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Biochemistry

विट्रो में मेम्ब्रेन वक्रता संवेदन प्रोटीन के अध्ययन के लिए एक नैनोबार-समर्थित लिपिड बाइलेयर सिस्टम

Published: November 30, 2022 doi: 10.3791/64340
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,3
1School of Chemistry, Chemical Engineering, and Biotechnology, Nanyang Technological University, 2State Key Laboratory Breeding Base of Green Chemistry Synthesis Technology, College of Chemical Engineering, Zhejiang University of Technology, 3Institute for Digital Molecular Analytics and Science, Nanyang Technological University
* These authors contributed equally

Summary

यहां, एक नैनोबार-समर्थित लिपिड बाइलेयर सिस्टम को परिभाषित वक्रता के साथ सिंथेटिक झिल्ली प्रदान करने के लिए विकसित किया गया है जो विट्रो में वक्रता संवेदन क्षमता के साथ प्रोटीन के लक्षण वर्णन को सक्षम बनाता है।

Abstract

झिल्ली वक्रता कोशिकाओं की विभिन्न आवश्यक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, जैसे कि कोशिका प्रवास, कोशिका विभाजन और पुटिका तस्करी। यह न केवल सेलुलर गतिविधियों द्वारा निष्क्रिय रूप से उत्पन्न होता है, बल्कि सक्रिय रूप से प्रोटीन इंटरैक्शन को भी नियंत्रित करता है और कई इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग में शामिल होता है। इस प्रकार, प्रोटीन और लिपिड के वितरण और गतिशीलता को विनियमित करने में झिल्ली वक्रता की भूमिका की जांच करना बहुत महत्वपूर्ण है। हाल ही में, विट्रो में घुमावदार झिल्ली और प्रोटीन के बीच संबंधों का अध्ययन करने के लिए कई तकनीकों का विकास किया गया है। पारंपरिक तकनीकों की तुलना में, नव विकसित नैनोबार-समर्थित लिपिड बाइलेयर (एसएलबी) पूर्व-परिभाषित झिल्ली वक्रता और स्थानीय फ्लैट नियंत्रण के साथ नैनोबार के पैटर्न सरणी पर एक निरंतर लिपिड बाइलेयर बनाकर झिल्ली वक्रता पीढ़ी में उच्च-थ्रूपुट और बेहतर सटीकता दोनों प्रदान करता है। घुमावदार झिल्ली के लिए लिपिड तरलता और प्रोटीन संवेदनशीलता दोनों को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी इमेजिंग का उपयोग करके मात्रात्मक रूप से विशेषता दी जा सकती है। यहां, नैनोबार सरणियों वाले निर्मित कांच की सतहों पर एसएलबी बनाने और ऐसे एसएलबी पर वक्रता-संवेदनशील प्रोटीन के लक्षण वर्णन पर एक विस्तृत प्रक्रिया पेश की गई है। इसके अलावा, नैनोचिप पुन: उपयोग और छवि प्रसंस्करण के लिए प्रोटोकॉल कवर किए गए हैं। नैनोबार-एसएलबी से परे, यह प्रोटोकॉल वक्रता संवेदन अध्ययन के लिए सभी प्रकार के नैनोस्ट्रक्चर्ड ग्लास चिप्स पर आसानी से लागू होता है।

Introduction

मेम्ब्रेन वक्रता एक कोशिका का एक महत्वपूर्ण भौतिक पैरामीटर है जो विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं जैसे मॉर्फोजेनेसिस, सेल डिवीजन और सेल माइग्रेशन1 में होता है। अब यह व्यापक रूप से मान्यता प्राप्त है कि झिल्ली वक्रता सेलुलर घटनाओं के एक साधारण परिणाम से परे है; इसके बजाय, यह प्रोटीन इंटरैक्शन और इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग के एक प्रभावी नियामक के रूप में उभरा है। उदाहरण के लिए, क्लैथ्रिन-मध्यस्थता एंडोसाइटोसिस में शामिल कई प्रोटीन अधिमानतः घुमावदार झिल्ली से बंधे हुए पाए गए, जिसके परिणामस्वरूप एंडोसाइटोसिस2 के लिए एक हॉटस्पॉट का गठन हुआ। झिल्ली विरूपण के कई अलग-अलग कारण हैं जैसे साइटोस्केलेटल बलों द्वारा झिल्ली खींचना, विभिन्न आकार के सिर समूहों के साथ लिपिड विषमता की उपस्थिति, शंक्वाकार आकार के साथ ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन का अस्तित्व, बीएआर-डोमेन प्रोटीन (बिन, एम्फीफिसिन और आरवीएस प्रोटीन के नाम पर) जैसे झिल्ली को आकार देने वाले प्रोटीन का संचय, और झिल्ली में एम्फीपैथिक हेलिकॉप्टर डोमेन का सम्मिलन1 . दिलचस्प बात यह है कि ये प्रोटीन और लिपिड न केवल झिल्ली को विकृत करते हैं, बल्कि झिल्ली वक्रता को भी महसूस कर सकते हैं और अधिमान्य संचय प्रदर्शित करसकते हैं। इसलिए, यह अध्ययन करना महत्वपूर्ण है कि क्या और कैसे विभिन्न वक्रता वाले झिल्ली उनसे जुड़े प्रोटीन और लिपिड के वितरण और गतिशीलता को बदलते हैं और संबंधित इंट्रासेल्युलर प्रक्रियाओं पर संभावित प्रभाव डालते हैं।

जीवित कोशिका और इन विट्रो सिस्टम दोनों में घुमावदार झिल्ली और प्रोटीन के बीच बातचीत का विश्लेषण करने के लिए कई तकनीकों को विकसित किया गया है। लाइव सेल सिस्टम समृद्ध लिपिड विविधता और गतिशील प्रोटीन सिग्नलिंग विनियमन 2,3,4,5,6,7 के साथ एक वास्तविक सेल वातावरण प्रदान करता है। हालांकि, इंट्रासेल्युलर वातावरण में अनिश्चितताओं और उतार-चढ़ाव के कारण इस तरह की परिष्कृत प्रणाली का अध्ययन करना मुश्किल है। इसलिए, ज्ञात लिपिड प्रजातियों और शुद्ध प्रोटीन से बने कृत्रिम झिल्ली का उपयोग करके इन विट्रो परख प्रोटीन और घुमावदार झिल्ली के बीच संबंधों को चिह्नित करने के लिए शक्तिशाली पुनर्गठन प्रणाली बन गए हैं। परंपरागत रूप से, विभिन्न व्यास के लिपोसोम एक्सट्रूज़न द्वारा उत्पन्न होते हैं ताकि या तो केन्द्रापसारक बल का उपयोग करके सह-अवसादन परख या प्रोटीन एकत्रीकरण 8,9 से बचने के लिए घनत्व ढाल के साथ सह-प्लवनशीलता परख के माध्यम से वक्रता-संवेदनशील प्रोटीन का पता लगाया जा सके। हालांकि, एक्सट्रूडेड लिपोसोम की वक्रता एक्सट्रूडर10 में उपयोग किए जाने वाले झिल्ली फिल्टर के उपलब्ध छिद्र आकार से सीमित है। एकल लिपोसोम वक्रता (एसएलआईसी) परख इस सीमा को दूर करने के लिए साबित हुई है, जिसमें विभिन्न व्यास वाले लिपोसोम को फ्लोरेसेंस-लेबल किया जाता है और सतह पर स्थिर किया जाता है ताकि वक्रता को फ्लोरोसेंट तीव्रता11 द्वारा चिह्नित किया जा सके। हालांकि, छोटे पुटिकाओं में लिपिड संरचना में मजबूत परिवर्तनशीलता देखी गई है, जो वक्रता माप12 की सटीकता को प्रभावित करती है। टीथर-पुलिंग प्रयोग ऑप्टिकल ट्वीज़र का उपयोग करके विशाल यूनिलैमेलर पुटिकाओं (जीयूवी) से खींचे गए क्षणिक टेथर पर वक्रता का अधिक सटीक माप प्रदान करते हैं, जहां वक्रता को13,14 उत्पन्न झिल्ली तनाव द्वारा अच्छी तरह से नियंत्रित किया जा सकता है। यह विधि सकारात्मक या नकारात्मक-वक्रता संवेदन प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है, लेकिन ट्यूब पीढ़ी10 के थ्रूपुट द्वारा बाधित है। समर्थित झिल्ली ट्यूब (एसएमआरटी) परख कई झिल्ली ट्यूबों की एक साथ पीढ़ी को वहन करती है जो माइक्रोफ्लुइडिक प्रवाह द्वारा एक ही लिपिड जलाशय से बाहर निकाले जाते हैं। फिर भी, झिल्ली वक्रता नैनोट्यूब के साथ आंतरिक रूप से भिन्न होती है, जो प्रतिदीप्ति-तीव्रता-आधारित वक्रता माप15,16 की सटीकता से समझौता करती है। इसकी तुलना में, डिजाइन किए गए टोपोग्राफी वाली सतहों पर एक समर्थित लिपिड बाइलेयर (एसएलबी) बनाने के लिए छोटे यूनिलैमेलर पुटिकाओं (एसयूवी, व्यास <100 एनएम 17) का उपयोग करके उच्च सटीकता 18,19,20 में नैनोफैब्रिकेशन या नैनोमैटेरियल्स द्वारा पूर्व निर्धारित वक्रता के साथ एक एकल बाईलेयर झिल्ली उत्पन्न हुई।

