Summary
Her rapporterer vi en protokol til kvantificering og differentiering af myokardie B-lymfocytter baseret på deres placering i det intravaskulære eller endotelrum ved hjælp af flowcytometri.
Abstract
En voksende mængde beviser viser, at B-lymfocytter spiller en vigtig rolle i forbindelse med myokardiefysiologi og myokardietilpasning til skade. Litteraturen rapporterer imidlertid kontrasterende data om forekomsten af myokardie-B-celler. B-celler er rapporteret at være både blandt de mest udbredte immunceller i gnaverhjertet eller at være til stede, men med en markant lavere forekomst end myeloide celler, eller at være ret sjældne. Tilsvarende har flere grupper beskrevet, at antallet af myokardie-B-celler stiger efter akut iskæmisk myokardieskade, men en gruppe rapporterede ingen ændringer i antallet af B-celler i det skadede myokardie. Implementering af en delt, reproducerbar metode til vurdering af forekomsten af myokardiale B-celler er afgørende for at harmonisere observationer fra forskellige forskningsgrupper og dermed fremme udviklingen af undersøgelsen af B-celle myokardieinteraktioner. Baseret på vores erfaring stammer de tilsyneladende kontrasterende observationer, der er rapporteret i litteraturen, sandsynligvis fra det faktum, at murine myokardie B-celler for det meste er intravaskulære og forbundet med det mikrovaskulære endotel. Derfor er antallet af B-celler, der genvindes fra et murinhjerte, udsøgt følsomt over for de perfusionsbetingelser, der anvendes til at rense organet og til den anvendte fordøjelsesmetode. Her rapporterer vi en optimeret protokol, der tager højde for disse to kritiske variabler på en bestemt måde. Denne protokol muliggør reproducerbar, flowcytometribaseret analyse af antallet af murine myokardie-B-celler og giver forskere mulighed for at skelne ekstravaskulære vs. intravaskulære myokardie-B-celler.
Introduction
B-lymfocytter er højt specialiserede immunceller, der spiller en vigtig rolle i både adaptive og medfødte immunresponser1. Der er to hovedpopulationer af B-celler: en mindre population af B1-celler, der for det meste produceres i embryonalt liv, og en overvejende population af B2-celler, der produceres i voksenlivet i knoglemarven1. Efter modning i knoglemarven migrerer B-celler til primære og sekundære lymfoide organer. Derfra recirkulerer de kontinuerligt mellem lymfoide organer, der rejser gennem blodkar og lymfekar2. B-celler udtrykker specifikke antistoffer på deres overflade, som fungerer som receptorer. Når B-celler støder på et antigen, der binder til deres receptor, kan et aktiverende signal udløses. Aktiverede B-celler migrerer enten til det væv, hvor antigenet blev fundet, eller går tilbage til knoglemarven, hvor de kan modnes til antistofproducerende plasmaceller 3,4.
For nylig er det blevet værdsat, at hjertet har en betydelig population af B-celler. Undersøgelser af gnavere har vist, at B-celler koloniserer hjertet tidligt under embryonal udvikling5, og at myokardieassocierede B-celler for det meste er intravaskulære, naive B2-celler klæbet til endotelet6,7, med en lille procentdel af B1-celler7. Der er stadig mange områder med usikkerhed, men de tilgængelige data indikerer, at B-celler spiller en vigtig rolle både i det naive hjerte og i forbindelse med myokardietilpasning til skade.
Undersøgelser i det naive murinhjerte har vist, at myokardie B-celler ved baseline for det meste er placeret i det intravaskulære rum, klæbet til endotelet (>95% af murine hjerte B-celler viste sig at være placeret i det intravaskulære rum). Disse B-celler viste sig at have genekspressionsmønstre, der adskiller sig fra cirkulerende B-celler isoleret fra det perifere blod. Analyse af naive hjerter fra dyr uden B-celler og syngeneiske kontroller viste, at dyr, der manglede B-celler, havde mindre hjerter og højere udstødningsfraktion6. Alt dette tyder på, at B-celler kan modulere myokardievækst og / eller myokardiefunktion, og at ikke kun interstitielle, men også intravaskulære B-celler kan være ansvarlige for sådanne observationer. B-celler viste sig også at modulere fænotypen af myokardieresidente makrofager8.
Flere undersøgelser har vist, at B-celler spiller en vigtig rolle i forbindelse med myokardietilpasning til skade 8,9,10,11,12,13. B-celler akkumuleres forbigående i det skadede hjerte, sandsynligvis gennem en CXCL13-CXCR5-afhængig mekanisme11,13. Derfra fremmer B-celler negativ hjerteremodellering gennem flere mekanismer, der inkluderer cytokinmedieret monocytrekruttering 9,12. Derudover kan B-celler producere antistoffer mod hjerteproteiner, der kan fremme udvidelsen af hjerteskader og negativ hjerteremodellering gennem flere mekanismer 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . B-celler kan også udøve beskyttende virkninger på det skadede hjerte gennem udskillelsen af IL-1010.
Efterhånden som antallet af grupper, der undersøger B-cellernes rolle i det naive og skadede hjerte, vokser, bliver det mere og mere vigtigt at definere fælles protokoller for korrekt at kvantificere og vurdere myokardie-B-celler og dermed undgå uoverensstemmelser, der allerede er begyndt at dukke op i litteraturen. Indtil videre er B-celler faktisk både rapporteret at være en af de mest udbredte immunceller i gnaverhjertet7 og at være til stede med en markant lavere forekomst end myeloide celler 26,27 eller at være ret sjældne 28. Tilsvarende har flere grupper beskrevet, at antallet af myokardie-B-celler stiger efter akut iskæmisk myokardieskade 7,9,13, men en gruppe rapporterede ingen ændringer i antallet af B-celler i det skadede myokardium29. Undersøgelser af hjerteimmunceller giver sjældent detaljer om perfusionsbetingelser, og der er ingen konsensus om fordøjelsesbetingelserne. Da en stor del af B-cellerne i gnaverhjertet er intravaskulære, og ekstraktion af immunceller fra myokardiet er stærkt afhængig af den anvendte fordøjelsesmetode, kan de forskelle, der rapporteres i litteraturen, være resultatet af forskelle i organperfusion og vævsfordøjelse.
