Summary
Nous rapportons ici un protocole pour la quantification et la différenciation des lymphocytes B myocardiques en fonction de leur emplacement dans l’espace intravasculaire ou endothélial en utilisant la cytométrie de flux.
Abstract
Un nombre croissant de preuves montre que les lymphocytes B jouent un rôle important dans le contexte de la physiologie myocardique et de l’adaptation myocardique aux blessures. Cependant, la littérature rapporte des données contrastées sur la prévalence des cellules B myocardiques. Il a été rapporté que les cellules B étaient à la fois parmi les cellules immunitaires les plus répandues dans le cœur des rongeurs ou qu’elles étaient présentes, mais à une prévalence nettement inférieure à celle des cellules myéloïdes, ou qu’elles étaient assez rares. De même, plusieurs groupes ont décrit que le nombre de cellules B myocardiques augmente après une lésion myocardique ischémique aiguë, mais un groupe n’a signalé aucun changement dans le nombre de cellules B du myocarde lésé. La mise en œuvre d’une méthode partagée et reproductible pour évaluer la prévalence des lymphocytes B myocardiques est essentielle pour harmoniser les observations des différents groupes de recherche et ainsi favoriser l’avancement de l’étude des interactions myocardiques des lymphocytes B. D’après notre expérience, les observations apparemment contrastées rapportées dans la littérature proviennent probablement du fait que les cellules B myocardiques murines sont principalement intravasculaires et connectées à l’endothélium microvasculaire. Par conséquent, le nombre de cellules B récupérées dans un cœur murin est extrêmement sensible aux conditions de perfusion utilisées pour nettoyer l’organe et à la méthode de digestion utilisée. Nous rapportons ici un protocole optimisé qui tient compte de ces deux variables critiques d’une manière spécifique. Ce protocole permet une analyse reproductible basée sur la cytométrie en flux du nombre de cellules B myocardiques murines et permet aux chercheurs de distinguer les cellules B myocardiques extravasculaires des cellules B intravasculaires.
Introduction
Les lymphocytes B sont des cellules immunitaires hautement spécialisées qui jouent un rôle important dans les réponses immunitaires adaptatives et innées1. Il existe deux populations principales de cellules B : une plus petite population de cellules B1 qui sont principalement produites au cours de la vie embryonnaire, et une population prépondérante de cellules B2 qui sont produites à l’âge adulte dans la moelle osseuse1. Après avoir mûri dans la moelle osseuse, les cellules B migrent vers les organes lymphoïdes primaires et secondaires. De là, ils recirculent continuellement entre les organes lymphoïdes voyageant à travers les vaisseaux sanguins et les vaisseaux lymphatiques2. Les cellules B expriment des anticorps spécifiques à leur surface, qui fonctionnent comme des récepteurs. Lorsque les cellules B rencontrent un antigène qui se lie à leur récepteur, un signal d’activation peut être déclenché. Les lymphocytes B activés migrent vers le tissu où l’antigène a été trouvé ou retournent dans la moelle osseuse où ils peuvent devenir des plasmocytes producteurs d’anticorps 3,4.
Récemment, il a été reconnu que le cœur abrite une population importante de cellules B. Des études chez les rongeurs ont montré que les lymphocytes B colonisent le cœur au début du développement embryonnaire5, et que les lymphocytes B associés au myocarde sont pour la plupart intravasculaires, des cellules B2 naïves adhérant à l’endothélium6,7, avec un faible pourcentagede cellules B17. Il existe encore de nombreuses zones d’incertitude, mais les données disponibles indiquent que les cellules B jouent un rôle important à la fois dans le cœur naïf et dans le contexte de l’adaptation myocardique aux blessures.
Des études sur le cœur murin naïf ont montré qu’au départ, les cellules B myocardiques sont principalement situées dans l’espace intravasculaire, adhèrent à l’endothélium (>95% des cellules B cardiaques murines se sont avérées être situées dans l’espace intravasculaire). On a constaté que ces cellules B avaient des schémas d’expression génique différents de ceux des cellules B circulantes isolées du sang périphérique. L’analyse des cœurs naïfs d’animaux déficients en lymphocytes B et de témoins syngéniques a révélé que les animaux dépourvus de lymphocytes B avaient des cœurs plus petits et une fraction d’éjection6 plus élevée. Toutes ces preuves suggèrent que les cellules B pourraient moduler la croissance myocardique et / ou la fonction myocardique, et que non seulement les cellules B interstitielles mais aussi intravasculaires pourraient être responsables de ces observations. Les cellules B ont également été trouvées pour moduler le phénotype des macrophages résidents du myocarde8.
Plusieurs études ont montré que les lymphocytes B jouent un rôle important dans le contexte de l’adaptation myocardique aux lésions 8,9,10,11,12,13. Les lymphocytes B s’accumulent transitoirement dans le cœur blessé, probablement par un mécanisme dépendant de CXCL13-CXCR511,13. À partir de là, les cellules B favorisent le remodelage cardiaque indésirable par plusieurs mécanismes, dont le recrutement demonocytes médiés par les cytokines 9,12. En outre, les cellules B peuvent produire des anticorps contre les protéines cardiaques qui peuvent favoriser l’extension des lésions cardiaques et du remodelage cardiaque indésirable par plusieurs mécanismes 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . Les cellules B peuvent également exercer des effets protecteurs sur le cœur blessé par la sécrétion d’IL-1010.
