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Biochemistry

Un sistema de bicapa lipídica soportado por nanobar para el estudio de proteínas de detección de curvatura de membrana in vitro

Published: November 30, 2022 doi: 10.3791/64340
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,3
1School of Chemistry, Chemical Engineering, and Biotechnology, Nanyang Technological University, 2State Key Laboratory Breeding Base of Green Chemistry Synthesis Technology, College of Chemical Engineering, Zhejiang University of Technology, 3Institute for Digital Molecular Analytics and Science, Nanyang Technological University
* These authors contributed equally

Summary

Aquí, se desarrolla un sistema de bicapa lipídica soportado por nanobarras para proporcionar una membrana sintética con una curvatura definida que permite la caracterización de proteínas con capacidad de detección de curvatura in vitro.

Abstract

La curvatura de la membrana juega un papel importante en varios procesos esenciales de las células, como la migración celular, la división celular y el tráfico de vesículas. No solo es generado pasivamente por actividades celulares, sino que también regula activamente las interacciones de proteínas y está involucrado en muchas señales intracelulares. Por lo tanto, es de gran valor examinar el papel de la curvatura de la membrana en la regulación de la distribución y dinámica de proteínas y lípidos. Recientemente, se han desarrollado muchas técnicas para estudiar la relación entre la membrana curva y la proteína in vitro. En comparación con las técnicas tradicionales, la bicapa lipídica (SLB) soportada por nanobar, recientemente desarrollada, ofrece un alto rendimiento y una mejor precisión en la generación de curvatura de membrana al formar una bicapa lipídica continua en matrices de nanobarras con patrones con una curvatura de membrana predefinida y control plano local. Tanto la fluidez lipídica como la sensibilidad proteica a las membranas curvas se pueden caracterizar cuantitativamente utilizando imágenes de microscopía de fluorescencia. Aquí, se presenta un procedimiento detallado sobre cómo formar un SLB en superficies de vidrio fabricadas que contienen matrices de nanobarras y la caracterización de proteínas sensibles a la curvatura en dicho SLB. Además, se cubren los protocolos para la reutilización de nanochips y el procesamiento de imágenes. Más allá del nanobar-SLB, este protocolo es fácilmente aplicable a todos los tipos de chips de vidrio nanoestructurado para estudios de detección de curvatura.

Introduction

La curvatura de la membrana es un parámetro físico crítico de una célula que ocurre en una variedad de procesos celulares como la morfogénesis, la división celular y la migración celular1. Ahora se reconoce ampliamente que la curvatura de la membrana va más allá de un simple resultado de eventos celulares; En cambio, se ha convertido en un regulador eficaz de las interacciones de proteínas y la señalización intracelular. Por ejemplo, se encontró que varias proteínas involucradas en la endocitosis mediada por clatrina se unen preferentemente a la membrana curva, lo que resulta en la formación de un punto caliente para la endocitosis2. Hay muchas causas diferentes de deformación de la membrana, como el tirón de la membrana por las fuerzas citoesqueléticas, la presencia de asimetría lipídica con grupos de cabeza de diferentes tamaños, la existencia de proteínas transmembrana con forma cónica, la acumulación de proteínas formadoras de membrana como las proteínas de dominio BAR (llamadas así por las proteínas Bin, anfifisina y Rvs), y la inserción del dominio de las hélices anfipáticas en la membrana1 . Curiosamente, estas proteínas y lípidos no solo deforman la membrana, sino que también pueden sentir la curvatura de la membrana y exhibir acumulación preferencial1. Por lo tanto, es crucial estudiar si y cómo las membranas con diferentes curvaturas alteran la distribución y la dinámica de las proteínas y lípidos unidos a ellas y los posibles impactos en los procesos intracelulares relacionados.

Se han desarrollado muchas técnicas para analizar la interacción entre la membrana curva y las proteínas tanto en células vivas como en sistemas in vitro. El sistema de células vivas proporciona un entorno celular real con rica diversidad lipídica y regulación dinámica de señalización proteica 2,3,4,5,6,7. Sin embargo, un sistema tan sofisticado es difícil de estudiar debido a las incertidumbres y fluctuaciones en el entorno intracelular. Por lo tanto, los ensayos in vitro utilizando una membrana artificial compuesta de especies lipídicas conocidas y proteínas purificadas se han convertido en poderosos sistemas de reconstitución para caracterizar la relación entre proteínas y membranas curvas. Tradicionalmente, los liposomas de diferentes diámetros se generan por extrusión para detectar proteínas sensibles a la curvatura mediante un ensayo de cosedimentación utilizando fuerza centrífuga o un ensayo de coflotación con un gradiente de densidad para evitar la agregación de proteínas 8,9. Sin embargo, la curvatura de los liposomas extruidos está limitada por el tamaño de poro disponible del filtro de membrana utilizado en la extrusora10. Se ha demostrado que el ensayo de curvatura de liposoma único (SLiC) supera esta limitación, en el que los liposomas con diferentes diámetros son marcados con fluorescencia e inmovilizados sobre la superficie para que la curvatura pueda ser marcada por la intensidad fluorescente11. Sin embargo, se ha observado una fuerte variabilidad en la composición lipídica en vesículas pequeñas, lo que afecta la precisión de la medición de la curvatura12. Los experimentos de tracción de la correa proporcionan una medición más precisa de la curvatura en la correa transitoria extraída de vesículas unilamelares gigantes (GUV) utilizando una pinza óptica, donde la curvatura puede ser bien controlada por la tensión de membrana generada13,14. Este método es adecuado para estudiar proteínas de detección de curvatura positiva o negativa, pero está limitado por el rendimiento de la generación de tubos10. El ensayo de tubos de membrana soportados (SMrT) permite la generación simultánea de múltiples tubos de membrana que se extruyen del mismo depósito de lípidos mediante flujos microfluídicos. Sin embargo, la curvatura de la membrana varía intrínsecamente a lo largo del nanotubo, lo que compromete la precisión de la medición de la curvatura basada en la intensidad de fluorescencia15,16. En comparación, el uso de pequeñas vesículas unilamelares (SUVs, diámetro <100 nm17) para formar una bicapa lipídica soportada (SLB) en superficies que contienen topografías diseñadas generó una sola membrana bicapa con curvaturas predeterminadas por nanofabricación o nanomateriales en alta precisión18,19,20.