यहां, हम नैनोबार सरणियों के साथ निर्मित नैनोचिप सतहों पर एसएलबी के गठन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और इसका उपयोग विट्रो में प्रोटीन की वक्रता संवेदनशीलता की जांच के लिए कैसे किया जा सकता है। जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, परख के छह आवश्यक घटक हैं: ए) माइक्रोफ्लुइडिक कक्ष के साथ चिप की सफाई और असेंबली; बी) परिभाषित लिपिड संरचना के साथ एसयूवी की तैयारी; सी) नैनोचिप पर एसएलबी का गठन और वक्रता संवेदनशील प्रोटीन के साथ बंधन; डी) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के तहत एसएलबी और वक्रता संवेदनशील प्रोटीन की इमेजिंग और लक्षण वर्णन; ई) पुन: उपयोग के लिए चिप की सफाई; च) प्रोटीन वक्रता संवेदन क्षमता के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए छवि प्रसंस्करण। विस्तृत प्रोटोकॉल नीचे चरण-दर-चरण वर्णित है।

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Protocol

1. नैनोचिप की सफाई

  1. नैनोचिप को 10 एमएल बीकर में रखें, जिसमें पैटर्न वाला साइड ऊपर की ओर हो।
    नोट: यह क्वार्ट्ज नैनोचिप इलेक्ट्रॉन बीम लिथोग्राफी के माध्यम से बनाया गया है जैसा कि21 से पहले वर्णित है। चिप पर नैनोस्ट्रक्चर की ज्यामिति और व्यवस्था को कस्टम डिज़ाइन किया जा सकता है। यहां उपयोग किए जाने वाले ढाल नैनोबार के आकार लंबाई में 2000 एनएम, ऊंचाई में 600 एनएम और चौड़ाई में 100 से 1000 एनएम (100 एनएम स्टेप-सेट) हैं।
  2. सावधानी से बीकर में 98% सल्फ्यूरिक एसिड का 1 एमएल जोड़ें, और सुनिश्चित करें कि एसिड चिप के सामने और पीछे की ओर पूरी तरह से कवर करता है।
    नोट: 98% सल्फ्यूरिक एसिड बेहद संक्षारक है और त्वचा या आंखों के संपर्क में आने पर तेजी से ऊतक विनाश और गंभीर रासायनिक जलन का कारण बन सकता है। उचित सुरक्षा के साथ फ्यूम हुड में इसका उपयोग करें।
  3. धीरे-धीरे बीकर को घुमाएं और 30% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के 200 μL को बूंद-बूंद जोड़ें जब तक कि पूरा बीकर गर्म न हो जाए। सुनिश्चित करें कि नैनोचिप17 से कार्बनिक अणुओं को हटाने के लिए पिरान्हा समाधान बनाने के लिए सल्फ्यूरिक एसिड और हाइड्रोजन पेरोक्साइड अच्छी तरह से मिश्रित हैं। स्वच्छ हाइड्रोफिलिक सतहों पर एसएलबी उत्पन्न करने के लिए वैकल्पिक तकनीकें हैं, जैसे कि यूवी प्रकाश और ओजोन जोखिम जैसा कि पहले वर्णितहै।
    नोट: प्रतिक्रिया बेहद एक्सोथर्मिक है और समाधान को उबलने का कारण बन सकती है, इसलिए सल्फ्यूरिक एसिड ड्रॉप में हाइड्रोजन पेरोक्साइड जोड़ें और घूमते रहें।
  4. बीकर को एक द्वितीयक ग्लास कंटेनर में रखें और अशुद्धियों को अच्छी तरह से साफ करने के लिए नैनोचिप को रात भर पिरान्हा घोल में डुबोकर रखें।
    नोट: प्रतिक्रिया गैस उत्पन्न करने की स्थिति में बीकर को बिना किसी कवर के फ्यूम हुड में रखें।
  5. बीकर को बाहर निकालें और पिरान्हा घोल को एसिड अपशिष्ट कंटेनर में सावधानीपूर्वक पिपेट करें।
  6. अवशिष्ट एसिड को पतला करने और इसे एसिड कचरे में फेंकने के लिए बीकर में 5 एमएल विआयनीकृत पानी लोड करें। इस चरण को पांच बार दोहराएं और एसिड अपशिष्ट को बेअसर करने के लिए 5 एम एनएओएच का उपयोग करें।
  7. चिप को चिमटी के साथ पकड़ें और अवशिष्ट एसिड को अच्छी तरह से हटाने के लिए विआयनीकृत पानी की निरंतर धारा से धो लें। एसएलबी गठन के लिए 99.9% नाइट्रोजन गैस के साथ चिप को ब्लो-ड्राईकरें।

2. छोटे यूनिलैमेलर पुटिकाओं (एसयूवी) का उत्पादन

  1. एक एम्बर शीशी में क्लोरोफॉर्म के 100 μL जोड़ें।
    नोट: क्लोरोफॉर्म एक अत्यधिक अस्थिर, रंगहीन तरल है, और यह विषाक्त हो सकता है यदि साँस लिया जाए या निगल लिया जाए। इसे मास्क और दस्ताने पहनकर फ्यूम हुड में इस्तेमाल करें।
  2. क्लोरोफॉर्म में लिपिड मिश्रण के 500 μg को घोलें। यहां उपयोग किए जाने वाले लिपिड मिश्रण की संरचना अंडे फॉस्फेटिडिलकोलाइन (पीसी) का 89.5 मोल%, मस्तिष्क फॉस्फेटिडिलसेरिन (पीएस) का 10 मोल% और टेक्सास रेड 1,2-डाइहेक्साडेकैनोइल-एसएन-ग्लिसेरो-3-फॉस्फोइथेनॉलमाइन, ट्राइएथाइलमोनियम नमक (टेक्सास रेड डीएचपीई) का 0.5 मोल% है।
  3. 99.9% नाइट्रोजन गैस के साथ शीशी में लिपिड मिश्रण को तब तक सुखाएं जब तक कि क्लोरोफॉर्म वाष्पीकृत न हो जाए और लिपिड मिश्रण सूख न जाए।
    नोट: यह चरण फ्यूम हुड में किया जाना चाहिए। ब्लो-ड्राईिंग करते समय लिक्विड स्पैटर से बचें।
  4. एल्यूमीनियम पन्नी से ढके वैक्यूम डेसिकेटर में ढक्कन के बिना एम्बर शीशी में मौजूद लिपिड मिश्रण रखें। फिर क्लोरोफॉर्म को पूरी तरह से वाष्पीकृत करने के लिए 3 घंटे के लिए पंप के साथ नमूने को वैक्यूम सुखाएं।
  5. शीशी में फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) बफर का 250 μL जोड़ें। भंवर समाधान है जब तक कि यह सजातीय न हो।
    नोट: पीबीएस बफर में कैल्शियम, मैग्नीशियम और फिनोल लाल के बिना 150 एमएम एनएसीएल होता है; पीसी और पीएस लिपिड बाइलेयर बनाने के लिए पीएच को 7.2 में समायोजित किया जाता है।
  6. एक स्नान सोनिकेटर में 50 kHz की आवृत्ति पर 30 मिनट के लिए लिपिड मिश्रण को सोनिकेट करें। फिर लिपिड मिश्रण को 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और पैराफिल्म के साथ सील करें।
  7. लिपिड मिश्रण को तरल नाइट्रोजन में 20 सेकंड के लिए फ्रीज करें और फिर पानी के स्नान में 2 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर पिघल जाएं। फ्रीज-पिघलना चक्र को 30 बार दोहराएं। उसके बाद, लिपिड मिश्रण एक स्पष्ट तरल की तरह दिखता है।
    चेतावनी: तरल नाइट्रोजन में लगभग -195.8 डिग्री सेल्सियस का क्वथनांक होता है। यह शीतदंश या क्रायोजेनिक जलन का कारण बन सकता है। गर्मी इन्सुलेशन दस्ताने के साथ इसे असीमित स्थान में उपयोग करें।
  8. क्रमशः इथेनॉल, क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल के साथ दो ग्लास गैस-टाइट सिरिंज और मिनी-एक्सट्रूडर के कनेक्टर को कुल्ला करें। उपकरण को पूर्व-साफ करने के लिए कुल्ला अनुक्रम को पांच बार दोहराएं। उन्हें फ्यूम हुड में छोड़ दें जब तक कि कार्बनिक विलायक पूरी तरह से वाष्पीकृत न हो जाए।
  9. मिनी-एक्सट्रूडर उपकरण को इकट्ठा करें और उपकरण को पूर्व-गीला करने के लिए कनेक्टर के माध्यम से पीबीएस बफर के 500 μL पास करें, फिर बफर को दूसरे सिरिंज से छोड़ दें। यह कदम अशुद्धियों को दूर करता है और एक्सट्रूज़न की सुविधा प्रदान करता है।
  10. मिनी-एक्सट्रूडर तंत्र को 100 एनएम छिद्र-आकार के पॉली कार्बोनेट फिल्टर झिल्ली के साथ इकट्ठा करें।
    नोट: फिल्टर झिल्ली का छिद्र आकार लिपोसोम के व्यास को निर्धारित करता है।
  11. एक सिरिंज के साथ पीबीएस बफर का 500 μL लें और दूसरे छोर पर दूसरी खाली सिरिंज को भरने के लिए धीरे से इसे फ़िल्टर के माध्यम से धक्का दें। उपकरण रिसाव की जांच करने के लिए एक्सट्रूज़न को तीन बार आगे और पीछे दोहराएं और दूसरे सिरिंज से बफर को छोड़ दें।
  12. पीबीएस बफर को बदलने के लिए मिनी एक्सट्रूडर के माध्यम से लिपिड मिश्रण पास करें। फिर एसयूवी बनाने के लिए 20 बार आगे-पीछे एक्सट्रूड करें। पुटिकाओं के मल्टीलैमेलर चरित्र को एक्सट्रूज़न समय की अपर्याप्त संख्या के साथ बनाए रखा जा सकता है, जो एसएलबी गठन23 को प्रभावित करेगा।
  13. बड़े कणों के साथ संदूषण को कम करने के लिए दूसरी सिरिंज से एसयूवी एकत्र करें और इसे 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: सिरिंज टूटने की स्थिति में सिरिंज को सीधे कनेक्टर से बाहर निकालें।
  14. फ्लोरोसेंट-लेबल लिपिड के विरंजन को रोकने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ ट्यूब लपेटें और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। आमतौर पर, एसयूवी को 7 दिनों तक संग्रहीत किया जा सकता है।