Præsenteret her er en detaljeret metode til flowcytometribaseret kvantificering af murinmyokardie B-celler, der maksimerer udbyttet af B-cellegendannelse ved at optimere perfusions- og fordøjelsesbetingelser og tillader diskrimination af intravaskulære vs. ekstravaskulære myokardiale B-celler6. Denne protokol er en tilpasning og optimering af andre lignende protokoller, der skelner mellem intravaskulære og interstitielle immunceller 28,30,31.
I denne protokol standardiserer vi myokardieperfusion for at eliminere B-celler, der flyder i det intravaskulære rum uden at fjerne biologisk relevante B-celler, der klæber til det mikrovaskulære endotel. Ved at bygge videre på tidligere protokoller, der har beskrevet brugen af intravenøs injektion af antistoffer til at skelne intravaskulære fra interstitielle immunceller32, og drage fordel af det faktum, at B-celler udtrykker overflademarkøren B22033, demonstrerer vi, hvordan man skelner mellem intravaskulære vs. ekstravaskulære myokardie-B-celler gennem intravaskulær injektion af et B220-specifikt antistof umiddelbart før dyreofring og hjerteperfusion. Denne protokol er relevant for forskningen fra enhver videnskabsmand, der er interesseret i at inkludere analysen af myokardiale B-celler i det naive og skadede hjerte. Den udbredte implementering af denne protokol vil reducere uoverensstemmelser mellem forskergrupper, vil muliggøre analyse af ændringer i de intravaskulære og ekstravaskulære myokardie-B-cellepuljer og dermed styrke udviklingen af opdagelser inden for hjerteimmunologi.
Sammenfattende repræsenterer protokollen en optimeret arbejdsgang til at kvantificere og analysere myokardiale B-celler via flowcytometri og samtidig skelne mellem celler placeret i det ekstravaskulære rum og det intravaskulære rum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter beskrevet i dette manuskript blev udført med godkendelse af IACUC ved Johns Hopkins University School of Medicine.
1. præparater
- Forbered FACS-bufferen som beskrevet i tabel 1.
- Sørg for, at der er nok CO2 til at aflive dyrene.
- Forbered dissektionsrummet (placer bænkpuden og placer tape og dissektionsværktøjer i nærheden).
- Mærk de 15 ml rør, læg 3 ml HBSS med calcium og magnesium i hvert rør (se materialetabel) og læg dem på is (et rør pr. hjerte og et ekstra rør til referencegruppen / flowcytometrikontrollerne). Fyld også de små (35 mm) petriskåle med HBSS.
- Tænd for den temperaturstyrede ryster, indstil den til 37 °C, og forafkøl centrifugen ved en temperatur på 4 °C.
- Klargør sprøjtepumpen, og indstil flowhastigheden til 3 ml/min. Fyld en 20 ml sprøjte med HBSS, prim rørledningen med buffer, og fjern eventuelle bobler.
2. Intravaskulær B-cellefarvning (in vivo)
- Vej en 12 uger gammel hanmus af C57BL/6J-stammen. Læg en 3/10 cc insulinsprøjte med 100 μL af B220-antistoffortyndingen (1:10, i PBS). Dæk sprøjten med aluminiumsfolie for at beskytte mod lys.
- Anæstetiser en mus.
- Påfør en intraperitoneal injektion af 2% 2,2,2-tribromethanol med en dosis på 400 mg/kg og vent 10-20 min.
BEMÆRK: Overvåg musens vejrtrækning og bevægelse. Når musen holder op med at bevæge sig, skal du stimulere smerter ved at klemme tåen; Fraværet af en tilbagetrækningsrefleks indikerer tilstrækkelig anæstesi. - Hvis der ikke opnås tilstrækkelig bedøvelse inden for 20 minutter, kan der administreres en yderligere dosis bedøvelse på 100 mg / kg, og der skal foretages en vurdering af musekinetik, abstinensrefleks og åndedræt hvert 5. minut.
- Påfør en intraperitoneal injektion af 2% 2,2,2-tribromethanol med en dosis på 400 mg/kg og vent 10-20 min.
- Placer musen på laboratoriebænken på en bænkpude skråt mod den ene side, træk forsigtigt ned i ryggens hud og tryk let kroppen mod bænken for at få øjet til at stikke ud.
- Det fortyndede B220-antistof fra trin 2.1 injiceres ved retroorbital injektion.
- Før sprøjten ind i øjet 45° fra musens hoveds sagittale plan. Injicer langsomt opløsningen. Hvis der mærkes modstand, skal du fjerne sprøjten og gå ind igen. Vent i 2 min.
BEMÆRK: Langvarig inkubationstid ville bringe evnen til at diskriminere intravaskulære vs ekstravaskulære B-celler i fare, da det ville give tid til det injicerede antistof til at diffundere uden for vaskulaturen.
- Før sprøjten ind i øjet 45° fra musens hoveds sagittale plan. Injicer langsomt opløsningen. Hvis der mærkes modstand, skal du fjerne sprøjten og gå ind igen. Vent i 2 min.