Aquí, presentamos un protocolo para la formación del SLB en superficies de nanochips fabricadas con matrices de nanobarras y cómo se puede usar para probar la sensibilidad a la curvatura de proteínas in vitro. Como se muestra en la Figura 1, hay seis componentes esenciales del ensayo: A) Limpieza y montaje del chip con una cámara microfluídica; B) Preparación de SUV con composición lipídica definida; C) Formación del SLB en un nanochip y unión con proteínas sensibles a la curvatura; D) Obtención de imágenes y caracterización de las proteínas sensibles a SLB y curvatura bajo microscopía de fluorescencia; E) Limpieza del chip para su reutilización; F) Procesamiento de imágenes para el análisis cuantitativo de la capacidad de detección de curvatura de proteínas. El protocolo detallado se describe paso a paso a continuación.

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Protocol

1. Limpieza del nanochip

  1. Coloque el nanochip en un vaso de precipitados de 10 ml con el lado estampado hacia arriba.
    NOTA: Este nanochip de cuarzo se ha fabricado mediante litografía de haz de electrones como se describió anteriormente21. La geometría y la disposición de la nanoestructura en el chip se pueden diseñar a medida. Los tamaños de las nanobarras de gradiente utilizadas aquí son 2000 nm de longitud, 600 nm de altura y 100 a 1000 nm de ancho (conjunto de pasos de 100 nm).
  2. Agregue cuidadosamente 1 ml de ácido sulfúrico al 98% al vaso de precipitados y asegúrese de que el ácido cubra completamente la parte frontal y posterior del chip.
    NOTA: El ácido sulfúrico al 98% es extremadamente corrosivo y puede causar una rápida destrucción de tejidos y quemaduras químicas graves al contacto con la piel o los ojos. Úselo en la campana extractora con la protección adecuada.
  3. Gire lentamente el vaso de precipitados y agregue 200 μL de peróxido de hidrógeno al 30% gota a gota hasta que todo el vaso de precipitados se caliente. Asegúrese de que el ácido sulfúrico y el peróxido de hidrógeno estén bien mezclados para formar una solución de piraña para la eliminación de moléculas orgánicas del nanochip17. Existen técnicas alternativas para generar el SLB en superficies hidrófilas limpias, como la luz UV y la exposición al ozono como se describió anteriormente23.
    NOTA: La reacción es extremadamente exotérmica y puede hacer que la solución hierva, así que agregue peróxido de hidrógeno al ácido sulfúrico gota a gota y siga girando.
  4. Coloque el vaso de precipitados en un recipiente de vidrio secundario y mantenga el nanochip sumergido en la solución de piraña durante la noche para limpiar las impurezas a fondo.
    NOTA: Coloque el vaso de precipitados en la campana extractora sin ninguna cubierta en caso de que la reacción pueda generar gas.
  5. Saque el vaso de precipitados y pipete cuidadosamente la solución de piraña en un recipiente de residuos ácidos.
  6. Cargue 5 ml de agua desionizada en el vaso de precipitados para diluir el ácido residual y desecharlo en los desechos ácidos. Repita este paso cinco veces y use 5 M NaOH para neutralizar los desechos ácidos.
  7. Agarre el chip con pinzas y lávelo con un chorro continuo de agua desionizada para eliminar completamente el ácido residual. Seque el chip con 99,9% de gas nitrógeno para la formación de SLB22.

2. Generación de pequeñas vesículas unilamelares (SUVs)

  1. Añadir 100 μL de cloroformo en un vial de color ámbar.
    NOTA: El cloroformo es un líquido altamente volátil e incoloro, y puede ser tóxico si se inhala o ingiere. Úselo en la campana extractora con la máscara y los guantes puestos.
  2. Disolver 500 μg de la mezcla lipídica en cloroformo. La composición de la mezcla de lípidos utilizada aquí es 89.5 mol% de fosfatidilcolinas de huevo (PC), 10 mol% de fosfatidilserina cerebral (PS) y 0.5 mol% de Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, sal de trietilamonio (Texas Red DHPE).
  3. Secar la mezcla lipídica en el vial con gas nitrógeno al 99,9% hasta que el cloroformo se volatilice y la mezcla lipídica esté seca.
    NOTA: Este paso debe realizarse en la campana extractora. Evite las salpicaduras de líquido al secarlo.
  4. Coloque la mezcla lipídica presente en el vial ámbar sin tapa en el desecador al vacío cubierto de papel de aluminio. Luego seque al vacío la muestra con una bomba durante 3 h para volatilicar completamente el cloroformo.
  5. Añadir 250 μL de tampón salino tamponado con fosfato (PBS) al vial. Vortex la solución hasta que sea homogénea.
    NOTA: El tampón PBS consiste en 150 mM de NaCl, sin calcio, magnesio y rojo fenol; el pH se ajusta a 7.2 para hacer la bicapa lipídica PC y PS.
  6. Sonicar la mezcla lipídica durante 30 minutos a una frecuencia de 50 kHz en un sonicador de baño. Luego transfiera la mezcla lipídica a un tubo de centrífuga de 1,5 ml y selle con parafilm.
  7. Congelar la mezcla de lípidos en nitrógeno líquido durante 20 s y luego descongelar a 42 °C durante 2 minutos en un baño maría. Repita los ciclos de congelación-descongelación 30 veces. Después de eso, la mezcla de lípidos parece un líquido claro.
    PRECAUCIÓN: El nitrógeno líquido tiene un punto de ebullición de aproximadamente -195.8 ° C. Puede causar congelación o quemaduras criogénicas. Úselo en el espacio no confinado con guantes de aislamiento térmico.
  8. Enjuague dos jeringas herméticas al gas de vidrio y el conector de la miniextrusora con etanol, cloroformo y metanol, respectivamente. Repita la secuencia de enjuague cinco veces para limpiar previamente el aparato. Déjelos en la campana extractora hasta que el disolvente orgánico esté completamente volatilizado.
  9. Ensamble el aparato miniextrusor y pase 500 μL de tampón PBS a través del conector para humedecer previamente el aparato, luego deseche el tampón de otra jeringa. Este paso elimina las impurezas y facilita la extrusión.
  10. Ensamble el aparato de miniextrusora con una membrana filtrante de policarbonato del tamaño de un poro de 100 nm.
    NOTA: El tamaño de poro de la membrana del filtro determina el diámetro de los liposomas.
  11. Tome 500 μL de tampón PBS con una de las jeringas y empújelo suavemente a través del filtro para llenar la segunda jeringa vacía en el otro extremo. Repita la extrusión hacia adelante y hacia atrás tres veces para comprobar la fuga del aparato y deseche el tampón de la segunda jeringa.
  12. Pase la mezcla de lípidos a través de la mini extrusora para reemplazar el tampón PBS. Luego extruya hacia adelante y hacia atrás 20 veces para formar SUV. El carácter multilamelar de las vesículas puede ser retenido con un número insuficiente de tiempos de extrusión, lo que afectará la formación de SLB23.
  13. Recoja los SUV de la segunda jeringa para reducir la contaminación con partículas más grandes y transfiéralos a un tubo de centrífuga de 1,5 ml.
    NOTA: Extraiga la jeringa directamente del conector en caso de que la jeringa se rompa.
  14. Envuelva el tubo con papel de aluminio para evitar el blanqueamiento de los lípidos marcados con fluorescencia y guárdelos a 4 °C. Por lo general, los SUV se pueden almacenar hasta por 7 días.

