Summary
Здесь разработана липидная бислойная система с поддержкой нанобара, чтобы обеспечить синтетическую мембрану с определенной кривизной, которая позволяет характеризовать белки с способностью зондировать кривизну in vitro.
Abstract
Кривизна мембраны играет важную роль в различных важных процессах клеток, таких как миграция клеток, деление клеток и перемещение пузырьков. Он не только пассивно генерируется клеточной активностью, но и активно регулирует белковые взаимодействия и участвует во многих внутриклеточных передачах сигналов. Таким образом, большое значение имеет изучение роли кривизны мембран в регулировании распределения и динамики белков и липидов. В последнее время было разработано множество методик для изучения взаимосвязи между изогнутой мембраной и белком in vitro. По сравнению с традиционными методами, недавно разработанный липидный бислой с поддержкой нанобара (SLB) обеспечивает как высокую пропускную способность, так и лучшую точность в генерации кривизны мембраны путем формирования непрерывного липидного бислоя на узорчатых массивах нанобаров с заранее определенной кривизной мембраны и локальным плоским контролем. Как липидная текучесть, так и чувствительность белка к изогнутым мембранам могут быть количественно охарактеризованы с помощью флуоресцентной микроскопии. Здесь представлена подробная процедура формирования SLB на изготовленных стеклянных поверхностях, содержащих нанобарные массивы, и характеристика чувствительных к кривизне белков на таких SLB. Кроме того, рассматриваются протоколы повторного использования наночипов и обработки изображений. Помимо нанобара-SLB, этот протокол легко применим ко всем типам наноструктурированных стеклянных чипов для исследований с измерением кривизны.
Introduction
Кривизна мембраны является критическим физическим параметром клетки, который происходит в различных клеточных процессах, таких как морфогенез, деление клеток и миграция клеток1. В настоящее время широко признано, что кривизна мембраны выходит за рамки простого результата клеточных событий; вместо этого он стал эффективным регулятором белковых взаимодействий и внутриклеточной сигнализации. Например, было обнаружено, что несколько белков, участвующих в клатрин-опосредованном эндоцитозе, предпочтительно связываются с изогнутой мембраной, что приводит к образованию горячей точки для эндоцитоза2. Существует много различных причин деформации мембраны, таких как притяжение мембраны цитоскелетными силами, наличие асимметрии липидов с различными по размеру головными группами, существование трансмембранных белков с конической формой, накопление мембранообразующих белков, таких как белки BAR-домена (названные в честь белков Bin, amphiphysin и Rvs), и вставка домена амфипатических спиралей в мембрану1 . Интересно, что эти белки и липиды не только деформируют мембрану, но также могут ощущать искривление мембраны и проявлять предпочтительное накопление1. Поэтому крайне важно изучить, изменяют ли мембраны с различными кривизнами распределение и динамику белков и липидов, прикрепленных к ним, и потенциальное воздействие на связанные внутриклеточные процессы.
Многие методы были разработаны для анализа взаимодействия между изогнутой мембраной и белками как в живых клетках, так и в системах in vitro. Система живых клеток обеспечивает реальную клеточную среду с богатым липидным разнообразием и динамической регуляцией передачи сигналов белка 2,3,4,5,6,7. Однако такую сложную систему трудно изучать из-за неопределенностей и флуктуаций во внутриклеточной среде. Следовательно, анализы in vitro с использованием искусственной мембраны, состоящей из известных видов липидов и очищенных белков, стали мощными системами восстановления для характеристики отношений между белками и изогнутыми мембранами. Традиционно липосомы различного диаметра генерируются экструзией для обнаружения чувствительных к кривизне белков либо с помощью анализа совместного осаждения с использованием центробежной силы, либо анализа совместной флотации с градиентом плотности, чтобы избежать агрегации белка 8,9. Однако кривизна экструдированных липосом ограничена доступным размером пор мембранного фильтра, используемого в экструдере10. Было доказано, что анализ искривления одной липосомы (SLiC) преодолевает это ограничение, в котором липосомы с различным диаметром мечутся флуоресценцией и иммобилизуются на поверхность, так что кривизна может быть отмечена флуоресцентной интенсивностью11. Однако сильная изменчивость липидного состава наблюдалась в небольших везикулах, что влияет на точность измерения кривизны12. Эксперименты по вытягиванию троса обеспечивают более точное измерение кривизны на переходном тросе, вытягиваемом из гигантских одноламеллярных везикул (GUV) с использованием оптического пинцета, где кривизна может хорошо контролироваться напряжением мембраны, генерируемым13,14. Этот метод подходит для изучения белков, чувствительных к положительной или отрицательной кривизне, но ограничен пропускной способностью трубчатой генерации10. Анализ поддерживаемых мембранных трубок (SMrT) обеспечивает одновременную генерацию нескольких мембранных трубок, которые выдавливаются из одного и того же липидного резервуара микрофлюидными потоками. Тем не менее, кривизна мембраны изменяется внутренне вдоль нанотрубки, что ставит под угрозу точность измерения кривизны на основе интенсивности флуоресценции15,16. Для сравнения, использование небольших одноламеллярных везикул (внедорожников, диаметром <100 нм17) для формирования поддерживаемого липидного бислоя (SLB) на поверхностях, содержащих разработанные топографии, генерировало одну двухслойную мембрану с кривизнами, предопределенными нанопроизводством или наноматериалами с высокой точностью 18,19,20.
Здесь мы представляем протокол формирования SLB на изготовленных поверхностях наночипов с нанобарными массивами и то, как его можно использовать для исследования чувствительности к кривизне белков in vitro. Как показано на рисунке 1, существует шесть основных компонентов анализа: А) Очистка и сборка чипа с микрофлюидной камерой; Б) Подготовка внедорожников с определенным липидным составом; В) Образование SLB на наночипе и связывание с кривизной чувствительных белков; D) Визуализация и характеристика чувствительных к SLB и кривизне белков при флуоресцентной микроскопии; Д) Очистка чипа для повторного использования; F) Обработка изображений для количественного анализа способности восприятия кривизны белка. Подробный протокол описан шаг за шагом ниже.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Очистка наночипа
- Поместите наночип в стакан объемом 10 мл с узорчатой стороной вверх.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот кварцевый наночип был изготовлен с помощью электронно-лучевой литографии, как описано выше21. Геометрия и расположение наноструктуры на чипе могут быть разработаны по индивидуальному заказу. Размеры градиентных нанобаров, используемых здесь, составляют 2000 нм в длину, 600 нм в высоту и от 100 до 1000 нм в ширину (шаг 100 нм). - Осторожно добавьте 1 мл 98% серной кислоты в стакан и убедитесь, что кислота полностью покрывает переднюю и заднюю стороны чипа.