- Aflive musen i henhold til IACUC-reglerne.
- Åbn CO2 -strømmen til eutanasikammeret med en hastighed på 0,5 l / min eller den anbefalede strømningshastighed baseret på størrelsen af dit kammer.
- Placer musen i kammeret i den anbefalede tid, og sørg for, at den ikke længere trækker vejret. Fjern det og udfør cervikal dislokation som en sekundær metode til eutanasi.
- Når musen er aflivet, skal du straks fortsætte med organhøst og perfusion.
3. Indsamling af hjerte
- Bryst åbning.
- Hold musens hud med tang i det epigastriske område. Lav en 2 mm åbning i huden ved hjælp af en saks og brug tangen til at skrælle huden væk for at afsløre fascialaget, et skinnende gennemsigtigt lag, af brystet og maven. Skær ved epigastrium gennem fascia og peritoneum for at åbne abdominalvæggen og afsløre xiphoidprocessen. Klem xiphoidprocessen ved hjælp af hæmostatiske tang.
- Med saksen skal du lave et lodret snit gennem brystvæggen på niveau med midterklavikulær linje på hver side og løfte den forreste brystvæg for at afsløre mediastinumindholdet ved hjælp af hæmostatiske tang som vægt for at opretholde åbningen.
- Hjerte perfusion og ekstraktion.
- Brug tang til at fjerne fedt eller thymisk væv, der omgiver hjertet.
- Hold aorta sikkert bagfra ved hjælp af tang. Indfør kanylen (25 G) i hjertets spids. Perfus med 3 ml HBSS med en hastighed på 3 ml/min.
BEMÆRK: Overvåg perfusionen. Leveren skal fylde, og blod i koronarbeholderne skal fjernes helt. Brug af en sprøjtepumpe, der er kalibreret til 1 ml / minut, anbefales for at opretholde et stabilt flow. - Klip aorta ved hjælp af en saks og tag hjertet ud. Vask hjertet i petriskålen med HBSS for at fjerne eventuelt resterende blod. Brug saks og tang til at fjerne fedt, bindevæv og thymus og tørre hjertet. Væg det isolerede hjerte og noter vægten i milligram. Hak hjertet ved stuetemperatur i små stykker (1-2 mm) med et blad.
BEMÆRK: Voksne musehjerter kan veje mellem 0,090-0,210 mg. - Mål massen af hjertevæv og anbring 60 mg af det hakkede hjerte, der skal fordøjes, i et 15 ml rør med 3 ml HBSS. Behold det resterende hjertevæv og læg det i et rør mærket "Referencekontrolvæv"; Dette vil blive brugt til kompensationskontrol for levende dødt signal og autofluorescens.
4. Hjertefordøjelse og cellefarvning
- Der tilsættes enzymer til hvert rør, der indeholder hakket væv (se tabel 1). Der tilsættes 0,5 μL/mg DNase 1 (300 enheder til 60 mg hjertevæv), 0,5 μL/mg collagenase II (625 enheder til 60 mg hjertevæv) og 0,2 μL/mg hyaluronidase (50 enheder til 60 mg hjertevæv) til røret.
- Anbring fordøjelsesreaktionen i rysteren i 30 minutter ved 300 o / min. Juster rystestativet til ca. 25° hældning.
- Der tilsættes 7 ml HBSS til hvert af 15 ml reaktionsglassene, og der centrifugeres ved 250 x g i 5 minutter ved 4 °C med acceleration og brud indstillet til moderat eller langsomt. Supernatanten dekanteres, og hver pellet resuspenderes i 5 ml ACK-lysisbuffer for at fjerne de røde blodlegemer. Inkuber i ACK-lysisbufferen i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Tilsæt 10 ml PBS til hvert rør, bland og filtrer derefter i et 50 ml rør med en 40 μm si. Sørg for, at alt snavs er inde i filterkammeret. Knus snavs på filteret med et sprøjtestempel, indtil det er helt opslæmmet i filterkammeret.
- Tilsæt PBS gennem filteret, indtil lydstyrken når 25 ml pr. Hjerte; Dette gør det muligt for de suspenderede celler at passere gennem filteret. Der tilsættes yderligere 25 ml PBS til referencekontrolrøret, og volumen deles op i forskellige rør (25 ml hver). Mærk et af rørene "Ufarvet" og det andet som "Live-dead". Der centrifugeres ved 250 x g i 5 minutter ved 4 °C.
BEMÆRK: På dette tidspunkt skal du forberede fortyndingen til den levende døde plet (fortynding: 1:500 i 1x PBS). - Supernatanten dekanteres, pellets resuspenderes i det ufarvede rør i 100 μl PBS og hver af de andre pellets i 100 μl af den levende døde pletfortynding. Inkuber på is i 30 minutter i mørke, dæk isspanden med aluminiumsfolie.
- Der tilsættes 500 μL FACS-buffer til hver prøve, og den overføres til et mærket FACS-rør gennem et 40 μm filter. FACS-glassene centrifugeres ved 250 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten kasseres. Pellet resuspenderes i 500 μL FACS-buffer.
- Der tilsættes 50 μL Fc-blokeringsopløsning (se tabel 1) til hvert glas, undtagen ufarvede og levende døde rør. Bland og inkuber i 5 min.
- Der tilsættes 50 μL antistofblandingsopløsning (se tabel 1) til hvert rør, bortset fra de ufarvede og levende døde rør, og der inkuberes i 30 minutter i mørke og dækkes isspanden med aluminiumsfolie.
- Der tilsættes 2 ml FACS-buffer til hvert rør, og centrifuge ved 250 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten fjernes, og der resuspenderes i 300-500 μL FACS-buffer.