Alors que le nombre de groupes étudiant le rôle des cellules B dans le cœur naïf et blessé augmente, il devient de plus en plus important de définir des protocoles partagés pour quantifier et évaluer correctement les cellules B myocardiques et ainsi éviter les incohérences qui ont déjà commencé à apparaître dans la littérature. Jusqu’à présent, les cellules B ont en fait été signalées comme étant l’une des cellules immunitaires les plus répandues dans le cœur des rongeurs7 et présentes à une prévalence nettement inférieure à celle des cellules myéloïdes26,27, ou assez rares 28. De même, plusieurs groupes ont décrit que le nombre de lymphocytes B myocardiques augmente après une lésion myocardique ischémique aiguë 7,9,13, mais un groupe n’a signalé aucun changement dans le nombre de lymphocytes B du myocarde29 lésé. Les études sur les cellules immunitaires cardiaques donnent rarement des détails sur les conditions de perfusion et il n’y a pas de consensus sur les conditions de digestion. Étant donné que dans le cœur de rongeur, une grande proportion de cellules B sont intravasculaires et que l’extraction des cellules immunitaires du myocarde dépend fortement de la méthode de digestion utilisée, les différences rapportées dans la littérature pourraient être le résultat de différences dans la perfusion d’organes et la digestion tissulaire.
Présenté ici est une méthode détaillée pour la quantification basée sur la cytométrie de flux des cellules B myocardiques murines qui maximise le rendement de la récupération des cellules B en optimisant les conditions de perfusion et de digestion et permet la discrimination des cellules B myocardiques intravasculaires vs extravasculaires6. Ce protocole est une adaptation et une optimisation d’autres protocoles similaires qui distinguent les cellules immunitaires intravasculaires et interstitielles 28,30,31.
Dans ce protocole, nous normalisons la perfusion myocardique pour éliminer les cellules B flottant dans l’espace intravasculaire sans éliminer les cellules B biologiquement pertinentes adhérant à l’endothélium microvasculaire. De plus, en nous appuyant sur des protocoles antérieurs qui ont décrit l’utilisation de l’injection intraveineuse d’anticorps pour distinguer les cellules immunitaires intravasculaires des cellules immunitaires interstitielles32, et en tirant parti du fait que les cellules B expriment le marqueur de surface B22033, nous démontrons comment distinguer les cellules B myocardiques intravasculaires des cellules B extravasculaires par injection intravasculaire d’un anticorps spécifique B220 immédiatement avant le sacrifice animal et la perfusion cardiaque. Ce protocole est pertinent pour la recherche de tout scientifique intéressé à inclure l’analyse des cellules B myocardiques dans le cœur naïf et blessé. La mise en œuvre généralisée de ce protocole réduira les incohérences entre les groupes de recherche, permettra l’analyse des changements dans les pools de lymphocytes B myocardiques intravasculaires et extravasculaires, et renforcera ainsi l’avancement des découvertes dans le domaine de l’immunologie cardiaque.
En résumé, le protocole représente un flux de travail optimisé pour quantifier et analyser les cellules B myocardiques via la cytométrie en flux, tout en distinguant les cellules situées dans l’espace extravasculaire et l’espace intravasculaire.
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Protocol
Toutes les expériences décrites dans ce manuscrit ont été réalisées avec l’approbation de l’IACUC à la faculté de médecine de l’Université Johns Hopkins.
1. Préparatifs
- Préparer le tampon FACS, tel que décrit dans le tableau 1.
- Assurez-vous qu’il y a suffisamment de CO2 pour euthanasier les animaux.
- Préparez l’espace de dissection (placez le paillasse et placez le ruban adhésif et les outils de dissection à proximité).
- Étiqueter les tubes de 15 mL, mettre 3 mL de HBSS avec du calcium et du magnésium dans chaque tube (voir le tableau des matières) et les placer sur de la glace (un tube par cœur et un tube supplémentaire pour le groupe de référence/témoins de cytométrie en flux). Remplissez également les petites boîtes de Petri (35 mm) avec HBSS.
- Allumez l’agitateur à température contrôlée, réglez-le à 37 °C et prérefroidissez la centrifugeuse à une température de 4 °C.
- Préparez la pompe à seringue et réglez le débit à 3 mL/min. Remplissez une seringue de 20 ml avec HBSS, amorcez la ligne du tube avec un tampon et enlevez les bulles.
2. Coloration intravasculaire des lymphocytes B (in vivo)
- Pesez une souris mâle de 12 semaines de la souche C57BL/6J. Charger une seringue à insuline 3/10 cc avec 100 μL de dilution de l’anticorps B220 (1:10, dans PBS). Couvrir la seringue avec du papier d’aluminium pour la protéger de la lumière.
- Anesthésiez une souris.
- Appliquer une injection intrapéritonéale de 2% de 2,2,2-tribromoéthanol avec une dose de 400 mg / kg et attendre 10-20 min.
REMARQUE: Surveillez la respiration et les mouvements de la souris. Une fois que la souris cesse de bouger, stimulez la douleur en pinçant l’orteil; L’absence de réflexe de retrait indique une anesthésie adéquate. - Si une anesthésie adéquate n’est pas obtenue au cours des 20 minutes, une dose supplémentaire d’anesthésique à 100 mg / kg peut être administrée, et une évaluation de la cinétique de la souris, du réflexe de sevrage et de la respiration doit être effectuée toutes les 5 minutes.
- Appliquer une injection intrapéritonéale de 2% de 2,2,2-tribromoéthanol avec une dose de 400 mg / kg et attendre 10-20 min.
- Placez la souris sur le banc de laboratoire sur un banc incliné d’un côté, tirez doucement vers le bas la peau du dos et appuyez légèrement le corps contre le banc pour faire saillir l’œil.
- Injecter l’anticorps B220 dilué de l’étape 2.1 par injection rétroorbitale.
- Introduisez la seringue dans l’œil à 45° du plan sagittal de la tête de la souris. Injectez lentement la solution. Si une résistance est ressentie, retirez la seringue et entrez à nouveau. Attendez 2 min.
REMARQUE: Un temps d’incubation prolongé compromettrait la capacité de discriminer les cellules B intravasculaires et extravasculaires, car cela donnerait le temps à l’anticorps injecté de diffuser à l’extérieur du système vasculaire.
- Introduisez la seringue dans l’œil à 45° du plan sagittal de la tête de la souris. Injectez lentement la solution. Si une résistance est ressentie, retirez la seringue et entrez à nouveau. Attendez 2 min.
- Euthanasier la souris conformément aux règlements de l’IACUC.
