Summary
Præsenteret her er en protokol, der bruger Leishmania store promastigotes til at bestemme binding, cytotoksicitet og signalering induceret af poredannende toksiner. Der gives et proof-of-concept med streptolysin O. Andre toksiner kan også bruges til at udnytte de genetiske mutanter, der er tilgængelige i L. major til at definere nye mekanismer for toksinresistens.
Abstract
At forstå funktionen og mekanismen af poredannende toksiner (PFT'er) er udfordrende, fordi celler modstår membranskader forårsaget af PFT'er. Mens biofysiske tilgange hjælper med at forstå poredannelse, er de ofte afhængige af reduktionistiske tilgange, der mangler det fulde supplement af membranlipider og proteiner. Dyrkede humane celler giver et alternativt system, men deres kompleksitet og redundans i reparationsmekanismer gør det vanskeligt at identificere specifikke mekanismer. I modsætning hertil tilbyder det humane protozopatogen, der er ansvarlig for kutan leishmaniasis, Leishmania major, en optimal balance mellem kompleksitet og fysiologisk relevans. L. major er genetisk medgørlig og kan dyrkes til høj densitet in vitro, og enhver påvirkning af forstyrrelser på infektion kan måles i etablerede murinemodeller. Derudover syntetiserer L. major lipider, der adskiller sig fra deres pattedyrs modstykker, hvilket kan ændre membrandynamikken. Disse ændringer i membrandynamikken kan undersøges med PFT'er fra den bedst karakteriserede toksinfamilie, kolesterolafhængige cytolysiner (CDC'er). CDC'er binder til ergosterol i Leishmania-membranen og kan dræbe L. store promastigotes, hvilket indikerer, at L. major er et egnet modelsystem til bestemmelse af de cellulære og molekylære mekanismer for PFT-funktion. Dette arbejde beskriver metoder til test af PFT-funktion i L. større promastigotes, herunder parasitkultur, genetiske værktøjer til vurdering af lipidfølsomhed, membranbindende assays og celledødsassays. Disse assays vil muliggøre hurtig brug af L. major som et kraftfuldt modelsystem til forståelse af PFT-funktion på tværs af en række evolutionært forskellige organismer og fællestræk i lipidorganisation.
Introduction
Poredannende toksiner (PFT'er) er den største familie af bakterielle toksiner1, men de mekanismer, hvormed de perforerer og ødelægger celler, er dårligt forstået. Den bedst undersøgte familie af poredannende toksiner er kolesterolafhængige cytolysiner (CDC'er). CDC'er syntetiseres primært af grampositive bakterier, herunder det forårsagende middel til nekrotiserende fasciitis, Streptococcus pyogenes2. S. pyogenes udskiller CDC streptolysin O (SLO), som binder til steroler i plasmamembranen i værtsceller som monomerer, oligomeriserer og indsætter ~ 20-30 nm porer i membranen1. Den rolle, som lipider spiller i denne proces, forbliver dårligt bestemt.
En tilgang til at studere lipid-CDC-interaktioner er brugen af kemisk definerede liposomer. Mens definerede liposomer giver information om de nødvendige tærskler for lipider for at opretholde toksinbinding og poredannelse3,4, rekapitulerer de ikke fuldt ud cellulære funktioner. For eksempel mangler rekonstituerede liposomer lipidasymmetrien hos pattedyrværter og lipidmodifikationer som reaktion på toksiner5. Et alternativ til liposomer er at bruge pattedyrcellelinjer. Mens disse cellelinjer er mere fysiologisk relevante, er der en stor grad af redundans i toksinfølende og resistensmekanismer2. Som følge heraf forbliver reparationsvejene, der bruges til at modstå CDC'er, dårligt bestemt. Især er Ca2+ tilstrømning den primære aktivator for membranreparation1. Nedstrøms for Ca2+ tilstrømning er flere veje aktiveret, herunder en ceramidafhængig reparation 6,7 og en MEK-afhængig reparationsvej6. Disse veje interagerer med andre proteineffektorer, herunder det endosomale sorteringskompleks, der kræves til transport (ESCRT)8, og annexiner 6,9,10. Dissekering af disse veje i pattedyrceller er udfordrende på grund af redundansen, som forvirrer datafortolkning.
En måde at afbalancere kompleksitet med enkelhed til dissekering af reparationsveje er brugen af enklere organismer, såsom protozopatogener i slægten Leishmania. Leishmania sp. forårsage leishmaniasis hos mennesker og andre dyr. Leishmaniasis spænder fra kutan leishmaniasis (selvbegrænsede hudlæsioner) til den dødelige viscerale leishmaniasis (hepatosplenomegali), afhængigt af arten og andre faktorer11. Leishmania major, det forårsagende middel til kutan leishmaniasis, overføres til mennesker via en sandfluevektor og bruges til at forstå Leishmania funktion og infektion12. Derudover er Leishmania sp. digenic12. De eksisterer som intracellulære pattedyrmakrofagparasitter kaldet amastigotes og som fritsvømmende, flagellerede promastigotes i sandfluen12. L. store promastigotes kan dyrkes i serum-supplerede medier såsom M199 til høj densitet13. Promastigotes er også genetisk medgørlige; Der findes mange gen-knockouts, herunder dem, der er rettet mod lipidbiosynteseveje13. Disse knockouts kan evalueres for vækst og forskelle i infektivitet og læsionsudvikling via infektion af Balb / c mus13.
Ud over den relative lethed af Leishmania-kulturen og rækkevidden af lipidbiosyntese knockouts har parasitten et enklere genom end pattedyr. Den bedst karakteriserede art af Leishmania er L. major, som har mange eksisterende genetiske værktøjer, såsom mutanter med defekt lipidmetabolisme14. Især er mange reparationsproteiner fraværende. L. major har til dato ikke identificeret homologer for vigtige pattedyrreparationsproteiner såsom annexiner. Dette muliggør karakterisering af evolutionært bevarede reparationsveje uden kompleksiteten af pattedyrsystemer. Imidlertid er reparationsveje ikke blevet karakteriseret i Leishmania til dato. Samtidig bevares vigtige signalveje, der er involveret i reparation, såsom MEK-stien6, i Leishmania sp.15,16, selvom homologer skal valideres. Den mitogenaktiverede proteinkinase (MAPK) vej er godt undersøgt i L. mexicana, hvor den bidrager til intracellulær overlevelse og termostabilitet i pattedyrceller og styrer metacyclogenese16. I Leishmania sp. er 10 af de 15 MAPK'er blevet karakteriseret17. LmMAPK9 og LmMAPK13 forventes at være de mest ligner pattedyr ERK1/2 baseret på identitet i den konserverede phosphoryleringslæbesekvens. Fosforyleringslæbesekvensen er TEY for både pattedyr ERK1/2 og LmMAPK9 og LmMAPK13. Imidlertid har otte af Leishmania MAPK'erne et TDY-fosforyleringsmotiv15. Mindst to homologer af MEK er blevet identificeret i Leishmania sp., LmxMKK18 og MEKK-relateret kinase (MRK1)19. Dette tyder på, at indsigt identificeret i Leishmania kunne oversættes til pattedyrsystemer. Hvor de ikke oversættes til pattedyrsystemer, repræsenterer de terapeutiske mål til behandling af leishmaniasis.