5. Flowcytometri
- Indstillinger for opsætning af instrumentkontrol.
BEMÆRK: I denne protokol analyseres prøven med et 4 lasere Cytek Aurora flowcytometer. Et andet passende flowcytometer kan bruges til at detektere markørerne af interesse.- Åbn instrumentstyringssoftwaren (se Materialetabel). Øverst i vinduet skal du vælge fanen Erhvervelse og klikke på Ny +. Et vindue kaldet Opret nyt eksperiment vises.
- I sektionen Bibliotek i feltet Type til filtrering skal du skrive PE, PerCP-Cy5.5, BV421, Alexa Fluor 700 og Zombie Aqua og klikke på Tilføj efter at have skrevet hver. Fluorofornavnene skal ses til højre. Klik derefter på Næste for at fortsætte til fanen Gruppe .
- Klik på symbolet med et rør under fanen Gruppe for at tilføje hjertet til analysen.
- Klik på + Reference gruppe, og et vindue vises. Vælg Zombie Aqua i kolonnen fluorescerende tag, vælg Celler i kolonnen Kontroltype, og klik derefter på Gem.
- Klik på Næste > fanen Markører ; En tabel vises med navnene på fluoroforerne. Indtast den tilsvarende cellemarkør i den første række i hver fluoroforkolonne, og skriv Enter: CD45 for PerCP-Cy5.5; CD19 til BV421; CD11b til Alexa Fluor 700; B220 til PE; og levende-død for Zombie Aqua.
- Klik på Næste to gange for at gå til fanen Anskaffelse . Skriv 10.000.000 i Hændelser, der skal registreres for eksperimentgruppen, og skriv 200.000 i samme felt for referencegruppelinjen. Klik på Gem og åbn. De andre indstillinger skal forblive som standard, Stoptid til 10.000 og Stoplydstyrke til 3.000.
- Klik nederst til venstre på Instrumentkontrol. Indstil spænding til FSC-50, SSC-175, SSC-B-175. Vælg derefter anskaffelseskontrolelementet. For indstillingen Flowhastighed skal du vælge Høj i rullemenuen.
- Få referenceprøver med et cytometer og bland i software.
- Vortex det ubejdsede hjerterør, og placer det sikkert på prøveinjektionsporten (SIP). Sørg for, at den grønne indikatorpil peger på den korrekte prøve, klik derefter på Start i kontrolpanelet til anskaffelse i cytometersoftwaren, og vent, indtil hændelserne er registreret. Gør det samme for det levende dødfarvede hjertevæv.
- Vælg menuen Unmix , og indstil følgende kontrolelementer:
- Markér afkrydsningsfelterne for PE, PerCP-Cy5.5, BV421 og Alexa Fluor 700 i kolonnen fra biblioteket. Sørg for, at Zombie Aqua ikke er markeret i samme kolonne. Nederst skal du kontrollere muligheden for Autofluorescens som et fluorescerende mærke.
- Klik på Næste for at fortsætte til fanen Identificer positive/negative populationer . I denne fane vises et plot af FSC-A vs. SSC-B-A. Klik og træk polygonpunkterne for at vælge et område mellem 1,0 M og 4,0 M på FSC-A-aksen og mellem 0,2 M og 3,0 M på SSC-B-A-aksen.
- I det næste plot til højre vises V5-A på X-aksen. Flyt portene for at vælge halvdelen af toppen yderst til højre som positiv og en region på venstre side af plottet som negativ. I plottet med titlen Referencegruppe - Ufarvet skal du vælge en population i et lignende interval. Til dette skal det ufarvede ikke indstilles positivt-negativt.
- Erhverv eksperimentelle prøver.
- For hvert rør, der indeholder en prøve til en individuel mus, hvirvel røret og placer det sikkert på SIP. Sørg for, at den grønne indikatorpil peger på den korrekte prøve, klik derefter på Start i kontrolpanelet til anskaffelse i cytometersoftwaren, og vent, indtil hændelserne er registreret.
- Gating strategi.
- Vælg fanen Standardublandet regneark . Opret et FSC-A vs. SSC-A-plot ved hjælp af prikplotværktøjet øverst. Vælg hændelser, der er højere end 0,4 M på FSC-A-aksen og højere end 0,8 M på SSC-A-aksen ved hjælp af polygonmarkeringsværktøjet. Dobbeltklik i dette valg, og et nyt plot vises.
- Fra det nyoprettede plot skal du højreklikke på X-akseetiketten og vælge AF-A; højreklik på Y-akseetiketten, og vælg Live-dead plet. Klik på rektangelvalgsværktøjet øverst, og vælg alle begivenhederne under 105 på live-dead-aksen, der svarer til det nedre live-dead-signal. Dobbeltklik i dette valg, og et nyt plot vises.
- Højreklik i den nye afbildning for at vælge PerCP-Cy5.5-A for X-aksen og SSC-A for Y-aksen . Brug værktøjet til valg af rektangel til at markere de hændelser, der er højere end 104 på PerCP-Cy5.5-A-aksen, og som svarer til de CD45-positive celler. Dobbeltklik på valget, og et nyt plot vises.
- I det nye plot skal du højreklikke for at vælge FSC-A for X-aksen og FSC-H for Y-aksen. Brug polygonvalgsværktøjet til at vælge de hændelser, der følger en tendens, hvor FSC-A-værdi og SSC-A-værdi er de samme; med dette fjernes celledubletterne, og populationen i udvælgelsen omtales som CD45+ populationen. Dobbeltklik på markeringen for at få vist et nyt plot med CD45+ populationen.
