Summary
Burada, in vitro eğrilik algılama yeteneğine sahip proteinlerin karakterizasyonunu sağlayan tanımlanmış bir eğriliğe sahip sentetik bir membran sağlamak için nanobar destekli bir lipit çift katmanlı sistem geliştirilmiştir.
Abstract
Membran eğriliği, hücre göçü, hücre bölünmesi ve vezikül kaçakçılığı gibi hücrelerin çeşitli temel süreçlerinde önemli roller oynar. Sadece hücresel aktiviteler tarafından pasif olarak üretilmez, aynı zamanda protein etkileşimlerini aktif olarak düzenler ve birçok hücre içi sinyallemede rol oynar. Bu nedenle, membran eğriliğinin proteinlerin ve lipitlerin dağılımını ve dinamiklerini düzenlemedeki rolünü incelemek büyük değer taşımaktadır. Son zamanlarda, kavisli membran ve protein in vitro arasındaki ilişkiyi incelemek için birçok teknik geliştirilmiştir. Geleneksel tekniklerle karşılaştırıldığında, yeni geliştirilen nanobar destekli lipit çift katmanlı (SLB), önceden tanımlanmış bir membran eğriliği ve yerel düz kontrol ile desenli nanobar dizileri üzerinde sürekli bir lipit çift katmanı oluşturarak membran eğriliği üretiminde hem yüksek verim hem de daha iyi doğruluk sunar. Hem lipit akışkanlığı hem de kavisli membranlara protein duyarlılığı, floresan mikroskopi görüntüleme kullanılarak kantitatif olarak karakterize edilebilir. Burada, nanobar dizileri içeren fabrikasyon cam yüzeylerde bir SLB'nin nasıl oluşturulacağına ve bu SLB üzerinde eğriliğe duyarlı proteinlerin karakterizasyonuna ilişkin ayrıntılı bir prosedür tanıtılmaktadır. Ek olarak, nanoçip yeniden kullanımı ve görüntü işleme protokolleri ele alınmaktadır. Nanobar-SLB'nin ötesinde, bu protokol eğrilik algılama çalışmaları için her türlü nanoyapılı cam çipine kolayca uygulanabilir.
Introduction
Membran eğriliği, morfogenez, hücre bölünmesi ve hücre göçü1 gibi çeşitli hücresel süreçlerde meydana gelen bir hücrenin kritik bir fiziksel parametresidir. Membran eğriliğinin hücresel olayların basit bir sonucunun ötesinde olduğu artık yaygın olarak kabul edilmektedir; bunun yerine, protein etkileşimlerinin ve hücre içi sinyalleşmenin etkili bir düzenleyicisi olarak ortaya çıkmıştır. Örneğin, klatrin aracılı endositozda yer alan birkaç proteinin tercihen kavisli membrana bağlandığı ve endositoz2 için bir sıcak nokta oluşumuna neden olduğu bulunmuştur. Membran deformasyonunun sitoiskelet kuvvetleri tarafından membran çekilmesi, farklı büyüklükte kafa gruplarına sahip lipit asimetrisinin varlığı, konik şekilli transmembran proteinlerinin varlığı, BAR-domain proteinleri (Bin, amfifin ve Rvs proteinlerinden sonra adlandırılmıştır) gibi membran şekillendirici proteinlerin birikmesi ve amfipatik helislerin membrana yerleştirilmesi gibi birçok farklı nedeni vardır1 . İlginç bir şekilde, bu proteinler ve lipitler sadece zarı deforme etmekle kalmaz, aynı zamanda membran eğriliğini algılayabilir ve tercihli birikim gösterebilir1. Bu nedenle, farklı eğriliklere sahip membranların, bunlara bağlı proteinlerin ve lipitlerin dağılımını ve dinamiklerini ve ilgili hücre içi süreçler üzerindeki potansiyel etkilerini değiştirip değiştirmediğini ve nasıl değiştirdiğini incelemek çok önemlidir.
Hem canlı hücre hem de in vitro sistemlerde kavisli membran ve proteinler arasındaki etkileşimi analiz etmek için birçok teknik geliştirilmiştir. Canlı hücre sistemi, zengin lipit çeşitliliği ve dinamik protein sinyal regülasyonu 2,3,4,5,6,7 ile gerçek bir hücre ortamı sağlar. Bununla birlikte, böyle sofistike bir sistemin, hücre içi ortamdaki belirsizlikler ve dalgalanmalar nedeniyle incelenmesi zordur. Bu nedenle, bilinen lipit türlerinden ve saflaştırılmış proteinlerden oluşan yapay bir membran kullanan in vitro testler, proteinler ve kavisli membranlar arasındaki ilişkiyi karakterize etmek için güçlü sulandırma sistemleri haline gelmiştir. Geleneksel olarak, farklı çaplardaki lipozomlar, eğriliğe duyarlı proteinleri, santrifüj kuvveti kullanan bir ko-sedimantasyon testi veya protein agregasyonunu önlemek için yoğunluk gradyanına sahip bir ko-yüzdürme testi yoluyla tespit etmek için ekstrüzyon ile üretilir 8,9. Bununla birlikte, ekstrüde lipozomların eğriliği, ekstrüder10'da kullanılan membran filtresinin mevcut gözenek boyutu ile sınırlıdır. Tek lipozom eğriliği (SLiC) testinin, farklı çaplara sahip lipozomların floresan etiketli olduğu ve yüzeye hareketsiz hale getirildiği, böylece eğriliğin floresan yoğunluğu11 ile işaretlenebildiği bu sınırlamanın üstesinden geldiği kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, küçük veziküllerde lipit bileşiminde güçlü değişkenlik gözlenmiştir, bu da eğrilik ölçümünün doğruluğunu etkiler12. Tether çekme deneyleri, optik bir cımbız kullanarak dev unilamellar veziküllerden (GUV'ler) çekilen geçici tether üzerindeki eğriliğin daha doğru bir ölçümünü sağlar, burada eğrilik13,14 üretilen membran gerilimi tarafından iyi kontrol edilebilir. Bu yöntem, pozitif veya negatif eğrilik algılama proteinlerini incelemek için uygundur, ancak tüp nesil10'un verimi ile sınırlıdır. Desteklenen membran tüpleri (SMrT) testi, mikroakışkan akışlarla aynı lipit rezervuarından ekstrüde edilen çoklu membran tüplerinin eşzamanlı olarak üretilmesini sağlar. Bununla birlikte, membran eğriliği nanotüp boyunca içsel olarak değişir, bu da floresan yoğunluğuna dayalı eğrilik ölçümünün doğruluğunu tehlikeye atar15,16. Buna karşılık, tasarlanmış topografyaları içeren yüzeylerde desteklenen bir lipit çift katmanlı (SLB) oluşturmak için küçük unilamellar veziküller (SUV'lar, çap <100 nm 17) kullanarak, nanofabrikasyon veya nanomalzemeler tarafından önceden belirlenmiş eğriliklere sahip tek bir çift katmanlı membran üretti18,19,20.
Burada, nanobar dizileri ile imal edilmiş nanoçip yüzeylerinde SLB'nin oluşumu ve proteinlerin in vitro eğrilik hassasiyetini araştırmak için nasıl kullanılabileceği için bir protokol sunuyoruz. Şekil 1'de gösterildiği gibi, tahlilin altı temel bileşeni vardır: A) Çipin mikroakışkan bir oda ile temizlenmesi ve montajı; b) Tanımlanmış lipit bileşimine sahip SUV'ların hazırlanması; C) SLB'nin bir nanoçip üzerinde oluşumu ve eğriliğe duyarlı proteinlerle bağlanması; d) Floresan mikroskobu altında SLB ve eğriliğe duyarlı proteinlerin görüntülenmesi ve karakterizasyonu; e) Çipin yeniden kullanılmak üzere temizlenmesi; f) Protein eğriliği algılama yeteneğinin kantitatif analizi için görüntü işleme. Ayrıntılı protokol aşağıda adım adım açıklanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Nanoçip temizliği
- Nanoçipi, desenli tarafı yukarı bakacak şekilde 10 mL'lik bir beherin içine yerleştirin.