For at kunne bruge L. store promastigotes til at studere membranreparation og interaktioner med toksiner, medium-throughput teknikker er nødvendige. Mens levende cellebilleddannelse i høj opløsning muliggør visualisering af mærkede proteiner og membraner i realtid, er det lavt gennemløb og måler muligvis ikke cellulær overlevelse. Levedygtighedsanalyser med medium gennemstrømning inkluderer farvestofoptagelse målt ved flowcytometri, måling af mitokondrieaktivitet eller frigivelse af cellulære proteiner som lactatdehydrogenase (LDH). I pattedyrceller måler LDH-assays ikke kvantitativt celledød20. Desuden tillader populationsbaserede assays som LDH-frigivelse eller mitokondrieaktivitet ikke robust enkeltcelle- eller multiparametrisk analyse20. I modsætning hertil muliggør flowcytometribaserede assays multiparametrisk enkeltcelleanalyse20. Disse assays er imidlertid ikke blevet anvendt til at forstå toksinbiologi eller reaktioner på toksiner i L. større promastigotes.
I denne undersøgelse anvendes SLO som et værktøj til at forstå plasmamembranforstyrrelsen af sphingolipid null mutant af L. major i to forskellige buffere - M199-medierne, der rutinemæssigt bruges til at dyrke L. store promastigotes og den enklere Tyrodes buffer. Et medium-throughput flow cytometri assay er beskrevet og bruges til at generere toksin dosis-respons kurver. Data fra det cytometriske flow-assay modelleres til en logistisk kurve for at bestemme LC50-værdierne. Med disse oplysninger kan en sublytisk dosis SLO bestemmes, så MAPK-antistoffer kan valideres ved hjælp af western blotting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle passende retningslinjer og standard mikrobiologisk, sikkerheds- og cellekulturpraksis blev anvendt til brug og håndtering af RG2-patogenet Leishmania major og rekombinant DNA. Alle eksperimenter med levende L. major blev udført i et biosikkerhedsskab i et BSL-2-certificeret laboratorium. Arbejdet blev overvåget af Texas Tech University Institutional Biosafety Committee.
BEMÆRK: Fra et sikkerhedsperspektiv er levende L. større promastigotes risikogruppe 2 patogener. Håndter ved hjælp af passende indeslutning, forholdsregler og tilsyn fra Institutional Biosafety Committee (IBC). Håndtere giftige stoffer og kemikalier i overensstemmelse med institutionelle procedurer for giftige stoffer. Hvis der anvendes rekombinante toksiner, kan IBC-godkendelse og tilsyn være nødvendigt for rekombinant DNA-arbejde.
1. Dyrkning og tilberedning af L. større promastigotes
- Opnå eller fremstille og validere L. større genetiske mutanter som tidligere beskrevet ved hjælp af enten homolog rekombination eller CRISPR-baserede metoder13,21. Brug knockouts suppleret med genet tilføjet tilbage på et plasmid for at sikre specificitet af knockout.
- Kultur vildtype L. major og spt2- promastigotes ved 27 °C i komplet M199 medium. Kultur de episomale addback-celler (spt2-/+SPT2) i komplet M199 plus 10 μg/ml G418 (se tabel 1 og materialetabel).
BEMÆRK: Hele forsøgsopsætningen, der involverer eksperimenter med L. majorceller , skal udføres i et BSL2-certificeret biosikkerhedsskab. - Dyrk promastigoterne i komplet M199 medium22, indtil de når logfase (2-8 x 106 celler / ml), som bestemt af L. større vækstkurveassays udført tidligere23. Planlæg 1 x 10 5 celler for hver brønd for cytotoksicitet plus 5 x 105 celler til farvningskontrol. For western blot, planlæg 2 x 107 celler pr. Brønd.
BEMÆRK: Udfør cytotoksicitetsassay med to tekniske replikater. - For at verificere den korrekte celletæthed blandes en aliquot (10-40 μL) promastigotes med et lige stort volumen fikseringsmiddel (3,7% paraformaldehyd i 1x PBS). 10 μL af den faste prøve anbringes på hver side af hæmacytometeret.
FORSIGTIG: Formaldehyd er et giftigt kemikalie. Håndtere i overensstemmelse med institutionelle politikker for farlige kemikalier. - Udfør celletælling ved hjælp af et mikroskop ved 20x forstørrelse. Tæl alle cellerne i de 25 små firkanter i midten af hæmacytometeret. Gentag for firkanterne på begge sider og gennemsnit tællingerne.
BEMÆRK: Hvis variationen mellem tællinger er >10, skal du tælle og gennemsnit. Hvis det gennemsnitlige antal er <10 eller >100, skal du ændre fortyndingen og genoptællingen og derefter beregne dyrkningstætheden ved hjælp af følgende formel:
(Arkivfoto)
For eksempel, hvis der i gennemsnit er 250 Leishmania i 25 firkanter, er kulturtætheden 5 x 106 celler / ml. - Efter tælling overføres 5 x 106 celler til et 15 ml konisk rør og centrifugeres ved 1.500 x g i 8 minutter ved stuetemperatur for at pelletere cellerne.
- Kassér supernatanten ved hjælp af en 10 ml pipette og vælt kortvarigt cellepelleten. Tilsæt 5 ml 1x PBS til det samme rør og vask cellerne ved forsigtigt at invertere 3-6x. Centrifuge ved 1.500 x g i 8 minutter ved stuetemperatur for at pelletere cellerne.
- Supernatanten kasseres ved hjælp af en 10 ml pipette, og den 5 x 10 6-cellede pellet genudsættes i 5 ml medium (f.eks. M199 eller 1x Tyrodes buffer), der anvendes til forsøgene med en 5 ml pipette for at give en endelig koncentration på 1 x 106 celler/ml.
(Arkivfoto)2. Cytotoksicitetsassay
- Eksperimentel forberedelse
- Rens toksinet som tidligere beskrevet24, eller køb toksinet fra en leverandør. Aliquot i aliquots til engangsbrug og opbevares -80 °C i op til 1 år. Undgå flere fryse-optøningscyklusser.
- Bestem den hæmolytiske aktivitet for hvert toksin ved hjælp af humane røde blodlegemer (se Materialetabel)24.
BEMÆRK: Hæmolytisk aktivitet bruges, fordi den styrer for forskelle i aktivitet på grund af oprensning, mutationer osv. Artsvalget af erythrocytter kan ændre den hæmolytiske aktivitet (f.eks. Intermedilysin kræver humane røde blodlegemer). - Planlæg to tekniske replikater for hver tilstand, syv fortyndinger for dosis-responskurven og en nul-toksinkontrol.
BEMÆRK: Med vildtype (WT), spt2- og spt2-/+SPT2-promastigotes kan to behandlinger testes i en V-bund 96-brøndplade. F.eks. kan følsomheden over for medier sammenlignes (figur 1). I stedet for en V-bundplade kan der anvendes 1,2 ml mikrotiterrør (se Materialetabel). På grund af anskaffelsestiderne på cytometeret anbefales det ikke at køre mere end en plade ad gangen. - Bestem, hvilken analysebuffer der skal anvendes, baseret på de nødvendige testbetingelser og formålet med eksperimentet.