ПРИМЕЧАНИЕ: 98% серная кислота чрезвычайно коррозионна и может вызвать быстрое разрушение тканей и серьезные химические ожоги при контакте с кожей или глазами. Используйте его в вытяжном шкафу с надлежащей защитой. - Медленно вращайте стакан и добавляйте 200 мкл 30% перекиси водорода капля за каплей, пока весь стакан не станет горячим. Убедитесь, что серная кислота и перекись водорода хорошо перемешаны с образованием раствора пираньи для удаления органических молекул из наночипа17. Существуют альтернативные методы генерации SLB на чистых гидрофильных поверхностях, такие как воздействие ультрафиолетового света и озона, как описано ранее23.
ПРИМЕЧАНИЕ: Реакция чрезвычайно экзотермическая и может привести к кипению раствора, поэтому добавляйте перекись водорода в серную кислоту по каплям и продолжайте вращаться. - Поместите стакан во вторичный стеклянный контейнер и держите наночип погруженным в раствор пираньи на ночь, чтобы тщательно очистить примеси.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите стакан в вытяжной капюшон без какой-либо крышки на случай, если реакция может привести к образованию газа. - Выньте стакан и аккуратно выложите раствор пираньи в контейнер для кислотных отходов.
- Загрузите 5 мл деионизированной воды в стакан, чтобы разбавить остаточную кислоту и выбросить ее в кислотные отходы. Повторите этот шаг пять раз и используйте 5 M NaOH для нейтрализации кислотных отходов.
- Возьмите чип пинцетом и промойте непрерывным потоком деионизированной воды, чтобы тщательно удалить остаточную кислоту. Высушите чип феном с 99,9% газообразным азотом для формирования SLB22.
2. Генерация малых одноламеллярных везикул (внедорожников)
- Добавьте 100 мкл хлороформа во флакон янтаря.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хлороформ представляет собой очень летучую, бесцветную жидкость, и он может быть токсичным при вдыхании или проглатывании. Используйте его в вытяжном капюшоне с маской и перчатками. - Растворить 500 мкг липидной смеси в хлороформе. Состав используемой здесь липидной смеси составляет 89,5 моль% яичных фосфатидилхолинов (ПК), 10 моль% фосфатидилсерина мозга (PS) и 0,5 моль% техасского красного 1,2-дигексадеканоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина, соли триэтиламмония (Texas Red DHPE).
- Высушите липидную смесь во флаконе с 99,9% газообразным азотом до тех пор, пока хлороформ не испарится и липидная смесь не высохнет.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен в вытяжном шкафу. Избегайте разбрызгивания жидкости при сушке феном. - Поместите липидную смесь, присутствующую в янтарном флаконе без крышки, в вакуумный осушитель, покрытый алюминиевой фольгой. Затем вакуумно высушите образец с помощью насоса в течение 3 ч, чтобы полностью испарить хлороформ.
- Добавьте 250 мкл буферного фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) во флакон. Вращайте раствор до однородности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер PBS состоит из 150 мМ NaCl, без кальция, магния и фенолов красного цвета; pH регулируется до 7,2 для того, чтобы сделать PC и PS липидными двухслойными. - Хранить липидную смесь в течение 30 мин на частоте 50 кГц в ванне соникаторе. Затем переложите липидную смесь в центрифужную трубку объемом 1,5 мл и запечатайте парапленкой.
- Заморозить липидную смесь в жидком азоте на 20 с, а затем разморозить при 42 °C в течение 2 мин на водяной бане. Повторите циклы замораживания-оттаивания 30 раз. После этого липидная смесь выглядит как прозрачная жидкость.
ВНИМАНИЕ: Жидкий азот имеет температуру кипения около −195,8 °C. Это может вызвать обморожение или криогенные ожоги. Используйте его в неограниченном пространстве с теплоизоляционными перчатками. - Промыть два стеклянных газонепроницаемых шприца и соединитель мини-экструдера с этанолом, хлороформом и метанолом соответственно. Повторите последовательность промывки пять раз, чтобы предварительно очистить устройство. Оставьте их в вытяжном шкафу до тех пор, пока органический растворитель полностью не испарится.
- Соберите мини-экструдер и пропустите 500 мкл буфера PBS через разъем, чтобы предварительно намочить устройство, а затем выбросьте буфер из другого шприца. Этот этап удаляет примеси и облегчает экструзию.
- Соберите мини-экструдер с поликарбонатной фильтрующей мембраной размером 100 нм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Размер пор фильтрующей мембраны определяет диаметр липосом. - Возьмите 500 мкл буфера PBS с одним из шприцев и осторожно протолкните его через фильтр, чтобы заполнить второй пустой шприц на другом конце. Повторите экструзию вперед и назад три раза, чтобы проверить утечку аппарата и выбросить буфер из второго шприца.
- Пропустите липидную смесь через мини-экструдер для замены буфера PBS. Затем выдавливайте вперед и назад 20 раз, чтобы сформировать внедорожники. Многоламеллярный характер везикул может сохраняться при недостаточном количестве времени экструзии, что повлияет на образование SLB23.
- Соберите внедорожники со второго шприца, чтобы уменьшить загрязнение более крупными частицами, и перенесите его в трубку центрифуги объемом 1,5 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Извлеките шприц прямо из разъема на случай, если шприц сломается. - Оберните трубку алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить отбеливание флуоресцентных липидов, и храните их при 4 °C. Обычно внедорожники могут храниться до 7 дней.
3. Формирование SLB на наночипе
- Осторожно извлеките очищенный наночип из деионизированной воды с помощью пинцета и высушите феном с 99,9% газообразного азота.
- Выполняют очистку поверхности наночипа воздушно-плазменной обработкой в течение 1 ч.
- Соберите наночип в полидиметилсилоксановую (PDMS) камеру, которая состоит из двух частей PDMS - средней PDMS и верхней PDMS (рисунок 1A). Средняя PDMS тонкая (~ 0,5 мм) с большим овальным отверстием в центре, чтобы обеспечить достаточную экспозицию нанобарного рисунка. Верхняя PDMS имеет толщину (~ 4,0 мм) с двумя небольшими отверстиями в большом овальном отверстии в качестве входного отверстия и выхода для обработки жидкости.
- Поместите чип на чистую поверхность с рисунком вверх.