NOT: Bu kuvars nanoçip,21'den önce açıklandığı gibi elektron ışını litografisi ile üretilmiştir. Çip üzerindeki nanoyapının geometrisi ve düzenlemesi özel olarak tasarlanabilir. Burada kullanılan gradyan nanoçubuklarının boyutları 2000 nm uzunluğunda, 600 nm yüksekliğinde ve 100 ila 1000 nm genişliğindedir (100 nm adım seti). - Beher'e dikkatlice 1 mL% 98 sülfürik asit ekleyin ve asidin çipin ön ve arka tarafını tamamen kapladığından emin olun.
NOT: %98 sülfürik asit son derece aşındırıcıdır ve cilt veya gözlerle temas ettiğinde hızlı doku yıkımına ve ciddi kimyasal yanıklara neden olabilir. Duman davlumbazında uygun koruma ile kullanın. - Beheri yavaşça döndürün ve tüm beher ısınana kadar damla damla damla 200 μL% 30 hidrojen peroksit ekleyin. Sülfürik asit ve hidrojen peroksitin, organik moleküllerin nanoçip17'den uzaklaştırılması için piranha çözeltisi oluşturmak üzere iyice karıştırıldığından emin olun. SLB'yi daha önce açıklandığı gibi UV ışığı ve ozona maruz kalma gibi temiz hidrofilik yüzeylerde üretmek için alternatif teknikler vardır23.
NOT: Reaksiyon son derece ekzotermiktir ve çözeltinin kaynamasına neden olabilir, bu nedenle sülfürik aside damla damla hidrojen peroksit ekleyin ve dönmeye devam edin. - Beheri ikincil bir cam kaba yerleştirin ve safsızlıkları iyice temizlemek için nanoçipi gece boyunca piranha çözeltisine batırılmış halde tutun.
NOT: Reaksiyonun gaz üretebilmesi ihtimaline karşı beheri herhangi bir örtü olmadan davlumbazın içine yerleştirin. - Beheri çıkarın ve piranha çözeltisini dikkatlice bir asit atık kabına pipetleyin.
- Artık asidi seyreltmek ve asit atığına atmak için beherin içine 5 mL deiyonize su yükleyin. Bu adımı beş kez tekrarlayın ve asit atıklarını nötralize etmek için 5 M NaOH kullanın.
- Çipi cımbızla alın ve artık asidi iyice gidermek için sürekli bir deiyonize su akışıyla yıkayın. SLB oluşumu22 için çipi %99,9 azot gazı ile fön ile kurulayın.
2. Küçük unilamellar veziküllerin (SUV'lar) üretimi
- Kehribar bir şişeye 100 μL kloroform ekleyin.
NOT: Kloroform oldukça uçucu, renksiz bir sıvıdır ve solunması veya yutulması durumunda toksik olabilir. Maske ve eldivenler açıkken duman başlığında kullanın. - 500 μg lipit karışımını kloroform içinde çözün. Burada kullanılan lipit karışımının bileşimi% 89.5 mol yumurta fosfatidilkolinleri (PC), beyin fosfatidilserin (PS) 10 mol% ve Texas Red 1,2-dihekzadekanoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin, trietilammonyum tuzu (Texas Red DHPE) 0.5 mol'dür.
- Şişedeki lipit karışımını, kloroform uçucu hale gelene ve lipit karışımı kuruyana kadar% 99.9 azot gazı ile üfleyerek kurutun.
NOT: Bu adım duman davlumbazında yapılmalıdır. Fön ile kuruturken sıvı sıçramasından kaçının. - Kehribar şişede bulunan lipit karışımını kapaksız olarak alüminyum folyo kaplı vakumlu kurutucuya yerleştirin. Daha sonra kloroformu tamamen uçucu hale getirmek için numuneyi bir pompayla 3 saat vakumla kurulayın.
- Flakona 250 μL fosfat tamponlu salin (PBS) tamponu ekleyin. Çözeltiyi homojen olana kadar vorteksleyin.
NOT: PBS tamponu, kalsiyum, magnezyum ve fenol kırmızısı içermeyen 150 mM NaCl'den oluşur; pH, PC ve PS lipit çift katmanlı hale getirmek için 7.2'ye ayarlanır. - Bir banyo sonikatöründe lipit karışımını 30 kHz frekansında 50 dakika boyunca sonikleştirin. Daha sonra lipit karışımını 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve parafilm ile kapatın.
- Lipid karışımını sıvı azotta 20 s dondurun ve ardından bir su banyosunda 2 dakika boyunca 42 ° C'de çözün. Donma-çözülme döngülerini 30 kez tekrarlayın. Bundan sonra, lipit karışımı berrak bir sıvı gibi görünür.
DİKKAT: Sıvı azot yaklaşık -195.8 °C kaynama noktasına sahiptir. Donma veya kriyojenik yanıklara neden olabilir. Isı yalıtım eldivenleri ile sınırlı olmayan alanda kullanın. - İki cam gaz geçirmez şırıngayı ve mini ekstrüderin konektörünü sırasıyla etanol, kloroform ve metanol ile durulayın. Aparatı önceden temizlemek için durulama sırasını beş kez tekrarlayın. Organik çözücü tamamen uçucu hale gelene kadar onları duman davlumbazında bırakın.
- Mini ekstrüder aparatını monte edin ve aparatı önceden ıslatmak için konektörden 500 μL PBS tamponunu geçirin, ardından tamponu başka bir şırıngadan atın. Bu adım safsızlıkları giderir ve ekstrüzyonu kolaylaştırır.
- Mini ekstrüder aparatını 100 nm gözenek boyutunda bir polikarbonat filtre membranı ile birleştirin.
NOT: Filtre zarının gözenek boyutu, lipozomların çapını belirler. - Şırıngalardan biriyle 500 μL PBS tamponu alın ve diğer ucundaki ikinci boş şırıngayı doldurmak için yavaşça filtreden geçirin. Aparat sızıntısını kontrol etmek için ekstrüzyonu üç kez ileri geri tekrarlayın ve tamponu ikinci şırıngadan atın.
- PBS tamponunu değiştirmek için lipit karışımını mini ekstrüderden geçirin. Daha sonra SUV'ları oluşturmak için 20 kez ileri geri ekstrüzyon yapın. Veziküllerin çok katmanlı karakteri, SLB oluşumunu etkileyecek yetersiz sayıda ekstrüzyon süresi ile korunabilir23.
- Daha büyük parçacıklarla kirlenmeyi azaltmak için SUV'ları ikinci şırıngadan toplayın ve 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
NOT: Şırınganın kopması ihtimaline karşı şırıngayı doğrudan konektörden çıkarın. - Floresan etiketli lipitlerin ağartılmasını önlemek için tüpü alüminyum folyo ile sarın ve 4 ° C'de saklayın. Genellikle, SUV'lar 7 güne kadar saklanabilir.
3. Bir nanoçip üzerinde SLB'nin oluşumu
- Temizlenmiş nanoçipi deiyonize sudan bir çift cımbızla dikkatlice çıkarın ve% 99.9 azot gazı ile fön ile kurutun.
- Nanoçipin yüzey temizliğini 1 saat boyunca hava plazma işlemi ile yapın.