3. Formación del SLB en un nanochip

  1. Saque el nanochip limpio del agua desionizada con cuidado con un par de pinzas y séquelo con gas nitrógeno al 99,9%.
  2. Realizar la limpieza superficial del nanochip con tratamiento de plasma de aire durante 1 h.
  3. Ensamble el nanochip en una cámara de polidimetilsiloxano (PDMS), que consta de dos piezas de PDMS: un PDMS medio y un PDMS superior (Figura 1A). El PDMS medio es delgado (~ 0.5 mm) con una gran abertura de forma ovalada en el centro para garantizar una exposición suficiente al patrón de nanobar. El PDMS superior es grueso (~ 4.0 mm) con dos pequeños orificios dentro de la gran abertura ovalada como entrada y salida para el manejo de líquidos.
    1. Coloque el chip sobre una superficie limpia con el patrón hacia arriba.
    2. Cubra suavemente el PDMS medio con el chip y asegúrese de que todo el patrón esté expuesto al área central de la gran abertura de forma ovalada en el PDMS medio.
    3. Cubra el PDMS superior con el PDMS medio y mantenga sus dos orificios pequeños dentro de la región del orificio ovalado grande del PDMS medio. Luego se ensambla la cámara PDMS.
      NOTA: PDMS es el polímero orgánico a base de silicio más utilizado. Es biocompatible, transparente y deformable para ser diseñado como una forma personalizada para el ensamblaje de chips y la obtención de imágenes bajo el microscopio. Más importante aún, se puede pegar covalentemente a otra capa de PDMS o vidrio firmemente después del tratamiento con plasma, lo que lo hace adecuado como cámara para preparar el SLB. Este paso garantiza que cada capa de PDMS esté bien ajustada para evitar huecos y fugas.
  4. Cargue los SUV en la cámara PDMS desde uno de los dos orificios pequeños en el PDMS superior con una pipeta e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente para formar el SLB.
  5. Pipetea suavemente el tampón PBS en la cámara PDMS desde un lado del orificio pequeño y retira los desechos con un bastoncillo de algodón del otro orificio para lavar los SUV no unidos. Luego adquiera el SLB formado en el nanochip (la calidad del SLB se prueba mediante la recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP) como se muestra en el paso 4.4 y se discute en la sección de resultados representativos).
    NOTA: Al pipetear el tampón PBS en la cámara, la punta de la pipeta debe estar llena del tampón y en contacto con la superficie del líquido para evitar inyectar burbujas.

4. Obtención de imágenes del SLB y de la unión a la proteína de detección de curvatura en el nanochip

NOTA: Esta sección dependerá del sistema de microscopio disponible para el experimento. Aquí, se describirá una guía general sobre cómo realizar las imágenes. Los ajustes detallados se pueden cambiar entre las diferentes configuraciones del microscopio.

  1. Configure la microscopía confocal de escaneo láser utilizando un objetivo de aceite 100x (N.A.1.4). Abra el software ZEN para seleccionar la potencia del láser de excitación que puede excitar la fluorescencia del lípido y la proteína. Elija el modo de adquisición > Configuración inteligente > Texas Red DHPE / EGFP.
  2. Ajuste el enfoque con la perilla de enfoque para ubicar las nanobarras en el chip hasta que los bordes de la nanobarra estén afilados debajo del canal lipídico.
  3. Establezca los parámetros de escaneo como se muestra a continuación para obtener una imagen de control del canal lipídico antes de agregar proteínas: Tamaño de fotograma = 512 px x 512 px (512 píxeles x 512 píxeles, un tamaño de píxel de 124 nm), Bits por píxel = 16 (profundidad de 16 bits), Velocidad de escaneo = 5 y Promedio = 4 (modo promedio de cuatro veces por línea).
  4. Realice el ensayo FRAP blanqueando la bicapa lipídica marcada con fluorescencia en un área aleatoria de nanobar.
    1. Seleccione las casillas de verificación Regiones de experimento y Blanqueo . Dibuje un área circular de 5 μm de diámetro que pueda incluir toda la nanobarra en el centro (el tamaño de la nanobarra es de 2 μm) y agregue a las regiones experimentales. Introduzca parámetros de imágenes de lapso de tiempo como el siguiente ejemplo: elija Velocidad de escaneo = 9 y Promedio = 1. Elija Serie temporal > Duración = 100 ciclos e Intervalo = 2 s. Introduzca parámetros de blanqueo como el siguiente ejemplo: seleccione la casilla de verificación Iniciar después de # imágenes y elija tres imágenes.
    2. Seleccione las casillas de verificación láser que realizan FRAP y cambie la potencia al 100,0%. Haga clic en Iniciar experimento para el experimento FRAP.
      NOTA: FRAP es un método común para caracterizar la movilidad de las moléculas celulares. Si el SLB tiene buena fluidez, la fluorescencia en el área blanqueada se recuperará gradualmente a medida que los fluoróforos blanqueados se difundan y los fluoróforos no blanqueados de otras áreas se difundan.
  5. Cargue la solución proteica en la cámara PDMS e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente para permitir la unión de la proteína en el SLB.
    NOTA: Las proteínas utilizadas en la Figura 2G,H para demostrar que la composición lipídica facilita la unión de proteínas en SLB curvadas con nanobarras son 74 μM GFP y 79 μM GFP-His. Estas dos proteínas son proteínas de fluorescencia verde sin o con His-tag. Las proteínas utilizadas para el estudio de detección de curvatura en la Figura 4 y la Figura 5 son 16 μM F-BAR, 16 μM IDR FBP17 y 16 μM FBAR+IDRFBP17. Estas tres proteínas son los dominios de FBP17, que es una proteína BAR típica que se asume intuitivamente como generadores y sensores de curvatura. Cada volumen de proteína es de 20 μL.
  6. Vuelva a enfocar las nanobarras y repita el paso 4.3 para tomar imágenes de los canales de lípidos y proteínas para la detección de la curvatura de proteínas.
  7. Repita el paso 4.4 para realizar el ensayo FRAP en los canales de lípidos y proteínas y realice imágenes de lapso de tiempo para caracterizar la movilidad de la proteína de detección de curvatura.