- Fra CD45+-befolkningsplottet skal du højreklikke for at vælge BV421 på X-aksen vs. SSC-A på Y-aksen. Brug polygonmarkeringsværktøjet til at vælge populationen til højre på BV421-aksen . Dette er B-cellepopulationen. Dobbeltklik to gange i denne population for at oprette to nye plots med B-cellepopulationen.
- Højreklik for at konfigurere det første B-cellediagram med PE-A ved X-aksen og BV421-A på Y-aksen. Populationen til højre svarer til de intravaskulære B-celler, og populationen til venstre repræsenterer de interstitielle B-celler. Brug markeringsværktøjet Polygon til at foretage et valg af begge.
- Højreklik for at konfigurere det andet B-celleplot med Alexa Fluor 700-A på X-aksen og SSC-A på Y-aksen . Populationen til venstre svarer til CD11b-cellerne, og begivenhederne til højre (hvis nogen) svarer til CD11b+-cellerne.
- Højreklik på hvert valg, og klik derefter på Gate Properties. Klik på Antal og % forælder for at få vist størrelser og procenter. Registrer antallet af hændelser og procentdele til yderligere dataanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når erhvervelsen er afsluttet, og alle hændelser er indsamlet, skal dataene analyseres i henhold til standard flowcytometripraksis. Analysens fokus vil variere afhængigt af det individuelle mål for hvert eksperiment. I dette tilfælde blev kvantificering af intravaskulære og ekstravaskulære B-celler forfulgt, og det blev udtrykt som antallet af celler pr. Mg væv.
Når du bruger et spektralcytometer, anbefales det at starte analysen med en indledende gating for at fjerne snavs med størrelser, der ikke er i et område svarende til immunceller, efterfulgt af fjernelse af live-dead plet+ signalet. Dette muliggør påvisning af en ren population af CD45-positive celler svarende til leukocytter (figur 1). Efter fjernelse af dubletter i et naivt uskadt hjerte forventes det, at ca. 20% af CD45+ cellerne vil være CD19+ B-celler (figur 2A, 18,1% B-celler i dette repræsentative eksperiment). Af disse celler er i gennemsnit 5,5% placeret i det interstitielle rum, mens 94,5% er placeret i det intravaskulære rum (figur 2B). Fra hele B-cellepopulationen, der findes i hjertet, svarer kun ca. 1,6% til B1-celler baseret på overflademarkøren CD11b (som typisk anses for tilstrækkelig til at klassificere en murin CD19+-celle som en B1-celle med en høj grad af tillid 1,34,35), og de øvrige 98,4% svarer til B2-celler (figur 2C).
Figur 1: Flowcytometri-gating-strategi, der bruges til at detektere og karakterisere myokardialassocierede B-celler. (A) FSC-A vs. SSC-A: Plottet viser alle de indsamlede begivenheder, og det valgte område tegnes for at berige analysen med begivenheder, der ligger inden for leukocytternes størrelsesområde. (B) Autofluorescens vs. levende-død farvning: Det valgte område svarer til det nedre live-døde signal. Porten trukket fjerner døde celler og nogle andre cellerester, der binder til den levende døde farvning. (C) CD45-signal vs. SSC-A: Det valgte område svarer til CD45+-cellerne (dvs. myokardieleukocytter). (D) FSC-A vs. FSC-H: Denne port er tegnet for at fjerne celledubletter (ikke-valgte hændelser). (E) CD19-signal vs. SSC-A: Det valgte område svarer til myokardie-B-celler. (F) B220 vs. CD19: Området inde i den sorte firkant svarer til de intramyokardiale B-celler (CD19+, B220-), og området inde i den røde firkant svarer til den intravaskulære B-cellepopulation. (G) CD11b vs. SSC-A: Området inden for den sorte cirkel svarer til CD11b + (B1-cellerne), og området inden for den røde cirkel svarer til CD11b- (B2-cellerne). De procentdele, der vises i hvert panel, repræsenterer den gennemsnitlige procentdel, som den viste population repræsenterer fra forældrepopulationen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative plots, der rapporterer det gennemsnitlige antal B-celler pr. milligram myokardievæv. (A) Gennemsnitligt antal CD45+ og CD19+ celler/mg murin myokardievæv. Den viste procentdel svarer til procentdelen af celler fra forældrepopulationen (CD45+). (B) Gennemsnitligt antal CD19+ celler og procentdelen af de B-celler, der er i det interstitielle (ekstravaskulære) rum i intravaskulære rum. (C) Absolut antal og procentdel af myokardie B-celler, der udtrykker markører for B1- eller B2-celler. Fejllinjer svarer til standardfejlen i middelværdien. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Denne tabel indeholder de opløsninger og reagenser, der er nødvendige for proceduren. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En voksende mængde beviser indikerer, at B-celler spiller en vigtig rolle i forbindelse med myokardiefysiologi og myokardieombygning / tilpasning til skade 7,8,9,10,11,12,13,36. Flowcytometri er et fremragende værktøj til at studere immuncellepopulationer i ethvert væv og næsten et obligatorisk værktøj til enhver undersøgelse, der fokuserer på B-celler i hjertet.
Den nye litteratur om B-celler og hjertet rapporterer allerede kontrasterende fund om meget grundlæggende aspekter, såsom antallet af B-celler i hjertet og ændringer i myokardie-B-celleantal med skade. B-celler er blevet rapporteret som den mest udbredte immuncelle i gnaverhjerter7. Andre undersøgelser evaluerede imidlertid deres relative forekomst sammenlignet med andre myeloide celler og viste markant lavere tal26,27. Pinto et al.26 fandt, at B-celler udgjorde omkring 9% af de samlede leukocytter, mens Yu et al.27 rapporterede 10%. Adamo et al.7 rapporterede, at den gennemsnitlige procentdel af B-celler i forhold til leukocyttal var omkring 20%, hvilket er meget tæt på de 18,1%, der er rapporteret i dette manuskript. Andre undersøgelser har rapporteret, at B-celler har en meget lav forekomst i myokardiet28.