BEMÆRK: I dette eksempel sammenlignes to analysebuffere: M199 og Tyrodes buffer suppleret med levedygtighedsfarvestoffet propidiumiodid (PI). Kolesterol i serum vil forstyrre CDC-aktivitet24. - Beregn mængden af toksin, der er nødvendig, baseret på betingelserne og antallet af behandlede genotyper. Sørg for, at 50% specifik lysis forekommer halvvejs ned i fortyndingskurven.
BEMÆRK: For CDC'er vil en dobbelt seriel fortynding give et godt interval for senere logistisk modellering. For spt2-promastigotes er 4.000 HU/ml SLO den anbefalede startfortynding. Hvis der anvendes inaktive toksiner, kan der i stedet anvendes en masse svarende til den højeste dosis. - Planlæg et slutvolumen på 200 μL pr. brønd, og tilføj et lille volumen ekstra (50-100 μL) for at tage højde for pipettefejl.
BEMÆRK: Med tre genotyper, hver udført i to eksemplarer, vil der være seks prøver til seriefortyndingen. - Bestem den samlede mængde toksin, der er nødvendig ved hjælp af følgende formel:
(Arkivfoto)
hvor ActivityMax er den højeste anvendte koncentration (HU/ml) TotalFinalVolume er det samlede volumen (for seks prøver, 200 x 6 + 100 = 1.300 μL); ActivityStock er aktiviteten af toksinbestanden (HU/ml); og VolStockToxin er den mængde toksinbestand, der er nødvendig. - Forbered tilstrækkelig analysebuffer, der er nødvendig for eksperimentet. Suppler basalmediet med et levedygtighedsfarvestof og enhver Ca 2+ eller EGTA, der er nødvendig for at kontrollere Ca2+ niveauer. Vortex at blande.
BEMÆRK: For hver 10 ml tyrodes buffer tilsættes f.eks. 50 μL 2 mg/ml PI og 200 μL 100 mM CaCl 2, hvilket giver endelige koncentrationer på henholdsvis 10 μg/ml og2 mM. - Sørg for, at levedygtighedsfarvestoffet PI ikke er i konflikt med andre anvendte sonder, såsom til fluorescerende bindingsassays ved hjælp af Cy5- eller AlexaFluor647-konjugerede toksiner20,25.
- Planlæg toksinfortyndinger for at fremstille en 2x opløsning af toksin. Tilsæt analysebuffer til 1,5 ml centrifugerør og afkøles på is. Tilsæt kun toksinet umiddelbart før analysen påbegyndes.
BEMÆRK: I dette eksempel vil der blive tilføjet 1,3 ml analysebuffer til topfortyndingen, og der tilsættes 650 μL til seriefortyndinger for at fremstille 2x toksinopløsningen.
- Eksperiment
- Der reserveres 0,5 ml forarbejdede promastigotes fra trin 1,8 i et separat rør som "Ufarvet kontrol".
BEMÆRK: Denne prøve vil blive brugt til at opsætte gating på flowcytometeret. - Der tilsættes 2 mg/ml PI til en slutkoncentration på 10 μg/ml til de resterende promastigotes. Hvirvel i 3 s.
BEMÆRK: Efter tilsætning af PI til de forarbejdede promastigotes kan disse celler kun anvendes i en periode på 2,5 timer. Efter 2,5 timer begynder cellerne at dø, og resultaterne bliver fejlagtige. - Der tilsættes 1 x 105 (i 100 μL/brønd) forarbejdede promastigotes til hver brønd i en V-bund 96-brøndplade eller 1,2 ml mikrotiterrør (figur 1). Placer tallerkenen eller rørstativet på is i en vinkel på ca. 45° fra visning. Udfør arbejdet i et biosikkerhedsskab, når du håndterer Leishmania promastigotes.
- Tilføj 100 μL analysebuffer med PI til hvert nultoksinkontrolelement (sidste række). Kontroller, at betjeningsanordningen er tilføjet korrekt, ved visuelt at identificere rør med et samlet volumen på 200 μL, der ser mørkere ud.
- Fjern toksinaliquoterne fra -80 ° C, tø op på is og pool efter behov. Det i trin 2.1.5 beregnede toksinvolumen lægges til den højeste fortynding (fremstillet i trin 2.1.10). Derefter fortyndes toksinet serielt (figur 1). Pipette op og ned mindst 8x for at sikre blanding.
BEMÆRK: Udfør på is, fordi CDC'er hurtigt inaktiveres ved stuetemperatur. - Fra den laveste toksinkoncentration tilsættes hurtigt 100 μL toksin til den korrekte række (figur 1 og figur 2) og fortsætter, indtil alt toksinet er blevet tilsat til cellerne.
- Forsegl pladen med tætningstape. Inkuberes ved 37 °C i 30 min. Efter inkubationsperioden pakkes og transporteres pladen til flowcytometeret.
- Der reserveres 0,5 ml forarbejdede promastigotes fra trin 1,8 i et separat rør som "Ufarvet kontrol".
- Dataindsamling
- Opsæt flowcytometeret (se Materialetabel) og anskaffelsessoftware i henhold til producentens anvisninger og pr. facilitetspolitik. Udfør ikke flowcytometriproceduren uden forudgående træning på cytometeret.
BEMÆRK: I dette eksempel blev der brugt en 4-laser Attune NxT. PI blev indsamlet på YL-1-kanalen (ophidset af en 561 nm laser, passeret gennem en 577 LP, reflekteret fra 600 DLP og filtreret gennem 585/16 båndpas), selvom det brede spektrum af PI tillader indsamling på andre kanaler. - Ved hjælp af den ufarvede L. major promastigoteprøve indstilles portene til fremad- og sidespredning og de indledende fluorescerende parametre baseret på de valgte farvestoffer.
- Medtag en ekstra parameter, hvis det ønskes for prikplotter for at kontrollere autofluorescens (f.eks. "ingen plet") (figur 3).
BEMÆRK: I dette eksempel blev BL-1-kanalen (exciteret af en 488 nm laser, passeret gennem 495 DLP og 503 LP, reflekteret fra 555 DLP og filtreret via 530/30 bandpass) brugt. - Ved hjælp af enkeltfarvede kontroller skal du indstille portene til levedygtighedsfarvestoffet (PI i denne undersøgelse) og eventuelle fluorescerende mærkede toksiner. Overvåg fremadgående spredning versus tid for mikro-træsko.
BEMÆRK: PI vil svagt plette alle cellerne over ufarvede kontroller. Døde celler vil være let adskillelige, med forbigående permeabiliserede celler mellem populationer. - Anskaf >10.000 gated events for hver prøve på cytometeret.
BEMÆRK: Det anbefales at læse fra mest følsomme til mindst følsomme, men anskaffelsesrækkefølgen kan vendes for at bestemme enhver indvirkning af læserækkefølgen på prøveresultaterne. - Gem dataene, og eksporter efter behov til analyse.
- Opsæt flowcytometeret (se Materialetabel) og anskaffelsessoftware i henhold til producentens anvisninger og pr. facilitetspolitik. Udfør ikke flowcytometriproceduren uden forudgående træning på cytometeret.
