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Immunology and Infection

फ्लो साइटोमेट्री-आधारित परिमाणीकरण और मायोकार्डियल बी-कोशिकाओं का विश्लेषण

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/64344
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Cardiology, Department of Medicine, The Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

यहां हम फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके इंट्रावास्कुलर या एंडोथेलियल स्पेस में उनके स्थान के आधार पर मायोकार्डियल बी-लिम्फोसाइटों के परिमाणीकरण और भेदभाव के लिए एक प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं।

Abstract

साक्ष्य के बढ़ते शरीर से पता चलता है कि बी-लिम्फोसाइट्स मायोकार्डियल फिजियोलॉजी और चोट के मायोकार्डियल अनुकूलन के संदर्भ में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हालांकि, साहित्य मायोकार्डियल बी-कोशिकाओं के प्रसार पर विपरीत डेटा की रिपोर्ट करता है। बी-कोशिकाओं को कृंतक हृदय में सबसे प्रचलित प्रतिरक्षा कोशिकाओं में से एक या मौजूद होने की सूचना दी गई है, लेकिन माइलॉयड कोशिकाओं की तुलना में स्पष्ट रूप से कम प्रसार पर, या काफी दुर्लभ है। इसी तरह, कई समूहों ने वर्णन किया है कि तीव्र इस्केमिक मायोकार्डियल चोट के बाद मायोकार्डियल बी-कोशिकाओं की संख्या बढ़ जाती है, लेकिन एक समूह ने घायल मायोकार्डियम के बी-कोशिकाओं की संख्या में कोई बदलाव नहीं होने की सूचना दी। मायोकार्डियल बी-कोशिकाओं की व्यापकता का आकलन करने के लिए एक साझा, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि का कार्यान्वयन विभिन्न शोध समूहों से टिप्पणियों को सुसंगत करने के लिए महत्वपूर्ण है और इस प्रकार बी-सेल मायोकार्डियल इंटरैक्शन के अध्ययन की प्रगति को बढ़ावा देता है। हमारे अनुभव के आधार पर, साहित्य में रिपोर्ट किए गए प्रतीत होने वाले विपरीत अवलोकन संभवतः इस तथ्य से उपजा है कि मुराइन मायोकार्डियल बी-कोशिकाएं ज्यादातर इंट्रावास्कुलर हैं और माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियम से जुड़ी हैं। इसलिए, मुराइन हृदय से बरामद बी-कोशिकाओं की संख्या अंग को साफ करने और उपयोग की जाने वाली पाचन की विधि के लिए उपयोग की जाने वाली छिड़काव स्थितियों के प्रति अति संवेदनशील है। यहां हम एक अनुकूलित प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं जो एक विशिष्ट तरीके से इन दो महत्वपूर्ण चर के लिए जिम्मेदार है। यह प्रोटोकॉल मुराइन मायोकार्डियल बी-कोशिकाओं की संख्या के प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित विश्लेषण को सशक्त बनाता है और शोधकर्ताओं को एक्स्ट्रावस्कुलर बनाम इंट्रावास्कुलर मायोकार्डियल बी-कोशिकाओं को अलग करने की अनुमति देता है।

Introduction

बी-लिम्फोसाइट्स अत्यधिक विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिकाएं हैं जो अनुकूली और जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं दोनों में महत्वपूर्ण भूमिकानिभाती हैं। बी-कोशिकाओं की दो मुख्य आबादी हैं: बी 1 कोशिकाओं की एक छोटी आबादी जो ज्यादातर भ्रूण के जीवन के दौरान उत्पन्न होती है, और बी 2 कोशिकाओं की एक प्रधान आबादी जो अस्थि मज्जा1 में वयस्क जीवन में उत्पन्न होती है। अस्थि मज्जा में परिपक्व होने के बाद, बी-कोशिकाएं प्राथमिक और द्वितीयक लिम्फोइड अंगों में स्थानांतरित हो जाती हैं। वहां से वे रक्त वाहिकाओं और लसीका वाहिकाओं के माध्यम से यात्रा करने वाले लिम्फोइड अंगोंके बीच लगातार पुन: परिचालित होते हैं। बी-कोशिकाएं अपनी सतह पर विशिष्ट एंटीबॉडी व्यक्त करती हैं, जो रिसेप्टर्स के रूप में कार्य करती हैं। जब बी-कोशिकाएं एक एंटीजन का सामना करती हैं जो उनके रिसेप्टर को बांधती है, तो एक सक्रिय संकेत ट्रिगर किया जा सकता है। सक्रिय बी-कोशिकाएं या तो ऊतक में स्थानांतरित हो जाती हैं जहां एंटीजन पाया गया था या अस्थि मज्जा में वापस जाते हैं जहां वे एंटीबॉडी-उत्पादक प्लाज्मा कोशिकाओं 3,4 में परिपक्व हो सकते हैं।

