USP 25grams/50 mL sterile | Hospira, Lake Forest, IL, US | NDC-0409-6648-16 | |
Analtech TLC Uniplates: silica gel matrix Z265500-1PAK | Fisher Scientific, Waltham, MA, US | 11-101-0007 | |
BD CareFusion ChloraPrep Swabstick | Fisher Scientific, Waltham, MA, US | 14-910-501 | |
Betadine surgical scrub | Dynarex Corp., Orangeburg, NY, US | 1201 | |
Bevel-cut cannula | Braintree Scientific., Braintree , MA, US | MRE025 | |
Buprenorphine HCl Injection Carpuject PFS 0.3mg/mL 10/Bx (Buprenex) | HenrySchein, Warrendale, PA, US | 1278184 | |
C57BL6/J male mice | Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine | ||
ChloraPrep | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, US | 260100 | |
Cholesterol Assay Kit | FujiFilm Healthcare, Lexington, MA, US | 99902601 | |
Cholesterol-[4-14C] | American Radiolabeled Chemicals, INC. St. Louis | MO 63146 | |
Clear plexiglass box L43cm X W26 X H 21 with temperature-controlled heating pad and humidification | our own design and modifications | ||
commercially available amphibian/reptile heating pad | ShenZhen XingHongChang Electric CO., LTD. ShenZhen, China | XHC-F035D | |
Cotton tip applicators | Fisher Scientific, Waltham, MA, US | 22363156 | |
Duodenal infusion tube – canuala | Braintree Scientific, Braintree , MA, US | MRE037 | |
Ensure | Abbott Nutrition, Columbus, OH | ||
Heating pad surgical platform with circulating warm water pump combination | Patterson Scientific, Waukesha, WI, US | Gaymar T/Pump Classic | |
Hetarin Sodium Injection, USP 1,000 units/mL sterile | Mylan, Morgantown, WV, US | NDC-67457-384-31 | |
Image J Software | National Institute of Health, Bethesda, Maryland, | ||
Iris scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US | RS-5602 | |
Isoflurane | Piramal Pharma Solutions, Riverview, MI, US | NDC 66794-017-25 | |
Isoflurane induction apparatus and Anesthesia Apparatus | Patterson Scientific, Waukesha, WI, US | mouse induction chamber | |
Krazy glue | Elmer's products Inc., Columbus, OH, US | KG484 | |
Liposyn III 20% lipid injectable | Hospira Inc. Lake Forest, Illinois, USA | ||
LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter | Beckman Coulter, Brea, CA | ||
Micro-dissecting Spring Scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US | RS-5602 | |
Mouse apoB ELISA Kit | ABCAM Inc., Waltham, MA, US | ab230932-1 | |
Needle Holder | Fine Science Tools, Foster City, CA, US | 12002-12 | |
Retractors | Kent Scientific Co., Torrington, CT, US | SURGI-5001 | |
Rimadyl (Carprofen) | Zoetis Inc., Kalamazoo MI, US | 4019449 | |
Rotating table Barnstead Thermolyne | Labquake, Zürich, Switzerland | Barnstead Thermolyne | |
SMOFlipid 20% lipid injectable emulsion, USP | Fresenius Kabi, Warrendale, PA, US | NDC-63323-820-01 | |
Snuggle | Lomir Biomedical Inc., Notre-Dame-de-l'Île-Perrot, QC J7V 7M4, Canada | MS 02.5PM | |
Surgical Scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US | RS-5912SC | |
Suture (5-0 silk with needle) | DemeTECH, Miami Lakes, FL, US | DT-719 | |
Transmission Electron Microscope (JEOL 1400-FLASH 120KV ) | JEOL, Peabody, MA | ||
Triglyceride Assay Kit | Randox Laboratories, Crumlin, United Kingdom | TR210 | |
ULTIMA GOLD XR Scintillation Fluid | Perkin Elmer, Hebron, KY, US | 6013119 | |
Ultracentrifuge, rotor S100AT4-497 | SORVALL RC M120 GX |