- Analyse af data
BEMÆRK: I denne undersøgelse er Excel med Problemløser plug-in (se Tabel over materialer) blev anvendt til dataanalyse (se Supplerende fil 1).- Gate total, enkelt celle L. større promastigotes ved gating på fremad og side spredning og tid efter behov (figur 3). Brug højde eller areal som anbefalet til flowcytometeret.
BEMÆRK: For det flowcytometer, der anvendes her, er højde den anbefalede parameter i stedet for areal. - Identificer og gate døde celler som "PI high". Gate mellemliggende celler som "PI lav". PI-høje celler er døde celler, mens PI-lavceller er forbigående permeabiliserede26.
BEMÆRK: PI-høje celler viser typisk et 2-3 logskift fra negative celler. - Eksportér dataene til Excel. Få prøvens navn / ID og % PI høj for at bestemme drab.
BEMÆRK: Hvis fluorescerende toksiner blev brugt, vil den mediane fluorescerende intensitet (MFI) af levende, forbigående permeabiliserede og negative populationer være nødvendig. %PI lav kan eksporteres til forbigående permeabilisering. - Bestem den gennemsnitlige % PI høj for hver tilstand mellem de to tekniske replikater.
BEMÆRK: Hvis der er behov for gennemsnitlig MFI for fluorescerende toksiner, skal du også beregne dette. - Beregn %Specifik lysis fra %PI-højden ved hjælp af følgende formel24,25:
(Spørgsmål 3)
hvor PIhighxpt er %PI-højden for forsøgstilstanden og PIhighctl er %PI-højden for nul-toksinkontrollen. - Specifik lysis mod toksinkoncentration for dosis-responskurven (figur 4).
- Organiser dosis-responskurven i Excel til logistisk modellering. Medtag toksinkoncentration og gennemsnit% Specifik lysis sammen med eksperimentelle detaljer og / eller rå % PI høje beregninger (tabel 2).
- Kontrollér, at tilføjelsesprogrammet Problemløser er aktiveret.
BEMÆRK: For at aktivere Problemløser i desktopversionen af Excel skal du gå til Fil> indstillinger > tilføjelsesprogrammer og markere afkrydsningsfeltet Problemløser . Genstart Excel. - Mærk yderligere fire kolonner som "modelleret", "rester", "parametre" og "parameterværdier". Kontrollér, at de første kolonner svarer til de eksperimentelle parametre, toksinkoncentrationen og %Specifik lysis (tabel 2).
- Tilføj følgende parametre i kolonnen "parametre": L, k, c, SUM og LC50. Initialiser parametrene L, k og c ved at indtaste følgende værdier i kolonnen "parameterværdier": 100, 0,05, 1.000.
- I kolonnen "modelleret" skal du oprette logistikmodellen ved hjælp af følgende formel:
(Arkivfoto)
Indstil L, k og c til cellerne, der indeholder disse parametre i kolonnen "parameterværdier".
Indstil x til cellen, der indeholder toksinkoncentrationen.
BEMÆRK: For tabel 2, celle G4, er formlen som følger: =$J$3/(1+EXP(-$J$4*(D4-$J$5))) - Anvend denne ligning på alle %Specifikke lysisværdier undtagen kontrolelementet uden toksin.
- I kolonnen "residualer" beregnes kvadratet af forskellen mellem det modellerede tal og den faktiske specifikke lysis ved hjælp af følgende ligning:
(Eq. 5)
hvor y er den eksperimentelle %Specifik lysis; og m er den tilsvarende værdi i kolonnen "modelleret" beregnet i trin 2.4.10-2.4.11. - I kolonnen "parameterværdier" ud for "SUM" skal du summere alle værdierne i restkolonnen.
- I kolonnen "parameterværdier" ud for "LC50" initialiseres ligningen for at beregne LC50 ud fra de bestemte værdier. Dette løser Eq 4 for x , når m = 50.
(Arkivfoto)
For tabel 2 er Excel-formlen som følger: =J5-(LN(J3/(50)-1))/J4 - Åbn Problemløser fra fanen Data. Vælg målsætningen Angiv som den celle, der indeholder summen af de beregnede restbeløb. Indstil den til Min.
- Skift variabelcellerne for parameterværdierne L, k og c.
BEMÆRK: Løseren kan opføre sig bedre, hvis "Gør ikke-begrænsede variabler ikke-negative" efterlades markeret. - For negative k-værdier skal du ændre Eq 4 og Eq 6 ved at indregne -1 fra k for at ændre k til positiv. Brug GRG Nonlinear løsningsmetoden. Klik på Løs.
- Kontroller kurven, og at LC50 beregnes automatisk ved hjælp af Eq 6 (tabel 2). Kontroller pasformen ved grafisk at plotte både %Specifik lysis og modellering mod toksinkoncentration.
BEMÆRK: Det kan også kontrolleres ved at beregne R2 for kurven.
- Gate total, enkelt celle L. større promastigotes ved gating på fremad og side spredning og tid efter behov (figur 3). Brug højde eller areal som anbefalet til flowcytometeret.
(Arkivfoto)
(Spørgsmål 3)
(Arkivfoto)
(Eq. 5)
(Arkivfoto)3. Proteinanalyse af toksin-udfordrede L. store promastigotes
- Forbered L. større promastigotes som beskrevet i afsnit 1.
- Resuspenderer 2 x 107 WT, spt2- og spt2-/+SPT2 L. større promastigotes i 2 ml af den ønskede assaybuffer ved hjælp af en 5 ml pipette (f.eks. serumfri M199). Der tilsættes toksin til en endelig sublytisk koncentration, og der inkuberes ved 37 °C i 30 min.
BEMÆRK: For eksempel er en sublytisk dosis SLO til spt2-promastigotes 500 HU / ml. - Medtag andre genotyper og kontrol uden toksin.
- Promastigotes centrifugeres ved 1.500 x g i 10 minutter for at pelletere cellerne. Kassér supernatanten ved hjælp af en 10 ml pipette. Kør det lukkede rør, der indeholder cellepellet, hurtigt tre gange over en uregelmæssig overflade, såsom grillen i biosikkerhedsskabet, for at bryde cellepelleten op.
BEMÆRK: Cellepillen er næsten usynlig for det blotte øje. - Rekonstituer 1x SDS-PAGE prøvebuffer med 2-mercaptoethanol umiddelbart før brug og opvarm til 95 °C i 10 minutter før tilsætning til cellepellet. Resuspender cellepelleten i varm 1x SDS-PAGE prøvebuffer, og bland godt ved at pipettere op og ned. Den resuspenderede cellepellet opvarmes i 1x prøvebuffer ved 95 °C i 10 min.
BEMÆRK: Efter opløselighed i prøvebufferen opbevares prøverne på lang sigt ved -20 °C, hvis det er nødvendigt. - Forbered den løsende gel. Afgass alle komponenter undtagen ammoniumpersulfat (APS) og TEMED i 15 min.
- Tilsæt APS og TEMED umiddelbart inden gelen støbes. Overlejr forsigtigt den løsende gel med vand. Lad den løsende gel polymerisere, ~ 30-45 min.
- Dekanter vandet og forbered stablingsgelen. Tilsæt stablingsgelen, og pas på at undgå bobler. Indsæt en kam med det relevante antal brønde, og lad det polymerisere i 5 minutter. Overvåg polymerisation ved hjælp af enhver resterende stablingsgel.