- Аккуратно накройте среднюю PDMS чипом и убедитесь, что весь рисунок подвергается воздействию центральной области большого отверстия овальной формы в середине PDMS.
- Закройте верхнюю PDMS средней PDMS и держите два ее небольших отверстия в области большого овального отверстия средней PDMS. Затем собирается камера PDMS.
ПРИМЕЧАНИЕ: PDMS является наиболее широко используемым органическим полимером на основе кремния. Он является биосовместимым, прозрачным, а также деформируемым, чтобы быть разработанным как индивидуальная форма для сборки чипа и визуализации под микроскопом. Что еще более важно, он может быть ковалентно прикреплен к другому слою PDMS или стеклу плотно после плазменной обработки, что делает его подходящим в качестве камеры для подготовки SLB. Этот шаг гарантирует, что каждый слой PDMS плотно прилегает, чтобы избежать зазоров и утечек.
- Загрузите внедорожники в камеру PDMS из одного из двух небольших отверстий в верхней части PDMS с пипеткой и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре, чтобы сформировать SLB.
- Аккуратно нанесите буфер PBS в камеру PDMS с одной стороны небольшого отверстия и удалите отходы ватной палочкой из другого отверстия, чтобы смыть несвязанные внедорожники. Затем приобретите SLB, сформированный на наночипе (качество SLB проверяется флуоресцентным восстановлением после фотоотбеливания (FRAP), как показано на этапе 4.4 и обсуждается в разделе репрезентативных результатов).
ПРИМЕЧАНИЕ: При пипетке буфера PBS в камеру наконечник пипетки должен быть заполнен буфером и контактировать с поверхностью жидкости, чтобы избежать нагнетания каких-либо пузырьков.
4. Визуализация SLB и связывание белка, чувствительного к кривизне на наночипе
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел будет зависеть от системы микроскопа, доступной для эксперимента. Здесь будет описано общее руководство по выполнению визуализации. Подробные настройки могут быть изменены между различными настройками микроскопа.
- Настройте лазерную сканирующую конфокальную микроскопию с использованием 100-кратного (N.A.1.4) масляного объектива. Откройте программное обеспечение ZEN, чтобы выбрать мощность лазера возбуждения, которая может возбуждать флуоресценцию липидов и белков. Выберите режим получения > Smart Setup > Texas Red DHPE / EGFP.
- Отрегулируйте фокусировку с помощью ручки фокусировки, чтобы найти нанобары на чипе до тех пор, пока края нанобара не станут острыми под липидным каналом.
- Задайте параметры сканирования, как показано ниже, чтобы получить контрольное изображение липидного канала перед добавлением белка: Размер кадра = 512 px x 512 px (512 пикселей x 512 пикселей, размер пикселя 124 нм), Бит на пиксель = 16 (16-битная глубина), Скорость сканирования = 5 и Усреднение = 4 (режим усреднения четыре раза на строку).
- Проведите анализ FRAP путем отбеливания флуоресцентно меченого липидного бислоя на случайной области нанобара.
- Установите флажки Области эксперимента и Отбеливание . Нарисуйте круглую область диаметром 5 мкм, которая может включать в себя весь нанобар в центре (размер нанобара составляет 2 мкм) и добавьте к областям эксперимента. Введите параметры покадровой съемки в следующем примере: выберите Скорость сканирования = 9 и Усреднение = 1. Выберите Временной ряд > Длительность = 100 циклов и Интервал = 2 с. Введите параметры отбеливания в следующем примере: установите флажок Начать после # изображений и выберите три изображения.
- Установите флажки лазера, которые выполняют FRAP, и измените мощность на 100,0%.. Нажмите кнопку Начать эксперимент для эксперимента FRAP.
ПРИМЕЧАНИЕ: FRAP является распространенным методом характеристики подвижности клеточных молекул. Если SLB имеет хорошую текучесть, флуоресценция в обесцвеченной области будет постепенно восстанавливаться, поскольку обесцвеченные флуорофоры диффундируют, а неотбеленные флуорофоры из других областей диффундируют.
- Загрузите белковый раствор в камеру PDMS и инкубируйте в течение 5 минут при комнатной температуре, чтобы обеспечить связывание белка на SLB.
ПРИМЕЧАНИЕ: Белки, используемые на рисунке 2G,H для демонстрации липидного состава, облегчающего связывание белков на нанобар-изогнутых SLOB, составляют 74 мкМ GFP и 79 мкМ GFP-His. Эти два белка являются зелеными флуоресцентными белками без или с His-tag. Белки, используемые для исследования чувствительности кривизны на рисунках 4 и 5, составляют 16 мкМ F-BAR, 16 мкМ IDRFBP17 и 16 мкМ FBAR+IDRFBP17. Эти три белка являются доменами из FBP17, который является типичным белком BAR, который интуитивно предполагается как генераторы кривизны и датчики. Каждый объем белка составляет 20 мкл. - Перефокусируйте нанобары и повторите шаг 4.3, чтобы получить изображения как липидных, так и белковых каналов для обнаружения искривления белка.
- Повторите шаг 4.4 для проведения анализа FRAP как на липидном, так и на белковом каналах и выполните покадровую визуализацию для характеристики подвижности белка, чувствительного к кривизне.
5. Повторное использование наночипа
- Возьмите наночип пинцетом и аккуратно отсоедините его от камеры PDMS в стакане объемом 50 мл, заполненном деионизированной водой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это критический шаг. Предотвратите прикосновение пинцета к наноструктуре и не заставляйте чип отделяться, чтобы избежать трещин. - Тщательно вымойте наночип безводным этанолом, чтобы удалить органические остатки, прикрепленные к поверхности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте чистую папиросную бумагу для удаления воды с поверхности перед мытьем безводным этанолом.
ВНИМАНИЕ: Безводный этанол является высоколетучим и слегка опасным химическим веществом. Избегайте контакта с кожей и глазами. Используйте его в вытяжном капюшоне с маской и перчатками. - Тщательно вымойте чип большим количеством деионизированной воды, чтобы удалить остаточный этанол. Затем высушите чип феном с 99,9% газообразным азотом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно удалить все следы этанола на чипе, прежде чем переходить к следующему этапу, потому что кислота пираньи может бурно реагировать с органическим растворителем и может вызвать взрывы. - Поместите чип в чистый стакан объемом 10 мл лицом вверх и очистите чип раствором пираньи для повторного использования, которое следует тем же шагам, что и «очистка наночипа».
6. Количественная оценка изображения
- Поверните изображения, полученные микроскопом, так, чтобы массив нанобаров находился в вертикальном положении для последующего анализа в программном обеспечении Fiji.