3. नैनोचिप पर एसएलबी का गठन

  1. 99.9% नाइट्रोजन गैस के साथ चिमटी और ब्लो-ड्राई की एक जोड़ी के साथ विआयनीकृत पानी से साफ किए गए नैनोचिप को सावधानीपूर्वक बाहर निकालें।
  2. 1 घंटे के लिए एयर प्लाज्मा उपचार के साथ नैनोचिप की सतह की सफाई करें।
  3. नैनोचिप को एक पॉलीडिमेथिलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) कक्ष में इकट्ठा करें, जिसमें पीडीएमएस के दो टुकड़े होते हैं-एक मध्य पीडीएमएस और एक शीर्ष पीडीएमएस (चित्रा 1 ए)। नैनोबार पैटर्न के लिए पर्याप्त जोखिम सुनिश्चित करने के लिए केंद्र में एक बड़े अंडाकार आकार के उद्घाटन के साथ मध्य पीडीएमएस पतला (~ 0.5 मिमी) है। शीर्ष पीडीएमएस मोटा (~ 4.0 मिमी) है, जिसमें बड़े अंडाकार उद्घाटन के भीतर दो छोटे छेद हैं जो एक इनलेट और तरल हैंडलिंग के लिए एक आउटलेट के रूप में हैं।
    1. चिप को एक साफ सतह पर रखें जिसमें पैटर्न ऊपर की ओर हो।
    2. धीरे से चिप के साथ मध्य पीडीएमएस को कवर करें, और सुनिश्चित करें कि पूरा पैटर्न मध्य पीडीएमएस में बड़े अंडाकार आकार के उद्घाटन के केंद्रीय क्षेत्र के संपर्क में है।
    3. शीर्ष पीडीएमएस को मध्य पीडीएमएस के साथ कवर करें और मध्य पीडीएमएस के बड़े अंडाकार छेद के क्षेत्र के भीतर इसके दो छोटे छेद रखें। फिर पीडीएमएस कक्ष इकट्ठा किया जाता है।
      नोट: पीडीएमएस सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला सिलिकॉन आधारित कार्बनिक बहुलक है। यह जैव-संगत, पारदर्शी है, साथ ही माइक्रोस्कोप के तहत चिप असेंबली और इमेजिंग के लिए एक अनुकूलित आकार के रूप में डिज़ाइन किया जा सकता है। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि प्लाज्मा उपचार के बाद इसे किसी अन्य पीडीएमएस परत या ग्लास से कसकर चिपकाया जा सकता है, जिससे यह एसएलबी तैयार करने के लिए कक्ष के रूप में उपयुक्त हो जाता है। यह कदम सुनिश्चित करता है कि अंतराल और रिसाव से बचने के लिए पीडीएमएस की प्रत्येक परत को कसकर फिट किया गया है।
  4. एसयूवी को पीडीएमएस कक्ष में शीर्ष पीडीएमएस में दो छोटे छेदों में से एक से एक पिपेट के साथ लोड करें और एसएलबी बनाने के लिए कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. धीरे से पीबीएस बफर को छोटे छेद के एक तरफ से पीडीएमएस कक्ष में डालें और अनबाउंड एसयूवी को धोने के लिए दूसरे छेद से कपास की कली के साथ कचरे को हटा दें। फिर नैनोचिप पर गठित एसएलबी प्राप्त करें (एसएलबी की गुणवत्ता को फोटोब्लीचिंग (एफआरएपी) के बाद फ्लोरेसेंस रिकवरी द्वारा परीक्षण किया जाता है जैसा कि चरण 4.4 में दिखाया गया है और प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में चर्चा की गई है)।
    नोट: पीबीएस बफर को कक्ष में पाइप करते समय, पिपेट टिप बफर से भरा होना चाहिए और किसी भी बुलबुले को इंजेक्ट करने से बचने के लिए तरल सतह के संपर्क में होना चाहिए।

4. नैनोचिप पर एसएलबी और वक्रता संवेदन प्रोटीन बाइंडिंग की इमेजिंग

नोट: यह खंड प्रयोग के लिए उपलब्ध माइक्रोस्कोप प्रणाली पर निर्भर करेगा। यहां, इमेजिंग करने के तरीके पर एक समग्र दिशानिर्देश का वर्णन किया जाएगा। विस्तृत सेटिंग्स को विभिन्न माइक्रोस्कोप सेटअप के बीच बदला जा सकता है।

  1. 100x (N.A.1.4) तेल उद्देश्य का उपयोग करके लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी सेट करें। उत्तेजना लेजर शक्ति का चयन करने के लिए ज़ेन सॉफ्टवेयर खोलें जो लिपिड और प्रोटीन की प्रतिदीप्ति को उत्तेजित कर सकता है। टेक्सास रेड डीएचपीई / ईजीएफपी > स्मार्ट सेटअप > अधिग्रहण मोड चुनें।
  2. चिप पर नैनोबार का पता लगाने के लिए फोकस नॉब के साथ फोकस समायोजित करें जब तक कि लिपिड चैनल के नीचे नैनोबार किनारे तेज न हों।
  3. प्रोटीन जोड़ने से पहले लिपिड चैनल की नियंत्रण छवि प्राप्त करने के लिए स्कैनिंग पैरामीटर नीचे दिए गए अनुसार सेट करें: फ्रेम आकार = 512 पीएक्स एक्स 512 पीएक्स (512 पिक्सेल x 512 पिक्सेल, 124 एनएम का पिक्सेल आकार), बिट्स प्रति पिक्सेल = 16 (16-बिट गहराई), स्कैन गति = 5, और औसत = 4 (चार गुना / लाइन का औसत मोड)।
  4. एक यादृच्छिक एकल नैनोबार क्षेत्र पर फ्लोरोसेंट-लेबल लिपिड बाइलेयर को ब्लीच करके एफआरएपी परख का संचालन करें।
    1. प्रयोग क्षेत्र और ब्लीचिंग चेकबॉक्स का चयन करें। 5 μm व्यास का एक वृत्ताकार क्षेत्र बनाएं जिसमें केंद्र में पूरे नैनोबार शामिल हो सकते हैं (नैनोबार का आकार 2 μm है) और प्रयोग क्षेत्रों में जोड़ें। इनपुट टाइम-लैप्स इमेजिंग पैरामीटर निम्नलिखित उदाहरण के रूप में: स्कैन गति = 9 और औसत = 1 चुनें। समय श्रृंखला > अवधि = 100 चक्र और अंतराल = 2 सेकंड चुनें। इनपुट ब्लीचिंग पैरामीटर निम्नलिखित उदाहरण के रूप में: # छवियों के बाद प्रारंभ चेकबॉक्स का चयन करें और तीन छवियों का चयन करें।
    2. FRAP निष्पादित करने वाले लेज़र चेकबॉक्स का चयन करें और शक्ति को 100.0% तक बदलें. FRAP प्रयोग के लिए प्रयोग प्रारंभ करें क्लिक करें.
      नोट: एफआरएपी सेलुलर अणुओं की गतिशीलता को चिह्नित करने के लिए एक सामान्य तरीका है। यदि एसएलबी में अच्छी तरलता है, तो प्रक्षालित क्षेत्र में प्रतिदीप्ति धीरे-धीरे ठीक हो जाएगी क्योंकि प्रक्षालित फ्लोरोफोरे फैल जाते हैं और अन्य क्षेत्रों से बिना ब्लीच किए गए फ्लोरोफोर फैलते हैं।
  5. प्रोटीन समाधान को पीडीएमएस कक्ष में लोड करें और एसएलबी पर प्रोटीन के बंधन की अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: लिपिड संरचना का प्रदर्शन करने के लिए चित्रा 2 जी, एच में उपयोग किए जाने वाले प्रोटीन नैनोबार-घुमावदार एसएलबी पर प्रोटीन बाइंडिंग की सुविधा प्रदान करते हैं 74 μM GFP और 79 μM GFP-His हैं। ये दो प्रोटीन हरे रंग के प्रतिदीप्ति प्रोटीन हैं जो हिस-टैग के बिना या उसके साथ हैं। चित्रा 4 और चित्रा 5 में वक्रता संवेदन अध्ययन के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटीन 16 μM F-BAR, 16 μM IDRFBP17, और 16 μM FBAR + IDRFBP17 हैं। ये तीन प्रोटीन एफबीपी 17 के डोमेन हैं, जो एक विशिष्ट बीएआर प्रोटीन है जिसे सहज रूप से वक्रता जनरेटर और सेंसर दोनों के रूप में माना जाता है। प्रत्येक प्रोटीन की मात्रा 20 μL है।
  6. प्रोटीन वक्रता संवेदन का पता लगाने के लिए लिपिड और प्रोटीन चैनल दोनों की छवियां लेने के लिए नैनोबार को फिर से केंद्रित करें और चरण 4.3 दोहराएं।
  7. लिपिड और प्रोटीन चैनलों दोनों पर एफआरएपी परख का संचालन करने के लिए चरण 4.4 दोहराएं और वक्रता संवेदन प्रोटीन की गतिशीलता को चिह्नित करने के लिए टाइम-लैप्स इमेजिंग करें।