- Saml gelen til kørsel af SDS-PAGE og tilsæt reservoirbuffer til kammeret.
- Der indlæses 10 μL af hver prøve pr. boring eller 8 μL af proteinstigen. Kør ved 180 V, indtil prøverne kommer ind i opløsningsgelen, og reducer derefter spændingen til ~ 160 V og kør, indtil farvestoffets front er ~ 0,5 cm fra kanten af pladen.
BEMÆRK: Den tid, det tager for prøverne at nå bunden, kan variere mellem 1-1,5 time. Tiden kan forlænges ved at reducere spændingen. Reducer aldrig spændingen til nul. Højere spændinger kan øge gel "smilende" og knække pladerne. - Overfør gelen enten til Coomassie-plet (til proteinfarvning) eller til 1x overførselsbuffer (til western blotting). Til Coomassie-farvning skal du plette natten over og derefter destain, image og tørre.
- For western blot skal du forberede overførselssystemet i henhold til producentens anvisninger.
- For en våd overførsel skal du bruge kold 1x overførselsbuffer og forvåde puder, filterpapir og nitrocellulose. For Bio-rad Protean III-systemet (se materialeoversigt), der anvendes her, kan filterpapiret skæres til 10 cm x 7,5 cm. Skær nitrocellulose til 9 cm x 6,75 cm.
BEMÆRK: Nitrocellulose er meget brandfarlig. Undgå åben ild og andre potentielle antændelseskilder. - Læg overførselskassetten ud med puder, filterpapir og nitrocellulose. Rul luftbobler ud. Tilsæt gelen forsigtigt.
- Tilsæt filterpapiret og rul luftbobler ud. Tilføj puden, luk kassetten, og indsæt den i holderen i den rigtige retning (sørg for, at nitrocellulose vender mod den røde terminal). Tilsæt en rørestang og en ispose til siden, og top reservoiret med kold 1x overførselsbuffer. Overfør ved 110 V i 90 min.
BEMÆRK: Den varme, der genereres under overførslen, kan påvirke overførslen negativt. For at sikre en god overførsel skal du altid bruge kold 1x overførselsbuffer. - Fjern nitrocellulose og plet med Ponceau-opløsning i ~ 5 min. Skyl med ultrarent vand. Marker proteinstigen med blyant og trim pletten efter behov. Fjern pletten ved hjælp af den resterende overførselsbuffer.
BEMÆRK: Ponceau kan genbruges mange gange. - Nitrocellulose blokeres i 25 ml 5% BSA i 1x TBST ved 4 °C med rystelser natten over. Kassér derefter blokeringsopløsningen og tilsæt primært antistof (1:1.000) i 1% BSA i 1x TBST. Ryst ved 4 °C natten over.
BEMÆRK: Det primære antistof kan gemmes ved -20 °C og genbruges flere gange. - Vask nitrocellulosen 3x i 10 minutter hver i 1x TBST med rystelser. Kassér vasken og tilsæt 10 ml HRP-konjugeret sekundært antistof (1:10.000) i 1% BSA i 1x TBST. Ryst ved stuetemperatur i 1 time. Vask nitrocellulosen 3x i 10 minutter hver i 1x TBST med rystelser.
- Forbered ECL-reagens umiddelbart før billeddannelse af nitrocellulose. Umiddelbart før billeddannelse dekanteres TBST'en, og ECL-reagenset tilsættes nitrocellulose. Ryst i 1 min. Billede gelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Øget promastigotefølsomhed over for SLO i Tyrodes buffer sammenlignet med M199
SLO-følsomheden af L. større promastigotes blev sammenlignet mellem forskellige assaybuffere. Wild-type, spt2- og spt2-/+SPT2 promastigotes blev udfordret med SLO i serumfri M199 eller Tyrodes buffer suppleret med 2 mM CaCl2 i 30 minutter før analyse på et flowcytometer. Egnede parasitter til analyse var enkeltceller identificeret ved hjælp af fremad/side spredningsprofiler (figur 3A, B). Data blev indsamlet ved hjælp af kanalerne BL1 (488 excitation, 530/30 emissionsfilter) som autofluorescenskontrol og YL1 (561 nm excitation, 585/16 emissionsfilter) til PI. BL1 blev brugt til at identificere potentielle autofluorescens- eller kompensationsproblemer (x-akse i figur 3C-E). Brugen af 561 nm-linjen reducerede udluftning fra PI til BL1-kanalen. Fraktionen af døde celler blev bestemt for hver tilstand, og %Specifik lysis blev bestemt. Wildtype og spt2-/+SPT2 promastigotes var resistente over for SLO i serumfri M199, men havde mindre (<20%) specifik lysis i Tyrodes buffer (figur 4A). De sphingolipid-mangelfulde spt2-promastigotes var følsomme over for SLO i både serumfri M199 og Tyrodes buffer (figur 4). For at kvantificere stigningen i følsomhed fra Tyrodes buffer sammenlignet med serumfri M199 var dosis-responskurven tilpasset en logistisk model, og LC50 blev beregnet for hver tilstand (figur 4B). Spt2-promastigotes var ca. otte gange mere følsomme over for SLO i Tyrodes buffer end i M199 (figur 4B). Disse data viser, at toksinfølsomheden kan variere afhængigt af den anvendte buffer. Kurvetilpasning gør det muligt at sammenligne ændringer i hele dosis-responskurven. Således muliggør flowcytometri et medium-gennemstrømningsassay for at sammenligne toksinfølsomheden af L. større promastigotes under forskellige forhold.
MEK pathway aktivering i L. større uafhængig af toksin udfordring
Enkeltcelledataene om cellulær overlevelse fra cytotoksicitetsassayet muliggør nedstrøms assays ved sublytiske toksindoser. For eksempel kan L. major analyseres for biokemiske veje ved western blotting efter toksinudfordring. MEK-vejen aktiveres under membranreparation i pattedyrceller6. Det vides ikke, om denne vej aktiveres efter SLO-udfordring i L. major, eller om de kommercielt tilgængelige antistoffer genkender nogen L. større MAPK-homologer. WT, spt2- og spt2-/+SPT2-promastigotes blev udfordret med en sublytisk (500 HU/ml) dosis SLO og analyseret ved western blotting. Et ~120 kDa bånd blev observeret for phospho-MEK i L. major promastigotes (figur 5). For total MEK blev der observeret bånd på ~120 kDa og ~55 kDa (figur 5), som er i overensstemmelse med størrelserne på henholdsvis MRK1 og LmxMKK. Phospho-ERK detekterede lignende bånd, mens ERK-antistoffarvningen ikke var robust i dette assay (figur 5). Lipophosphoglycan (LPG) og tubulin blev også blottet som belastningskontrol. Disse data afslører vigtigheden af at validere antistoffer til brug i L. major.