- Используйте специально написанный код MATLAB «c_pillarmask_averaging», чтобы найти отдельный нанобар с помощью квадратной маски (51 пиксель x 51 пиксель) как в липидном, так и в белковом канале.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот код MATLAB специально разработан для наночипа. Его можно получить на GitHub по ссылке: https://github.com/wtzhaolab/GNB_SLB_MX. - Вычтите фоновые сигналы каждого изображения с тремя ROI (5 пикселей x 5 пикселей) по углам изображения с помощью функции сетки в коде MATLAB 'BarGra_avg'. Эта операция направлена на исправление потенциальных неравномерных фоновых шумов, вызванных установкой микроскопа или выравниванием чипа на ступени микроскопа.
- Генерируйте средние изображения нанобаров одинакового размера, используя код MATLAB «BarGra_avg», где каждая точка является средним значением значений в этой точке во всех отдельных нанобарных квадратных масках. Генерируйте 3D-графики поверхности средних изображений в программном обеспечении Фиджи, чтобы интуитивно показать среднее распределение сигнала вокруг нанобаров. Выберите «Анализировать > поверхностной графике > Input 100 для множителя полигонов» и установите флажки «Тень», «Ось рисования» и «Сглаживание».
- Сегментируйте каждый нанобар на три области, которые включают в себя две области нанобара и одну область нанобарного центра, чтобы извлечь их интенсивность флуоресценции соответственно с помощью кода MATLAB «avg_nanobar_quantification». Размеры ROI нанобара корректируются в соответствии с размерами нанобаров с помощью файла «положение».
- Разделите интенсивность белка на интенсивность липидов, извлеченных из кода MATLAB «avg_nanobar_quantification» в области стержня, чтобы получить плотность нанобарного конца, которая исключает эффект площади поверхности.
- Нанесите на график плотность нанобарного конца с различными концентрациями в GraphPad Prism, чтобы получить кривую связывания. Откройте меню Анализ . Выберите Нелинейная регрессия (подгонка кривой) > Привязка - Насыщенность > Конкретная привязка с функцией наклона Хилла , чтобы соответствовать кривой уравнению Хилла, а затем вычислить значение коэффициента КД и Хилла.
- Интенсивность липидов и белков нормализуется до соответствующих им интенсивностей в центре нанобаров 600 нм, полученном на том же изображении с использованием кода MATLAB «avg_nanobar_quantification».
- Используйте самые яркие девять пикселей нормализованной интенсивности белка в области нанобара, деленной на область стержневого центра, для количественной оценки искривления белка с нанобарами того же размера, значение называется «отношением конца к центру». Используйте соотношение нормализованной интенсивности белка для нормализации интенсивности липидов для количественной оценки диапазона восприятия кривизны белка с нанобарами разного размера, значение называется «Нормализованная плотность нанобара»... Эти значения вычисляются кодом MATLAB 'avg_nanobar_quantification'.
- Загрузите образ стека FRAP в программное обеспечение Fiji. Выберите область FRAP и создайте рентабельность инвестиций. Выберите функцию More > Multi measure для измерения интенсивности области FRAP за каждый раз. Настройте интенсивность в GraphPad Prism для создания кривой восстановления FRAP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Конструкция Nanobar рекомендуется для зондирования белков с положительным измерением кривизны, которая содержит полукруг на каждом конце с кривизной, определяемой шириной нанобара, и один плоский / нулевой контроль кривизны локально в центре (рисунок 2A, B). Успешное формирование SLB на нанобарах приводит к равномерно распределенным липидным маркерным сигналам по всей поверхности нанобара, как показано на рисунке 2C. Сигналы от нескольких нанобаров могут быть объединены путем усреднения отдельных изображений нанобара (рисунок 2D), так что случайные вариации между различными нанобарами могут быть сведены к минимуму. Более раннее исследование электронной микроскопии показало, что клеточная плазматическая мембрана образует конформное покрытие вокруг всех наноструктур24. Поэтому считается, что синтетический липидный бислой плотно прикрепляется и к поверхности наноструктуры, что дает дифракционно-ограниченные линии на нанобаре 200 нм, как показано на рисунке 4E. Кроме того, текучесть мембраны на нанобарно-изогнутом SLB также может быть охарактеризована анализом FRAP, где флуоресцентный сигнал на одном нанобаре может быть отбелен индивидуально для характеристики текучести мембраны (рисунок 2E, F).
Формирование SLB на нанобарах требует генерации внедорожников аналогично формированию SLB на плоских поверхностях, как сообщалось ранее17. Липидный состав внедорожников определяет химический состав поверхности нанобарно-изогнутого SLB, который может быть изменен для мембранной маркировки и различных механизмов связывания белка. Например, Texas Red DHPE может быть добавлен в ~ 0,5 моль% в внедорожниках, так что обогащение площади поверхности мембраны на нанобарах может быть легко визуализировано с помощью флуоресцентной микроскопии (рисунок 2C). Помимо визуализации, липидный состав также может быть изменен, чтобы облегчить связывание белка на нанобарно-изогнутых SLP. Например, чтобы облегчить закрепление помеченных His белков, никель-нитрилотриацетовая кислота (Ni-NTA) может быть приведена в SLB на нанобарах путем включения 1,2-диолеоил-sn-glycero-3-[(N-(5-амино-1-карбоксипентил) иминодиуксусной кислоты) сукцинила] (никелевая соль) (18:1 DGS-NTA(Ni)) в внедорожники (~1 моль%)25. Без этой функциональной группы на липидах белок зеленой флуоресценции (GFP) не может связываться с SLB с отрицательно заряженным PS, что приводит к более темному барообразному отверстию в каждом месте нанобара из-за объемного истощения сигналов GFP в растворе (рисунок 2G). Для сравнения, добавляя 1 моль% 18:1 DGS-NTA(Ni) в SLB, GFP с маркировкой His-tag может сильно закрепиться на мембране, чтобы четко следовать форме SLB, изогнутой нанобарами (рисунок 2H). Диффузия липидов не показала обнаруживаемой разницы при связывании белка, как это было исследовано с помощью анализа FRAP (дополнительный рисунок 1). Стоит отметить, что измерение FRAP основано только на интенсивности 0,5 моль% Texas Red DHPE в SLB, который может не представлять 1 моль% DGS-NTA(Ni), используемый для связывания белка His-tag. Кроме того, заряженные липиды, такие как PS, могут усиливать связывание белка посредством электростатического взаимодействия26, в то время как сигнальные липиды, такие как фосфатидилинозитол (4,5)-бисфосфат (PIP2), также могут быть интегрированы в внедорожники для облегчения специфического связывания белка (например, FCHo2, для которого PIP2 считается необходимым для измерения кривизны мембраны27).