5. नैनोचिप का पुन: उपयोग

  1. नैनोचिप को चिमटी के साथ पकड़ें और सावधानीपूर्वक इसे पीडीएमएस कक्ष से विआयनीकृत पानी से भरे 50 एमएल बीकर में अलग करें।
    नोट: यह एक महत्वपूर्ण कदम है। चिमटी को नैनोस्ट्रक्चर को छूने से रोकें, और दरारों से बचने के लिए चिप को अलग करने के लिए मजबूर न करें।
  2. सतह पर जुड़े कार्बनिक अवशेषों को हटाने के लिए नैनोचिप को निर्जल इथेनॉल के साथ अच्छी तरह से धोएं।
    नोट: निर्जल इथेनॉल से धोने से पहले सतह पर पानी निकालने के लिए साफ टिशू पेपर का उपयोग करें।
    चेतावनी: निर्जल इथेनॉल एक अत्यधिक अस्थिर और थोड़ा खतरनाक रसायन है। त्वचा और आंखों के संपर्क से बचें। इसे मास्क और दस्ताने पहनकर फ्यूम हुड में इस्तेमाल करें।
  3. अवशिष्ट इथेनॉल को हटाने के लिए चिप को बहुत सारे विआयनीकृत पानी से अच्छी तरह से धो लें। फिर चिप को 99.9% नाइट्रोजन गैस के साथ ब्लो-ड्राई करें।
    नोट: अगले चरण पर जाने से पहले चिप पर इथेनॉल के सभी निशान ों को हटाना महत्वपूर्ण है क्योंकि पिरान्हा एसिड कार्बनिक विलायक के साथ हिंसक प्रतिक्रिया कर सकता है और विस्फोट का कारण बन सकता है।
  4. चिप को एक साफ 10 एमएल बीकर में पैटर्न साइड के साथ रखें और चिप को पुन: उपयोग के लिए पिरान्हा समाधान के साथ साफ करें जो 'नैनोचिप की सफाई' के समान चरणों का पालन करता है।

6. छवि परिमाणीकरण

  1. माइक्रोस्कोप द्वारा प्राप्त छवियों को घुमाएं ताकि फिजी सॉफ्टवेयर में बाद के विश्लेषण के लिए नैनोबार सरणी ऊर्ध्वाधर स्थिति में हो।
  2. लिपिड चैनल और प्रोटीन चैनल दोनों में एक वर्ग मास्क (51 पिक्सेल x 51 पिक्सेल) द्वारा व्यक्तिगत नैनोबार का पता लगाने के लिए एक कस्टम-लिखित MATLAB कोड 'c_pillarmask_averaging' का उपयोग करें।
    नोट: यह MATLAB कोड विशेष रूप से नैनोचिप के लिए डिज़ाइन किया गया है। यह लिंक के माध्यम से GitHub पर प्राप्त किया जा सकता है: https://github.com/wtzhaolab/GNB_SLB_MX।
  3. मैटलैब कोड 'BarGra_avg' में जालग्रिड फ़ंक्शन द्वारा छवि के कोनों पर तीन आरओआई (5 पिक्सेल x 5 पिक्सेल) के साथ प्रत्येक छवि के पृष्ठभूमि संकेतों को घटाएं। इस ऑपरेशन का उद्देश्य माइक्रोस्कोप चरण पर माइक्रोस्कोप सेटअप या चिप लेवलिंग के कारण संभावित असमान पृष्ठभूमि शोर को ठीक करना है।
  4. MATLAB कोड 'BarGra_avg' का उपयोग करके समान आकार के नैनोबार की औसत छवियां उत्पन्न करें, जहां प्रत्येक बिंदु सभी अलग-अलग नैनोबार स्क्वायर मास्क में उस बिंदु पर मूल्यों का औसत है। नैनोबार के आसपास औसत सिग्नल वितरण को सहज रूप से दिखाने के लिए फिजी सॉफ्टवेयर में औसत छवियों के 3 डी सतह भूखंड उत्पन्न करें। बहुभुज गुणक > लिए इनपुट 100 > विश्लेषण करें, और शेड, ड्रॉ एक्सिस और स्मूथ चेकबॉक्स का चयन करें।
  5. प्रत्येक नैनोबार को तीन क्षेत्रों में विभाजित करें, जिसमें दो नैनोबार-एंड क्षेत्र और एक नैनोबार-सेंटर क्षेत्र शामिल हैं ताकि क्रमशः MATLAB कोड 'avg_nanobar_quantification' द्वारा उनकी प्रतिदीप्ति तीव्रता को निकाला जा सके। नैनोबार आरओआई के आकार को 'स्थिति' फ़ाइल का उपयोग करके नैनोबार के आयाम के अनुसार समायोजित किया जाता है।
  6. नैनोबार-एंड घनत्व प्राप्त करने के लिए बार-एंड क्षेत्र में मैटलैब कोड 'avg_nanobar_quantification' से निकाले गए लिपिड तीव्रता द्वारा प्रोटीन तीव्रता को विभाजित करें जिसमें सतह क्षेत्र प्रभाव शामिल नहीं है।
  7. बाइंडिंग वक्र प्राप्त करने के लिए ग्राफपैड प्रिज्म में विभिन्न सांद्रता के साथ नैनोबार-एंड घनत्व को प्लॉट करें। विश्लेषण मेनू खोलें । नॉनलाइनियर रिग्रेशन (वक्र फिट) > बाइंडिंग चुनें - हिल समीकरण के साथ वक्र फिट करने के लिए हिल ढलान फ़ंक्शन के साथ संतृप्ति > विशिष्ट बाइंडिंग और फिर केडी और हिल गुणांक मान की गणना करें।
  8. लिपिड और प्रोटीन तीव्रता को MATLAB कोड 'avg_nanobar_quantification' का उपयोग करके एक ही छवि में प्राप्त 600 एनएम नैनोबार्स केंद्र पर उनकी संबंधित तीव्रता के लिए सामान्यीकृत किया जाता है।
  9. समान आकार के नैनोबार के साथ प्रोटीन वक्रता संवेदन को निर्धारित करने के लिए बार-सेंटर क्षेत्र द्वारा विभाजित नैनोबार-एंड क्षेत्र में सामान्यीकृत प्रोटीन तीव्रता के सबसे चमकीले नौ पिक्सेल का उपयोग करें, मूल्य को "एंड-टू-सेंटर अनुपात" के रूप में नामित किया गया है। विभिन्न आकार के नैनोबार के साथ प्रोटीन वक्रता संवेदन रेंज को निर्धारित करने के लिए लिपिड तीव्रता को सामान्य करने के लिए सामान्यीकृत प्रोटीन तीव्रता के अनुपात का उपयोग करें, मूल्य को "सामान्यीकृत नैनोबार-एंड डेंसिटी" नाम दिया गया है। इन मानों की गणना MATLAB कोड 'avg_nanobar_quantification' द्वारा की जाती है।
  10. फिजी सॉफ्टवेयर में एफआरएपी स्टैक छवि लोड करें। FRAP क्षेत्र चुनें और ROI उत्पन्न करें। प्रत्येक बार एफआरएपी क्षेत्र की तीव्रता को मापने के लिए अधिक > बहु माप फ़ंक्शन चुनें। एफआरएपी रिकवरी वक्र उत्पन्न करने के लिए ग्राफपैड प्रिज्म में तीव्रता को प्लॉट करें।