- Nanoçipi, iki parça PDMS-bir orta PDMS ve bir üst PDMS'den oluşan bir polidimetilsiloksan (PDMS) odasında birleştirin (Şekil 1A). Orta PDMS, nanobar desenine yeterli pozlama sağlamak için merkezde oval şekilli büyük bir açıklık ile ince (~ 0,5 mm) dir. Üst PDMS kalındır (~4,0 mm), büyük oval açıklık içinde sıvı kullanımı için bir giriş ve çıkış olarak iki küçük delik vardır.
- Çipi, desen yukarı bakacak şekilde temiz bir yüzeye yerleştirin.
- Orta PDMS'yi çiple yavaşça örtün ve tüm desenin orta PDMS'deki büyük oval şekilli açıklığın merkezi alanına maruz kaldığından emin olun.
- Üst PDMS'yi orta PDMS ile örtün ve iki küçük deliğini orta PDMS'nin büyük oval deliği bölgesinde tutun. Daha sonra PDMS odası monte edilir.
NOT: PDMS en yaygın kullanılan silikon bazlı organik polimerdir. Biyouyumlu, şeffaf ve mikroskop altında çip montajı ve görüntüleme için özelleştirilmiş bir şekil olarak tasarlanmak üzere deforme olabilir. Daha da önemlisi, plazma işleminden sonra kovalent olarak başka bir PDMS tabakasına veya cama sıkıca yapıştırılabilir, bu da SLB'yi hazırlamak için oda olarak uygun hale getirir. Bu adım, boşlukları ve sızıntıyı önlemek için her PDMS katmanının sıkıca takılmasını sağlar.
- SUV'ları üst PDMS'deki iki küçük delikten birinden PDMS odasına bir pipetle yükleyin ve SLB'yi oluşturmak için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
- PBS tamponunu küçük deliğin bir tarafından PDMS odasına nazikçe pipetleyin ve bağlanmamış SUV'ları yıkamak için atıkları diğer delikten pamuklu bir tomurcukla çıkarın. Daha sonra nanoçip üzerinde oluşturulan SLB'yi edinin (SLB'nin kalitesi, adım 4.4'te gösterildiği ve temsili sonuçlar bölümünde tartışıldığı gibi fotobeyazlatma sonrası floresan geri kazanımı (FRAP) ile test edilir).
NOT: PBS tamponunu hazneye pipetlediğinizde, herhangi bir kabarcık enjekte edilmemesi için pipet ucu tamponla dolu ve sıvı yüzeyiyle temas halinde olmalıdır.
4. SLB'nin ve nanoçip üzerindeki eğrilik algılama proteininin bağlanmasını görüntüleme
NOT: Bu bölüm, deney için mevcut mikroskop sistemine bağlı olacaktır. Burada, görüntülemenin nasıl yapılacağına dair genel bir kılavuz açıklanacaktır. Ayrıntılı ayarlar farklı mikroskop kurulumları arasında değiştirilebilir.
- 100x (N.A.1.4) yağ hedefi kullanarak lazer tarama konfokal mikroskopisini ayarlayın. Lipid ve proteinin floresansını uyarabilecek uyarma lazer gücünü seçmek için ZEN yazılımını açın. Texas Red DHPE / EGFP> Akıllı Kurulum > Edinme modunu seçin.
- Nanobar kenarları lipit kanalının altında keskin olana kadar çip üzerindeki nanoçubukları bulmak için odak düğmesiyle odağı ayarlayın.
- Protein eklemeden önce lipit kanalının kontrol görüntüsünü elde etmek için tarama parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: Çerçeve Boyutu = 512 piksel x 512 piksel (512 piksel x 512 piksel, 124 nm piksel boyutu), Piksel Başına Bit = 16 (16 bit derinlik), Tarama hızı = 5 ve Ortalama = 4 (dört kez/çizgi ortalama modu).
- FRAP tahlilini, floresan etiketli lipit çift katmanını rastgele tek bir nanobar alanı üzerinde ağartarak yapın.
- Deneme Bölgeleri ve Ağartma onay kutularını seçin. Merkezdeki tüm nanobarı içerebilen 5 μm çapında dairesel bir alan çizin (nanobar boyutu 2 μm'dir) ve Deney Bölgelerine ekleyin. Hızlandırılmış görüntüleme parametrelerini aşağıdaki örnekte olduğu gibi girin: Tarama hızı = 9 ve Ortalama = 1'i seçin. Zaman Serisi > Süre = 100 döngü ve Aralık = 2 sn'yi seçin. Ağartma parametrelerini aşağıdaki örnekte olduğu gibi girin: # görüntülerden sonra başla onay kutusunu seçin ve üç görüntü seçin.
- FRAP gerçekleştiren lazer onay kutularını seçin ve gücü %100,0 olarak değiştirin. FRAP denemesi için Denemeyi Başlat'ı tıklatın.
NOT: FRAP, hücresel moleküllerin hareketliliğini karakterize etmek için yaygın bir yöntemdir. SLB iyi akışkanlığa sahipse, ağartılmış alandaki floresan, ağartılmış floroforlar yayıldıkça ve diğer alanlardan ağartılmamış floroforlar yayıldıkça yavaş yavaş iyileşecektir.
- Protein çözeltisini PDMS odasına yükleyin ve proteinin SLB üzerine bağlanmasına izin vermek için oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
NOT: Şekil 2G,H'de lipid bileşimini göstermek için kullanılan proteinler, nanobar kavisli SLB'lerde protein bağlanmasını kolaylaştırır 74 μM GFP ve 79 μM GFP-His'tir. Bu iki protein, His-etiketi olmayan veya His-etiketi olan yeşil floresan proteinlerdir. Şekil 4 ve Şekil 5'te eğrilik algılama çalışması için kullanılan proteinler 16 μM F-BAR, 16 μM IDR FBP17 ve 16 μM FBAR + IDRFBP17'dir. Bu üç protein, sezgisel olarak hem eğrilik jeneratörleri hem de sensörler olarak kabul edilen tipik bir BAR proteini olan FBP17'nin alanlarıdır. Her protein hacmi 20 μL'dir. - Nanobarları yeniden odaklayın ve protein eğriliği algılama tespiti için hem lipit hem de protein kanallarının görüntülerini almak için adım 4.3'ü tekrarlayın.
- FRAP testini hem lipit hem de protein kanallarında yapmak için adım 4.4'ü tekrarlayın ve eğrilik algılama proteininin hareketliliğini karakterize etmek için hızlandırılmış görüntüleme gerçekleştirin.
5. Nanoçipin yeniden kullanımı
- Nanoçipi cımbızla alın ve deiyonize suyla doldurulmuş 50 mL'lik bir beherde PDMS odasından dikkatlice ayırın.
NOT: Bu kritik bir adımdır. Cımbızların nanoyapıya temas etmesini önleyin ve çatlakları önlemek için çipi ayrılmaya zorlamayın. - Yüzeye yapışmış organik kalıntıları gidermek için nanoçipi susuz etanol ile iyice yıkayın.
NOT: Susuz etanol ile yıkamadan önce yüzeydeki suyu çıkarmak için temiz mendil kağıdı kullanın.
DİKKAT: Susuz etanol oldukça uçucu ve hafif tehlikeli bir kimyasaldır. Cilt ve gözlerle temasından kaçının. Maske ve eldivenler açıkken duman başlığında kullanın. - Artık etanol çıkarmak için çipi bol miktarda deiyonize suyla iyice yıkayın. Daha sonra çipi %99,9 azot gazı ile kurulayın.
NOT: Bir sonraki adıma geçmeden önce çip üzerindeki tüm etanol izlerini çıkarmak önemlidir, çünkü piranha asidi organik çözücü ile şiddetli reaksiyona girebilir ve patlamalara neden olabilir. - Çipi, desen tarafı yukarı bakacak şekilde temiz bir 10 mL beherine yerleştirin ve çipi, 'nanoçipin temizlenmesi' ile aynı adımları izleyen yeniden kullanım için piranha çözeltisi ile temizleyin.