5. Reutilización del nanochip

  1. Agarre el nanochip con pinzas y sepáralo con cuidado de la cámara PDMS en un vaso de precipitados de 50 ml lleno de agua desionizada.
    NOTA: Este es un paso crítico. Evite que las pinzas toquen la nanoestructura y no fuerce el chip a separarse para evitar grietas.
  2. Lave bien el nanochip con etanol anhidro para eliminar los residuos orgánicos adheridos a la superficie.
    NOTA: Use papel de seda limpio para eliminar el agua de la superficie antes de lavar con etanol anhidro.
    PRECAUCIÓN: El etanol anhidro es un producto químico altamente volátil y ligeramente peligroso. Evite el contacto con la piel y los ojos. Úselo en la campana extractora con la máscara y los guantes puestos.
  3. Lave bien el chip con abundante agua desionizada para eliminar el etanol residual. Luego seque el chip con 99.9% de gas nitrógeno.
    NOTA: Es importante eliminar todos los restos de etanol en el chip antes de continuar con el siguiente paso porque el ácido piraña puede reaccionar violentamente con el disolvente orgánico y puede causar explosiones.
  4. Coloque el chip en un vaso de precipitados limpio de 10 ml con el lado del patrón hacia arriba y limpie el chip con una solución de piraña para su reutilización, que sigue los mismos pasos que la "limpieza del nanochip".

6. Cuantificación de imágenes

  1. Gire las imágenes adquiridas por un microscopio para que la matriz de nanobarras esté en posición vertical para su posterior análisis en el software Fiji.
  2. Utilice un código de MATLAB escrito a medida 'c_pillarmask_averaging' para localizar la nanobarra individual mediante una máscara cuadrada (51 píxeles x 51 píxeles) tanto en el canal lipídico como en el canal de proteínas.
    NOTA: Este código de MATLAB está especialmente diseñado para el nanochip. Se puede obtener en GitHub a través del enlace: https://github.com/wtzhaolab/GNB_SLB_MX.
  3. Resta las señales de fondo de cada imagen con los tres ROI (5 píxeles x 5 píxeles) en las esquinas de la imagen mediante la función meshgrid en el código de MATLAB 'BarGra_avg'. Esta operación tiene como objetivo corregir posibles ruidos de fondo desiguales causados por la configuración del microscopio o la nivelación de virutas en la etapa del microscopio.
  4. Genere las imágenes promedio de las nanobarras del mismo tamaño utilizando el código 'BarGra_avg' de MATLAB, donde cada punto es la media de los valores en ese punto en todas las máscaras cuadradas de nanobarras individuales. Genere gráficos de superficie 3D de las imágenes promedio en el software Fiji para mostrar la distribución promedio de la señal alrededor de las nanobarras de forma intuitiva. Elija Analizar > trazado de superficie > Entrada 100 para el multiplicador de polígonos y seleccione las casillas Sombreado, Eje de dibujo y Suavizar.
  5. Segmente cada nanobarra en tres áreas, que incluyen dos áreas de extremo de nanobarra y un área de centro de nanobarra para extraer sus intensidades de fluorescencia respectivamente mediante el código 'avg_nanobar_quantification' de MATLAB. Los tamaños de los ROI de las nanobarras se ajustan de acuerdo con la dimensión de las nanobarras utilizando el archivo de 'posición'.
  6. Divida las intensidades de las proteínas por las intensidades lipídicas extraídas del código 'avg_nanobar_quantification' de MATLAB en el área del extremo de la barra para obtener la densidad del extremo de la nanobarra que excluye el efecto del área superficial.
  7. Trazar la densidad del extremo de nanobarra con diferentes concentraciones en GraphPad Prism para obtener la curva de unión. Abra el menú Analizar . Elija Regresión no lineal (ajuste de curva) > Enlace - Saturación > Enlace específico con función de pendiente de pendiente para ajustar la curva con la ecuación de Hill y, a continuación, calcular el valor de KD y coeficiente de Hill.
  8. Las intensidades de lípidos y proteínas se normalizan a sus correspondientes intensidades en el centro de nanobares de 600 nm adquiridas en la misma imagen utilizando el código de MATLAB 'avg_nanobar_quantification'.
  9. Utilice los nueve píxeles más brillantes de intensidades de proteínas normalizadas en el área de extremo de nanobarra dividida por el área de centro de barra para cuantificar la detección de curvatura de proteínas con nanobarras del mismo tamaño, el valor se denomina "relación de extremo a centro". Utilice la proporción de intensidad de proteína normalizada para normalizar la intensidad de lípidos para cuantificar el rango de detección de curvatura de proteínas con nanobarras de diferentes tamaños, el valor se denomina "Densidad de extremo de nanobarra normalizada". Estos valores se calculan mediante el código de MATLAB 'avg_nanobar_quantification'.
  10. Cargue la imagen de pila FRAP en el software Fiji. Elija el área FRAP y genere un ROI. Elija la función Más > medida múltiple para medir la intensidad del área FRAP para cada vez. Trazar la intensidad en GraphPad Prism para generar la curva de recuperación FRAP.