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Representative Results

सकारात्मक वक्रता संवेदन प्रोटीन की जांच के लिए नैनोबार डिजाइन की सिफारिश की जाती है, जिसमें नैनोबार चौड़ाई द्वारा परिभाषित वक्रता के साथ प्रत्येक छोर पर आधा चक्र होता है और केंद्र में स्थानीय रूप से एक फ्लैट / शून्य वक्रता नियंत्रण होता है (चित्रा 2 ए, बी)। नैनोबार पर एसएलबी के सफल गठन के परिणामस्वरूप पूरे नैनोबार सतह पर समान रूप से वितरित लिपिड मार्कर संकेत होते हैं जैसा कि चित्र 2 सी में दिखाया गया है। कई नैनोबारों से संकेतों को अलग-अलग नैनोबार छवियों (चित्रा 2 डी) के औसत से जोड़ा जा सकता है ताकि विभिन्न नैनोबारों के बीच यादृच्छिक भिन्नताओं को कम किया जा सके। पहले के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी अध्ययन से पता चला है कि सेल प्लाज्मा झिल्ली ने पूरे नैनोस्ट्रक्चर24 के चारों ओर अनुरूप कोटिंग का गठन किया। इसलिए, सिंथेटिक लिपिड बाइलेयर को नैनोस्ट्रक्चर सतह पर कसकर संलग्न करने के लिए माना जाता है, जो चित्र 4ई में देखे गए 200 एनएम नैनोबार पर विवर्तन-सीमित रेखाएं देता है। इसके अलावा, नैनोबार-घुमावदार एसएलबी पर झिल्ली तरलता को एफआरएपी परख द्वारा भी चिह्नित किया जा सकता है, जहां एकल नैनोबार पर फ्लोरोसेंट सिग्नल को झिल्ली तरलता लक्षण वर्णन (चित्रा 2 ई, एफ) के लिए व्यक्तिगत रूप से ब्लीच किया जा सकता है।

नैनोबार पर एसएलबी के गठन के लिए सपाट सतहों पर एसएलबी गठन के समान एसयूवी के उत्पादन की आवश्यकता होती है जैसा कि पहले17 में बताया गया था। एसयूवी की लिपिड संरचना नैनोबार-घुमावदार एसएलबी की सतह रसायन विज्ञान को निर्धारित करती है जिसे झिल्ली लेबलिंग और विभिन्न प्रोटीन बाध्यकारी तंत्र के लिए बदला जा सकता है। उदाहरण के लिए, टेक्सास रेड डीएचपीई को एसयूवी में ~ 0.5 मोल% में जोड़ा जा सकता है ताकि नैनोबार पर झिल्ली की सतह क्षेत्र के संवर्धन को आसानी से फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2 सी) द्वारा चित्रित किया जा सके। विज़ुअलाइज़ेशन के अलावा, नैनोबार-घुमावदार एसएलबी पर प्रोटीन बाइंडिंग की सुविधा के लिए लिपिड संरचना को भी बदला जा सकता है। उदाहरण के लिए, हिस-टैग किए गए प्रोटीन के लंगर को सुविधाजनक बनाने के लिए, निकल-नाइट्रिलोट्रिएसेटिक एसिड (नी-एनटीए) को नैनोबार पर एसएलबी में 1,2-डायोलियोइल-एसएन-ग्लिसेरो-3-[(एन-(5-एमिनो-1-कार्बोक्सीपेंटाइल) इमिनोडायसेटिक एसिड) सक्सिनिल] (निकल नमक) (18: 1 डीजीएस-एनटीए (एनआई)) को एसयूवी (~ 1 मोल%) में शामिल करके लाया जा सकता है। लिपिड पर इस कार्यात्मक समूह के बिना, हरे रंग की फ्लोरेसेंस प्रोटीन (जीएफपी) नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए पीएस के साथ एसएलबी से नहीं जुड़ सकती है, जिसके परिणामस्वरूप समाधान में जीएफपी संकेतों की वॉल्यूमेट्रिक कमी के कारण प्रत्येक नैनोबार स्थान पर एक गहरा बार-आकार का छेद होता है (चित्रा 2 जी)। इसकी तुलना में, एसएलबी में 1 मोल% 18: 1 डीजीएस-एनटीए (एनआई) जोड़कर, जीएफपी लेबल वाला हिस-टैग नैनोबार्स द्वारा घुमावदार एसएलबी आकार का स्पष्ट रूप से पालन करने के लिए झिल्ली पर दृढ़ता से लंगर डाल सकता है (चित्रा 2 एच)। लिपिड प्रसार ने प्रोटीन बाइंडिंग पर एक पता लगाने योग्य अंतर नहीं दिखाया जैसा कि एफआरएपी परख (पूरक चित्रा 1) द्वारा जांच की गई थी। यह ध्यान देने योग्य है कि एफआरएपी माप केवल एसएलबी में 0.5 मोल% टेक्सास रेड डीएचपीई की तीव्रता पर आधारित है, जो हिस-टैग प्रोटीन के बंधन के लिए उपयोग किए जाने वाले 1 मोल% डीजीएस-एनटीए (एनआई) का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकता है। इसके अलावा, पीएस जैसे चार्ज किए गए लिपिड इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन26 के माध्यम से प्रोटीन बाइंडिंग को बढ़ा सकते हैं, जबकि सिग्नलिंग लिपिड जैसे फॉस्फेटिडिलिनोसिटोल (4,5)-बिस्फॉस्फेट (पीआईपी 2) को विशिष्ट प्रोटीन बाइंडिंग की सुविधा के लिए एसयूवी में भी एकीकृत किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, एफसीएचओ 2, जिसके लिए पीआईपी 2 को इसकी झिल्ली वक्रता संवेदन27 के लिए आवश्यक पाया जाता है)।

सतह एकरूपता और झिल्ली तरलता के संदर्भ में एसएलबी गठन की गुणवत्ता नैनोबार पर प्रोटीन वक्रता संवेदन क्षमता की जांच के लिए महत्वपूर्ण है। तीन विशिष्ट मुद्दे हैं जो एसएलबी एकरूपता और तरलता से समझौता कर सकते हैं। एक अक्षम धुलाई के कारण एसएलबी पर अतिरिक्त एसयूवी का बंधन है जो नैनोबार पर और नैनोबार के बीच सपाट झिल्ली दोनों पर पंक्टा उत्पन्न करता है (चित्रा 3 ए, बी)। यह वक्रता संवेदन मूल्यांकन के लिए नैनोबार पर घुमावदार या सपाट सतहों पर प्रोटीन बाइंडिंग की मात्रा को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित करता है। एक और मुद्दा धोने के चरण के दौरान पीडीएमएस कक्ष के अंदर हवा के बुलबुले का अप्रत्याशित परिचय है, जो वायु-तरल इंटरफ़ेस के प्रक्षेपवक्र के साथ एसएलबी को नष्ट कर सकता है और नैनोबार सतह पर बेहद कम लिपिड संकेतों के साथ खरोंच जैसी विशेषताओं को आसानी से पहचानने योग्य छोड़ सकता है (चित्रा 3 सी, डी)। इसके अलावा, अनुचित रूप से साफ किए गए नैनोबार सब्सट्रेट सतह पर यादृच्छिक रूप से वितरित रासायनिक अवशेष छोड़ते हैं जो एसएलबी गठन के लिए लिपिड सोखना को रोकते हैं। यह झिल्ली दोषों की पीढ़ी की ओर जाता है जो माइक्रोस्कोपी विज़ुअलाइज़ेशन (चित्रा 3 ई) के लिए ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन से ऊपर हो सकते हैं या नहीं भी हो सकते हैं। हालांकि, झिल्ली द्रवता झिल्ली दोष गठन28 से संवेदनशील रूप से प्रभावित होगी ताकि एफआरएपी परख का उपयोग सतह की सफाई को सत्यापित करने के लिए किया जा सके (चित्रा 3 एफ, जी)।

नैनोबार सरणी का उपयोग करके वक्रता संवेदन प्रोटीन के लक्षण वर्णन को प्रदर्शित करने के लिए, विशिष्ट एफ-बार डोमेन की तुलना एफबीपी 17 (आईडीआरएफबीपी 17) में हाल ही में पहचाने गए आंतरिक रूप से अव्यवस्थित क्षेत्र के साथ की जाती है। एफ-बार को फ्लोरोसेंटली एलेक्सा फ्लूर 488 टेट्राफ्लोरोफेनिल एस्टर रंगों के साथ लेबल किया गया है जबकि आईडीआरएफबीपी 17 को एलेक्सा फ्लूर 647 सी 2 मैलिमाइड के साथ लेबल किया गया है। जैसा कि चित्रा 4 ए में दिखाया गया है, दोनों प्रोटीन डोमेन 300 एनएम चौड़ाई के साथ एसएलबी-लेपित व्यक्तिगत नैनोबार पर संचय में वृद्धि दिखाते हैं। यहां, एसएलबी में प्रोटीन बाइंडिंग को इलेक्ट्रोस्टैटिक रूप से बढ़ाने के लिए 10% पीएस होता है। प्रोटीन की वक्रता संवेदन क्षमता को फ्लैट नैनोबार केंद्रों पर संकेतों की तुलना में उच्च फ्लोरोसेंट तीव्रता के साथ घुमावदार नैनोबार सिरों पर अधिमान्य संवर्धन द्वारा पहचाना जा सकता है, जो 100 से अधिक नैनोबार (चित्रा 4 बी) से छवि औसत के बाद अधिक स्पष्ट रूप से दिखाया गया है। वक्रता संवेदन क्षमता को मात्रात्मक रूप से प्रत्येक नैनोबार पर एंड-टू-सेंटर अनुपात की गणना करके परिलक्षित किया जा सकता है (यानी, नैनोबार अंत बनाम नैनोबार केंद्र पर प्रतिदीप्ति तीव्रता)। जैसा कि चित्रा 4 सी में दिखाया गया है, दोनों प्रोटीनों में लिपिड की तुलना में उच्च एंड-टू-सेंटर अनुपात होता है, जो लगभग 1 है। आईडीआरएफबीपी 17 और एफ-बार की तुलना करते समय, यह देखा जा सकता है कि आईडीआरएफबीपी 17 (1.385 ± 0.011, औसत ± एसईएम) का उच्च एंड-टू-सेंटर अनुपात एफ-बीएआर (1.144 ± 0.004, औसत ± एसईएम) की तुलना में मजबूत वक्रता संवेदन को इंगित करता है।