- Ouvrez le débit de CO2 dans la chambre d’euthanasie à un débit de 0,5 L/min, ou le débit recommandé en fonction de la taille de votre chambre.
- Placez la souris dans la chambre pendant le temps recommandé, en vous assurant qu’elle ne respire plus. Retirez-le et effectuez une luxation cervicale comme méthode secondaire d’euthanasie.
- Une fois que la souris est euthanasiée, procédez rapidement au prélèvement d’organes et à la perfusion.
3. Collecte du cœur
- Ouverture de la poitrine.
- Tenez la peau de la souris avec une pince dans la région épigastrique. Faites une ouverture de 2 mm dans la peau à l’aide de ciseaux et utilisez la pince pour décoller la peau afin de révéler la couche de fascia, une couche translucide brillante, de la poitrine et de l’abdomen. Couper à l’épigastre à travers le fascia et le péritoine pour ouvrir la paroi abdominale et révéler le processus xiphoïde. Serrez le processus xiphoïde à l’aide d’une pince hémostatique.
- Avec les ciseaux, faites une coupe verticale à travers la paroi thoracique au niveau de la ligne mi-claviculaire de chaque côté et soulevez la paroi thoracique antérieure pour révéler le contenu du médiastin, en utilisant des pinces hémostatiques comme poids pour maintenir l’ouverture.
- Perfusion et extraction cardiaques.
- À l’aide d’une pince, enlevez tout tissu adipeux ou thymique entourant le cœur.
- Tenez fermement l’aorte par derrière à l’aide d’une pince. Introduire l’aiguille de la seringue (25 G) dans l’apex du cœur. Perfuse avec 3 mL de HBSS à un débit de 3 mL/min.
REMARQUE: Surveillez la perfusion. Le foie devrait se remplir et le sang dans les vaisseaux coronaires devrait être entièrement enlevé. L’utilisation d’une pompe à seringue calibrée à 1 mL / minute est recommandée pour maintenir un débit constant. - Coupez l’aorte à l’aide de ciseaux et sortez le cœur. Lavez le cœur dans la boîte de Petri avec HBSS pour éliminer tout sang restant. À l’aide de ciseaux et de pinces, retirez la graisse, le tissu conjonctif et le thymus, et séchez le cœur. Pesez le cœur isolé et notez le poids en milligrammes. Hacher le cœur à température ambiante en petits morceaux (1-2 mm) avec une lame.
REMARQUE: Les cœurs de souris adultes peuvent peser entre 0,090 et 0,210 mg. - Mesurer la masse de tissu cardiaque et placer 60 mg du cœur émincé à digérer dans un tube de 15 mL avec 3 mL de HBSS. Conserver le tissu cardiaque restant et le placer dans un tube étiqueté « Tissu témoin de référence »; Cela sera utilisé pour le contrôle de compensation du signal mort-vivant et de l’autofluorescence.
4. Digestion cardiaque et coloration cellulaire
- Ajouter des enzymes à chaque tube contenant du tissu haché (voir le tableau 1). Ajouter 0,5 μL / mg de DNase 1 (300 unités pour 60 mg de tissu cardiaque), 0,5 μL / mg de collagénase II (625 unités pour 60 mg de tissu cardiaque) et 0,2 μL / mg de hyaluronidase (50 unités pour 60 mg de tissu cardiaque) dans le tube.
- Placer la réaction de digestion dans l’agitateur pendant 30 min à 300 tr/min. Ajustez le rack du vibreur à environ 25° d’inclinaison.
- Ajouter 7 mL de HBSS à chacun des tubes de réaction de 15 mL et centrifuger à 250 x g pendant 5 min à 4 °C avec accélération et rupture réglées sur modérée ou lente. Décanter le surnageant et remettre en suspension chaque pastille dans 5 mL de tampon de lyse ACK pour éliminer les globules rouges. Incuber dans le tampon de lyse ACK pendant 5 min à température ambiante.
- Ajouter 10 mL de PBS dans chaque tube, mélanger, puis filtrer dans un tube de 50 mL avec une crépine de 40 μm. Assurez-vous que tous les débris sont à l’intérieur de la chambre filtrante. Écrasez tous les débris sur le filtre avec un piston de seringue jusqu’à ce qu’il soit complètement suspendu dans la chambre filtrante.
- Ajouter le PBS à travers le filtre jusqu’à ce que le volume atteigne 25 mL par cœur; Cela permettra aux cellules suspendues de passer à travers le filtre. Ajouter 25 mL supplémentaires de PBS au tube de tissu témoin de référence et diviser le volume en différents tubes (25 mL chacun). Étiquetez l’un des tubes « Unstained » et l’autre comme « Live-dead ». Centrifuger à 250 x g pendant 5 min à 4 °C.
NOTE: À ce stade, préparer la dilution pour la coloration morte vivante (dilution: 1:500 dans 1x PBS). - Décanter le surnageant, remettre en suspension la pastille dans le tube non coloré dans 100 μL de PBS et chacune des autres pastilles dans 100 μL de la dilution de la tache morte vivante. Incuber sur la glace pendant 30 minutes dans l’obscurité, en recouvrant le seau à glace de papier d’aluminium.
- Ajouter 500 μL de tampon FACS à chaque échantillon et le transférer dans un tube FACS marqué à travers un filtre de 40 μm. Centrifuger les tubes FACS à 250 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant. Remettez la pastille en suspension dans 500 μL de tampon FACS.
- Ajouter 50 μL de solution bloquante de Fc (voir tableau 1) dans chaque tube, à l’exception des tubes non colorés et morts-vivants. Mélanger et incuber pendant 5 min.
- Ajouter 50 μL de solution de mélange d’anticorps (voir le tableau 1) dans chaque tube, à l’exception des tubes non colorés et morts-vivants, et incuber pendant 30 minutes dans l’obscurité, en recouvrant le seau à glace de papier d’aluminium.
- Ajouter 2 mL de tampon FACS dans chaque tube et centrifuger à 250 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirer le surnageant et remettre en suspension dans 300-500 μL de tampon FACS.