हाल ही में, यह सराहना की गई है कि दिल बी-कोशिकाओं की एक बड़ी आबादी को आश्रय देता है। कृन्तकों में अध्ययन से पता चला है कि बी-कोशिकाएं भ्रूण के विकासके दौरान दिल को जल्दी उपनिवेशित करती हैं, और यह कि मायोकार्डियल-संबद्ध बी-कोशिकाएं ज्यादातर इंट्रावास्कुलर, भोले बी 2 कोशिकाएं एंडोथेलियम 6,7 का पालन करती हैं, जिसमें बी 1 कोशिकाओं का एक छोटा प्रतिशतहोता है। अभी भी अनिश्चितता के कई क्षेत्र हैं, लेकिन उपलब्ध डेटा इंगित करता है कि बी-कोशिकाएं भोले दिल में और चोट के मायोकार्डियल अनुकूलन के संदर्भ में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं।

भोले मुराइन दिल में अध्ययन से पता चला है कि बेसलाइन मायोकार्डियल बी-कोशिकाएं ज्यादातर इंट्रावास्कुलर स्पेस में स्थित होती हैं, एंडोथेलियम का पालन करती हैं (>95% म्यूरिन कार्डियक बी-कोशिकाएं इंट्रावास्कुलर स्पेस में स्थित पाई गईं)। इन बी कोशिकाओं में परिधीय रक्त से पृथक परिसंचारी बी कोशिकाओं से अलग जीन अभिव्यक्ति पैटर्न पाए गए। बी-सेल की कमी वाले जानवरों और सिंजेनिक नियंत्रणों से भोले दिलों के विश्लेषण में पाया गया कि बी-कोशिकाओं की कमी वाले जानवरों में छोटे दिल और उच्च इजेक्शन अंश6 थे। इन सभी सबूतों से पता चलता है कि बी-कोशिकाएं मायोकार्डियल विकास और / या मायोकार्डियल फ़ंक्शन को संशोधित कर सकती हैं, और यह कि न केवल अंतरालीय बल्कि इंट्रावास्कुलर बी-कोशिकाएं भी ऐसी टिप्पणियों के लिए जिम्मेदार हो सकती हैं। बी-कोशिकाओं को मायोकार्डियल निवासी मैक्रोफेज 8 के फेनोटाइप कोसंशोधित करने के लिए भी पाया गया था।

कई अध्ययनों से पता चला है कि बी-कोशिकाएं चोट 8,9,10,11,12,13 के मायोकार्डियल अनुकूलन के संदर्भ में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। बी-कोशिकाएं घायल दिल में क्षणिक रूप से जमा होती हैं, संभवतः एक 11,13 के माध्यम से एक सीएक्स13-सीएक्ससीआर 5निर्भर तंत्र के माध्यम से। वहां से, बी-कोशिकाएं कई तंत्रों के माध्यम से प्रतिकूल कार्डियक रीमॉडेलिंग को बढ़ावा देती हैं जिसमें साइटोकिन-मध्यस्थता मोनोसाइट भर्ती 9,12 शामिल हैं। इसके अलावा, बी-कोशिकाएं कार्डियक प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी का उत्पादन कर सकती हैं जो कईतंत्रों के माध्यम से कार्डियक क्षति और प्रतिकूल कार्डियक रीमॉडेलिंग के विस्तार को बढ़ावा दे सकती हैं 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . बी-कोशिकाएं आईएल -10 10 के स्राव के माध्यम से घायल दिल पर सुरक्षात्मक प्रभाव भी डाल सकतीहैं।