Figur 1: 96-brøndsplader muliggør en bestilt opsætning til cytotoksicitetsassays. Cytotoksicitetsanalysen er opdelt i seks kolonner med to tekniske replikater hver. Med kontroller gør dette det muligt at teste to betingelser pr. Plade. I dette eksempel sammenlignes L.major promastigotes resuspenderet i serumfri M199 med dem i Tyrodes buffer. Genotyperne følger rækkefølgen af vildtype (WT) (grøn), spt2- (rød) og spt2-/+SPT2 (blå). Toksinet (SLO) tilsættes således, at koncentrationen løber fra den højeste koncentration øverst på pladen til bunden, hvilket efterlader den sidste række som en kontrol uden toksin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Konsekvent opsætning muliggør reproducerbare cytotoksicitetsresultater. Efter beregning af den nødvendige mængde toksin fremstilles mængden af analysebuffer, der er nødvendig for en 2x opløsning. Levedygtighedsfarvestoffet (PI) og CaCl2 tilsættes efter behov, og bufferen dispenseres i 1,5 ml rør. Efter vask og genanvendelse i analysebuffer udleveres lige mange L. dur-promastigotes i hver brønd på 96-brøndspladen . Toksinet tilsættes til analysebufferen og fortyndes serielt fra den højeste toksindosis (1. rør) ned til den laveste dosis (7. rør) umiddelbart før tilsætning til cellerne. Toksinet tilsættes til celler i 96-brøndspladen, der begynder fra bunden af pladen ved den laveste toksindosis (7. række) og arbejder op til den højeste dosis (1. række). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Gating-strategien skelner mellem levende og døde populationer af celler. L. større promastigotes farvet med PI og udfordret med SLO blev analyseret ved flowcytometri. (A,B) Gating-strategien identificerer enkeltceller fra total L. major baseret på fremad- og sidespredning. (C-E) PI-farvning vurderes derefter, og celler er indhegnet i PI-høje, PI-lave og PI-negative populationer. Repræsentative data for (C) intet toksin, (D) 1.000 HU/ml og (E) 4.000 HU/ml SLO vises. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Tyrodes buffer øger følsomheden af L. major promastigotes sammenlignet med M199. Wildtype (WT), spt2-, og spt2-/+SPT2 L. større promastigotes i serumfri M199 eller Tyrodes buffer suppleret med 2 mM CaCl2 blev udfordret med SLO ved de angivne koncentrationer ved 37 ° C i 30 minutter, og PI-optagelse blev analyseret ved flowcytometri. Den %Specifikke Lysis blev beregnet. En logistisk model blev konstrueret og LC50 beregnet for spt2-mutanterne. Grafer viser (A) betyder ± SEM eller (B) individuelle eksperimenter fra tre uafhængige eksperimenter. En studerendes uparrede t-test med Welchs korrektion blev brugt til LC50-værdierne. ** p < 0,01 Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Phospho-ERK og phospho-MEK1/2 detekterer L. større proteiner uafhængigt af sphingolipider eller toksinudfordring. Wildtype (WT), spt2-, og spt2-/+SPT2 L. større promastigotes blev udfordret i 30 min ved 37 °C med eller uden 500 HU/ml SLO i serumfri M199 suppleret med 2 mM CaCl2. Cellelysaterne blev opløst af SDS-PAGE, overført til nitrocellulose og undersøgt for phospho-MEK (pMEK), total MEK, phospho-ERK (pERK), total ERK, lipophosphoglycan (LPG) eller tubulin efterfulgt af HRP-konjugerede sekundære antistoffer og ECL. En repræsentativ plet fra to uafhængige eksperimenter er vist i hvert tilfælde. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Buffer- og mediesammensætninger. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Eksempellayout til Excel-beregninger. Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende fil 1: Excel-regneark med formler. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse blev metoder til undersøgelse af PFT'ers molekylære mekanismer og funktioner beskrevet ved anvendelse af det humane patogen Leishmania major som et modelsystem. Der blev udviklet et cytometribaseret cytotoksicitetsassay med medium gennemstrømning til måling af enkeltcellelevedygtighed. Levedygtighed er kvantitativ på befolkningsniveau, fordi LC50-værdier kan beregnes ud fra dosis-responskurven ved hjælp af logistisk modellering. Som et principbevis blev et flowcytometrisk assay brugt til at illustrere, at valget af medier kan ændre vildtype og sphingolipid-mangelfuld L.major følsomhed over for SLO og til at bestemme den sublytiske toksindosis i hvert medium. Som et principielt bevis i nedstrøms assays blev phospho-MAPK og phospho-ERK antistoffer testet i L. større promastigotes under toksinudfordring. Samlet set er L. store promastigotes et patogent relevant og genetisk medgørligt modelsystem, der kan bruges til bedre at forstå mekanismerne og funktionerne i toksinmedieret skade på celler.
Flowcytometrianalysen giver høj fleksibilitet. Andre levedygtighedsfarvestoffer kan erstattes af PI, hvis det ønskes. I pattedyrceller blev der ikke observeret forskelle i rapporteringsevnen for en række levedygtighedsfarvestoffer20. Valget af toksin, L. major genotype, tilsætning af eventuelle behandlinger og valg af assaybuffer kan varieres efter behov. Toksinbinding kan vurderes enten parallelt med eller i stedet for cytotoksicitet, hvis det anvendte toksin er konjugeret til en fluorofor, såsom Cy5. For L. større genotyper er det vigtigt at inkludere supplerede stammer for at sikre, at fænotypen skyldes genet slået ud. I denne proof-of-concept-undersøgelse gav basismediet, der blev brugt til dyrkning af L. major, M199, mere beskyttelse til L. major promastigotes end Tyrodes buffer. Tyrodes buffer øgede følsomheden af spt2-mutanten af L. major promastigotes sammenlignet med brugen af serumfri M199, et basalt medie, der bruges til at udbrede L. major promastigotes in vitro. Dette tyder på, at der er en eller flere cytoprotektive komponenter i M199. To potentielle cytoprotektive midler er glycin eller alanin, som er cytoprotektive i andre pattedyrsystemer27,28. Samlet set giver flowcytometricytotoksicitetsanalysen en fleksibel platform til analyse af forskellige toksiner, tilstande og parasitgenotyper.
Koblingen af det flowcytometriske assay med logistisk modellering giver forbedret information om cellemodtagelighed for PFT'er. For det første blev hæmolytiske enheder anvendt i stedet for masse for aktive toksiner. Dette muliggjorde normalisering af dataene på tværs af forskellige toksinpræparater og konsistente analyseresultater og muliggjorde en direkte sammenligning af drab mellem toksiner og mål. Mens specifik lysis blev brugt til at analysere toksinets bidrag til dødelighed, giver de kontroller, der er nødvendige for hver tilstand, information om baseline-drab. Hvis et middel er specifikt giftigt, vises det i disse kontroller. Specifik lysis på tværs af flere koncentrationer muliggør oprettelse af en dosis-respons-kurve. Dosis-respons-kurver er afgørende for fortolkning af toksinaktivitet. I mange tilfælde vil laboratorier rapportere forskelle i toksinfølsomhed ved en enkelt koncentration. Afhængigt af den valgte del af dosis-responskurven kan denne forskel forvrænges for at give et hvilket som helst indtryk af følsomhed eller ønsket resistens. Analyse af hele dosis-responskurverne kan ske gennem logistisk modellering. Logistisk modellering er ligetil ved hjælp af let tilgængelig software og giver yderligere information om LC50, kurvens stejlhed (k) og den maksimale lysis (L). Forskelle i alle disse parametre kan bruges til at bestemme statistisk signifikans mellem kurverne. Ændringer i maksimal lysis kan være nyttige for delvist aktive toksiner, inaktive toksiner eller resistente celletyper. Samlet set blev der tilvejebragt kvantitative metoder til måling af ændringer i cytotoksicitet.