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Representative Results

El diseño de nanobarras se recomienda para sondear proteínas de detección de curvatura positiva, que contiene un medio círculo en cada extremo con curvatura definida por el ancho de nanobarra y un control de curvatura plana / cero localmente en el centro (Figura 2A, B). La formación exitosa del SLB en nanobarras da como resultado señales de marcadores lipídicos distribuidos uniformemente en toda la superficie de la nanobarra, como se muestra en la Figura 2C. Las señales de múltiples nanobarras se pueden combinar promediando las imágenes individuales de nanobarras (Figura 2D) para que se puedan minimizar las variaciones aleatorias entre diferentes nanobarras. Un estudio anterior de microscopía electrónica mostró que la membrana plasmática celular formó un recubrimiento conforme alrededor de todas las nanoestructuras24. Por lo tanto, se cree que la bicapa lipídica sintética también se adhiere firmemente a la superficie de la nanoestructura, lo que da líneas limitadas por difracción en la nanobarra de 200 nm como se observa en la Figura 4E. Además, la fluidez de la membrana en el SLB curvado con nanobarras también se puede caracterizar mediante el ensayo FRAP, donde la señal fluorescente en una sola nanobarra se puede blanquear individualmente para la caracterización de la fluidez de la membrana (Figura 2E, F).

La formación del SLB en nanobarras requiere la generación de SUV de manera similar a la formación de SLB en superficies planas como se informó anteriormente17. La composición lipídica de los SUV determina la química de la superficie del SLB curvado con nanobarras que puede alterarse para el etiquetado de la membrana y diferentes mecanismos de unión a proteínas. Por ejemplo, Texas Red DHPE se puede agregar en ~0.5 mol% en SUV para que el enriquecimiento del área de superficie de la membrana en nanobarras se pueda visualizar fácilmente mediante microscopía de fluorescencia (Figura 2C). Además de la visualización, la composición lipídica también se puede cambiar para facilitar la unión de proteínas en SLB curvadas con nanobar. Por ejemplo, para facilitar el anclaje de las proteínas marcadas con His, el ácido níquel-nitrilotriacético (Ni-NTA) se puede llevar al SLB en las nanobarras incorporando ácido 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl) iminodiacético) succinyl] (sal de níquel) (18:1 DGS-NTA(Ni)) en SUVs (~1 mol%)25. Sin este grupo funcional en lípidos, la proteína de fluorescencia verde (GFP) no puede unirse a la SLB con PS cargado negativamente, lo que resulta en un agujero más oscuro en forma de barra en cada ubicación de nanobar debido al agotamiento volumétrico de las señales de GFP en la solución (Figura 2G). En comparación, al agregar 1 mol% 18: 1 DGS-NTA (Ni) en el SLB, la etiqueta His etiquetada GFP puede anclarse fuertemente en la membrana para seguir claramente la forma SLB curvada por nanobarras (Figura 2H). La difusión lipídica no mostró una diferencia detectable en la unión a proteínas según lo sondeado por el ensayo FRAP (Figura suplementaria 1). Vale la pena señalar que la medición de FRAP se basa solo en la intensidad del DHPE rojo de Texas al 0,5 mol% en el SLB, que puede no representar el 1 mol% DGS-NTA (Ni) utilizado para la unión de la proteína His-tag. Además, los lípidos cargados como el PS pueden mejorar la unión a proteínas a través de la interacción electrostática26, mientras que los lípidos de señalización como el fosfatidilinositol (4,5)-bisfosfato (PIP2) también pueden integrarse en SUV para facilitar la unión a proteínas específicas (por ejemplo, FCHo2, para el cual PIP2 se encuentra esencial para su detección de curvatura de membrana27).

La calidad de la formación de SLB en términos de uniformidad superficial y fluidez de membrana es crítica para sondear la capacidad de detección de curvatura de proteínas en nanobarras. Hay tres problemas típicos que pueden comprometer la uniformidad y fluidez de SLB. Una es la unión del exceso de SUV en el SLB debido a un lavado ineficiente que genera puntos tanto en las nanobarras como en la membrana plana entre las nanobarras (Figura 3A, B). Afecta significativamente la cuantificación de la unión de proteínas en superficies curvas o planas en nanobarras para la evaluación de detección de curvatura. Otro problema es la introducción inesperada de burbujas de aire dentro de la cámara PDMS durante el paso de lavado, que puede destruir el SLB a lo largo de la trayectoria de la interfaz aire-líquido y dejar características similares a arañazos fácilmente identificables con señales lipídicas extremadamente bajas en la superficie de la nanobarra (Figura 3C, D). Además, los sustratos de nanobarras mal limpiados dejan residuos químicos distribuidos aleatoriamente en la superficie que impiden la adsorción de lípidos para la formación de SLB. Conduce a la generación de defectos de membrana que pueden o no estar por encima de la resolución óptica para la visualización de microscopía (Figura 3E). Sin embargo, la fluidez de la membrana se verá afectada sensiblemente por la formación de defectos de la membrana28 , de modo que el ensayo FRAP se puede utilizar para verificar la limpieza de la superficie (Figura 3F, G).

Para demostrar la caracterización de la proteína de detección de curvatura utilizando una matriz de nanobar, el dominio F-BAR típico se compara con una región intrínsecamente desordenada recientemente identificada en FBP17 (IDRFBP17). F-BAR está marcado con fluorescencia con colorantes de éster tetrafluorofenil Alexa Fluor 488, mientras que IDRFBP17 está etiquetado con Alexa Fluor 647 C2 Maleimide. Como se muestra en la Figura 4A, ambos dominios proteicos muestran una mayor acumulación en nanobarras individuales recubiertas de SLB con un ancho de 300 nm. Aquí, el SLB contiene 10% de PS para mejorar electrostáticamente la unión a proteínas. La capacidad de detección de curvatura de la proteína se puede identificar por el enriquecimiento preferencial en los extremos curvos de nanobar con mayor intensidad fluorescente que las señales en los centros de nanobar planos, que se muestra más obviamente después de un promedio de imagen de más de 100 nanobares (Figura 4B). La capacidad de detección de curvatura se puede reflejar cuantitativamente calculando la relación de extremo a centro en cada nanobar (es decir, la intensidad de fluorescencia en el extremo de nanobar frente al centro de nanobar). Como se muestra en la Figura 4C, ambas proteínas tienen una relación de extremo a centro más alta que los lípidos, que es de alrededor de 1. Al comparar el IDR FBP17 y el F-BAR, se puede ver que la mayor relación de extremo a centro del IDRFBP17 (1,385 ±0,011, media ± SEM) indica una detección de curvatura más fuerte que la F-BAR (1,144 ± 0,004, media ± SEM).