Качество образования SLB с точки зрения однородности поверхности и текучести мембраны имеет решающее значение для зондирования способности зондировать кривизну белка на нанобарах. Есть три типичные проблемы, которые могут поставить под угрозу однородность и текучесть SLB. Одним из них является связывание избыточных внедорожников на SLB из-за неэффективной промывки, которая генерирует пункту как на нанобарах, так и на плоской мембране между нанобарами (рисунок 3A, B). Это значительно влияет на количественную оценку связывания белка на изогнутых или плоских поверхностях на нанобарах для оценки чувствительности кривизны. Другой проблемой является неожиданное введение пузырьков воздуха внутрь камеры PDMS во время этапа промывки, которые могут разрушить SLB по траектории воздушно-жидкостного интерфейса и оставить царапиноподобные черты, легко идентифицируемые с чрезвычайно низкими липидными сигналами на поверхности нанобара (рисунок 3C, D). Кроме того, неправильно очищенные нанобарные подложки оставляют на поверхности случайно распределенные химические остатки, которые предотвращают адсорбцию липидов для образования SLB. Это приводит к образованию дефектов мембраны, которые могут быть или не быть выше оптического разрешения для визуализации микроскопии (рисунок 3E). Однако на текучесть мембраны будет чувствительно влиять образование мембранных дефектов28, так что анализ FRAP может быть использован для проверки чистоты поверхности (фиг.3F,G).
Чтобы продемонстрировать характеристику белка, чувствительного к кривизне, с использованием массива нанобаров, типичный домен F-BAR сравнивают с недавно идентифицированной внутренне неупорядоченной областью в FBP17 (IDRFBP17). F-BAR флуоресцентно маркируется красителями тетрафторфенилового эфира Alexa Fluor 488, в то время как IDRFBP17 маркируется Alexa Fluor 647 C2 Maleimide. Как показано на рисунке 4A, оба белковых домена демонстрируют повышенное накопление на отдельных нанобарах с SLB-покрытием шириной 300 нм. Здесь SLB содержит 10% PS для электростатического усиления связывания с белками. Способность белка к восприятию кривизны может быть идентифицирована по предпочтительному обогащению на изогнутом нанобаре, заканчивающемся с более высокой интенсивностью флуоресценции, чем сигналы в плоских нанобарных центрах, что более очевидно показано после усреднения изображения из более чем 100 нанобаров (рисунок 4B). Способность зондировать кривизну может быть количественно отражена путем расчета отношения конца к центру на каждом нанобаре (т. Е. Интенсивность флуоресценции на конце нанобара по сравнению с нанобарным центром). Как показано на рисунке 4C, оба белка имеют более высокое отношение конца к центру, чем липиды, которое составляет около 1. При сравнении IDRFBP17 и F-BAR можно увидеть, что более высокое отношение конца к центру IDRFBP17 (1,385 ± 0,011, среднее ± SEM) указывает на более сильное измерение кривизны, чем F-BAR (1,144 ± 0,004, среднее ± SEM).
Чтобы исследовать диапазон кривизн, которые могут быть ощущаемы белками, SLB генерируется на нанобарных массивах с шириной градиента от 200 нм до 600 нм (рисунок 4D), где липиды показали однородное покрытие на нанобарах разного размера (рисунок 4E). Три белка (IDRFBP17, F-BAR и F-BAR+IDRFBP17) инкубируются на градиентной нанобарной решетке, и все они показали преимущественное накопление на нанобарных изогнутых мембранных участках, когда кривизна уменьшилась ниже 400 нм в диаметре (рисунок 4E, F). Среди этих трех белковых доменов IDRFBP17 дает самую высокую плотность нанобарного конца, что указывает на его самую сильную способность зондировать кривизну, в то время как F-BAR показывает самое низкое значение (рисунок 4F). Кроме того, кривая связывания белка, чувствительного к кривизне, также может быть построена путем постепенного увеличения концентрации белка (рисунок 4G), что показывает, что IDRFBP17 обладает сильной кооперативной способностью к восприятию кривизны. При подгонке кривых связывания к уравнению Хилла KD обнаруживается в диапазоне мкМ (0,6 ± 0,1 мкМ), а коэффициент Хилла (H) составляет от 2 до 3, что предполагает сверхчувствительное связывание IDRFBP17 с кривизнами мембраны, индуцированными нанобаром. Чем острее кривизна, тем выше связующая способность при равновесии.
Динамическая мембранная диффузия и мембранная ассоциация белков, чувствительных к кривизне, вокруг нанобарообразных участков SLB также могут быть изучены FRAP. По сравнению с быстрым восстановлением липидных сигналов на нанобарах (рисунок 5A,E), F-BAR не мог восстановиться в течение 2 мин (рисунок 5B,E), что свидетельствует о его значительном снижении подвижности мембраны и ассоциативной динамики на изогнутых участках мембраны. Удивительно, но в отличие от поведения F-BAR, сигнал IDRFBP17 показал очевидное восстановление в течение того же периода времени (рисунок 5C,E), что указывает на динамический характер IDRFBP17, накопленный на изогнутых мембранах. Однако после смывания несвязанного IDRFBP17 в растворе такое же восстановление в канале IDRFBP17 не наблюдалось, как раньше (рисунок 5D,E). Это указывает на то, что в восстановлении преобладает обмен с раствородержащими молекуламиIDR FBP17 и в меньшей степени боковой диффузией мембранно-связанных молекул.
В целом, эти результаты демонстрируют, что эта система nanobar-SLB является мощным инструментом для характеристики белков in vitro, чувствительных к кривизне мембраны.