Flere kritiske eksperimentelle trin kunne forklare variabiliteterne i B-celletal rapporteret i litteraturen. Forskelle i hjertets perfusion, vævshakning og fordøjelse kan nemlig påvirke antallet af B-celler, der genvindes pr. mg hjertevæv, betydeligt. Perfusion med buffere indeholdende calciumchelateringsmidler og intet calcium eller perfusion med et højere volumen eller perfusionshastighed kunne løsne de B-celler, der er bundet til endotelet, og reducere genvindingsudbyttet. Overdreven finvævshakning kan føre til overfordøjelse af vævet og tab af cellelevedygtighed. En reduktion i cellelevedygtighed kan også være resultatet af fordøjelse i længere tid eller med højere enzymkoncentrationer.
Procentdelen af CD45+ celler, der svarer til B-celler, kan ligge i et interval mellem 15% -30% i en vildtypemus. Afhængigt af den anvendte musestamme, alderen og den genetiske baggrund kan denne værdi variere. Procentdelen bør dog forblive ens i den undersøgte gruppe. Stor variation i antallet og procentdelen af B-celler mellem mus, der tilhører samme gruppe, tyder på, at der kan opstå en eksperimentel fejl. Lave procentdele kan indikere et overskud i perfusionsstyrke og tid. Global reduktion i CD45+ celler kan indikere, at vævet bliver overfordøjet.
Protokollen beskrevet her er optimeret til at give et ensartet udbytte af B-celler fra det fordøjede murinhjerte og til at tillade diskrimination af intravaskulære vs. ekstravaskulære B-celler6. Diskriminering af intravaskulære vs. ekstravaskulære B-celler opnås via intravaskulær injektion af et antistof umiddelbart før ofring. Antistoffet injiceret intravaskulært diffunderer let gennem vaskulaturen og møder alle de intravaskulære B-celler. Hvis dyret ofres hurtigt nok, og hjertet straks høstes, har antistoffet ikke tid til at diffundere i det ekstravaskulære rum og plette ekstravaskulære B-celler. Da tiden mellem den intravaskulære injektion af antistoffet og organhøsten er kritisk, anbefales det at inokulere med antistoffet og samle et individuelt musehjerte ad gangen. Intravaskulær injektion af antistoffer kan udelades, hvis diskriminationen af intravaskulære vs. ekstravaskulære B-celler ikke er af interesse. Gating -strategien vist i figur 1 ville forblive den samme bortset fra det sidste trin, hvilket ikke ville være muligt på grund af manglen på B220-mærkning. Afhængigt af det eksperimentelle design kan enhver fluorofor fra det viste panel ændres til en farve, der passer til det anvendte panel. Det er også vigtigt at overveje, at valget af overflademarkører kan ændres i henhold til behovene hos den gruppe, der udfører det; for eksempel, hvis det i det eksperimentelle design antages, at CD11b-ekspression på B1-celler kunne reduceres, anbefales tilsætning af forskellige markører, såsom IgM, IgD og CD537.
Bemærk, at det kan være nødvendigt at behandle et hjerte bare for at køre kompensationskontroller for flowcytometri. Dette anbefales første gang eksperimentet optimeres. I de følgende eksperimenter kan det være tilstrækkeligt at gemme noget væv i øjeblikket for hjerteindsamling, da det ville give tilstrækkelige celler til at køre en negativ "ufarvet" kontrol og en positiv "levende-død" pletkontrol. Individuelle kontrolelementer til de andre farver kan enten importeres fra tidligere eksperimenter eller genereres ved hjælp af perler.
Nogle trin i protokollen kan ændres uden at ændre resultaterne af eksperimentet. For eksempel kan anæstesimetoden ændres til en foretrukken afhængigt af forskerens erfaring; Brugen af isofluran i stedet for 2,2,2-tribromethanol kan reducere tiden mellem anæstesiadministration og hjerteopsamling. Perfusion af hjertet kan også udføres manuelt uden brug af en sprøjtepumpe, så længe det udføres langsomt, forsigtigt og konsekvent.
På trods af den nøjagtige udførelse af protokollen kunne uerfarne operatører støde på stor variabilitet mellem prøver inden for samme eksperimentelle session eller mellem forskellige eksperimentelle sessioner. Baseret på erfaring forsvinder denne variabilitet, når forskeren har haft mulighed for at blive fuldt fortrolig med arbejdsgangen. Det anbefales derfor, at alle, der ønsker at implementere denne protokol, vurderer dens reproducerbarhed i to til tre forsøgskørsler, før de indsamler vigtige data om deres forskningsprojekter.
Sammenfattende overvejer eksisterende metoder til isolering af immunceller fra hjertet og analyse af dem via flowcytometri typisk ikke immuncellernes evne til at binde sig til endotelet og enten ikke standardisere perfusion eller implementere omfattende perfusion med den antagelse, at enhver immuncelle i det intravaskulære rum er et forurenende stof, der skal renses. Dette ignorerer forestillingen om, at intravaskulære immunceller, der klæber til endotelet, har biologisk relevans. Protokollen her præsenteret er optimeret til at maksimere genopretningen af myokardieimmunceller med særlig opmærksomhed på myokardiale B-celler, intravaskulære og ekstravaskulære. Vi forventer, at denne protokol vil være af interesse for alle de forskere, der arbejder inden for hjerteimmunologi og er interesseret i at udforske den funktion, som B-celler kan spille i raske og skadede hjerter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Luigi Adamo er medstifter af i-Cordis, LLC, et firma med fokus på udvikling af immunmodulerende molekyler til behandling af hjertesvigt med en særlig interesse i derivater af B-cellemodulerende lægemiddel pirfenidon. De resterende forfattere har ingen konflikter at erklære.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev finansieret af NHLBI-tilskud 5K08HLO145108-03 og 1R01HL160716-01 tildelt Luigi Adamo.