5. Cytométrie de flux
- Configurez les paramètres de contrôle des instruments.
REMARQUE: Dans ce protocole, l’échantillon est analysé avec un cytomètre en flux Cytek Aurora à 4 lasers. Un autre cytomètre de flux approprié pourrait être utilisé pour détecter les marqueurs d’intérêt.- Ouvrez le logiciel de contrôle de l’instrument (voir le tableau des matériaux). En haut de la fenêtre, sélectionnez l’onglet Acquisition et cliquez sur Nouveau +. Une fenêtre appelée Créer une nouvelle expérience s’affiche.
- Dans la section Bibliothèque, dans le champ Type à filtrer, tapez PE, PerCP-Cy5.5, BV421, Alexa Fluor 700 et Zombie Aqua, cliquez sur Ajouter après avoir tapé chacun. Les noms fluorophores doivent être vus à droite. Cliquez ensuite sur Suivant pour passer à l’onglet Groupe .
- Dans l’onglet Groupe , cliquez sur le symbole avec un tube pour ajouter le cœur de l’analyse.
- Cliquez sur le groupe + Référence et une fenêtre s’affichera. Dans la colonne de balise fluorescente, sélectionnez Zombie Aqua, puis dans la colonne type de contrôle, sélectionnez Cellules, puis cliquez sur Enregistrer.
- Cliquez sur l’onglet Marqueurs > suivant ; Un tableau s’affichera avec les noms des fluorophores. Tapez le marqueur de cellule correspondant dans la première ligne de chaque colonne fluorophore et tapez Entrée: CD45 pour PerCP-Cy5.5; CD19 pour BV421; CD11b pour Alexa Fluor 700; B220 pour l’EP; et mort-vivant pour Zombie Aqua.
- Cliquez deux fois sur Suivant pour accéder à l’onglet Acquisition . Dans Events to Record du groupe d’expériences, tapez 10 000 000 et dans le même champ pour la ligne du groupe de référence, tapez 200 000. Cliquez sur Enregistrer et ouvrir. Les autres paramètres doivent rester définis par défaut, Temps d’arrêt à 10 000 et Arrêt du volume à 3 000.
- En bas à gauche, cliquez sur Contrôle de l’instrument. Réglez la tension sur FSC-50, SSC-175, SSC-B-175. Ensuite, sélectionnez le contrôle d’acquisition. Pour l’option Débit (Débit), sélectionnez High (Élevé) dans le menu déroulant.
- Acquérir des échantillons de référence à l’aide d’un cytomètre et les démélanger dans un logiciel.
- Vortex le tube cardiaque non coloré et placez-le solidement sur l’orifice d’injection de l’échantillon (SIP). Assurez-vous que la flèche verte de l’indicateur pointe vers le bon échantillon, puis cliquez sur Démarrer dans le panneau Contrôle d’acquisition du logiciel du cytomètre et attendez que les événements soient enregistrés. Faites de même pour le tissu cardiaque coloré vivant.
- Sélectionnez le menu Unmix et définissez les commandes suivantes :
- Cochez les cases PE, PerCP-Cy5.5, BV421 et Alexa Fluor 700 dans la colonne de la bibliothèque. Assurez-vous que Zombie Aqua n’est pas coché dans la même colonne. En bas, cochez l’option Autofluorescence en tant que balise fluorescente.
- Cliquez sur Suivant pour passer à l’onglet Identifier les populations positives/négatives . Dans cet onglet, un graphique de FSC-A vs SSC-B-A sera affiché. Cliquez et faites glisser les points du polygone pour sélectionner une zone comprise entre 1,0 M et 4,0 M sur l’axe FSC-A et entre 0,2 M et 3,0 M sur l’axe SSC-B-A.
- Dans le tracé suivant à droite, V5-A sera affiché sur l’axe X. Déplacez les portes pour sélectionner la moitié du pic à l’extrême droite comme positif et une région sur le côté gauche du graphique comme négatif. Dans le graphique intitulé Groupe de référence - Non coloré, sélectionnez une population dans une fourchette similaire. Pour cela, le non coloré n’a pas de positif-négatif doit être défini.
- Acquérir des échantillons expérimentaux.
- Pour chaque tube contenant un échantillon pour une souris individuelle, vortex le tube et placez-le solidement sur le SIP. Assurez-vous que la flèche verte de l’indicateur pointe vers le bon échantillon, puis cliquez sur Démarrer dans le panneau Contrôle d’acquisition du logiciel du cytomètre et attendez que les événements soient enregistrés.
- Stratégie de contrôle.
- Sélectionnez l’onglet Feuille de calcul non mélangée par défaut . Créez un tracé FSC-A par rapport à SSC-A à l’aide de l’outil Tracé par points situé en haut. Sélectionnez des événements supérieurs à 0,4 M sur l’axe FSC-A et supérieurs à 0,8 M sur l’axe SSC-A à l’aide de l’outil de sélection Polygone. Double-cliquez dans cette sélection et un nouveau tracé s’affichera.
- Dans le tracé nouvellement créé, cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’étiquette de l’axe X et sélectionnez AF-A ; cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’étiquette de l’axe Y et sélectionnez Coloration vivante. Cliquez sur l’outil de sélection du rectangle en haut et sélectionnez tous les événements inférieurs à 105 sur l’axe mort-vivant qui correspondent au signal vivant-mort inférieur. Double-cliquez dans cette sélection et un nouveau tracé s’affichera.
- Dans le nouveau tracé, cliquez avec le bouton droit de la souris pour sélectionner PerCP-Cy5.5-A pour l’axe X et SSC-A pour l’axe Y. À l’aide de l’outil de sélection de rectangle, sélectionnez les événements supérieurs à 104 sur l’axe PerCP-Cy5.5-A qui correspondent aux cellules CD45 positives. Double-cliquez sur la sélection et un nouveau tracé s’affichera.