Рисунок 1: Иллюстрация системы nanobar-SLB. (A) Камера PDMS состоит из верхнего и среднего слоев с собранным на ней очищенным наночипом. (B) Texas Red DHPE маркировал внедорожники с увеличенными деталями. (C) Неповрежденная модель системы nanobar-SLB и области масштабирования иллюстрирует, что SLB образуется на нанобарах с однородным одним слоем липидного бислоя. (D) Процесс визуализации и определения характеристик с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. (E) Очистка наночипа для дальнейшего повторного использования. (F) Обработка изображений для количественной оценки искривления белка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Формирование изогнутого SLB на нанобарах с связыванием с белками. (A) SEM изображение отдельного нанобара. (B) Схематическое изображение системы нанобар-SLB. (C) Флуоресцентные изображения SLB, помеченные Texas Red DHPE на наночипе. (D) Среднее изображение распределения SLB на нанобарах (вверху) и 3D-график поверхности среднего изображения (внизу). Эта цифра была изменена по сравнению с Su et al.22 и воспроизведена с разрешения. (E) Покадровое изображение SLB FRAP на нанобаре. Область отбеливания обозначена желтым пунктирным кругом. F) Нормализованный график интенсивности нанобара путем измерения FRAP. (G) Схематическое изображение GFP не может связываться с SLB с 10 моль% отрицательно заряженным PS (слева) и соответствующим репрезентативным изображением справа. (H) Схематическое изображение His-метки GFP, привязанной к SLB с 1 моль% DGS-NTA(Ni) (слева) и соответствующим репрезентативным изображением справа. Шкала: 2 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Типичные проблемы, которые ставят под угрозу качество SLB. (A) Схема приготовления SLB без эффективной промывки. (B) Репрезентативное изображение привязки SLB с избыточными внедорожниками. Желтые стрелки показывают пункту, которые являются избыточными внедорожниками на поверхности SLB. (C) Схема приготовления SLB с впрыском пузырьков воздуха. D) репрезентативное изображение SLB, разрушенного траекторией границы раздела воздух-жидкость. Желтая стрелка показывает неполный SLB на подложке. (E) Схема приготовления SLB с неочищенными нанобарными подложками. Область увеличения показывает прерывистый липидный бислой из-за поверхностных остатков, препятствующих адсорбции липидов. (F) Покадровая визуализация анализа SLB FRAP на неочищенных нанобарных подложках. Область отбеливания обозначена желтым пунктирным кругом. (G) Нормализованный график интенсивности нанобара путем измерения FRAP. Шкала: 2 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Определение характеристик кривизны белка системой nanobar-SLB. (A) Флуоресцентные изображения F-BAR (слева) и IDRFBP17 (справа) накапливаются на нанобарах с SLB-покрытием (10% PS и 90% PC). Шкала: 2 мкм. (B) Средние изображения F-BAR (слева сверху) и IDRFBP17 (слева внизу) накапливаются на нанобарах и соответствующих 3D-участках поверхности (справа сверху и справа внизу соответственно). Шкала: 2 мкм. (C) Отношение конца к центру липидного бислоя, F-BAR и IDRFBP17 интенсивность флуоресценции около нанобара шириной 300 нм. T-тест Уэлча был выполнен для статистического анализа. p < 0,0001. (n = 3) (D) SEM изображение градиентных нанобарных массивов шириной от 200 нм до 600 нм. Шкала: 5 мкм. (E) Аннотация белковой конструкции (вверху), средние изображения липидного бислоя, распределения IDRFBP17, F-BAR и F-BAR+IDRFBP17 на градиентных нанобарах шириной от 200 нм до 600 нм (середина) и профили интенсивности вдоль нанобаров каждого среднего изображения (внизу). Шкала: 2 мкм. (F) IDRFBP17, F-BAR и F-BAR+IDRFBP17 нормализованная плотность нанобарного конца, количественная с различной шириной нанобаров соответственно. Каждый данный показан как среднее ± SEM (n ≥ 60). G) Кривая связывания РДЭFBP17 , снабженная уравнением Хилла. Каждый данный показан как среднее ± SEM (n = 3). Эта цифра была изменена по сравнению с Su et al.22 и воспроизведена с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Мембраносвязывающая динамика чувствительных к кривизне белков вокруг нанобара. (А-Д) Покадровая визуализация липидного бислоя (A), F-BAR (B), IDRFBP17 (C) и IDRFBP17 вымыла (D) анализ FRAP на нанобаре. Область отбеливания обозначена красным пунктирным кругом. Шкала стержней: 5 мкм. (E) Нормализованный график интенсивности нанобара путем измерения FRAP. Эта цифра была изменена по сравнению с Su et al.22 и воспроизведена с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Мембранная диффузия до и после добавления белка. (A) Покадровая визуализация теста FRAP на липидном бислое POPC с 1 моль% 18:1 DGS-NTA(Ni) и 0,5 моль% Texas Red DHPE вокруг нанобара до (сверху) и после (снизу) добавления белка GFP-His. Область отбеливания обозначена желтым пунктирным кругом. (B) Нормализованный график интенсивности нанобара путем измерения FRAP. Шкала: 2 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Система nanobar-SLB, описанная здесь, предлагает уникальное сочетание преимуществ в нескольких существующих анализах in vitro. Он эффективно выявляет предпочтительное связывание белков с сильно изогнутыми мембранами в качестве анализа липосомной флоатации или седиментации, но требует гораздо меньше образцов и предлагает более точно определенную кривизну на отдельных нанобарах 8,29. Он также предлагает широкий диапазон точно контролируемой кривизны для одновременного сравнения в качестве анализа SLiC, с меньшим беспокойством об изменении липидного состава в различных кривизнах и неопределяемых морфологических или кривичных изменениях с размерами ниже дифракционного предела света, поскольку SLB является мобильным и непрерывно охватывает все размеры нанобаров плотно30 . Nanobar-SLB также позволяет наблюдать динамическое поведение белка на изогнутой мембране в качестве анализов, тянущих за трос, но не ограничивается пропускной способностью генерации трубок и опытом в оптических манипуляциях с улавливанием13. Хотя анализ SMrT генерирует мембранные трубки с высокой пропускной способностью, кривизна мембраны изменяется вдоль нанотрубки, что затрудняет изучение чувствительности к кривизне белков16. Что еще более интересно, по сравнению с другими системами на основе SLB на узорчатой подложке 18,19,20,27, nanobar-SLB обеспечивает плоский стержневой центр рядом с определенной кривизной на конце стержня, что эффективно служит локальным контролем нулевой кривизны для минимизации влияния вариаций поверхностной плотности на количественный анализ. Возможность настройки комбинаций кривизны с использованием электронно-лучевой литографии с высоким разрешением может генерировать не только локальные элементы контроля нулевой кривизны, но и положительные и отрицательные кривизны, как было продемонстрировано ранее в исследованиях живых клеток2.