Para examinar el rango de curvaturas que pueden ser detectadas por las proteínas, el SLB se genera en matrices de nanobarras con anchos de gradiente de 200 nm a 600 nm (Figura 4D) donde los lípidos mostraron un recubrimiento homogéneo en nanobarras de diferentes tamaños (Figura 4E). Tres proteínas (IDR FBP17, F-BAR y F-BAR + IDRFBP17) se incuban en la matriz de nanobarras de gradiente, y todas ellas mostraron acumulación preferencial en los sitios de membrana curvada del extremo nanobar-end cuando la curvatura disminuyó por debajo de 400 nm de diámetro (Figura 4E, F). Entre estos tres dominios proteicos, IDRFBP17 proporciona la mayor densidad de extremo nanobar, lo que indica su mayor capacidad de detección de curvatura, mientras que F-BAR muestra el valor más bajo (Figura 4F). Además, la curva de unión de la proteína de detección de curvatura también se puede trazar aumentando gradualmente la concentración de proteína (Figura 4G), lo que muestra que IDRFBP17 tiene una fuerte capacidad de detección de curvatura cooperativa. Al ajustar sus curvas de enlace a la ecuación de Hill, el KD se encuentra en el rango de μM (0,6 ± 0,1 μM) y el coeficiente de Hill (H) está entre 2 y 3, lo que sugiere una unión ultrasensible de IDRFBP17 a curvaturas de membrana inducidas por nanobar. Cuanto más aguda sea la curvatura, mayor será la capacidad de unión en equilibrio.

La difusión dinámica de la membrana y la asociación de membrana de las proteínas de detección de curvatura alrededor de los sitios SLB en forma de nanobarra también se pueden estudiar mediante FRAP. En comparación con la rápida recuperación de señales lipídicas en nanobares (Figura 5A, E), el F-BAR no pudo recuperarse en 2 minutos (Figura 5B, E), lo que sugiere una movilidad de membrana significativamente disminuida y la dinámica de asociación en los sitios de membrana curva. Sorprendentemente, a diferencia del comportamiento de la F-BAR, LA SEÑAL IDR FBP17 mostró una recuperación obvia dentro del mismo marco de tiempo (Figura 5C, E), lo que indica la naturaleza dinámica de IDRFBP17 acumulada en las membranas curvas. Sin embargo, después de lavar el IDR FBP17 no unido en la solución, no se pudo observar la misma recuperación en el canal IDRFBP17 como antes (Figura 5D, E). Indica que la recuperación está dominada por el intercambio con las moléculas IDRFBP17 que contienen solución y menos por la difusión lateral de las moléculas unidas a la membrana.

En general, estos resultados demuestran que este sistema nanobar-SLB es una herramienta poderosa para caracterizar proteínas sensibles a la curvatura de la membrana in vitro.

Figure 1
Figura 1: Ilustración del sistema nanobar-SLB . (A) La cámara PDMS consiste en las capas superior y media con el nanochip limpio ensamblado en ella. (B) El Texas Red DHPE etiquetó SUV con detalles ampliados. (C) El modelo intacto del sistema nanobar-SLB y el área de zoom ilustra que el SLB se forma en nanobarras con una sola capa uniforme de la bicapa lipídica. (D) Proceso de imagen y caracterización bajo microscopía confocal de barrido láser. (E) Limpieza del nanochip para su posterior reutilización. (F) Procesamiento de imágenes para la cuantificación de detección de curvatura de proteínas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: La formación del SLB curvo en nanobarras con unión a proteínas . (A) Imagen SEM de una nanobarra individual. (B) Representación esquemática del sistema nanobar-SLB. (C) Imágenes fluorescentes del SLB etiquetadas con Texas Red DHPE en el nanochip. (D) Imagen promedio de la distribución SLB en nanobarras (arriba) y un gráfico de superficie 3D de la imagen promedio (abajo). Esta figura ha sido modificada de Su et al.22 y reproducida con autorización. (E) Imágenes de lapso de tiempo del SLB FRAP en la nanobar. La región de blanqueamiento está indicada por un círculo discontinuo amarillo. (F) Diagrama de intensidad de nanobar normalizada por medición FRAP. (G) La representación esquemática de GFP no puede vincularse al SLB con 10 mol% de PS cargado negativo (izquierda) y una imagen representativa correspondiente a la derecha. (H) Representación esquemática de su etiqueta etiquetada GFP unida al SLB con 1 mol% DGS-NTA (Ni) (izquierda) y una imagen representativa correspondiente a la derecha. Barras de escala: 2 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Problemas típicos que comprometen la calidad de SLB . (A) Esquema de preparación de SLB sin lavado eficiente. (B) Imagen representativa del SLB vinculado con el exceso de SUV. Las flechas amarillas muestran los puntos que son el exceso de SUV en la superficie SLB. (C) Esquema de la preparación de SLB con burbujas de aire inyectadas. (D) Imagen representativa de SLB destruida por la trayectoria de la interfaz aire-líquido. La flecha amarilla muestra el SLB incompleto en el sustrato. (E) Esquema de la preparación de SLB con sustratos de nanobar sin limpiar. El área de zoom muestra una bicapa lipídica discontinua debido a que los residuos superficiales impiden la adsorción de lípidos. (F) Imágenes de lapso de tiempo del análisis SLB FRAP en sustratos de nanobar sin limpiar. La región de blanqueamiento está indicada por un círculo discontinuo amarillo. (G) Diagrama de intensidad de nanobar normalizada por medición FRAP. Barras de escala: 2 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Caracterización de detección de curvatura de proteínas mediante el sistema nanobar-SLB. (A) Las imágenes fluorescentes de F-BAR (izquierda) e IDRFBP17 (derecha) se acumulan en nanobarras recubiertas con SLB (10% PS y 90% PC). Barra de escala: 2 μm. (B) Las imágenes promedio de F-BAR (izquierda superior) e IDRFBP17 (izquierda abajo) se acumulan en nanobarras y gráficos de superficie 3D correspondientes (derecha superior y derecha inferior, respectivamente). Barra de escala: 2 μm. (C) Relación de extremo a centro de la bicapa lipídica, F-BAR e IDRFBP17 intensidad de fluorescencia alrededor de la nanobarra de 300 nm de ancho. Se realizó una prueba t de Welch para el análisis estadístico. p < 0,0001. (n = 3) (D) Imagen SEM de matrices de nanobarras de gradiente con anchos de 200 nm a 600 nm. Barra de escala: 5 μm. (E) Anotación de la construcción de proteínas (arriba), imágenes promedio de bicapa lipídica, distribución IDR FBP17, F-BAR y F-BAR + IDRFBP17 en nanobarras de gradiente con ancho que varía de 200 nm a 600 nm (medio) y perfiles de intensidad a lo largo de las nanobarras de cada imagen promedio (abajo). Barra de escala: 2 μm. (F) IDR FBP17, F-BAR y F-BAR + IDRFBP17 normalizada densidad de nanobar-end cuantificada con diferentes anchos de nanobarras respectivamente. Cada dato se muestra como la media ± SEM (n ≥ 60). (G) La curva de enlace de IDRFBP17 ajustada con la ecuación de Hill. Cada dato se muestra como la media ± SEM (n = 3). Esta figura ha sido modificada de Su et al.22 y reproducida con autorización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: La dinámica de unión a la membrana de las proteínas de detección de curvatura alrededor de la nanobar. (A-D) Imágenes de lapso de tiempo de la bicapa lipídica (A), F-BAR (B), IDR FBP17 (C) e IDRFBP17 lavado (D) Análisis FRAP en la nanobar. La región de blanqueamiento está indicada por un círculo discontinuo rojo. Barra de escala: 5 μm. (E) Diagrama de intensidad de nanobar normalizada por medición FRAP. Esta figura ha sido modificada de Su et al.22 y reproducida con autorización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Difusión de la membrana antes y después de añadir proteína. (A) Imágenes de lapso de tiempo de la prueba FRAP en la bicapa lipídica POPC con 1 mol% 18: 1 DGS-NTA (Ni) y 0.5 mol% de DHPE rojo de Texas alrededor de la nanobarra antes (arriba) y después (abajo) agregando proteína GFP-His. La región de blanqueamiento está indicada por un círculo discontinuo amarillo. (B) Diagrama de intensidad de nanobar normalizada por medición FRAP. Barras de escala: 2 μm. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