6. Görüntü ölçümü
- Bir mikroskop tarafından elde edilen görüntüleri, nanobar dizisi Fiji yazılımında sonraki analizler için dikey konumda olacak şekilde döndürün.
- Tek tek nanobarı hem lipit kanalında hem de protein kanalında kare bir maske (51 piksel x 51 piksel) ile bulmak için özel olarak yazılmış bir MATLAB kodu 'c_pillarmask_averaging' kullanın.
NOT: Bu MATLAB kodu nanoçip için özel olarak tasarlanmıştır. GitHub'da şu bağlantı aracılığıyla edinilebilir: https://github.com/wtzhaolab/GNB_SLB_MX. - MATLAB kodu 'BarGra_avg'daki meshgrid işleviyle görüntünün köşelerindeki üç ROI (5 piksel x 5 piksel) ile her görüntünün arka plan sinyallerini çıkarın. Bu işlem, mikroskop kurulumunun veya mikroskop aşamasında çip tesviyesinin neden olduğu potansiyel düzensiz arka plan gürültülerini düzeltmeyi amaçlamaktadır.
- MATLAB kodu 'BarGra_avg' kullanarak aynı büyüklükteki nanobarların ortalama görüntülerini oluşturun, burada her bir nokta, tüm bireysel nanobar kare maskelerinde o noktadaki değerlerin ortalamasıdır. Nanoçubukların etrafındaki ortalama sinyal dağılımını sezgisel olarak göstermek için Fiji yazılımındaki ortalama görüntülerin 3B yüzey grafiklerini oluşturun. Poligon Çarpanı için > Yüzey Grafiğini Analiz Et > Giriş 100'ü seçin ve Gölge, Çizim Ekseni ve Pürüzsüz onay kutularını seçin.
- Her nanobarı, floresan yoğunluklarını sırasıyla MATLAB kodu 'avg_nanobar_quantification' ile çıkarmak için iki nanobar uç alanı ve bir nanobar merkezi alanı içeren üç alana ayırın. Nanobar ROI'lerinin boyutları, 'konum' dosyası kullanılarak nanobarların boyutuna göre ayarlanır.
- Yüzey alanı etkisini hariç tutan nanobar-uç yoğunluğunu elde etmek için protein yoğunluklarını çubuk uç alanındaki 'avg_nanobar_quantification' MATLAB kodundan çıkarılan lipit yoğunluklarına bölün.
- Bağlanma eğrisini elde etmek için nanobar uç yoğunluğunu GraphPad Prizma'da farklı konsantrasyonlarla çizin. Analiz menüsünü açın. Eğriyi Hill denklemine uydurmak için Doğrusal olmayan regresyon (eğri uyumu) > Bağlama - Doygunluk > Tepe eğimi işleviyle özel bağlama'yı seçin ve ardından KD ve Tepe katsayısı değerini hesaplayın.
- Lipid ve protein yoğunlukları, MATLAB kodu 'avg_nanobar_quantification' kullanılarak aynı görüntüde elde edilen 600 nm nanobar merkezinde karşılık gelen yoğunluklarına normalleştirilir.
- Aynı büyüklükteki nanobarlarla protein eğriliği algılamasını ölçmek için nanobar uç alanında normalleştirilmiş protein yoğunluklarının en parlak dokuz pikselini çubuk merkez alanına bölünerek kullanın, değer "uçtan merkeze oran" olarak adlandırılır. Farklı büyüklükteki nanobarlarla protein eğriliği algılama aralığını ölçmek için lipit yoğunluğunu normalleştirmek için normalleştirilmiş protein yoğunluğunun oranını kullanın, değer "Normalleştirilmiş Nanobar-Uç Yoğunluğu" olarak adlandırılır. Bu değerler MATLAB kodu 'avg_nanobar_quantification' ile hesaplanır.
- FRAP yığını görüntüsünü Fiji yazılımına yükleyin. FRAP alanını seçin ve bir yatırım getirisi oluşturun. Her seferinde FRAP alanının yoğunluğunu ölçmek için Daha > Çoklu ölçüm işlevini seçin. FRAP kurtarma eğrisini oluşturmak için yoğunluğu GraphPad Prizma'da çizin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nanobar tasarımı, nanobar genişliği ile tanımlanan eğrilik ve merkezde yerel olarak bir düz / sıfır eğrilik kontrolü ile her iki ucunda yarım daire içeren pozitif eğrilik algılama proteinlerini araştırmak için önerilir (Şekil 2A, B). SLB'nin nanobarlar üzerinde başarılı bir şekilde oluşturulması, Şekil 2C'de gösterildiği gibi tüm nanobar yüzeyi boyunca eşit olarak dağılmış lipit işaretleyici sinyalleri ile sonuçlanır. Birden fazla nanobardan gelen sinyaller, bireysel nanobar görüntülerinin ortalaması alınarak birleştirilebilir (Şekil 2D), böylece farklı nanobarlar arasındaki rastgele varyasyonlar en aza indirilebilir. Daha önceki bir elektron mikroskobu çalışması, hücre plazma zarının tüm nanoyapıların etrafında konformal kaplama oluşturduğunu göstermiştir24. Bu nedenle, sentetik lipit çift katmanının nanoyapı yüzeyine de sıkıca yapıştığına inanılmaktadır, bu da Şekil 4E'de gözlemlendiği gibi 200 nm nanobar üzerinde kırınım sınırlı çizgiler vermektedir. Ek olarak, nanobar kavisli SLB üzerindeki membran akışkanlığı, tek bir nanobar üzerindeki floresan sinyalinin membran akışkanlık karakterizasyonu için ayrı ayrı ağartılabildiği FRAP testi ile de karakterize edilebilir (Şekil 2E, F).
SLB'nin nanobarlar üzerindeki oluşumu, daha önce17'de bildirildiği gibi düz yüzeylerdeki SLB oluşumuna benzer şekilde SUV'ların üretilmesini gerektirir. SUV'ların lipit bileşimi, membran etiketleme ve farklı protein bağlama mekanizmaları için değiştirilebilen nanobar kavisli SLB'nin yüzey kimyasını belirler. Örneğin, Texas Red DHPE, SUV'larda ~% 0.5 mol olarak eklenebilir, böylece nanobarlar üzerindeki membran yüzey alanının zenginleştirilmesi floresan mikroskobu ile kolayca görüntülenebilir (Şekil 2C). Görselleştirmenin yanı sıra, nanobar kavisli SLB'lerde protein bağlanmasını kolaylaştırmak için lipit bileşimi de değiştirilebilir. Örneğin, His-etiketli proteinlerin ankrajını kolaylaştırmak için, nikel-nitrilotriasetik asit (Ni-NTA), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentitic) iminodiasetik asit) süksinil] (nikel tuzu) (18:1 DGS-NTA (Ni)) SUV'lara (~1 mol)25 dahil edilerek nanobarlar üzerindeki SLB'ye getirilebilir. Lipitler üzerindeki bu fonksiyonel grup olmadan, yeşil floresan proteini (GFP), negatif yüklü PS ile SLB'ye bağlanamaz, bu da çözeltideki GFP sinyallerinin hacimsel tükenmesi nedeniyle her nanobar konumunda daha koyu çubuk şeklinde bir delik ile sonuçlanır (Şekil 2G). Buna karşılık, SLB'ye 1 mol% 18: 1 DGS-NTA (Ni) ekleyerek, His-etiketi etiketli GFP, nanobarlar tarafından kavisli SLB şeklini açıkça takip etmek için membran üzerine güçlü bir şekilde sabitlenebilir (Şekil 2H). Lipid difüzyonu, FRAP testi ile incelendiği gibi protein bağlanması üzerine saptanabilir bir fark göstermedi (Ek Şekil 1). FRAP ölçümünün sadece SLB'deki 0.5 mol% Texas Red DHPE'nin yoğunluğuna dayandığını ve bunun da His-tag proteininin bağlanması için kullanılan 1 mol% DGS-NTA (Ni) 'yi temsil etmeyebileceğini belirtmek gerekir. Ek olarak, PS gibi yüklü lipitler, elektrostatik etkileşim yoluyla protein bağlanmasını artırabilir26, fosfatidilinositol (4,5)-bisfosfat (PIP2) gibi sinyal lipitleri de spesifik protein bağlanmasını kolaylaştırmak için SUV'lara entegre edilebilir (örneğin, PIP2'nin membran eğriliği algılaması için gerekli olduğu FCHo227).