Существуют потенциальные ограничения, которые стоит отметить при использовании этого метода. Во-первых, нанопроизводство на чипе является относительно сложной процедурой, с необходимыми помещениями для чистых помещений и специализированным оборудованием (в частности, пишущим электронным лучом). Эта высокая стоимость заставила нас повторно использовать чип; это приводит к увеличению времени, затрачиваемого на очистку поверхности чипа и сборку чипа с помощью PDMS по сравнению с одноразовым использованием. Доступность наночипа является еще одним типом ограничения. Неправильная работа при использовании чипа, например, обращенная к поверхности в сторону стенда, может привести к истощению наноструктуры, особенно для структур с высоким соотношением сторон. Более того, липидный бислой, образующийся на подложке, представляет собой сплошную мембрану; напряжение может легко распространяться повсюду. Для исследований, требующих манипуляций с натяжением мембраны, такие методы, как трос, вытянутый из ГУВ через прикрепленную систему микропипеток, обеспечивают более удобные решения10.
Для получения оптимальных результатов следующие шаги также имеют решающее значение. i) Размер везикул имеет решающее значение для образования SLB31,32. Предыдущая литература показывает более высокую склонность к слиянию для везикул меньшего размера (< 90 нм) по сравнению с большим размером с использованием кварцевого кристаллического микровеса с диссипацией (QCM-D) тест32. Таким образом, по сравнению с LUV 300 нм, диаметры ~50 нм будут легче для формирования SLB. Учитывая этот вопрос, для формирования однородных внедорожников для формирования SLB необходимо не менее 20 раз как на этапах замораживания-оттаивания, так и на стадии экструзии. Тест FRAP также необходим в каждом эксперименте для проверки подвижности мембраны. ii) Во время подготовки внедорожника все оборудование должно содержаться в чистоте во избежание загрязнения пылевидными мелкими частицами. Специально для мини-экструдера иглы легко забиваются в грязной среде. iii) Для получения внедорожников хорошего качества хлороформ в липидной смеси необходимо полностью удалить, с тем чтобы избежать разрушения липидных пузырьков. (iv) Плазменная очистка чипа должна проводиться сразу перед образованием SLB, чтобы обеспечить высокогидрофильную поверхность для эффективной поломки внедорожника с образованием непрерывного бислоя. Длительное воздействие в окружающую среду после плазменной обработки может вызвать неспецифическое связывание частиц пыли или органических остатков с поверхностью чипа, что ставит под угрозу гидрофильность поверхности. (v) Для сборки камеры PDMS для образования SLB и инкубации белка важна чистота и плоскостность каждого куска PDMS для обеспечения хорошей герметизации текучего канала. Любая утечка камеры может привести к высыханию SLB или изменению концентрации белка. (vi) Регулировка фокусировки изображения имеет решающее значение для обеспечения последовательного измерения интенсивности, поскольку высота нанобара (600 нм) сопоставима с фокусной глубиной лазерной сканирующей конфокальной микроскопии по осиz 33. Фокус следует перенастраивать каждый раз, когда массив перемещается по горизонтали, чтобы сохранить резкость краев нанобара на изображениях.
Прежде всего, система nanobar-SLB, представленная здесь, обеспечивает мощный метод изучения белков, чувствительных к кривизне мембраны. Различные параметры, влияющие на взаимодействие белка с изогнутой мембраной, могут быть количественно изучены в диапазоне кривизнак, таких как чувствительные к кривизне домены (например, домен BAR и амфифильная спираль) белка 8,30, липидный состав (например, PS и PIP2) мембраны27,34, pH, ионная сила и температура окружающей среды35,36 , а также белково-белковое взаимодействие для образования комплекса (например, CHMP2B и CHMP2A могут по-разному способствовать процессам ремоделирования мембран, катализируемых ESCRT-III)37,38. Динамические исследования также могут быть проведены с использованием системы nanobar-SLB для зондирования мембранного связывания кинетика11, мембранной диффузии белка или сборки39, а также ферментативных реакций40 или разделения фаз 13,41,42. Кроме того, искусственный липидный бислой обычно считается симметричным с каждым липидным монослоем, содержащим один и тот же липидный состав, который сильно отличается от живой клеточной мембраны43. Индуцирование асимметрии бислоя для лучшей имитации плазматической мембраны может быть получено путем изменения материала поверхности, буферного состояния, липидного состава или температуры 44,45,46,47. Очень важно проверить, может ли быть сформирован асимметричный бислой в системе nanobar-SLB для изучения поведения белка на изогнутой мембране, что заслуживает дальнейших исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующей финансовой заинтересованности в этой работе.
Acknowledgments
Мы благодарим Наньянский нанофабрикационный центр (N2FC) и Центр прорывных фотонных технологий (CDPT) в Наньянском технологическом университете (NTU) за поддержку изготовления наноструктур и визуализации SEM, Платформу производства белка (PPP) в Школе биологических наук NTU для очистки белка и Школу химической и биомедицинской инженерии NTU за конфокальный микроскоп. Эта работа финансируется Министерством образования Сингапура (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 и MOE-T2EP30220-0009), Институтом цифровой молекулярной аналитики и науки (IDMxS), поддерживаемым финансированием MOE по схеме Исследовательских центров передового опыта (W. Zhao), Фондом Human Frontier Science Program (W. Zhao, RGY0088/2021), Грантом NTU Start-up Grant (W. Zhao), Школа химической и биомедицинской инженерии NTU для исследовательской стипендии (X. Miao) и China Scholarship Council для исследовательской стипендии (J. Wu).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anhydrous Ethanol | Sigma-Aldrich | 100983 | |
| Aluminum foil | Diamond | RN0879999FU | |
| Amber Vial | Sigma-Aldrich | 27115-U | |
| Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 840032 | |
| 10 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211060804 | |
| 50 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211061706 | |
| 1000 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211065408 | The second container |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | V800117 | |
| Cotton buds | Watsons | ||
| 18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 790404 | |
| Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 840051 | |
| F-BAR | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| F-BAR+IDR | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GFP | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GFP-His | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GraphPad Prism | GraphPad | V9.0.0 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS) | Thermo Scientific | H325-500 | |
| IDR from human FBP17 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.50d | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss | LSM 800 with Airyscan | 100x (N.A.1.4) oil objective. |
| Methanol | Fisher scientific | 10010240 | |
| Mini-extuder | Avanti Polar Lipids, Inc. | 610000-1EA | |
| 1.5 mL Microtubes | Greiner | 616201 | |
| MATLAB | Mathworks | R2018b | |
| Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μm | Whatman | 800309 | |
| Phosphate Bufferen Saline (PBS) | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | 70013 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Base | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| Plasma Cleaner | HARRICK PLASMA | PDC-002-HP | |
| Quartz Nanochip | Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | |
| Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | T1395MP | |
| Tweezer | Gooi | PDC-002-HP | |
| Ultrasonic Cleaners | Elma | D-78224 | |
| Voterx | Scientific Industries | G560E | |
| Vacuum Desiccator | NUCERITE | 5312 | |
| Water Bath | Julabo | TW8 |
References
- McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).