- Sur le nouveau tracé, cliquez avec le bouton droit de la souris pour sélectionner FSC-A pour l’axe X et FSC-H pour l’axe Y. À l’aide de l’outil de sélection Polygone, sélectionnez les événements qui suivent une tendance sur laquelle la valeur FSC-A et la valeur SSC-A sont identiques ; avec cela, les doublets cellulaires seront retirés et la population de la sélection sera appelée population CD45+. Double-cliquez sur la sélection pour afficher une nouvelle parcelle avec la population CD45+.
- À partir du diagramme de la population CD45+, cliquez avec le bouton droit de la souris pour sélectionner BV421 sur l’axe X par rapport à SSC-A sur l’axe Y. À l’aide de l’outil de sélection Polygone, sélectionnez la population à droite sur l’axe BV421 . Il s’agit de la population de cellules B. Double-cliquez deux fois dans cette population pour créer deux nouveaux graphiques avec la population de cellules B.
- Cliquez avec le bouton droit de la souris pour configurer le premier tracé de cellules B avec PE-A sur l’axe X et BV421-A sur l’axe Y. La population de droite correspond aux cellules B intravasculaires, et la population de gauche représente les cellules B interstitielles. Utilisez l’outil de sélection Polygone pour effectuer une sélection des deux.
- Cliquez avec le bouton droit de la souris pour configurer le deuxième tracé de cellules B avec Alexa Fluor 700-A sur l’axe X et SSC-A sur l’axe Y. La population de gauche correspond aux cellules CD11b- et les événements de droite (le cas échéant) correspondent aux cellules CD11b+.
- Cliquez avec le bouton droit sur chaque sélection, puis cliquez sur Propriétés de la porte. Cliquez sur Nombre et % Parent pour afficher les tailles et les pourcentages. Consigner le nombre d’événements et les pourcentages pour une analyse plus approfondie des données.
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Representative Results
Une fois l’acquisition terminée et tous les événements collectés, les données doivent être analysées conformément à la pratique standard de cytométrie en flux. L’objet de l’analyse variera en fonction de l’objectif individuel de chaque expérience. Dans ce cas, la quantification des cellules B intravasculaires et extravasculaires a été poursuivie, et elle a été exprimée en nombre de cellules par mg de tissu.
Lors de l’utilisation d’un cytomètre spectral, il est recommandé de commencer l’analyse par un déclenchement initial pour éliminer les débris dont la taille ne correspond pas aux cellules immunitaires, suivi de l’élimination du signal coloration vivante +. Cela permet la détection d’une population propre de cellules CD45 positives correspondant aux leucocytes (Figure 1). Après le retrait des doublets, dans un cœur naïf non blessé, on s’attend à ce qu’environ 20 % des cellules CD45+ soient des lymphocytes B CD19+ (Figure 2A, 18,1 % de lymphocytes B dans cette expérience représentative). Parmi ces cellules, en moyenne 5,5 % sont situées dans l’espace interstitiel, tandis que 94,5 % sont situées dans l’espace intravasculaire (Figure 2B). De l’ensemble de la population de cellules B trouvée dans le cœur, seulement environ 1,6% correspond aux cellules B1 basées sur le marqueur de surface CD11b (qui est généralement considéré comme suffisant pour classer une cellule CD19+ murine comme une cellule B1 avec un degré élevé de confiance 1,34,35), et les 98,4% restants correspondent aux cellules B2 (Figure 2C).
Figure 1 : Stratégie de contrôle par cytométrie de flux utilisée pour détecter et caractériser les cellules B associées au myocarde. (A) FSC-A vs SSC-A: Le graphique montre tous les événements collectés, et la zone sélectionnée est dessinée pour enrichir l’analyse avec des événements qui sont dans la gamme de taille des leucocytes. (B) Autofluorescence vs coloration vivante-morte : La zone sélectionnée correspond au signal inférieur. La porte dessinée enlève les cellules mortes et certains autres débris cellulaires qui se lient à la coloration vivante. (C) Signal CD45 vs SSC-A : La zone sélectionnée correspond aux cellules CD45+ (c.-à-d. les leucocytes myocardiques). (D) FSC-A vs FSC-H : Cette porte est dessinée pour supprimer les doublets de cellules (événements non sélectionnés). (E) Signal CD19 vs SSC-A : La zone sélectionnée correspond aux cellules B myocardiques. (F) B220 vs CD19 : La zone à l’intérieur du carré noir correspond aux cellules B intramyocardiques (CD19+, B220-), et la zone à l’intérieur du carré rouge correspond à la population intravasculaire de cellules B. (G) CD11b vs SSC-A : La zone à l’intérieur du cercle noir correspond au CD11b+ (cellules B1), et la zone à l’intérieur du cercle rouge correspond au CD11b- (cellules B2). Les pourcentages affichés sur chaque panneau représentent le pourcentage moyen que la population affichée représente de la population parentale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Tracés représentatifs indiquant le nombre moyen de lymphocytes B par milligramme de tissu myocardique. (A) Nombre moyen de cellules CD45+ et CD19+/mg de tissu myocardique murin. Le pourcentage affiché correspond au pourcentage de cellules de la population parentale (CD45+). (B) Nombre moyen de cellules CD19+ et pourcentage de cellules B qui se trouvent dans l’espace interstitiel (extravasculaire) des espaces intravasculaires. (C) Nombre absolu et pourcentage de cellules B myocardiques qui expriment des marqueurs de cellules B1 ou B2. Les barres d’erreur correspondent à l’erreur type de la moyenne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau 1 : Ce tableau contient les solutions et les réactifs nécessaires à la procédure. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
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Discussion
Un nombre croissant de preuves indique que les cellules B jouent un rôle important dans le contexte de la physiologie myocardique et du remodelage/adaptation myocardique aux blessures 7,8,9,10,11,12,13,36. La cytométrie en flux est un excellent outil pour étudier les populations de cellules immunitaires dans n’importe quel tissu et presque un outil obligatoire pour toute étude axée sur les cellules B dans le cœur.