SLB oluşumunun yüzey homojenliği ve membran akışkanlığı açısından kalitesi, nanobarlardaki protein eğriliği algılama yeteneğini araştırmak için kritik öneme sahiptir. SLB homojenliğini ve akışkanlığını tehlikeye atabilecek üç tipik sorun vardır. Birincisi, hem nanobarlarda hem de nanobarlar arasındaki düz membranda punkta üreten verimsiz yıkama nedeniyle SLB üzerindeki fazla SUV'ların bağlanmasıdır (Şekil 3A, B). Eğrilik algılama değerlendirmesi için nanobarlar üzerindeki kavisli veya düz yüzeylerde protein bağlanmasının miktarını önemli ölçüde etkiler. Diğer bir sorun, yıkama adımı sırasında PDMS odasının içine hava kabarcıklarının beklenmedik bir şekilde girmesidir, bu da SLB'yi hava-sıvı arayüzünün yörüngesi boyunca tahrip edebilir ve nanobar yüzeyinde son derece düşük lipit sinyalleri ile kolayca tanımlanabilen çizik benzeri özellikler bırakabilir (Şekil 3C, D). Ayrıca, yanlış temizlenmiş nanobar substratlar, SLB oluşumu için lipit adsorpsiyonunu önleyen yüzeyde rastgele dağılmış kimyasal kalıntılar bırakır. Mikroskopi görselleştirmesi için optik çözünürlüğün üzerinde olabilecek veya olmayabilecek membran kusurlarının oluşmasına yol açar (Şekil 3E). Bununla birlikte, membran akışkanlığı, membran kusur oluşumu28'den hassas bir şekilde etkilenecektir, böylece FRAP testi yüzey temizliğini doğrulamak için kullanılabilir (Şekil 3F, G).
Nanobar dizisi kullanarak eğrilik algılama proteininin karakterizasyonunu göstermek için, tipik F-BAR alanı, FBP17'de (IDR FBP17) yakın zamanda tanımlanmış içsel olarak düzensiz bir bölge ile karşılaştırılmıştır. F-BAR, Alexa Fluor 488 tetraflorofenil ester boyaları ile floresan olarak etiketlenirken, IDRFBP17 , Alexa Fluor 647 C2 Maleimide ile etiketlenmiştir. Şekil 4A'da gösterildiği gibi, her iki protein alanı da 300 nm genişliğe sahip SLB kaplı bireysel nanobarlarda artan birikim göstermektedir. Burada, SLB, protein bağlanmasını elektrostatik olarak arttırmak için% 10 PS içerir. Proteinin eğrilik algılama yeteneği, düz nanobar merkezlerindeki sinyallerden daha yüksek floresan yoğunluğa sahip kavisli nanobar uçlarındaki tercihli zenginleştirme ile tanımlanabilir; bu, 100 nanobardan daha fazla görüntü ortalamasından sonra daha açık bir şekilde gösterilmiştir (Şekil 4B). Eğrilik algılama yeteneği, her nanobar üzerindeki uçtan merkeze oranın hesaplanmasıyla nicel olarak yansıtılabilir (yani, nanobar ucundaki floresan yoğunluğu nanobar merkezine karşı). Şekil 4C'de gösterildiği gibi, her iki protein de lipitlerden daha yüksek bir uç-merkez oranına sahiptir, bu da yaklaşık 1'dir. IDR FBP17 ve F-BAR karşılaştırıldığında, IDRFBP17'nin daha yüksek uçtan merkeze oranının (1.385 ±0.011, ortalama SEM ±) F-BAR'dan (1.144 ± 0.004, ortalama ± SEM) daha güçlü eğrilik algılaması gösterdiği görülebilir.
Proteinler tarafından algılanabilen eğrilik aralığını incelemek için, SLB, lipitlerin farklı büyüklükteki nanobarlar üzerinde homojen kaplama gösterdiği 200 nm ila 600 nm arasında gradyan genişliklerine sahip nanobar dizileri üzerinde üretilir (Şekil 4D) (Şekil 4E). Üç protein (IDR FBP17, F-BAR ve F-BAR + IDRFBP17) gradyan nanobar dizisi üzerinde inkübe edilir ve bunların hepsi, eğrilik çapı 400 nm'nin altına düştüğünde nanobar ucu kavisli membran bölgelerinde tercihli birikim göstermiştir (Şekil 4E, F). Bu üç protein alanı arasında, IDRFBP17 en yüksek nanobar-uç yoğunluğunu verir, bu da en güçlü eğrilik algılama yeteneğini gösterirken, F-BAR en düşük değeri gösterir (Şekil 4F). Ayrıca, eğrilik algılama proteininin bağlanma eğrisi, IDRFBP17'nin güçlü bir işbirlikçi eğrilik algılama yeteneğine sahip olduğunu gösteren protein konsantrasyonunu kademeli olarak artırarak da çizilebilir (Şekil 4G). Bağlanma eğrilerini Hill denklemine uyarlarken, KD μM aralığında (0.6 ± 0.1 μM) bulunur ve Hill katsayısı (H) 2 ila 3 arasındadır, bu da IDRFBP17'nin nanobar kaynaklı membran eğriliklerine ultra hassas bir şekilde bağlandığını gösterir. Eğrilik ne kadar keskin olursa, dengedeki bağlanma kapasitesi o kadar yüksek olur.
Nanobar şeklindeki SLB bölgeleri etrafındaki eğrilik algılama proteinlerinin dinamik membran difüzyonu ve membran ilişkisi de FRAP tarafından incelenebilir. Nanobarlar üzerindeki lipit sinyallerinin hızlı geri kazanımı ile karşılaştırıldığında (Şekil 5A, E), F-BAR 2 dakika içinde iyileşemedi (Şekil 5B, E), bu da kavisli membran bölgelerinde membran hareketliliğinin ve ilişki dinamiğinin önemli ölçüde azaldığını düşündürmektedir. Şaşırtıcı bir şekilde, F-Bar'ın davranışından farklı olarak, IDR FBP17 sinyali, aynı zaman dilimi içinde belirgin bir iyileşme göstermiştir (Şekil 5C, E), kavisli membranlarda biriken IDRFBP17'nin dinamik doğasını göstermektedir. Bununla birlikte, çözümdeki bağlanmamış IDR FBP17'yi yıkadıktan sonra, IDRFBP17 kanalında aynı iyileşme daha önce olduğu gibi gözlenemedi (Şekil 5D, E). Geri kazanımın, çözelti içeren IDRFBP17 molekülleri ile değişimin ve membrana bağlı moleküllerin yanal difüzyonunun daha az baskın olduğunu gösterir.
Genel olarak, bu sonuçlar bu nanobar-SLB sisteminin membran eğriliği algılayan proteinleri in vitro olarak karakterize etmek için güçlü bir araç olduğunu göstermektedir.