प्रोटीन द्वारा महसूस की जा सकने वाली वक्रता की सीमा की जांच करने के लिए, एसएलबी को नैनोबार सरणियों पर 200 एनएम से 600 एनएम (चित्रा 4 डी) तक ढाल चौड़ाई के साथ उत्पन्न किया जाता है, जहां लिपिड ने विभिन्न आकार के नैनोबार (चित्रा 4 ई) पर सजातीय कोटिंग दिखाई। तीन प्रोटीन (आईडीआरएफबीपी 17, एफ-बार, और एफ-बीएआर + आईडीआरएफबीपी 17) को ग्रेडिएंट नैनोबार सरणी पर इनक्यूबेट किया जाता है, और उनमें से सभी ने नैनोबार-एंड घुमावदार झिल्ली साइटों पर अधिमान्य संचय दिखाया जब वक्रता व्यास में 400 एनएम से कम हो गई (चित्रा 4 ई, एफ)। इन तीन प्रोटीन डोमेन में से, आईडीआरएफबीपी 17 उच्चतम नैनोबार-एंड घनत्व देता है, जो इसकी सबसे मजबूत वक्रता संवेदन क्षमता का संकेत देता है, जबकि एफ-बार सबसे कम मूल्य दिखाता है (चित्रा 4 एफ)। इसके अलावा, वक्रता संवेदन प्रोटीन के बाध्यकारी वक्र को धीरे-धीरे प्रोटीन एकाग्रता (चित्रा 4 जी) को बढ़ाकर भी प्लॉट किया जा सकता है, जो दर्शाता है कि आईडीआरएफबीपी 17 में एक मजबूत सहकारी वक्रता संवेदन क्षमता है। हिल समीकरण के लिए अपने बाध्यकारी वक्रों को फिट करते समय, केडी को μM रेंज (0.6 ± 0.1 μM) में पाया जाता है और हिल गुणांक (H) 2 और 3 के बीच होता है, जो नैनोबार-प्रेरित झिल्ली वक्रता के लिए IDRFBP17 के अति संवेदनशील बंधन का सुझाव देता है। वक्रता जितनी तेज होती है, संतुलन पर बाध्यकारी क्षमता उतनी ही अधिक होती है।

नैनोबार के आकार के एसएलबी साइटों के चारों ओर वक्रता संवेदन प्रोटीन के गतिशील झिल्ली प्रसार और झिल्ली संघ का अध्ययन एफआरएपी द्वारा भी किया जा सकता है। नैनोबार (चित्रा 5 ए, ई) पर लिपिड संकेतों की तेजी से वसूली की तुलना में, एफ-बीएआर 2 मिनट (चित्रा 5 बी, ई) के भीतर ठीक नहीं हो सका, जिससे पता चलता है कि घुमावदार झिल्ली साइटों पर इसकी झिल्ली गतिशीलता और एसोसिएशन गतिशील में काफी कमी आई है। आश्चर्यजनक रूप से, एफ-बार के व्यवहार से अलग, आईडीआरएफबीपी 17 सिग्नल ने एक ही समय सीमा (चित्रा 5 सी, ई) के भीतर स्पष्ट वसूली दिखाई, जो घुमावदार झिल्ली पर संचित आईडीआरएफबीपी 17 की गतिशील प्रकृति को दर्शाता है। हालांकि, समाधान में अनबाउंड आईडीआरएफबीपी 17 को धोने के बाद, आईडीआरएफबीपी 17 चैनल में पहले की तरह वसूली नहीं देखी जा सकती है (चित्रा 5 डी, ई)। यह इंगित करता है कि रिकवरी समाधान युक्त आईडीआरएफबीपी 17 अणुओं के साथ विनिमय पर हावी है और झिल्ली-बाध्य अणुओं के पार्श्व प्रसार द्वारा कम है।

कुल मिलाकर, इन परिणामों से पता चलता है कि यह नैनोबार-एसएलबी प्रणाली विट्रो में झिल्ली वक्रता-संवेदन प्रोटीन को चिह्नित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।