La littérature émergente sur les cellules B et le cœur rapporte déjà des résultats contrastés sur des aspects très fondamentaux, tels que le nombre de cellules B dans le cœur et les changements dans le nombre de cellules B myocardiques avec lésion. Les cellules B ont été signalées comme la cellule immunitaire la plus répandue dans le cœur des rongeurs7. Cependant, d’autres études ont évalué leur prévalence relative par rapport à d’autres cellules myéloïdes et ont montré des nombres nettement inférieurs26,27. Pinto et al.26 ont constaté que les cellules B représentaient environ 9% du total des leucocytes, tandis que Yu et al.27 en ont rapporté 10%. Adamo et al.7 ont rapporté que le pourcentage moyen de cellules B par rapport au nombre de leucocytes était d’environ 20%, ce qui est très proche des 18,1% rapportés dans ce manuscrit. D’autres études ont rapporté que les cellules B ont une très faible prévalence dans le myocarde28.
Plusieurs étapes expérimentales critiques pourraient expliquer les variabilités du nombre de cellules B rapportées dans la littérature. À savoir, les différences dans la perfusion du cœur, le hachage des tissus et la digestion peuvent affecter de manière significative le nombre de cellules B récupérées par mg de tissu cardiaque. La perfusion avec des tampons contenant des agents chélatants du calcium et sans calcium, ou la perfusion avec un volume ou un taux de perfusion plus élevé, pourrait détacher les cellules B attachées à l’endothélium et réduire le rendement de récupération. Un hachage trop fin des tissus pourrait entraîner une surdigestion des tissus et une perte de viabilité cellulaire. Une réduction de la viabilité cellulaire pourrait également être le résultat d’une digestion prolongée ou avec des concentrations enzymatiques plus élevées.
Le pourcentage de cellules CD45+ qui correspondent aux cellules B pourrait se situer entre 15 % et 30 % chez une souris de type sauvage. Selon la souche de souris utilisée, l’âge et le bagage génétique, cette valeur peut varier. Cependant, le pourcentage devrait rester similaire dans le groupe étudié. La grande variabilité du nombre et du pourcentage de cellules B entre les souris appartenant au même groupe suggère qu’une erreur expérimentale peut se produire. De faibles pourcentages pourraient indiquer un excès de force et de temps de perfusion. La réduction globale des cellules CD45+ pourrait indiquer que le tissu est surdigéré.
Le protocole décrit ici a été optimisé pour fournir un rendement constant des cellules B du cœur murin digéré et pour permettre la discrimination des cellules B intravasculaires vs extravasculaires6. La discrimination des cellules B intravasculaires par rapport aux cellules B extravasculaires est obtenue par injection intravasculaire d’un anticorps immédiatement avant le sacrifice. L’anticorps injecté par voie intravasculaire diffuse facilement dans tout le système vasculaire et rencontre toutes les cellules B intravasculaires. Si l’animal est sacrifié assez tôt et que le cœur est rapidement récolté, l’anticorps n’a pas le temps de diffuser dans l’espace extravasculaire et de colorer les cellules B extravasculaires. Étant donné que le temps entre l’injection intravasculaire de l’anticorps et le prélèvement d’organes est critique, il est recommandé d’inoculer l’anticorps et de prélever un cœur de souris individuel à la fois. L’injection intravasculaire d’anticorps peut être omise si la discrimination des cellules B intravasculaires par rapport aux cellules B extravasculaires n’est pas intéressante. La stratégie de contrôle illustrée à la figure 1 demeurerait la même, à l’exception de la dernière étape, qui ne serait pas possible en raison de l’absence d’étiquetage B220. Selon la conception expérimentale, tout fluorophore du panneau montré peut être modifié à une couleur qui correspond au panneau utilisé. En outre, il est important de considérer que la sélection des marqueurs de surface pourrait être modifiée en fonction des besoins du groupe qui l’effectue; par exemple, si dans le plan expérimental on croit que l’expression de CD11b sur les cellules B1 pourrait être réduite, l’ajout de différents marqueurs est recommandé, tels que IgM, IgD et CD537.
Veuillez noter qu’il peut être nécessaire de traiter un cœur juste pour exécuter des contrôles de compensation pour la cytométrie en flux. Ceci est recommandé la première fois que l’expérience est optimisée. Dans les expériences suivantes, la conservation de certains tissus au moment de la collecte cardiaque pourrait suffire, car elle fournirait suffisamment de cellules pour effectuer un contrôle négatif « non coloré » et un contrôle positif des taches « mortes vivantes ». Les contrôles individuels pour les autres couleurs pouvaient être importés à partir d’expériences antérieures ou générés à l’aide de perles.
Certaines étapes du protocole peuvent être modifiées sans altérer les résultats de l’expérience. Par exemple, la méthode d’anesthésie pourrait être remplacée par une méthode préférée en fonction de l’expérience du chercheur; L’utilisation d’isoflurane au lieu du 2,2,2-tribromoéthanol pourrait réduire le temps écoulé entre l’administration de l’anesthésie et le prélèvement cardiaque. En outre, la perfusion du cœur pourrait être effectuée manuellement sans l’utilisation d’une pompe à seringue tant qu’elle est effectuée lentement, doucement et régulièrement.
Malgré l’exécution précise du protocole, les opérateurs inexpérimentés pourraient rencontrer une grande variabilité entre les échantillons au cours de la même session expérimentale ou entre différentes sessions expérimentales. Sur la base de l’expérience, cette variabilité disparaît une fois que le scientifique a eu l’occasion de se familiariser pleinement avec le flux de travail. Il est donc recommandé à toute personne souhaitant mettre en œuvre ce protocole d’évaluer sa reproductibilité en deux ou trois essais avant de recueillir des données cruciales sur ses projets de recherche.