El sistema nanobar-SLB descrito aquí ofrece una combinación única de las ventajas en varios ensayos in vitro existentes. Revela eficientemente la unión preferencial de proteínas a membranas altamente curvadas como el ensayo de flotación o sedimentación de liposomas, pero requiere muchas menos muestras y ofrece una curvatura definida con mayor precisión en nanobarras individuales 8,29. También ofrece una amplia gama de curvatura controlada con precisión para la comparación simultánea como el ensayo SLiC, con menos preocupación por el cambio de composición lipídica en diferentes curvaturas y cambios morfológicos o de curvatura indetectables con tamaños por debajo del límite de difracción de la luz, ya que el SLB es móvil y cubre continuamente todos los tamaños de nanobarras herméticamente30 . Nanobar-SLB también permite la observación de comportamientos dinámicos de proteínas en la membrana curva como ensayos de tracción de ataduras, pero no limitado por el rendimiento de la generación de tubos y la experiencia en la manipulación de trampeo óptico13. Aunque el ensayo SMrT genera tubos de membrana en alto rendimiento, la curvatura de la membrana varía a lo largo del nanotubo, lo que dificulta el estudio de la sensibilidad a la curvatura de las proteínas16. Más interesante aún, en comparación con otros sistemas basados en SLB en el sustrato estampado18,19,20,27, el nanobar-SLB proporciona un centro de barra plano junto a la curvatura definida en el extremo de la barra, que sirve efectivamente como control local de curvatura cero para minimizar el impacto de las variaciones de densidad superficial en el análisis cuantitativo. La capacidad de personalizar combinaciones de curvatura utilizando litografía de haz de electrones de alta resolución puede generar no solo controles locales de curvatura cero, sino también curvaturas positivas y negativas, como se demostró anteriormente en estudios de células vivas2.

Existen limitaciones potenciales que vale la pena tener en cuenta al usar este método. En primer lugar, la nanofabricación en el chip es un procedimiento relativamente complejo, con instalaciones de sala limpia y equipos especializados necesarios (en particular, un escritor de vigas E). Este alto costo nos llevó a reutilizar el chip; esto da como resultado un mayor tiempo dedicado a limpiar la superficie del chip y ensamblar el chip con PDMS en comparación con un solo uso. La disponibilidad del nanochip es otro tipo de limitación. El funcionamiento incorrecto al usar el chip, como mirar la superficie hacia el banco, puede causar el desgaste de la nanoestructura, especialmente para las estructuras de alta relación de aspecto. Además, la bicapa lipídica formada en el sustrato es una membrana continua; La tensión puede propagarse fácilmente a todas partes. Para estudios que requieren manipulación de la tensión de la membrana, técnicas como la correa extraída de los GUV a través del sistema de micropipetas acoplado proporcionan soluciones más convenientes10.

Para obtener resultados óptimos, los siguientes pasos también son críticos. (i) El tamaño de las vesículas es crítico para la formación de SLB31,32. La literatura previa muestra una mayor propensión a la fusión para vesículas de menor tamaño (< 90 nm) en comparación con el tamaño más grande utilizando una microbalanza de cristal de cuarzo con prueba de disipación (QCM-D)32. Por lo tanto, en comparación con los LUV de 300 nm, los diámetros de ~ 50 nm serán más fáciles para la formación de SLB. Teniendo en cuenta este problema, se necesitan al menos 20 veces en los pasos de congelación-descongelación y extrusión para formar SUV homogéneos para la formación de SLB. La prueba FRAP también es necesaria en cada experimento para validar la movilidad de la membrana. (ii) Durante la preparación del SUV, todo el equipo debe mantenerse limpio para evitar la contaminación de pequeñas partículas similares al polvo. Especialmente para la mini-extrusora, las agujas se obstruyen fácilmente en un ambiente sucio. (iii) Para preparar SUV con buena calidad, el cloroformo en la mezcla de lípidos debe eliminarse completamente para evitar la destrucción de las vesículas lipídicas. (iv) La limpieza por plasma del chip debe realizarse recientemente antes de la formación de SLB para garantizar una superficie altamente hidrófila para que la rotura eficiente del SUV forme una bicapa continua. La exposición prolongada en el medio ambiente después del tratamiento con plasma puede causar una unión no específica de partículas de polvo o residuos orgánicos a la superficie del chip, comprometiendo la hidrofilicidad de la superficie. (v) Para ensamblar la cámara PDMS para la formación de SLB y la incubación de proteínas, la limpieza y planitud de cada pieza de PDMS son importantes para garantizar un buen sellado del canal fluídico. Cualquier fuga de la cámara puede hacer que el SLB se seque o cambie la concentración de proteína. (vi) El ajuste del enfoque de imagen es fundamental para garantizar una medición de intensidad consistente, ya que la altura de la nanobarra (600 nm) es comparable a la profundidad focal de la microscopía confocal de barrido láser en el eje z33. El enfoque debe reajustarse cada vez que la matriz se mueva horizontalmente para mantener la nitidez de los bordes de la nanobarra en las imágenes.