Figure 1
चित्र 1: नैनोबार-एसएलबी प्रणाली का चित्रण। (A) PDMS कक्ष में शीर्ष और मध्य परतें होती हैं जिन पर साफ नैनोचिप इकट्ठी होती है। (बी) टेक्सास रेड डीएचपीई लेबल एसयूवी को ज़ूम-इन विस्तार के साथ लेबल किया गया है। (सी) नैनोबार-एसएलबी प्रणाली और ज़ूम-इन क्षेत्र का बरकरार मॉडल दर्शाता है कि एसएलबी लिपिड बाइलेयर की एक समान एकल परत के साथ नैनोबार पर बनता है। (डी) लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के तहत इमेजिंग और लक्षण वर्णन प्रक्रिया। (ई) आगे पुन: उपयोग के लिए नैनोचिप की सफाई। (च) प्रोटीन वक्रता संवेदन परिमाणीकरण के लिए इमेजिंग प्रसंस्करण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: प्रोटीन बाइंडिंग के साथ नैनोबार पर घुमावदार एसएलबी का गठन। (बी) नैनोबार-एसएलबी प्रणाली का योजनाबद्ध चित्रण। (सी) नैनोचिप पर टेक्सास रेड डीएचपीई के साथ लेबल किए गए एसएलबी की फ्लोरोसेंट छवियां। (डी) नैनोबार (ऊपर) पर एसएलबी वितरण की औसत छवि और औसत छवि (नीचे) का 3 डी सतह प्लॉट। इस आंकड़े को Su et al.22 से संशोधित किया गया है और अनुमति के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया है। (ई) नैनोबार पर एसएलबी एफआरएपी की टाइम-लैप्स इमेजिंग। विरंजन क्षेत्र को एक पीले डैश्ड सर्कल द्वारा इंगित किया जाता है। (एफ) एफआरएपी माप द्वारा सामान्यीकृत नैनोबार तीव्रता प्लॉट। (जी) जीएफपी का योजनाबद्ध चित्रण एसएलबी को 10 मोल% नकारात्मक चार्ज पीएस (बाएं) और दाईं ओर एक संबंधित प्रतिनिधि छवि के साथ बांध नहीं सकता है। (एच) 1 मोल% डीजीएस-एनटीए (एनआई) (बाएं) और दाईं ओर एक संबंधित प्रतिनिधि छवि के साथ एसएलबी से बंधे जीएफपी लेबल वाले हिस-टैग का योजनाबद्ध चित्रण। स्केल पट्टियाँ: 2 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: विशिष्ट मुद्दे जो एसएलबी गुणवत्ता से समझौता करते हैं। (ए) कुशल धोने के बिना एसएलबी तैयारी का योजनाबद्ध। (बी) एसएलबी की प्रतिनिधि छवि अतिरिक्त एसयूवी के साथ बंधती है। पीले तीर पंक्टा दिखाते हैं जो एसएलबी सतह पर अतिरिक्त एसयूवी हैं। (सी) हवा के बुलबुले इंजेक्शन के साथ एसएलबी तैयारी का योजनाबद्ध। (डी) वायु-तरल इंटरफ़ेस के प्रक्षेपवक्र द्वारा नष्ट एसएलबी की प्रतिनिधि छवि। पीला तीर सब्सट्रेट पर अपूर्ण एसएलबी दिखाता है। (ई) अनचाहे नैनोबार सब्सट्रेट्स के साथ एसएलबी तैयारी की योजनाबद्ध। ज़ूम-इन क्षेत्र लिपिड सोखने को रोकने के लिए सतह अवशेषों के कारण एक असंतुलित लिपिड बाइलेयर दिखाता है। (च) अनस्कृत नैनोबार सब्सट्रेट्स पर एसएलबी एफआरएपी विश्लेषण की टाइम-लैप्स इमेजिंग। विरंजन क्षेत्र को एक पीले डैश्ड सर्कल द्वारा इंगित किया जाता है। (छ) एफआरएपी माप द्वारा सामान्यीकृत नैनोबार तीव्रता प्लॉट। स्केल पट्टियाँ: 2 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: नैनोबार-एसएलबी प्रणाली द्वारा प्रोटीन वक्रता संवेदन लक्षण वर्णन। (ए) एफ-बार (बाएं) और आईडीआरएफबीपी 17 (दाएं) की फ्लोरोसेंट छवियां एसएलबी-लेपित नैनोबार (10% पीएस और 90% पीसी) पर जमा होती हैं। (बी) एफ-बार (बाएं शीर्ष) और आईडीआरएफबीपी 17 (बाएं नीचे) की औसत छवियां नैनोबार और संबंधित 3 डी सतह भूखंडों (क्रमशः दाएं ऊपर और दाएं नीचे) पर जमा होती हैं। स्केल बार: 2 μm. (C) लिपिड बाइलेयर, F-BAR और IDRFBP17 फ्लोरेसेंस तीव्रता का एंड-टू-सेंटर अनुपात 300 एनएम चौड़ाई नैनोबार के आसपास। सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए वेल्च का टी-टेस्ट किया गया था। पी < 0.0001. (n = 3) (डी) 200 एनएम से 600 एनएम तक चौड़ाई के साथ ढाल नैनोबार सरणियों की एसईएम छवि। स्केल बार: 5 μm. (E) प्रोटीन निर्माण (ऊपर), लिपिड बाइलेयर की औसत छवियां, IDRFBP17, F-BAR, और F-BAR + IDRFBP17 वितरण ग्रेडिएंट नैनोबार पर 200 nm से 600 nm (मध्य) तक की चौड़ाई और प्रत्येक औसत छवि (नीचे) के नैनोबार के साथ तीव्रता प्रोफाइल। स्केल बार: 2 μm. (F) IDRFBP17, F-BAR, और F-BAR + IDRFBP17 क्रमशः नैनोबार की विभिन्न चौड़ाई के साथ सामान्यीकृत नैनोबार-एंड घनत्व निर्धारित किया गया। प्रत्येक डेटा को एसईएम (एन ≥ 60) ± माध्य के रूप में दिखाया गया है। (छ) आईडीआरएफबीपी 17 का बाइंडिंग वक्र हिल समीकरण के साथ फिट है। प्रत्येक डेटा को एसईएम (एन = 3) ± माध्य के रूप में दिखाया गया है। इस आंकड़े को Su et al.22 से संशोधित किया गया है और अनुमति के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: नैनोबार के चारों ओर वक्रता संवेदन प्रोटीन की झिल्ली-बाध्यकारी गतिशीलता। (ए-डी) लिपिड बाइलेयर (ए), एफ-बीएआर (बी), आईडीआरएफबीपी 17 (सी), और आईडीआरएफबीपी 17 की टाइम-लैप्स इमेजिंग नैनोबार पर धोया गया (डी) एफआरएपी विश्लेषण। विरंजन क्षेत्र को एक लाल डैश्ड सर्कल द्वारा इंगित किया जाता है। स्केल बार: 5 μm. (E) FRAP माप द्वारा सामान्यीकृत नैनोबार तीव्रता प्लॉट। इस आंकड़े को Su et al.22 से संशोधित किया गया है और अनुमति के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1: प्रोटीन जोड़ने से पहले और बाद में झिल्ली प्रसार। (ए) पीओपीसी लिपिड बाइलेयर पर एफआरएपी परीक्षण की टाइम-लैप्स इमेजिंग जिसमें 1 मोल% 18: 1 डीजीएस-एनटीए (एनआई) और 0.5 मोल% टेक्सास रेड डीएचपीई नैनोबार के चारों ओर (ऊपर) और बाद में (नीचे) जीएफपी-हिज प्रोटीन को जोड़ता है। विरंजन क्षेत्र को एक पीले डैश्ड सर्कल द्वारा इंगित किया जाता है। (बी) एफआरएपी माप द्वारा सामान्यीकृत नैनोबार तीव्रता प्लॉट। स्केल पट्टियाँ: 2 μm. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां वर्णित नैनोबार-एसएलबी प्रणाली कई मौजूदा इन विट्रो परखों में फायदे का एक अनूठा संयोजन प्रदान करती है। यह कुशलतापूर्वक लिपोसोम फ्लोटेशन या अवसादन परख के रूप में अत्यधिक घुमावदार झिल्ली के लिए प्रोटीन के अधिमान्य बंधन को प्रकट करता है, लेकिन इसके लिए बहुत कम नमूनों की आवश्यकता होती है और व्यक्तिगत नैनोबार 8,29 पर अधिक सटीक रूप से परिभाषित वक्रता प्रदान करता है। यह एसएलआईसी परख के रूप में एक साथ तुलना के लिए सटीक रूप से नियंत्रित वक्रता की एक विस्तृत श्रृंखला भी प्रदान करता है, जिसमें विभिन्न वक्रता में लिपिड संरचना परिवर्तन के बारे में कम चिंता होती है और प्रकाश की विवर्तन सीमा से नीचे के आकार के साथ अज्ञात रूपात्मक या वक्रता परिवर्तन होते हैं, क्योंकि एसएलबी गतिशील है और लगातार नैनोबारके सभी आकारों को कसकर कवर करता है। . नैनोबार-एसएलबी घुमावदार झिल्ली पर प्रोटीन के गतिशील व्यवहार के अवलोकन की अनुमति देता है, लेकिन ट्यूब पीढ़ी के थ्रूपुट और ऑप्टिकल ट्रैपिंग मैनिपुलेशन13 में अनुभव तक सीमित नहीं है। यद्यपि एसएमआरटी परख उच्च थ्रूपुट में झिल्ली ट्यूब उत्पन्न करता है, झिल्ली वक्रता नैनोट्यूब के साथ भिन्न होती है जो प्रोटीन16 की वक्रता संवेदनशीलता का अध्ययन करना कठिन बनाती है। अधिक दिलचस्प बात यह है कि पैटर्न सब्सट्रेट 18,19,20,27 पर अन्य एसएलबी-आधारित प्रणालियों की तुलना में, नैनोबार-एसएलबी बार अंत में परिभाषित वक्रता के बगल में एक फ्लैट बार केंद्र प्रदान करता है, जो मात्रात्मक विश्लेषण पर सतह घनत्व भिन्नताओं के प्रभाव को कम करने के लिए प्रभावी रूप से शून्य वक्रता के स्थानीय नियंत्रण के रूप में कार्य करता है। उच्च-रिज़ॉल्यूशन इलेक्ट्रॉन-बीम लिथोग्राफी का उपयोग करके वक्रता संयोजनों को अनुकूलित करने की क्षमता न केवल स्थानीय शून्य वक्रता नियंत्रण उत्पन्न कर सकती है, बल्कि सकारात्मक और नकारात्मक वक्रता भी उत्पन्न कर सकती है जैसा कि लाइव सेल अध्ययन2 में पहले दिखाया गया है।

इस विधि का उपयोग करते समय ध्यान देने योग्य संभावित सीमाएं हैं। सबसे पहले, चिप पर नैनोफैब्रिकेशन एक अपेक्षाकृत जटिल प्रक्रिया है, जिसमें क्लीनरूम सुविधाओं और विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है (विशेष रूप से, एक ई-बीम लेखक)। इस उच्च लागत ने हमें चिप का पुन: उपयोग करने के लिए प्रेरित किया; इसके परिणामस्वरूप चिप की सतह को साफ करने और एक बार के उपयोग की तुलना में पीडीएमएस के साथ चिप को इकट्ठा करने में अधिक समय लगता है। नैनोचिप की उपलब्धता एक अन्य प्रकार की सीमा है। चिप का उपयोग करते समय अनुचित संचालन जैसे कि बेंच की ओर सतह का सामना करना नैनोस्ट्रक्चर एट्रिशन का कारण बन सकता है, खासकर उच्च-पहलू-अनुपात संरचनाओं के लिए। इसके अलावा, सब्सट्रेट पर गठित लिपिड बाइलेयर एक निरंतर झिल्ली है; तनाव आसानी से हर जगह फैल सकता है। उन अध्ययनों के लिए जिनके लिए झिल्ली तनाव के हेरफेर की आवश्यकता होती है, संलग्न माइक्रोपिपेट सिस्टम के माध्यम से जीयूवी से खींचे गए टीथर जैसी तकनीकें अधिक सुविधाजनक समाधान प्रदान करतीहैं।

इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए, निम्न चरण भी महत्वपूर्ण हैं। (i) एसएलबी गठन31,32 के लिए पुटिका का आकार महत्वपूर्ण है। पिछले साहित्य में लंपटता (क्यूसीएम-डी) परीक्षण32 के साथ क्वार्ट्ज क्रिस्टल माइक्रोबैलेंस का उपयोग करके बड़े आकार की तुलना में छोटे आकार के पुटिकाओं (< 90 एनएम) के लिए फ्यूजिंग की उच्च प्रवृत्ति दिखाई देती है। इस प्रकार, 300 एनएम के एलयूवी की तुलना में, ~ 50 एनएम का व्यास एसएलबी गठन के लिए आसान होगा। इस मुद्दे को ध्यान में रखते हुए, एसएलबी गठन के लिए सजातीय एसयूवी बनाने के लिए फ्रीज-पिघलना और एक्सट्रूज़न चरणों दोनों में कम से कम 20 बार की आवश्यकता होती है। झिल्ली गतिशीलता को मान्य करने के लिए हर प्रयोग में एफआरएपी परीक्षण भी आवश्यक है। (ii) एसयूवी तैयार करने के दौरान, धूल जैसे छोटे कणों के संदूषण से बचने के लिए सभी उपकरणों को साफ रखा जाना चाहिए। विशेष रूप से मिनी-एक्सट्रूडर के लिए, सुइयों को गंदे वातावरण में आसानी से बंद कर दिया जाता है। (iii) अच्छी गुणवत्ता वाली एसयूवी तैयार करने के लिए लिपिड मिश्रण में क्लोरोफॉर्म को पूरी तरह से हटाने की आवश्यकता होती है ताकि लिपिड पुटिकाओं को नष्ट करने से बचा जा सके। (iv) एसएलबी गठन से पहले चिप की प्लाज्मा सफाई नए सिरे से किए जाने की आवश्यकता है ताकि एक सतत बाईलेयर बनाने के लिए कुशल एसयूवी टूटने के लिए अत्यधिक हाइड्रोफिलिक सतह सुनिश्चित की जा सके। प्लाज्मा उपचार के बाद पर्यावरण में लंबे समय तक संपर्क में रहने से चिप की सतह पर धूल के कणों या कार्बनिक अवशेषों के गैर-विशिष्ट बंधन हो सकते हैं, जिससे सतह की हाइड्रोफिलिसिटी से समझौता हो सकता है। (v) एसएलबी गठन और प्रोटीन इनक्यूबेशन के लिए पीडीएमएस कक्ष को इकट्ठा करने के लिए, द्रविक चैनल की एक अच्छी सील सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक पीडीएमएस टुकड़े की स्वच्छता और फ्लैटनेस महत्वपूर्ण है। कक्ष के किसी भी रिसाव से एसएलबी सूख सकता है या प्रोटीन एकाग्रता को बदल सकता है। (vi) लगातार तीव्रता माप सुनिश्चित करने के लिए इमेजिंग फोकस समायोजन महत्वपूर्ण है, क्योंकि नैनोबार (600 एनएम) की ऊंचाई जेड अक्ष33 में लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की फोकल गहराई के बराबर है। छवियों में नैनोबार किनारों की तीक्ष्णता को बनाए रखने के लिए सरणी क्षैतिज रूप से चलने पर हर बार फोकस को फिर से समायोजित किया जाना चाहिए।

इन सबसे ऊपर, यहां पेश की गई नैनोबार-एसएलबी प्रणाली झिल्ली वक्रता संवेदन प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली विधि प्रदान करती है। घुमावदार झिल्ली के साथ प्रोटीन इंटरैक्शन को प्रभावित करने वाले विभिन्न मापदंडों का मात्रात्मक रूप से वक्रता की एक श्रृंखला में अध्ययन किया जा सकता है, जैसे कि प्रोटीन8,30 के वक्रता-संवेदनशील डोमेन (जैसे, बीएआर डोमेन और एम्फीफिलिक हेलिक्स), झिल्ली27,34 की लिपिड संरचना (जैसे, पीएस और पीआईपी 2), पीएच, आयनिक शक्ति और पर्यावरण का तापमान35,36 , साथ ही जटिल गठन के लिए प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (जैसे, सीएचएमपी 2 बी और सीएचएमपी 2 ए ईएससीआरटी-III-उत्प्रेरित झिल्ली रीमॉडेलिंग प्रक्रियाओं में अलग-अलग योगदान दे सकते हैं) 37,38। गतिशील अध्ययन नैनोबार-एसएलबी प्रणाली का उपयोग करके झिल्ली बाइंडिंग काइनेटिक11, झिल्ली प्रोटीन प्रसार या असेंबली39, साथ ही एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाओं 40 या चरण पृथक्करण 13,41,42 की जांच करने के लिए भी आयोजित किया जा सकता है। इसके अलावा, कृत्रिम लिपिड बाइलेयर को आमतौर पर प्रत्येक लिपिड मोनोलेयर के साथ सममित माना जाता है जिसमें एक ही लिपिड संरचना होती है, जो जीवित कोशिका झिल्ली43 से काफी अलग है। प्लाज्मा झिल्ली की बेहतर नकल करने के लिए एक विषमता बाइलेयर को प्रेरित करना सतह की सामग्री, बफर स्थिति, लिपिड संरचना, या तापमान44,45,46,47 को बदलकर प्राप्त किया जा सकता है। यह सत्यापित करना बहुत महत्वपूर्ण है कि घुमावदार झिल्ली पर प्रोटीन व्यवहार का अध्ययन करने के लिए नैनोबार-एसएलबी प्रणाली पर एक असममित बाइलेयर बनाया जा सकता है, जो आगे के अध्ययन के योग्य है।

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Disclosures

लेखक इस काम में कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित घोषित नहीं करते हैं।

Acknowledgments

हम नैनोस्ट्रक्चर फैब्रिकेशन और एसईएम इमेजिंग का समर्थन करने के लिए नानयांग टेक्नोलॉजिकल यूनिवर्सिटी (एनटीयू) में नानयांग नैनोफैब्रिकेशन सेंटर (एन 2 एफसी) और सेंटर फॉर डिसरप्टिव फोटोनिक टेक्नोलॉजीज (सीडीपीटी), प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए स्कूल ऑफ बायोलॉजिकल साइंसेज एनटीयू में प्रोटीन प्रोडक्शन प्लेटफॉर्म (पीपीपी) और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के लिए स्कूल ऑफ केमिकल एंड बायोमेडिकल इंजीनियरिंग एनटीयू को धन्यवाद देते हैं। इस काम को सिंगापुर शिक्षा मंत्रालय (एमओई) (डब्ल्यू झाओ, आरजी 112/20, आरजी 95/21, और एमओई-टी 2ईपी 30220-0009), इंस्टीट्यूट फॉर डिजिटल मॉलिक्यूलर एनालिटिक्स एंड साइंस (आईडीएमएक्सएस) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है, जो रिसर्च सेंटर ऑफ एक्सीलेंस स्कीम (डब्ल्यू झाओ), ह्यूमन फ्रंटियर साइंस प्रोग्राम फाउंडेशन (डब्ल्यू झाओ, आरजीवाई0088/2021) के तहत एमओई फंडिंग द्वारा समर्थित है। अनुसंधान छात्रवृत्ति के लिए स्कूल ऑफ केमिकल एंड बायोमेडिकल इंजीनियरिंग एनटीयू (एक्स मियाओ), और अनुसंधान छात्रवृत्ति के लिए चीन छात्रवृत्ति परिषद (जे वू)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anhydrous Ethanol Sigma-Aldrich 100983
Aluminum foil Diamond RN0879999FU
Amber Vial Sigma-Aldrich 27115-U
Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) Avanti Polar Lipids, Inc. 840032
10 mL Beaker Schott-Duran SCOT211060804
50 mL Beaker Schott-Duran SCOT211061706
1000 mL Beaker Schott-Duran SCOT211065408 The second container 
Chloroform Sigma-Aldrich V800117
Cotton buds Watsons
18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) Avanti Polar Lipids, Inc. 790404
Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) Avanti Polar Lipids, Inc. 840051
F-BAR Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
F-BAR+IDR Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
GFP Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
GFP-His Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
GraphPad Prism GraphPad V9.0.0
Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS) Thermo Scientific H325-500
IDR from human FBP17 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
ImageJ National Institutes of Health 1.50d
Laser Scanning Confocal Microscopy Zeiss  LSM 800 with Airyscan 100x (N.A.1.4) oil objective.
Methanol Fisher scientific 10010240
Mini-extuder  Avanti Polar Lipids, Inc. 610000-1EA
1.5 mL Microtubes Greiner 616201
MATLAB Mathworks R2018b
Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μm Whatman 800309
Phosphate Bufferen Saline (PBS) Life Technologies Holdings Pte Ltd. 70013
Polydimethylsiloxane (PDMS) Base Dow Corning Corporation SYLGARD 184
Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker Dow Corning Corporation SYLGARD 184
Plasma Cleaner HARRICK PLASMA PDC-002-HP
Quartz Nanochip Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD
Sodium Hydroxide  Sigma-Aldrich 795429
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 258105
Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt Life Technologies Holdings Pte Ltd. T1395MP
Tweezer Gooi PDC-002-HP
Ultrasonic Cleaners Elma D-78224
Voterx Scientific Industries G560E
Vacuum Desiccator NUCERITE 5312
Water Bath Julabo TW8

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बायोकैमिस्ट्री अंक 189 नैनोबार सरणी झिल्ली वक्रता वक्रता संवेदन प्रोटीन समर्थित लिपिड बाइलेयर इन विट्रो परख
<em>विट्रो</em> में मेम्ब्रेन वक्रता संवेदन प्रोटीन के अध्ययन के लिए एक नैनोबार-समर्थित लिपिड बाइलेयर सिस्टम
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Miao, X., Wu, J., Zhao, W. A… More

Miao, X., Wu, J., Zhao, W. A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro. J. Vis. Exp. (189), e64340, doi:10.3791/64340 (2022).

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