Resim 1: Nanobar-SLB sisteminin çizimi . (A) PDMS odası, üzerine monte edilmiş temizlenmiş nanoçip ile üst ve orta katmanlardan oluşur. (B) Texas Red DHPE, SUV'ları yakınlaştırılmış ayrıntılarla etiketledi. (C) Nanobar-SLB sisteminin bozulmamış modeli ve yakınlaştırma alanı, SLB'nin lipit çift katmanının tek tip bir tek tabakası ile nanobarlar üzerinde oluştuğunu göstermektedir. (D) Lazer taramalı konfokal mikroskopi altında görüntüleme ve karakterizasyon işlemi. (E) Daha fazla yeniden kullanım için nanoçipin temizlenmesi. (F) Protein eğriliği algılama ölçümü için görüntüleme işlemi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Protein bağlanması ile nanobarlar üzerinde kavisli SLB'nin oluşumu . (A) Tek bir nanobarın SEM görüntüsü. (B) Nanobar-SLB sisteminin şematik tasviri. (C) SLB'nin nanoçip üzerinde Texas Red DHPE ile etiketlenmiş floresan görüntüleri. (D) Nanobarlarda SLB dağılımının ortalama görüntüsü (üstte) ve ortalama görüntünün 3D yüzey grafiği (altta). Bu rakam Su ve ark.22'den değiştirilmiş ve izin alınarak çoğaltılmıştır. (E) SLB FRAP'ın nanobar üzerinde hızlandırılmış görüntülemesi. Beyazlatma bölgesi sarı kesikli bir daire ile gösterilir. (F) FRAP ölçümü ile normalleştirilmiş nanobar yoğunluk grafiği. (G) GFP'nin şematik tasviri, SLB'ye %10 mol negatif yüklü PS (solda) ve sağda karşılık gelen temsili bir görüntü ile bağlanamaz. (H) SLB'ye bağlanmış GFP etiketli His-etiketinin şematik tasviri, 1 mol% DGS-NTA (Ni) (solda) ve sağda karşılık gelen temsili bir resim. Ölçek çubukları: 2 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: SLB kalitesini tehlikeye atan tipik sorunlar. (A) Verimli yıkama olmadan SLB hazırlama şeması. (B) SLB'nin temsili görüntüsü, fazla SUV'larla bağlanır. Sarı oklar, SLB yüzeyinde fazla SUV olan punkta'yı gösterir. (C) Enjekte edilen hava kabarcıkları ile SLB preparatının şeması. (D) Hava-sıvı arayüzünün yörüngesi tarafından tahrip edilen SLB'nin temsili görüntüsü. Sarı ok, alt tabaka üzerindeki tamamlanmamış SLB'yi gösterir. (E) Temizlenmemiş nanobar substratlarla SLB preparatının şeması. Yakınlaştırma alanı, yüzey kalıntılarının lipid adsorpsiyonunu önlemesi nedeniyle süreksiz bir lipit çift katmanı gösterir. (F) Temizlenmemiş nanobar substratlar üzerinde SLB FRAP analizinin hızlandırılmış görüntülemesi. Beyazlatma bölgesi sarı kesikli bir daire ile gösterilir. (G) FRAP ölçümü ile normalleştirilmiş nanobar yoğunluk grafiği. Ölçek çubukları: 2 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Nanobar-SLB sistemi tarafından protein eğriliği algılama karakterizasyonu. (A) F-BAR (solda) ve IDRFBP17'nin (sağda) floresan görüntüleri SLB kaplı nanobarlarda (% 10 PS ve% 90 PC) birikir. Ölçek çubuğu: 2 μm. (B) F-BAR (sol üst) ve IDRFBP17'nin (sol alt) ortalama görüntüleri nanobarlarda ve karşılık gelen 3D yüzey grafiklerinde (sırasıyla sağ üst ve sağ alt) birikir. Ölçek çubuğu: 2 μm. (C) 300 nm genişliğindeki nanobar etrafındaki lipit çift katmanlı, F-BAR ve IDRFBP17 floresan yoğunluğunun uçtan merkeze oranı. İstatistiksel analiz için bir Welch'in t-testi yapıldı. p < 0.0001. (n = 3) (D) 200 nm ila 600 nm genişliklere sahip gradyan nanobar dizilerinin SEM görüntüsü. Ölçek çubuğu: 5 μm. (E) Protein yapısının ek açıklaması (üstte), lipid çift katmanının ortalama görüntüleri, IDR FBP17, F-BAR ve F-BAR + IDRFBP17 dağılımı, genişliği 200 nm ila 600 nm (orta) arasında değişen gradyan nanobarlarda ve her ortalama görüntünün nanoçubukları boyunca yoğunluk profilleri (altta). Ölçek çubuğu: 2 μm. (F) IDR FBP17, F-BAR ve F-BAR + IDRFBP17 normalleştirilmiş nanobar uç yoğunluğu, sırasıyla farklı nanobar genişlikleriyle ölçülür. Her veri SEM'± ortalaması olarak gösterilir (n ≥ 60). (G) IDRFBP17'nin tepe denklemi ile donatılmış bağlanma eğrisi. Her veri SEM'± ortalaması olarak gösterilir (n = 3). Bu rakam Su ve ark.22'den değiştirilmiş ve izin alınarak çoğaltılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Nanobar etrafındaki eğrilik algılama proteinlerinin membran bağlama dinamiği. (A-D) Nanobar üzerinde lipid çift katmanlı (A), F-BAR (B), IDR FBP17 (C) ve IDRFBP17 yıkanmış (D) FRAP analizinin hızlandırılmış görüntülemesi. Ağartma bölgesi kırmızı kesikli bir daire ile gösterilir. Ölçek çubuğu: 5 μm. (E) FRAP ölçümü ile normalleştirilmiş nanobar yoğunluk grafiği. Bu rakam Su ve ark.22'den değiştirilmiş ve izin alınarak çoğaltılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Protein eklemeden önce ve sonra membran difüzyonu. (A) GFP-His proteini eklenmeden önce (üstte) ve sonra (altta) nanobar etrafında 1 mol% 18: 1 DGS-NTA (Ni) ve 0.5 mol% Texas Red DHPE ile POPC lipid çift katmanı üzerinde FRAP testinin hızlandırılmış görüntülemesi. Beyazlatma bölgesi sarı kesikli bir daire ile gösterilir. (B) FRAP ölçümü ile normalleştirilmiş nanobar yoğunluk grafiği. Ölçek çubukları: 2 μm. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan nanobar-SLB sistemi, mevcut birkaç in vitro tahlildeki avantajların benzersiz bir kombinasyonunu sunmaktadır. Proteinlerin lipozom yüzdürme veya sedimantasyon testi olarak yüksek oranda kavisli membranlara tercihli bağlanmasını etkili bir şekilde ortaya çıkarır, ancak çok daha az numune gerektirir ve bireysel nanobarlarda daha doğru tanımlanmış eğrilik sunar 8,29. Ayrıca, SLB hareketli olduğundan ve sürekli olarak nanobarların tüm boyutlarını sıkıca kapsadığından, farklı eğriliklerdeki lipit bileşimi değişimi ve ışığın kırınım sınırının altındaki boyutlarla tespit edilemeyen morfolojik veya eğrilik değişiklikleri hakkında daha az endişe duyarak, SLiC testi olarak eşzamanlı karşılaştırma için çok çeşitli hassas kontrollü eğrilik sunar30 . Nanobar-SLB ayrıca kavisli membran üzerindeki proteinin dinamik davranışlarının tether çekme tahlilleri olarak gözlemlenmesine izin verir, ancak tüp üretiminin verimi ve optik yakalama manipülasyonundaki deneyimile sınırlı değildir13. SMrT testi yüksek verimde membran tüpleri üretmesine rağmen, membran eğriliği nanotüp boyunca değişir ve bu da proteinlerin eğrilik hassasiyetini incelemeyi zorlaştırır16. Daha da ilginci, desenli substrat 18,19,20,27 üzerindeki diğer SLB tabanlı sistemlerle karşılaştırıldığında, nanobar-SLB, çubuk ucundaki tanımlanmış eğriliğin yanında, yüzey yoğunluğu varyasyonlarının kantitatif analiz üzerindeki etkisini en aza indirmek için sıfır eğriliğin yerel kontrolü olarak etkili bir şekilde hizmet eden düz bir çubuk merkezi sağlar. Yüksek çözünürlüklü elektron ışını litografisi kullanarak eğrilik kombinasyonlarını özelleştirme yeteneği, yalnızca yerel sıfır eğrilik kontrollerini değil, aynı zamanda canlı hücre çalışmalarında daha önce gösterildiği gibi pozitif ve negatif eğrilikleri de üretebilir2.