En résumé, les méthodes existantes pour isoler les cellules immunitaires du cœur et les analyser par cytométrie de flux ne tiennent généralement pas compte de la capacité des cellules immunitaires à se fixer à l’endothélium, et ne normalisent pas la perfusion ou ne mettent pas en œuvre une perfusion étendue, en supposant que toute cellule immunitaire dans l’espace intravasculaire est un contaminant qui doit être purgé. Cela ne tient pas compte de la notion selon laquelle les cellules immunitaires intravasculaires adhérant à l’endothélium ont une pertinence biologique. Le protocole présenté ici a été optimisé pour maximiser la récupération des cellules immunitaires myocardiques avec une attention particulière aux cellules B myocardiques, intravasculaires et extravasculaires. Nous nous attendons à ce que ce protocole intéresse tous les scientifiques qui travaillent dans le domaine de l’immunologie cardiaque et qui sont intéressés à explorer la fonction que les cellules B pourraient jouer dans les cœurs sains et blessés.
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Disclosures
Luigi Adamo est co-fondateur de i-Cordis, LLC, une société axée sur le développement de molécules immunomodulatrices pour le traitement de l’insuffisance cardiaque, avec un intérêt particulier pour les dérivés du médicament modulateur des cellules B pirfenidone. Les autres auteurs n’ont aucun conflit à déclarer.
Acknowledgments
Cette étude a été financée par les subventions NHLBI 5K08HLO145108-03 et 1R01HL160716-01 accordées à Luigi Adamo.
Le cytomètre en flux Aurora utilisé pour développer cette étude a été financé par la subvention NIH S10OD026859. Nous reconnaissons le soutien du JHU Ross Flow Cytometry Core.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody | 101222 | BioLegend | 100 µg 200 µL |
| (CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 µm, Blue | QBIAP303 | Southern Labware | |
| 0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1605-0000 | SealRite, USA Scientific | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection, USP | 114-055-101 | Quality Biological | 0.90% |
| 1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1615-5500 | SealRite, USA Scientific | |
| 10 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11213810 | USA Scientific | |
| 1000 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11267810 | USA Scientific | |
| 15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430052 | Corning | |
| 1-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT951 | ECT Manufacturing | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | T48402 | Sigma-Aldrich | |
| 200 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11208810 | USA Scientific | |
| 3-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT953 | ECT Manufacturing | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style | 352054 | Falcon, a Corning Brand | |
| 50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430290 | Corning | |
| ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer | 118-156-101 | Quality Biological | Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20 |
| Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63 | 5810759005 | Eppendorf | |
| Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62 | 22638289 | Eppendorf | |
| Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 – 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62 | 22638246 | Eppendorf | |
| Aluminum Foil 12 in x 75' Roll .0007 | UPC 109153 | Reynolds Wrap | |
| Anesthesia Induction Chamber - Mouse | RWD-AICMV-100 | Conduct Science | |
| BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL | 309626 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-Pack | CMD 2613 | Brandzig | |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody | 115537 | BioLegend | 50 µg/mL |
| CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 µm, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile | T9009 | Southern Labware | |
| Carbon Dioxide USP E CGA 940 | CD USPE | AirGas USA | |
| Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL | UX-34502-46 | Cole-Parmer | |
| Collagenase 2 | LS004176 | Sigma-Aldrich | |
| Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barb | Y992611-AG | AirGas USA | |
| Cytek Aurora Flow Cytometer | Cytek Biosciences | ||
| Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP | M-08-12 | AirGas USA | |
| DNase I - 40,000 U | D4527 | Sigma-Aldrich | |
| Easypet 3 - Electronic Pipette Controller | 4430000018 | Eppendorf | |
| Electronic Balance, AX223/E | 30100606 | Ohaus Corp. | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | 5810R | Eppendorf | |
| Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes | Eppendorf | ||
| FlowJo 10.8.1 | BD Becton, Dickinson and Company | ||
| GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100) | Z740287 | Heathrow Scientific | |
| HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+] | 14025076 | gibco | 1x |
| Hyaluronidase | H3506 | Sigma-Aldrich | |
| Kelly Hemostats, Straight | 13018-14 | Fine Science Tools | |
| Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL | 302831 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940 | M1-940-PG | AirGas USA | |
| McKesson Underpads, Moderate | 4033-CS150 | McKesson | |
| Navigator Multi-Purpose Portable Balance | NV2201 | Ohaus Corp. | |
| PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-] | 10010023 | gibco | 1x |
| PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | 103208 | BioLegend | 200 µg/mL |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody | 103132 | BioLegend | 100 µg 500 uL |
| Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene | FB0875711YZ | Fisher Scientific | |
| Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02 | M08-1 | AirGas USA | |
| Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator | LED-6W | AmScope | |
| PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm) | 305122 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO) | 553141 | BD Becton, Dickinson and Company Biosciences | 0.5 mg/mL |
| R 4.1.1 | The R Foundation | ||
| Razor Blades | 9501250000 | Accutec Blades Inc | |
| Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet | Y12244A320-AG | AirGas USA | |
| Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets | Rotor A-4-62 | Eppendorf | |
| Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister | 86.1254.001 | Sarstedt AG & Co KG | |
| Sigma label tape | L8394 | Sigma-Aldrich | |
| SpectroFlo 3.0.0 | Cytek Biosciences | ||
| Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8" Hose Barb; 1/EA | MTLL230-6005 | Spex | |
| Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' Long | CG-730-003 | Excelon Laboratory | |
| Syringe PP/PE without needle, 3 mL | Z683566 | Millipore Sigma | |
| Syringe pump | 55-1199 (95-240) | Harvard Apparatus | |
| Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500 | 9371W13 | Thomas Scientific | |
| Tube Rack, 12 positions, 6 for 5.0 mL and 15 mL tubes and 6 for 25 mL and 50 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119835 | Eppendorf | |
| Tube Rack, 12 positions, for 5.0 mL and 15 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119827 | Eppendorf | |
| TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in. | T8913 (Millipore Sigma) | Tygon, Saint-Gobain | |
| Vortex-Genie 2 | SI-0236 | Scientific Industries, Inc. | |
| VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips | 89259-946 | Avantor, by VWR | |
| VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4½" | 82027-578 | Avantor, by VWR | |
| VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I | 12620-946 | Avantor, by VWR | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | 423102 | BioLegend |
References
- Adamo, L., Rocha-Resende, C., Mann, D. L. The emerging role of B lymphocytes in cardiovascular disease. Annual Review of Immunology. 38, 99-121 (2020).