- Zhao, W. et al. Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells. Nature Nanotechnology. 12 (8), 750-756 (2017).
- Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).
- Rosholm, K. R. et al. Membrane curvature regulates ligand-specific membrane sorting of GPCRs in living cells. Nature Chemical Biology. 13 (7), 724-729 (2017).
- Lou, H. Y. et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).
- Cail, R. C., Shirazinejad, C. R., Drubin, D. G. Induced nanoscale membrane curvature bypasses the essential endocytic function of clathrin. Journal of Cell Biology. 221 (7), e202109013 (2022).
- Mu, H. et al. Patterning of oncogenic ras clustering in live cells using vertically aligned nanostructure arrays. Nano Letter. 22 (3), 1007-1016 (2022).
- Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science. 303 (5657), 495-499 (2004).
- Bigay, J., Casella, J. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).
- Ebrahimkutty, M. P., Galic, M. Receptor-free signaling at curved cellular membranes. Bioessays. 41 (10), e1900068 (2019).
- Bhatia, V. K. et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. The EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
- Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of inhomogeneity in the lipid composition of individual nanoscale liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
- Prevost, C. et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nature Communications. 6, 8529 (2015).
- Simunovic, M. et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), 11226-11231 (2016).
- Holkar, S. S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Spatial control of epsin-induced clathrin assembly by membrane curvature. Journal of Biological Chemistry. 290 (23), 14267-14276 (2015).
- Dar, S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Use of the supported membrane tube assay system for real-time analysis of membrane fission reactions. Nature Protocols. 12 (2), 390-400 (2017).
- Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using patterned supported lipid membranes to investigate the role of receptor organization in intercellular signaling. Nature Protocols. 6 (4), 523-539 (2011).
- Lee, I. H., Kai, H., Carlson, L. A., Groves, J. T., Hurley, J. H. Negative membrane curvature catalyzes nucleation of endosomal sorting complex required for transport (ESCRT)-III assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (52), 15892-15897 (2015).
- Beber, A. et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).
- Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
- Li, X. et al. A nanostructure platform for live-cell manipulation of membrane curvature. Nature Protocols. 14 (6), 1772-1802 (2019).
- Su, M. et al. Comparative study of curvature sensing mediated by F-BAR and an intrinsically disordered region of FBP17. iScience. 23 (11), 101712 (2020).
- Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et Biophysica Acta. 858 (1), 161-168 (1986).
- Santoro, F. et al. Revealing the cell-material interface with nanometer resolution by focused ion beam/scanning electron microscopy. ACS Nano. 11 (8), 8320-8328 (2017).
- Platt, V. et al. Influence of multivalent nitrilotriacetic acid lipid-ligand affinity on the circulation half-life in mice of a liposome-attached His6-protein. Bioconjugate Chemistry. 21 (5), 892-902 (2010).
- Williams, D., Vicogne, J., Zaitseva, I., McLaughlin, S., Pessin, J. E. Evidence that electrostatic interactions between vesicle-associated membrane protein 2 and acidic phospholipids may modulate the fusion of transport vesicles with the plasma membrane. Molecular Biology of the Cell. 20 (23), 4910-4919 (2009).
- El Alaoui, F. et al. Structural organization and dynamics of FCHo2 docking on membranes. Elife. 11, e73156 (2022).
- Seu, K. J. et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).
- Hung, Y. F. et al. Amino terminal region of dengue virus NS4A cytosolic domain binds to highly curved liposomes. Viruses. 7 (7), 4119-4130 (2015).
- Hatzakis, N. S. et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
- Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).
- Jing, Y., Trefna, H., Persson, M., Kasemo, B., Svedhem, S. Formation of supported lipid bilayers on silica: relation to lipid phase transition temperature and liposome size. Soft Matter. 10 (1), 187-195 (2014).
- Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
- Itoh, T. et al. Dynamin and the actin cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane invagination by BAR and F-BAR proteins. Developmental Cell. 9 (6), 791-804 (2005).
- Florentsen, C. D. et al. Annexin A4 trimers are recruited by high membrane curvatures in giant plasma membrane vesicles. Soft Matter. 17 (2), 308-318 (2021).
- Sarkar, Y., Majumder, R., Das, S., Ray, A., Parui, P. P. Detection of curvature-radius-dependent interfacial pH/polarity for amphiphilic self-assemblies: positive versus negative curvature. Langmuir. 34 (21), 6271-6284 (2018).
- Raiborg, C., Stenmark, H. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature. 458 (7237), 445-452 (2009).
- Alqabandi, M. et al. The ESCRT-III isoforms CHMP2A and CHMP2B display different effects on membranes upon polymerization. BMC Biology. 19 (1), 66 (2021).
- Leitenberger, S. M., Reister-Gottfried, E., Seifert, U. Curvature coupling dependence of membrane protein diffusion coefficients. Langmuir. 24 (4), 1254-1261 (2008).
- Bozelli, J. C., Jr. et al. Membrane curvature allosterically regulates the phosphatidylinositol cycle, controlling its rate and acyl-chain composition of its lipid intermediates. Journal of Biological Chemistry. 293 (46), 17780-17791 (2018).
- Parthasarathy, R., Yu, C. H., Groves, J. T. Curvature-modulated phase separation in lipid bilayer membranes. Langmuir. 22 (11), 5095-5099 (2006).
- Yuan, F. et al. Membrane bending by protein phase separation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (11), e2017435118 (2021).
- London, E. Membrane structure-function insights from asymmetric lipid vesicles. Accounts of Chemical Research. 52 (8), 2382-2391 (2019).
- Rossetti, F. F., Textor, M., Reviakine, I. Asymmetric distribution of phosphatidyl serine in supported phospholipid bilayers on titanium dioxide. Langmuir. 22 (8), 3467-3473 (2006).
- Richter, R. P., Maury, N., Brisson, A. R. On the effect of the solid support on the interleaflet distribution of lipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 21 (1), 299-304 (2005).
- Wacklin, H. P., Thomas, R. K. Spontaneous formation of asymmetric lipid bilayers by adsorption of vesicles. Langmuir. 23 (14), 7644-7651 (2007).
- Lin, W. C., Blanchette, C. D., Ratto, T. V., Longo, M. L. Lipid asymmetry in DLPC/DSPC-supported lipid bilayers: a combined AFM and fluorescence microscopy study. Biophysical Journal. 90 (1), 228-237 (2006).