जैसे-जैसे भोले और घायल दिल में बी-कोशिकाओं की भूमिका की जांच करने वाले समूहों की संख्या बढ़ती है, मायोकार्डियल बी-कोशिकाओं को ठीक से मापने और उनका आकलन करने के लिए साझा प्रोटोकॉल को परिभाषित करना अधिक से अधिक महत्वपूर्ण होता जा रहा है और इस प्रकार विसंगतियों से बचा जा सकता है जो पहले से ही साहित्य में दिखाई देने लगे हैं। अब तक बी-कोशिकाओं को वास्तव में कृंतक हृदय7 में सबसे प्रचलित प्रतिरक्षा कोशिकाओं में से एक बताया गया है और माइलॉयड कोशिकाओं26,27 की तुलना में स्पष्ट रूप से कम प्रसार पर मौजूद है, या काफी दुर्लभ28 है। इसी तरह, कई समूहों ने वर्णन किया है कि तीव्र इस्केमिक मायोकार्डियल चोट 7,9,13 के बाद मायोकार्डियल बी-कोशिकाओं की संख्या बढ़ जाती है, लेकिन एक समूह ने घायल मायोकार्डियम29 की बी-कोशिकाओं की संख्या में कोई बदलाव नहीं होने की सूचना दी। कार्डियक प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर अध्ययन शायद ही कभी छिड़काव स्थितियों पर विवरण देते हैं और पाचन स्थितियों पर कोई सहमति नहीं है। चूंकि कृंतक हृदय में बी-कोशिकाओं का एक बड़ा हिस्सा इंट्रावास्कुलर होता है और मायोकार्डियम से प्रतिरक्षा कोशिकाओं का निष्कर्षण उपयोग की जाने वाली पाचन विधि पर अत्यधिक निर्भर होता है, साहित्य में रिपोर्ट किए गए अंतर अंग छिड़काव और ऊतक पाचन में अंतर का परिणाम हो सकते हैं।

यहां प्रस्तुत म्यूरिन मायोकार्डियल बी-कोशिकाओं के प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित परिमाणीकरण के लिए एक विस्तृत विधि है जो छिड़काव और पाचन स्थितियों को अनुकूलित करके बी-सेल रिकवरी की उपज को अधिकतम करती है और इंट्रावास्कुलर बनाम एक्स्ट्रावास्कुलर मायोकार्डियल बी-कोशिकाओंके भेदभाव की अनुमति देती है। यह प्रोटोकॉल अन्य समान प्रोटोकॉल का अनुकूलन और अनुकूलन है जो इंट्रावास्कुलर और अंतरालीय प्रतिरक्षा कोशिकाओं 28,30,31 के बीच अंतर करता है।

इस प्रोटोकॉल में, हम माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियम का पालन करने वाली जैविक रूप से प्रासंगिक बी-कोशिकाओं को हटाए बिना इंट्रावास्कुलर स्पेस में तैरने वाली बी-कोशिकाओं को खत्म करने के लिए मायोकार्डियल छिड़काव को मानकीकृत करते हैं। इसके अलावा, पूर्व प्रोटोकॉल के आधार पर, जिन्होंने अंतरालीय प्रतिरक्षा कोशिकाओं32 से इंट्रावास्कुलर को अलग करने के लिए एंटीबॉडी के अंतःशिरा इंजेक्शन के उपयोग का वर्णन किया है, और इस तथ्य का लाभ उठाते हुए कि बी-कोशिकाएं सतह मार्कर बी 22033 को व्यक्त करती हैं, हम प्रदर्शित करते हैं कि पशु बलिदान और कार्डियक छिड़काव से तुरंत पहले बी 220-विशिष्ट एंटीबॉडी के इंट्रावास्कुलर इंजेक्शन के माध्यम से इंट्रावास्कुलर बनाम एक्स्ट्रावास्कुलर मायोकार्डियल बी-कोशिकाओं को कैसे अलग किया जाए। यह प्रोटोकॉल भोले और घायल दिल में मायोकार्डियल बी-कोशिकाओं के विश्लेषण को शामिल करने में रुचि रखने वाले किसी भी वैज्ञानिक के शोध के लिए प्रासंगिक है। इस प्रोटोकॉल का व्यापक कार्यान्वयन अनुसंधान समूहों के बीच विसंगतियों को कम करेगा, इंट्रावास्कुलर और एक्स्ट्रावस्कुलर मायोकार्डियल बी-सेल पूल में परिवर्तन के विश्लेषण की अनुमति देगा, और इस प्रकार कार्डियक इम्यूनोलॉजी के क्षेत्र में खोजों की प्रगति को बढ़ावा देगा।