- Gowans, J. L., Knight, E. J. The route of re-circulation of lymphocytes in the rat. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 159 (975), 257-282 (1964).
- Kunkel, E. J., Butcher, E. C. Chemokines and the tissue-specific migration of lymphocytes. Immunity. 16 (1), 1-4 (2002).
- Tanaka, T., et al. Molecular determinants controlling homeostatic recirculation and tissue-specific trafficking of lymphocytes. International Archives of Allergy and Immunology. 134 (2), 120-134 (2004).
- Rocha-Resende, C., et al. Developmental changes in myocardial B cells mirror changes in B cells associated with different organs. JCI Insight. 5 (16), (2020).
- Adamo, L., et al. Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart. JCI Insight. 5 (3), 139377 (2020).
- Adamo, L., et al. Modulation of subsets of cardiac B lymphocytes improves cardiac function after acute injury. JCI Insight. 3 (11), (2018).
- Rocha-Resende, C., Pani, F., Adamo, L. B cells modulate the expression of MHC-II on cardiac CCR2(-) macrophages. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 157, 98-103 (2021).
- Zouggari, Y., et al. B lymphocytes trigger monocyte mobilization and impair heart function after acute myocardial infarction. Nature Medicine. 19 (10), 1273-1280 (2013).
- Wu, L., et al. IL-10-producing B cells are enriched in murine pericardial adipose tissues and ameliorate the outcome of acute myocardial infarction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21673-21684 (2019).
- Heinrichs, M., et al. The healing myocardium mobilizes a distinct B-cell subset through a CXCL13-CXCR5-dependent mechanism. Cardiovascular Research. 117 (13), 2664-2676 (2021).
- Sun, Y., et al. Splenic marginal zone B lymphocytes regulate cardiac remodeling after acute myocardial infarction in mice. Journal of the American College of Cardiology. 79 (7), 632-647 (2022).
- Yan, X., et al. Temporal dynamics of cardiac immune cell accumulation following acute myocardial infarction. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 62, 24-35 (2013).
- Iwata, M., et al. Autoimmunity against the second extracellular loop of beta(1)-adrenergic receptors induces beta-adrenergic receptor desensitization and myocardial hypertrophy in vivo. Circulation Research. 88 (1), 578-586 (2001).
- Jahns, R., et al. Direct evidence for a beta 1-adrenergic receptor-directed autoimmune attack as a cause of idiopathic dilated cardiomyopathy. The Journal of Clinical Investigation. 113 (10), 1419-1429 (2004).
- Christ, T., et al. Autoantibodies against the beta1 adrenoceptor from patients with dilated cardiomyopathy prolong action potential duration and enhance contractility in isolated cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (8), 1515-1525 (2001).
- Jane-wit, D., et al. Adrenergic receptor autoantibodies mediate dilated cardiomyopathy by agonistically inducing cardiomyocyte apoptosis. Circulation. 116 (4), 399-410 (2007).
- Ludwig, R. J., et al. Mechanisms of autoantibody-induced pathology. Frontiers in Immunology. 8, 603 (2017).
- Haudek, S. B., et al. Fc receptor engagement mediates differentiation of cardiac fibroblast precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (29), 10179-10184 (2008).
- Staudt, A., Eichler, P., Trimpert, C., Felix, S. B., Greinacher, A. Fc(gamma) receptors IIa on cardiomyocytes and their potential functional relevance in dilated cardiomyopathy. Journal of the American College of Cardiology. 49 (16), 1684-1692 (2007).
- Zhang, M., et al. The role of natural IgM in myocardial ischemia-reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 41 (1), 62-67 (2006).
- Zhang, M., et al. Identification of a specific self-reactive IgM antibody that initiates intestinal ischemia/reperfusion injury. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (11), 3886-3891 (2004).
- Schulze, K., Becker, B. F., Schauer, R., Schultheiss, H. P. Antibodies to ADP-ATP carrier--an autoantigen in myocarditis and dilated cardiomyopathy--impair cardiac function. Circulation. 81 (3), 959-969 (1990).
- Matsumoto, Y., Park, I. K., Kohyama, K. B-cell epitope spreading is a critical step for the switch from C-protein-induced myocarditis to dilated cardiomyopathy. The American Journal of Pathology. 170 (1), 43-51 (2007).
- Caforio, A. L. P., et al. Current state of knowledge on aetiology, diagnosis, management, and therapy of myocarditis: a position statement of the European Society of Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases. European Heart Journal. 34 (33), 2636-2648 (2013).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
- Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Horckmans, M., et al. Pericardial adipose tissue regulates granulopoiesis, fibrosis and cardiac function after myocardial infarction. Circulation. 137 (9), 948-960 (2017).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Bajpai, G., Lavine, K. J. Isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens. Journal of Visualized Experiments. (154), e60015 (2019).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).
- Coffman, R. L., Weissman, I. L. B220: a B cell-specific member of th T200 glycoprotein family. Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).
- Montecino-Rodriguez, E., Dorshkind, K. B-1 B cell development in the fetus and adult. Immunity. 36 (1), 13-21 (2012).
- Bermea, K., Bhalodia, A., Huff, A., Rousseau, S., Adamo, L. The role of B cells in cardiomyopathy and heart failure. Current Cardiology Reports. , 01722-01724 (2022).
- Zhao, T. X., et al. Rituximab in patients with acute ST-elevation myocardial infarction: an experimental medicine safety study. Cardiovascular Research. 118 (3), 872-882 (2022).
- Kushnir, N., et al. B2 but not B1 cells can contribute to CD4+ T-cell-mediated clearance of rotavirus in SCID mice. Journal of Virology. 75 (12), 5482-5490 (2001).