På trods af fordelene ved at bruge et kvantitativt, medium-throughput flow cytometrisk cytotoksicitetsassay, er der forbehold at overveje, når du bruger dette assay. Især begrænser manglen på serum inkubationstiderne til 1-2 timer. På senere tidspunkter komplicerer højere baggrundsdød fortolkningen af resultater. Fjernelse af serum er nødvendig for CDC'er, fordi kolesterolet i serumet hæmmer CDC'er24. Andre serumfaktorer kan også ændre cellefølsomheden over for toksiner. En anden udfordring er koncentrationen af calcium, der anvendes i analysen. Mens membranreparationsassays typisk bruger 2 mM Ca 2+ til at efterligne ekstracellulær Ca2+, kan buffere med højt calciumindhold risikere calciumaflejring i flowcytometeret, hvilket kan forårsage celleklumpning og / eller tilstoppe mikrofluidikken. Rengøring af cytometeret med 2 mM EDTA inden rengøring med Hellmanex III (se Materialetabel) og/eller blegemiddel reducerer opbygningen af Ca2+. En sidste advarsel er til den logistiske modellering. Problemløser-pluginet vil til tider sidde "fast" i en lokal minimumsværdi, der ikke giver en optimal pasform. I disse tilfælde kan manuel ændring af parametrene og genkørsel af Problemløser forbedre modellen. Når den fulde logistiske kurve ikke er angivet, kan Problemløser også ekstrapolere store værdier for L. Det er vigtigt at indsamle nok datapunkter til at generere en komplet logistisk kurve. Hvis dosis-responskurven ikke let kan modelleres med en logistisk kurve, kan LC 50-værdierne forblive udefinerede (f.eks. > 4.000 HU/ml), eller en anden kurve kan være egnet til dataene.
Når den sublytiske dosis af SLO var bestemt, kunne cellulære reaktioner på SLO testes. Et principbevis blev tilvejebragt ved at teste antistoffer i MEK-ERK-vejen i L. major, fordi MEK-aktivering styrer ~ 70% af reparation mod SLO i pattedyrceller6. Fosfo-MEK-antistoffet detekterede et ~ 120 kDa-bånd, der er i overensstemmelse med MRK1. Robust phosphorylering af LmxMKK-homologen, forventet ved 55 kDa, blev ikke påvist. MEK-antistoffet detekterede imidlertid bånd i overensstemmelse med både MRK1 og LmxMKK. Fosfo-ERK-antistoffet detekterede også bånd ved ~ 120 kDa og 55 kDa. 55 kDa-båndet er i overensstemmelse med størrelsen på MAPK5. ERK-antistoffet var ikke robust i dette assay. Massespektrometri eller andre metoder ville være nødvendige for at bekræfte identiteten af disse proteiner. Fosforyleringen af leishmaniale homologer af MEK1/2 og ERK1/2 blev påvist uafhængigt af toksinudfordringen. Samlet set blev en sublytisk dosis toksin bestemt ved flowcytometri brugt til at detektere kinaser i et nedstrøms assay, som western blotting.
Der findes også forbehold med western blot-analyserne. Især er de fleste kommercielle antistoffer ikke rejst specifikt mod leishmaniale proteiner. I stedet skal antistoffer rettet mod homologer i andre organismer valideres og titreres først. Prøveforberedelse kan have indflydelse på det endelige udfald. Reduktionsmidlet i prøvebufferen, 2-mercaptoethanol, skal tilsættes umiddelbart før tilsætningen af SDS-prøvebufferen til cellepelleten. Mens resuspenderede cellepiller kan opbevares ved -20 ° C, overlever de ikke mange fryse- / optøningscyklusser. Primære antistoffer, der er målrettet mod homologe proteiner som MAPK i Leishmania , skal inkuberes med blotterne natten over for bånd af højere kvalitet på western blots.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dette arbejde blev støttet af National Institute of Allergy And Infectious Diseases fra National Institutes of Health tilskud R21AI156225 til PAK og KZ (co-I) og R01AI139198 til KZ (co-I). CH vil gerne anerkende Institut for Biovidenskab for den undervisningsassistent, der blev leveret i løbet af denne undersøgelse.
Finansieringsorganerne havde ingen rolle i udformningen af undersøgelsen; i indsamling, analyse eller fortolkning af data; i skrivningen af manuskriptet; heller ikke i beslutningen om at offentliggøre resultaterne. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis finansieringsorganernes officielle synspunkter. Forfatterne erklærer, at de ikke har konkurrerende interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke medlemmer af Keyel- og Zhang-laboratorierne for deres kritiske gennemgang af manuskriptet. Forfatterne takker College of Arts and Sciences Microscopy for brugen af faciliteter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.2 mL microtiter (Marsh) tubes | Fisher | 02-681-376 | Cytotoxicity assay |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | Toxin dilutions |
| 15 mL centrifuge tube | Avantor VWR (Radnor, PA) | 89039-666 | To hold cells and media |
| 1x Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399 | For cell processing |
| 3% H2O2 | Walmart (Fayetteville, AR) | N/A | For ECL |
| 5x M199 | Cell-gro | 11150067 | Basal growth media for L. major promastigotes |
| Biosafety cabinet | Baker | To culture cells in sterile conditions | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher | BP1605-100 | Fraction V acceptable purity |
| CaCl2 | Fisher | BP510-100 | Stock concentration 100 mM |
| Centrifuge | Thermo Fisher | Heraeus Megafuge 40R | To pellet the cells from culture |
| Cy5 Mono-reactive dye pack | Cytiva (Marlborough, MA) | PA25031 | Fluorophore label for toxins |
| Digital dry bath | Benchmark | BSH1002 | To denature protein samples |
| EGTA | Amresco | 0732-100G | Stock concentration 0.5 M |
| Excel | Microsoft (Redmond, VA) | Data analysis software | |
| Flow cytometer (4-laser Attune NxT) | Fisher | Cytometer for data acquisition | |
| FlowJo | BD (Ashland, OR) | Software | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | Fixative for counting cells |
| G418 | Fisher | BP673-1 | Selection agent for cells |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939 | Dilute 1:4 for cleaning cytometer |
| Hemacytometer | Fisher | 0267151B | For counting cells |
| Human red blood cells | Zen-bio (Durham, NC) | SER-10MLRBC | To validate toxin activity |
| Ice bucket | |||
| Light microscope | Nikon | Eclipse 55i | To visualize cells |
| Nitrocellulose | Fisher | 88018 | For probing proteins via antibodies |
| Pipettors and tips | Avantor VWR | To dispense reagents | |
| Power supply | Bio-Rad | To run SDS-PAGE and transfers | |
| Propidium iodide | Biotium | 40016 | Stock concentration 2 mg/mL in water |
| Protein ladder | Bio-Rad | 161-0373 | To determine molecular weight of proteins |
| SDS-PAGE Running Apparatus (Mini Protean III) | Bio-Rad | 165-3302 | To separate proteins based on their size |
| Sealing tape | R&D | DY992 | To seal plates with cells |
| Streptolysin O C530A plasmid insert | Cloned into pBAD-gIII vector (Reference: 7) | ||
| Streptolysin O C530A toxin | Lab purified | Specific activity 4.34 x 105 HU/mg | |
| Swinging bucket rotor | Thermo Fisher | 75003607 | To centrifuge cells |
| V-bottom plate | Greiner Bio-one | 651206 | For cytotoxicity assay |
| Vortex | Benchmark | BV1000 | To mix cells |
| Western blot imaging system (Chemi-doc) | Bio-Rad | To visualize proteins by western blot | |
| Western Blot Transfer Apparatus (Mini Protean III) | Bio-Rad | 170-3930 | Transfer proteins to nitrocellulose |
| Whatman Filter paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030-700 | Used in transfer of proteins to nitrocellulose |
| Antibody | |||
| Anti-ERK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9102S | Rabbit (1:1000 dilution) |
| Anti-lipophosphoglycan (LPG) antibody | CreativeBioLabs | Cat# WIC79.3 | Mouse (1: 1000) |
| Anti-MEK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9122L | Rabbit (1:1000) |
| Anti-mouse IgG, HRP conjugate | Jackson Immunoresearch | Cat#715-035-151 | Donkey (1:10000) |
| Anti-phosphoERK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9101S | Rabbit (1:1000) |
| Anti-pMEK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9121S | Rabbit (1:1000) |
| Anti-rabbit IgG, HRP conjugate | Jackson Immunoresearch | Cat#711-035-152 | Donkey (1:10000) |
| Anti-tubulin antibody | Sigma | Cat# T5168 | Mouse (1: 2000) |
| Leishmania major Genotypes | Reference: 13 | ||
| Episomal addback (spt2-/+SPT2) | Δspt2::HYG/Δspt2:PAC/+pXG-SPT2 | ||
| Serine palmitoyltransferase subunit 2 knockout (spt2-) | Δspt2::HYG/Δspt2::PAC | ||
| Wild type (WT) | LV39 clone 5 (Rho/SU/59/P) |
References
- Thapa, R., Ray, S., Keyel, P. A. Interaction of macrophages and cholesterol-dependent cytolysins: The impact on immune response and cellular survival. Toxins. 12 (9), 531 (2020).