Bu yöntemi kullanırken dikkat edilmesi gereken potansiyel sınırlamalar vardır. İlk olarak, çip üzerindeki nanofabrikasyon, temiz oda tesisleri ve ihtiyaç duyulan özel ekipmanlarla (özellikle bir E-beam yazıcı) nispeten karmaşık bir prosedürdür. Bu yüksek maliyet çipi yeniden kullanmamıza neden oldu; bu, talaş yüzeyinin temizlenmesi ve çipin PDMS ile monte edilmesinin tek seferlik kullanıma kıyasla daha uzun süre harcanmasına neden olur. Nanoçipin mevcudiyeti başka bir sınırlama türüdür. Çipi kullanırken yüzeyin tezgaha doğru bakması gibi yanlış çalışma, özellikle yüksek en boy oranına sahip yapılar için nanoyapı yıpranmasına neden olabilir. Ayrıca, substrat üzerinde oluşan lipit çift katmanı sürekli bir zardır; gerginlik her yere kolayca yayılabilir. Membran geriliminin manipülasyonunu gerektiren çalışmalar için, bağlı mikropipet sistemi aracılığıyla GUV'lardan çekilen tether gibi teknikler daha uygun çözümler sunar10.
En iyi sonuçları elde etmek için, aşağıdaki adımlar da çok önemlidir. (i) Vezikül boyutu SLB oluşumu için kritik öneme sahiptir31,32. Önceki literatür, daha küçük boyutlu veziküller (< 90 nm) için, dağılımlı bir kuvars kristali mikro terazisi (QCM-D) testi32 kullanılarak daha büyük boyuta kıyasla daha yüksek bir kaynaşma eğilimi göstermektedir. Böylece, 300 nm'lik LUV'larla karşılaştırıldığında, SLB oluşumu için ~ 50 nm çaplar daha kolay olacaktır. Bu sorun göz önüne alındığında, SLB oluşumu için homojen SUV'lar oluşturmak için hem donma-çözülme hem de ekstrüzyon adımlarında en az 20 kez gereklidir. FRAP testi, membran hareketliliğini doğrulamak için her deneyde de gereklidir. (ii) SUV hazırlığı sırasında, toz benzeri küçük parçacıkların kirlenmesini önlemek için tüm ekipman temiz tutulmalıdır. Özellikle mini ekstrüder için, iğneler kirli bir ortamda kolayca tıkanır. (iii) SUV'ları iyi kalitede hazırlamak için, lipit veziküllerinin tahrip olmasını önlemek için lipit karışımındaki kloroformun tamamen çıkarılması gerekir. (iv) Sürekli bir çift katman oluşturmak üzere verimli SUV kırılması için oldukça hidrofilik bir yüzey sağlamak amacıyla çipin plazma temizliğinin SLB oluşumundan önce taze olarak yapılması gerekir. Plazma işleminden sonra çevrede uzun süre maruz kalmak, toz parçacıklarının veya organik kalıntıların talaş yüzeyine spesifik olmayan bir şekilde bağlanmasına neden olarak yüzeyin hidrofilikliğini tehlikeye atabilir. (v) SLB oluşumu ve protein inkübasyonu için PDMS odasını monte etmek için, her bir PDMS parçasının temizliği ve düzlüğü, akışkan kanalın iyi bir şekilde kapatılmasını sağlamak için önemlidir. Odanın herhangi bir sızıntısı, SLB'nin kurumasına veya protein konsantrasyonunu değiştirmesine neden olabilir. (vi) Görüntüleme odağı ayarı, tutarlı yoğunluk ölçümü sağlamak için kritik öneme sahiptir, çünkü nanoçubuğun yüksekliği (600 nm), z ekseni33'teki lazer tarama konfokal mikroskobunun odak derinliği ile karşılaştırılabilir. Görüntülerdeki nanobar kenarlarının keskinliğini korumak için dizi yatay olarak her hareket ettiğinde odak yeniden ayarlanmalıdır.
Her şeyden önce, burada tanıtılan nanobar-SLB sistemi, membran eğriliği algılama proteinlerini incelemek için güçlü bir yöntem sağlar. Kavisli membran ile protein etkileşimini etkileyen çeşitli parametreler, protein 8,30'un eğriliğe duyarlı alanları (örneğin, BAR alanı ve amfifilik sarmal), membranın lipit bileşimi (örneğin, PS ve PIP2),27,34, pH, iyonik mukavemet ve ortamın sıcaklığı35,36 gibi bir dizi eğrilik boyunca nicel olarak incelenebilir. , karmaşık oluşum için protein-protein etkileşiminin yanı sıra (örneğin, CHMP2B ve CHMP2A, ESCRT-III-katalizörlü membran yeniden şekillendirme süreçlerine farklı şekilde katkıda bulunabilir)37,38. Dinamik çalışmalar ayrıca, membran bağlayıcı kinetik11, membran protein difüzyonu veya montaj 39'un yanı sıra enzimatik reaksiyonlar 40 veya faz ayırma davranışlı 13,41,42'yi araştırmak için nanobar-SLB sistemi kullanılarak da gerçekleştirilebilir. Ek olarak, yapay lipit çift katmanı genellikle canlı hücre zarı43'ten oldukça farklı olan aynı lipit bileşimini içeren her lipit tek katmanlı ile simetrik olarak kabul edilir. Plazma zarını daha iyi taklit etmek için asimetri çift katmanını indüklemek, yüzeyin malzemesini, tampon durumunu, lipit bileşimini veya sıcaklığını değiştirerek elde edilebilir44,45,46,47. Daha fazla çalışmayı hak eden kavisli membran üzerindeki protein davranışını incelemek için nanobar-SLB sisteminde asimetrik bir çift katmanın oluşturulup oluşturulamayacağını doğrulamak çok değerlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar bu çalışmada rakip bir finansal çıkar olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Nanyang NanoFabrication Centre (N2FC) ve Nanyang Teknoloji Üniversitesi'ndeki (NTU) Yıkıcı Fotonik Teknolojiler Merkezi'ne (CDPT), nanoyapı imalatını ve SEM görüntülemeyi destekledikleri için, protein saflaştırma için Biyolojik Bilimler Okulu NTU'daki Protein Üretim Platformu'na (PPP) ve konfokal mikroskop için Kimya ve Biyomedikal Mühendisliği NTU Okulu'na teşekkür ederiz. Bu çalışma, Singapur Eğitim Bakanlığı (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 ve MOE-T2EP30220-0009), Araştırma Mükemmeliyet Merkezleri programı kapsamında MOE finansmanı tarafından desteklenen Dijital Moleküler Analitik ve Bilim Enstitüsü (IDMxS), İnsan Sınırı Bilim Programı Vakfı (W. Zhao, RGY0088/2021), NTU Start-up Grant (W. Zhao) tarafından finanse edilmektedir. Araştırma bursu için Kimya ve Biyomedikal Mühendisliği NTU Okulu (X. Miao) ve araştırma bursu için Çin Burs Konseyi (J. Wu).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anhydrous Ethanol | Sigma-Aldrich | 100983 | |
| Aluminum foil | Diamond | RN0879999FU | |
| Amber Vial | Sigma-Aldrich | 27115-U | |
| Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 840032 | |
| 10 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211060804 | |
| 50 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211061706 | |
| 1000 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211065408 | The second container |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | V800117 | |
| Cotton buds | Watsons | ||
| 18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 790404 | |
| Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 840051 | |
| F-BAR | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| F-BAR+IDR | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GFP | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GFP-His | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GraphPad Prism | GraphPad | V9.0.0 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS) | Thermo Scientific | H325-500 | |
| IDR from human FBP17 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.50d | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss | LSM 800 with Airyscan | 100x (N.A.1.4) oil objective. |
| Methanol | Fisher scientific | 10010240 | |
| Mini-extuder | Avanti Polar Lipids, Inc. | 610000-1EA | |
| 1.5 mL Microtubes | Greiner | 616201 | |
| MATLAB | Mathworks | R2018b | |
| Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μm | Whatman | 800309 | |
| Phosphate Bufferen Saline (PBS) | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | 70013 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Base | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| Plasma Cleaner | HARRICK PLASMA | PDC-002-HP | |
| Quartz Nanochip | Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | |
| Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | T1395MP | |
| Tweezer | Gooi | PDC-002-HP | |
| Ultrasonic Cleaners | Elma | D-78224 | |
| Voterx | Scientific Industries | G560E | |
| Vacuum Desiccator | NUCERITE | 5312 | |
| Water Bath | Julabo | TW8 |
References
- McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).