Aurora Flow Cytometer, der blev brugt til at udvikle denne undersøgelse, blev finansieret af NIH Grant S10OD026859. Vi anerkender støtten fra JHU Ross Flow Cytometry Core.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody | 101222 | BioLegend | 100 µg 200 µL |
| (CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 µm, Blue | QBIAP303 | Southern Labware | |
| 0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1605-0000 | SealRite, USA Scientific | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection, USP | 114-055-101 | Quality Biological | 0.90% |
| 1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1615-5500 | SealRite, USA Scientific | |
| 10 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11213810 | USA Scientific | |
| 1000 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11267810 | USA Scientific | |
| 15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430052 | Corning | |
| 1-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT951 | ECT Manufacturing | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | T48402 | Sigma-Aldrich | |
| 200 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11208810 | USA Scientific | |
| 3-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT953 | ECT Manufacturing | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style | 352054 | Falcon, a Corning Brand | |
| 50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430290 | Corning | |
| ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer | 118-156-101 | Quality Biological | Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20 |
| Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63 | 5810759005 | Eppendorf | |
| Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62 | 22638289 | Eppendorf | |
| Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 – 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62 | 22638246 | Eppendorf | |
| Aluminum Foil 12 in x 75' Roll .0007 | UPC 109153 | Reynolds Wrap | |
| Anesthesia Induction Chamber - Mouse | RWD-AICMV-100 | Conduct Science | |
| BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL | 309626 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-Pack | CMD 2613 | Brandzig | |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody | 115537 | BioLegend | 50 µg/mL |
| CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 µm, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile | T9009 | Southern Labware | |
| Carbon Dioxide USP E CGA 940 | CD USPE | AirGas USA | |
| Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL | UX-34502-46 | Cole-Parmer | |
| Collagenase 2 | LS004176 | Sigma-Aldrich | |
| Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barb | Y992611-AG | AirGas USA | |
| Cytek Aurora Flow Cytometer | Cytek Biosciences | ||
| Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP | M-08-12 | AirGas USA | |
| DNase I - 40,000 U | D4527 | Sigma-Aldrich | |
| Easypet 3 - Electronic Pipette Controller | 4430000018 | Eppendorf | |
| Electronic Balance, AX223/E | 30100606 | Ohaus Corp. | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | 5810R | Eppendorf | |
| Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes | Eppendorf | ||
| FlowJo 10.8.1 | BD Becton, Dickinson and Company | ||
| GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100) | Z740287 | Heathrow Scientific | |
| HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+] | 14025076 | gibco | 1x |
| Hyaluronidase | H3506 | Sigma-Aldrich | |
| Kelly Hemostats, Straight | 13018-14 | Fine Science Tools | |
| Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL | 302831 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940 | M1-940-PG | AirGas USA | |
| McKesson Underpads, Moderate | 4033-CS150 | McKesson | |
| Navigator Multi-Purpose Portable Balance | NV2201 | Ohaus Corp. | |
| PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-] | 10010023 | gibco | 1x |
| PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | 103208 | BioLegend | 200 µg/mL |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody | 103132 | BioLegend | 100 µg 500 uL |
| Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene | FB0875711YZ | Fisher Scientific | |
| Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02 | M08-1 | AirGas USA | |
| Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator | LED-6W | AmScope | |
| PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm) | 305122 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO) | 553141 | BD Becton, Dickinson and Company Biosciences | 0.5 mg/mL |
| R 4.1.1 | The R Foundation | ||
| Razor Blades | 9501250000 | Accutec Blades Inc | |
| Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet | Y12244A320-AG | AirGas USA | |
| Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets | Rotor A-4-62 | Eppendorf | |
| Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister | 86.1254.001 | Sarstedt AG & Co KG | |
| Sigma label tape | L8394 | Sigma-Aldrich | |
| SpectroFlo 3.0.0 | Cytek Biosciences | ||
| Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8" Hose Barb; 1/EA | MTLL230-6005 | Spex | |
| Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' Long | CG-730-003 | Excelon Laboratory | |
| Syringe PP/PE without needle, 3 mL | Z683566 | Millipore Sigma | |
| Syringe pump | 55-1199 (95-240) | Harvard Apparatus | |
| Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500 | 9371W13 | Thomas Scientific | |
| Tube Rack, 12 positions, 6 for 5.0 mL and 15 mL tubes and 6 for 25 mL and 50 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119835 | Eppendorf | |
| Tube Rack, 12 positions, for 5.0 mL and 15 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119827 | Eppendorf | |
| TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in. | T8913 (Millipore Sigma) | Tygon, Saint-Gobain | |
| Vortex-Genie 2 | SI-0236 | Scientific Industries, Inc. | |
| VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips | 89259-946 | Avantor, by VWR | |
| VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4½" | 82027-578 | Avantor, by VWR | |
| VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I | 12620-946 | Avantor, by VWR | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | 423102 | BioLegend |
References
- Adamo, L., Rocha-Resende, C., Mann, D. L. The emerging role of B lymphocytes in cardiovascular disease. Annual Review of Immunology. 38, 99-121 (2020).