- Limbago, B., Penumalli, V., Weinrick, B., Scott, J. R. Role of streptolysin O in a mouse model of invasive group A streptococcal disease. Infection & Immunity. 68 (11), 6384-6390 (2000).
- Farrand, A. J., et al. The cholesterol-dependent cytolysin membrane-binding interface discriminates lipid environments of cholesterol to support beta-barrel pore insertion. Journal of Biological Chemistry. 290 (29), 17733-17744 (2015).
- Soltani, C. E., Hotze, E. M., Johnson, A. E., Tweten, R. K. Structural elements of the cholesterol-dependent cytolysins that are responsible for their cholesterol-sensitive membrane interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (51), 20226-20231 (2007).
- Schoenauer, R., et al. Down-regulation of acid sphingomyelinase and neutral sphingomyelinase-2 inversely determines the cellular resistance to plasmalemmal injury by pore-forming toxins. FASEB Journal. 33 (1), 275-285 (2019).
- Ray, S., Roth, R., Keyel, P. A. Membrane repair triggered by cholesterol-dependent cytolysins is activated by mixed lineage kinases and MEK. Science Advances. 8 (11), (2022).
- Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Draeger, A. Fluorescent annexin A1 reveals dynamics of ceramide platforms in living cells. Traffic. 9 (10), 1757-1775 (2008).
- Jimenez, A. J., et al. ESCRT machinery is required for plasma membrane repair. Science. 343 (6174), 1247136 (2014).
- Demonbreun, A. R., et al. An actin-dependent annexin complex mediates plasma membrane repair in muscle. Journal of Cell Biology. 213 (6), 705-718 (2016).
- Wolfmeier, H., et al. Ca(2)(+)-dependent repair of pneumolysin pores: A new paradigm for host cellular defense against bacterial pore-forming toxins. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (2), 2045-2054 (2015).
- Bravo, F., Sanchez, M. R. New and re-emerging cutaneous infectious diseases in Latin America and other geographic areas. Dermatologic Clinics. 21 (4), 655-668 (2003).
- Manfredi, M., Iuliano, S. Cutaneous leishmaniasis with long duration and bleeding ulcer. Clinical Microbiology Open Access. 05, 2-6 (2016).
- Zhang, K., et al. Sphingolipids are essential for differentiation but not growth in Leishmania. EMBO Journal. 22 (22), 6016-6026 (2003).
- Zhang, K. Balancing de novo synthesis and salvage of lipids by Leishmania amastigotes. Current Opinions in Microbiology. 63, 98-103 (2021).
- Kaur, P., Goyal, N. Pathogenic role of mitogen activated protein kinases in protozoan parasites. Biochimie. 193, 78-89 (2022).
- Wiese, M. Leishmania MAP kinases--Familiar proteins in an unusual context. International Journal of Parasitology. 37 (10), 1053-1062 (2007).
- Brumlik, M. J., Pandeswara, S., Ludwig, S. M., Murthy, K., Curiel, T. J. Parasite mitogen-activated protein kinases as drug discovery targets to treat human protozoan pathogens. Journal of Signal Transduction. 2011, 971968 (2011).
- Wiese, M., Kuhn, D., Grunfelder, C. G. Protein kinase involved in flagellar-length control. Eukaryotic Cell. 2 (4), 769-777 (2003).
- Agron, P. G., Reed, S. L., Engel, J. N. An essential, putative MEK kinase of Leishmania major. Molecular Biochemistry of Parasitology. 142 (1), 121-125 (2005).
- Ray, S., Thapa, R., Keyel, P. A. Multiple parameters beyond lipid binding affinity drive cytotoxicity of cholesterol-dependent cytolysins. Toxins. 11 (1), (2018).
- Beneke, T., et al. A CRISPR Cas9 high-throughput genome editing toolkit for kinetoplastids. Royal Society Open Science. 4 (5), 170095 (2017).
- Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression. Molecular and Cellular Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).
- Moitra, S., Pawlowic, M. C., Hsu, F. F., Zhang, K. Phosphatidylcholine synthesis through cholinephosphate cytidylyltransferase is dispensable in Leishmania major. Scientific Reports. 9, 7602 (2019).
- Keyel, P. A., Heid, M. E., Watkins, S. C., Salter, R. D. Visualization of bacterial toxin induced responses using live cell fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (68), 4227 (2012).
- Romero, M., et al. Intrinsic repair protects cells from pore-forming toxins by microvesicle shedding. Cell Death & Differentiation. 24 (5), 798-808 (2017).
- Keyel, P. A., et al. Streptolysin O clearance through sequestration into blebs that bud passively from the plasma membrane. Journal of Cell Science. 124, 2414-2423 (2011).
- Dong, Z., Patel, Y., Saikumar, P., Weinberg, J. M., Venkatachalam, M. A. Development of porous defects in plasma membranes of adenosine triphosphate-depleted Madin-Darby canine kidney cells and its inhibition by glycine. Laboratory Investigations. 78 (6), 657-668 (1998).
- Loomis, W. P., den Hartigh, A. B., Cookson, B. T., Fink, S. L. Diverse small molecules prevent macrophage lysis during pyroptosis. Cell Death & Disease. 10 (4), 326 (2019).