Por encima de todo, el sistema nanobar-SLB presentado aquí proporciona un método poderoso para estudiar las proteínas de detección de curvatura de membrana. Varios parámetros que afectan la interacción de proteínas con la membrana curva se pueden estudiar cuantitativamente a través de un rango de curvaturas, como dominios sensibles a la curvatura (por ejemplo, dominio BAR y hélice anfifílica) de la proteína8,30, composición lipídica (por ejemplo, PS y PIP2) de la membrana27,34, pH, fuerza iónica y temperatura del ambiente35,36 , así como la interacción proteína-proteína para la formación de complejos (por ejemplo, CHMP2B y CHMP2A podrían contribuir de manera diferente a los procesos de remodelación de membrana catalizados por ESCRT-III)37,38. También se pueden realizar estudios dinámicos utilizando el sistema nanobar-SLB para sondear la cinética de unión a la membrana 11, la difusión o ensamblaje de proteínas de membrana39, así como las reacciones enzimáticas 40 o el comportamiento de separaciónde fases 13,41,42. Además, la bicapa lipídica artificial generalmente se considera simétrica con cada monocapa lipídica que contiene la misma composición lipídica, que es bastante diferente de la membrana celular viva43. La inducción de una bicapa de asimetría para imitar mejor la membrana plasmática se puede obtener cambiando el material de la superficie, la condición del amortiguador, la composición lipídica o la temperatura44,45,46,47. Es de gran valor verificar si se puede formar una bicapa asimétrica en el sistema nanobar-SLB para estudiar el comportamiento de las proteínas en la membrana curva, lo que merece más estudios.

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Disclosures

Los autores declaran que no hay ningún interés financiero en conflicto en este trabajo.

Acknowledgments

Agradecemos al Centro de Nanofabricación de Nanyang (N2FC) y al Centro de Tecnologías Fotónicas Disruptivas (CDPT) de la Universidad Tecnológica de Nanyang (NTU) por apoyar la fabricación de nanoestructuras e imágenes SEM, la Plataforma de Producción de Proteínas (PPP) de la Escuela de Ciencias Biológicas NTU para la purificación de proteínas, y la Escuela de Ingeniería Química y Biomédica NTU para el microscopio confocal. Este trabajo está financiado por el Ministerio de Educación de Singapur (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 y MOE-T2EP30220-0009), el Instituto de Análisis y Ciencia Molecular Digital (IDMxS) apoyado por fondos del Ministerio de Educación bajo el esquema de Centros de Excelencia de Investigación (W. Zhao), la Fundación del Programa de Ciencia de la Frontera Humana (W. Zhao, RGY0088/2021), la Subvención de Inicio de NTU (W. Zhao), Escuela de Ingeniería Química y Biomédica NTU para la beca de investigación (X. Miao), y Consejo de Becas de China para la beca de investigación (J. Wu).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anhydrous Ethanol Sigma-Aldrich 100983
Aluminum foil Diamond RN0879999FU
Amber Vial Sigma-Aldrich 27115-U
Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) Avanti Polar Lipids, Inc. 840032
10 mL Beaker Schott-Duran SCOT211060804
50 mL Beaker Schott-Duran SCOT211061706
1000 mL Beaker Schott-Duran SCOT211065408 The second container 
Chloroform Sigma-Aldrich V800117
Cotton buds Watsons
18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) Avanti Polar Lipids, Inc. 790404
Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) Avanti Polar Lipids, Inc. 840051
F-BAR Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
F-BAR+IDR Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
GFP Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
GFP-His Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
GraphPad Prism GraphPad V9.0.0
Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS) Thermo Scientific H325-500
IDR from human FBP17 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
ImageJ National Institutes of Health 1.50d
Laser Scanning Confocal Microscopy Zeiss  LSM 800 with Airyscan 100x (N.A.1.4) oil objective.
Methanol Fisher scientific 10010240
Mini-extuder  Avanti Polar Lipids, Inc. 610000-1EA
1.5 mL Microtubes Greiner 616201
MATLAB Mathworks R2018b
Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μm Whatman 800309
Phosphate Bufferen Saline (PBS) Life Technologies Holdings Pte Ltd. 70013
Polydimethylsiloxane (PDMS) Base Dow Corning Corporation SYLGARD 184
Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker Dow Corning Corporation SYLGARD 184
Plasma Cleaner HARRICK PLASMA PDC-002-HP
Quartz Nanochip Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD
Sodium Hydroxide  Sigma-Aldrich 795429
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 258105
Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt Life Technologies Holdings Pte Ltd. T1395MP
Tweezer Gooi PDC-002-HP
Ultrasonic Cleaners Elma D-78224
Voterx Scientific Industries G560E
Vacuum Desiccator NUCERITE 5312
Water Bath Julabo TW8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Bioquímica Número 189 matriz de nanobar curvatura de membrana proteína de detección de curvatura bicapa lipídica soportada ensayo in vitro
Un sistema de bicapa lipídica soportado por nanobar para el estudio de proteínas de detección de curvatura de membrana <em>in vitro</em>
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Miao, X., Wu, J., Zhao, W. A… More

Miao, X., Wu, J., Zhao, W. A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro. J. Vis. Exp. (189), e64340, doi:10.3791/64340 (2022).

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