- Zhao, W. et al. Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells. Nature Nanotechnology. 12 (8), 750-756 (2017).
- Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).
- Rosholm, K. R. et al. Membrane curvature regulates ligand-specific membrane sorting of GPCRs in living cells. Nature Chemical Biology. 13 (7), 724-729 (2017).
- Lou, H. Y. et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).
- Cail, R. C., Shirazinejad, C. R., Drubin, D. G. Induced nanoscale membrane curvature bypasses the essential endocytic function of clathrin. Journal of Cell Biology. 221 (7), e202109013 (2022).
- Mu, H. et al. Patterning of oncogenic ras clustering in live cells using vertically aligned nanostructure arrays. Nano Letter. 22 (3), 1007-1016 (2022).
- Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science. 303 (5657), 495-499 (2004).
- Bigay, J., Casella, J. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).
- Ebrahimkutty, M. P., Galic, M. Receptor-free signaling at curved cellular membranes. Bioessays. 41 (10), e1900068 (2019).
- Bhatia, V. K. et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. The EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
- Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of inhomogeneity in the lipid composition of individual nanoscale liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
- Prevost, C. et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nature Communications. 6, 8529 (2015).
- Simunovic, M. et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), 11226-11231 (2016).
- Holkar, S. S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Spatial control of epsin-induced clathrin assembly by membrane curvature. Journal of Biological Chemistry. 290 (23), 14267-14276 (2015).
- Dar, S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Use of the supported membrane tube assay system for real-time analysis of membrane fission reactions. Nature Protocols. 12 (2), 390-400 (2017).
- Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using patterned supported lipid membranes to investigate the role of receptor organization in intercellular signaling. Nature Protocols. 6 (4), 523-539 (2011).
- Lee, I. H., Kai, H., Carlson, L. A., Groves, J. T., Hurley, J. H. Negative membrane curvature catalyzes nucleation of endosomal sorting complex required for transport (ESCRT)-III assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (52), 15892-15897 (2015).
- Beber, A. et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).
- Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
- Li, X. et al. A nanostructure platform for live-cell manipulation of membrane curvature. Nature Protocols. 14 (6), 1772-1802 (2019).
- Su, M. et al. Comparative study of curvature sensing mediated by F-BAR and an intrinsically disordered region of FBP17. iScience. 23 (11), 101712 (2020).
- Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et Biophysica Acta. 858 (1), 161-168 (1986).
- Santoro, F. et al. Revealing the cell-material interface with nanometer resolution by focused ion beam/scanning electron microscopy. ACS Nano. 11 (8), 8320-8328 (2017).
- Platt, V. et al. Influence of multivalent nitrilotriacetic acid lipid-ligand affinity on the circulation half-life in mice of a liposome-attached His6-protein. Bioconjugate Chemistry. 21 (5), 892-902 (2010).
- Williams, D., Vicogne, J., Zaitseva, I., McLaughlin, S., Pessin, J. E. Evidence that electrostatic interactions between vesicle-associated membrane protein 2 and acidic phospholipids may modulate the fusion of transport vesicles with the plasma membrane. Molecular Biology of the Cell. 20 (23), 4910-4919 (2009).
- El Alaoui, F. et al. Structural organization and dynamics of FCHo2 docking on membranes. Elife. 11, e73156 (2022).
- Seu, K. J. et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).
- Hung, Y. F. et al. Amino terminal region of dengue virus NS4A cytosolic domain binds to highly curved liposomes. Viruses. 7 (7), 4119-4130 (2015).
- Hatzakis, N. S. et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
- Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).
- Jing, Y., Trefna, H., Persson, M., Kasemo, B., Svedhem, S. Formation of supported lipid bilayers on silica: relation to lipid phase transition temperature and liposome size. Soft Matter. 10 (1), 187-195 (2014).
- Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
- Itoh, T. et al. Dynamin and the actin cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane invagination by BAR and F-BAR proteins. Developmental Cell. 9 (6), 791-804 (2005).
- Florentsen, C. D. et al. Annexin A4 trimers are recruited by high membrane curvatures in giant plasma membrane vesicles. Soft Matter. 17 (2), 308-318 (2021).
- Sarkar, Y., Majumder, R., Das, S., Ray, A., Parui, P. P. Detection of curvature-radius-dependent interfacial pH/polarity for amphiphilic self-assemblies: positive versus negative curvature. Langmuir. 34 (21), 6271-6284 (2018).
- Raiborg, C., Stenmark, H. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature. 458 (7237), 445-452 (2009).
- Alqabandi, M. et al. The ESCRT-III isoforms CHMP2A and CHMP2B display different effects on membranes upon polymerization. BMC Biology. 19 (1), 66 (2021).
- Leitenberger, S. M., Reister-Gottfried, E., Seifert, U. Curvature coupling dependence of membrane protein diffusion coefficients. Langmuir. 24 (4), 1254-1261 (2008).
- Bozelli, J. C., Jr. et al. Membrane curvature allosterically regulates the phosphatidylinositol cycle, controlling its rate and acyl-chain composition of its lipid intermediates. Journal of Biological Chemistry. 293 (46), 17780-17791 (2018).
- Parthasarathy, R., Yu, C. H., Groves, J. T. Curvature-modulated phase separation in lipid bilayer membranes. Langmuir. 22 (11), 5095-5099 (2006).
- Yuan, F. et al. Membrane bending by protein phase separation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (11), e2017435118 (2021).
- London, E. Membrane structure-function insights from asymmetric lipid vesicles. Accounts of Chemical Research. 52 (8), 2382-2391 (2019).
- Rossetti, F. F., Textor, M., Reviakine, I. Asymmetric distribution of phosphatidyl serine in supported phospholipid bilayers on titanium dioxide. Langmuir. 22 (8), 3467-3473 (2006).
- Richter, R. P., Maury, N., Brisson, A. R. On the effect of the solid support on the interleaflet distribution of lipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 21 (1), 299-304 (2005).
- Wacklin, H. P., Thomas, R. K. Spontaneous formation of asymmetric lipid bilayers by adsorption of vesicles. Langmuir. 23 (14), 7644-7651 (2007).
- Lin, W. C., Blanchette, C. D., Ratto, T. V., Longo, M. L. Lipid asymmetry in DLPC/DSPC-supported lipid bilayers: a combined AFM and fluorescence microscopy study. Biophysical Journal. 90 (1), 228-237 (2006).