- Gowans, J. L., Knight, E. J. The route of re-circulation of lymphocytes in the rat. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 159 (975), 257-282 (1964).
- Kunkel, E. J., Butcher, E. C. Chemokines and the tissue-specific migration of lymphocytes. Immunity. 16 (1), 1-4 (2002).
- Tanaka, T., et al. Molecular determinants controlling homeostatic recirculation and tissue-specific trafficking of lymphocytes. International Archives of Allergy and Immunology. 134 (2), 120-134 (2004).
- Rocha-Resende, C., et al. Developmental changes in myocardial B cells mirror changes in B cells associated with different organs. JCI Insight. 5 (16), (2020).
- Adamo, L., et al. Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart. JCI Insight. 5 (3), 139377 (2020).
- Adamo, L., et al. Modulation of subsets of cardiac B lymphocytes improves cardiac function after acute injury. JCI Insight. 3 (11), (2018).
- Rocha-Resende, C., Pani, F., Adamo, L. B cells modulate the expression of MHC-II on cardiac CCR2(-) macrophages. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 157, 98-103 (2021).
- Zouggari, Y., et al. B lymphocytes trigger monocyte mobilization and impair heart function after acute myocardial infarction. Nature Medicine. 19 (10), 1273-1280 (2013).
- Wu, L., et al. IL-10-producing B cells are enriched in murine pericardial adipose tissues and ameliorate the outcome of acute myocardial infarction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21673-21684 (2019).
- Heinrichs, M., et al. The healing myocardium mobilizes a distinct B-cell subset through a CXCL13-CXCR5-dependent mechanism. Cardiovascular Research. 117 (13), 2664-2676 (2021).
- Sun, Y., et al. Splenic marginal zone B lymphocytes regulate cardiac remodeling after acute myocardial infarction in mice. Journal of the American College of Cardiology. 79 (7), 632-647 (2022).
- Yan, X., et al. Temporal dynamics of cardiac immune cell accumulation following acute myocardial infarction. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 62, 24-35 (2013).
- Iwata, M., et al. Autoimmunity against the second extracellular loop of beta(1)-adrenergic receptors induces beta-adrenergic receptor desensitization and myocardial hypertrophy in vivo. Circulation Research. 88 (1), 578-586 (2001).
- Jahns, R., et al. Direct evidence for a beta 1-adrenergic receptor-directed autoimmune attack as a cause of idiopathic dilated cardiomyopathy. The Journal of Clinical Investigation. 113 (10), 1419-1429 (2004).
- Christ, T., et al. Autoantibodies against the beta1 adrenoceptor from patients with dilated cardiomyopathy prolong action potential duration and enhance contractility in isolated cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (8), 1515-1525 (2001).
- Jane-wit, D., et al. Adrenergic receptor autoantibodies mediate dilated cardiomyopathy by agonistically inducing cardiomyocyte apoptosis. Circulation. 116 (4), 399-410 (2007).
- Ludwig, R. J., et al. Mechanisms of autoantibody-induced pathology. Frontiers in Immunology. 8, 603 (2017).
- Haudek, S. B., et al. Fc receptor engagement mediates differentiation of cardiac fibroblast precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (29), 10179-10184 (2008).
- Staudt, A., Eichler, P., Trimpert, C., Felix, S. B., Greinacher, A. Fc(gamma) receptors IIa on cardiomyocytes and their potential functional relevance in dilated cardiomyopathy. Journal of the American College of Cardiology. 49 (16), 1684-1692 (2007).
- Zhang, M., et al. The role of natural IgM in myocardial ischemia-reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 41 (1), 62-67 (2006).
- Zhang, M., et al. Identification of a specific self-reactive IgM antibody that initiates intestinal ischemia/reperfusion injury. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (11), 3886-3891 (2004).
- Schulze, K., Becker, B. F., Schauer, R., Schultheiss, H. P. Antibodies to ADP-ATP carrier--an autoantigen in myocarditis and dilated cardiomyopathy--impair cardiac function. Circulation. 81 (3), 959-969 (1990).
- Matsumoto, Y., Park, I. K., Kohyama, K. B-cell epitope spreading is a critical step for the switch from C-protein-induced myocarditis to dilated cardiomyopathy. The American Journal of Pathology. 170 (1), 43-51 (2007).
- Caforio, A. L. P., et al. Current state of knowledge on aetiology, diagnosis, management, and therapy of myocarditis: a position statement of the European Society of Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases. European Heart Journal. 34 (33), 2636-2648 (2013).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
- Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Horckmans, M., et al. Pericardial adipose tissue regulates granulopoiesis, fibrosis and cardiac function after myocardial infarction. Circulation. 137 (9), 948-960 (2017).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Bajpai, G., Lavine, K. J. Isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens. Journal of Visualized Experiments. (154), e60015 (2019).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).
- Coffman, R. L., Weissman, I. L. B220: a B cell-specific member of th T200 glycoprotein family. Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).
- Montecino-Rodriguez, E., Dorshkind, K. B-1 B cell development in the fetus and adult. Immunity. 36 (1), 13-21 (2012).
- Bermea, K., Bhalodia, A., Huff, A., Rousseau, S., Adamo, L. The role of B cells in cardiomyopathy and heart failure. Current Cardiology Reports. , 01722-01724 (2022).
- Zhao, T. X., et al. Rituximab in patients with acute ST-elevation myocardial infarction: an experimental medicine safety study. Cardiovascular Research. 118 (3), 872-882 (2022).
- Kushnir, N., et al. B2 but not B1 cells can contribute to CD4+ T-cell-mediated clearance of rotavirus in SCID mice. Journal of Virology. 75 (12), 5482-5490 (2001).