सारांश में, प्रोटोकॉल फ्लो साइटोमेट्री के माध्यम से मायोकार्डियल बी-कोशिकाओं को मापने और विश्लेषण करने के लिए एक अनुकूलित वर्कफ़्लो का प्रतिनिधित्व करता है, और एक ही समय में एक्स्ट्रावस्कुलर स्पेस और इंट्रावास्कुलर स्पेस में स्थित कोशिकाओं के बीच अंतर करता है।

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Protocol

इस पांडुलिपि में वर्णित सभी प्रयोग जॉन्स हॉपकिंस यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन में आईएसीयूसी के अनुमोदन के साथ किए गए थे।

1. तैयारी

  1. एफएसीएस बफर तैयार करें, जैसा कि तालिका 1 में वर्णित है।
  2. सुनिश्चित करें कि जानवरों को इच्छामृत्यु करने के लिए पर्याप्त सीओ2 है।
  3. विच्छेदन स्थान तैयार करें (बेंच पैड रखें और टेप और विच्छेदन उपकरण पास में रखें)।
  4. 15 एमएल ट्यूबों को लेबल करें, प्रत्येक ट्यूब में कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ 3 एमएल एचबीएसएस डालें (सामग्री की तालिका देखें) और उन्हें बर्फ पर रखें (प्रति दिल एक ट्यूब और संदर्भ समूह / प्रवाह साइटोमेट्री नियंत्रण के लिए एक अतिरिक्त)। इसके अलावा, एचबीएसएस के साथ छोटे (35 मिमी) पेट्री व्यंजन भरें।
  5. तापमान-नियंत्रित शेकर चालू करें, इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें, और सेंट्रीफ्यूज को 4 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर प्री-ठंडा करें।
  6. सिरिंज पंप तैयार करें और प्रवाह दर को 3 एमएल / मिनट पर सेट करें। एचबीएसएस के साथ 20 एमएल सिरिंज भरें, ट्यूब लाइन को बफर के साथ प्राइम करें, और किसी भी बुलबुले को हटा दें।

2. इंट्रावास्कुलर बी-सेल धुंधला (विवो में)

  1. C57BL/6J स्ट्रेन के 12 सप्ताह के नर माउस का वजन करें। बी 220 एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के 100 μL के साथ 3/10 सीसी इंसुलिन सिरिंज लोड करें (पीबीएस में 1: 10)। प्रकाश से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ सिरिंज को कवर करें।
  2. एक माउस को एनेस्थेटाइज करें।
    1. 400 मिलीग्राम / किग्रा की खुराक के साथ 2% 2,2,2-ट्राइब्रोमोएथेनॉल का इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन लागू करें और 10-20 मिनट प्रतीक्षा करें।
      नोट: माउस की श्वास और आंदोलन की निगरानी करें। एक बार जब माउस हिलना बंद कर देता है, तो पैर की अंगुली को चुटकी मारकर दर्द को उत्तेजित करें; वापसी रिफ्लेक्स की अनुपस्थिति पर्याप्त संज्ञाहरण को इंगित करती है।
    2. यदि 20 मिनट के दौरान पर्याप्त संज्ञाहरण प्राप्त नहीं किया जाता है, तो 100 मिलीग्राम / किग्रा पर एनेस्थेटिक की एक अतिरिक्त खुराक प्रशासित की जा सकती है, और माउस कैनेटीक्स, वापसी रिफ्लेक्स और श्वसन का आकलन हर 5 मिनट में किया जाना चाहिए।
  3. माउस को एक तरफ झुके हुए बेंच पैड पर लैब बेंच पर रखें, धीरे से पीठ की त्वचा को नीचे खींचें, और आंख को फैलाने के लिए बेंच के खिलाफ शरीर को थोड़ा दबाएं।
  4. रेट्रोऑर्बिटल इंजेक्शन द्वारा चरण 2.1 से पतला बी 220 एंटीबॉडी इंजेक्ट करें।
    1. माउस के सिर के तल से 45 ° पर आंख में सिरिंज का परिचय दें। धीरे-धीरे घोल इंजेक्ट करें। यदि प्रतिरोध महसूस होता है, तो सिरिंज को हटा दें और फिर से प्रवेश करें। 2 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें।
      नोट: लंबे समय तक इनक्यूबेशन समय इंट्रा-वैस्कुलर बनाम एक्स्ट्रा-वैस्कुलर बी कोशिकाओं को भेदभाव करने की क्षमता को खतरे में डाल देगा क्योंकि यह इंजेक्शन एंटीबॉडी को वाहिका के बाहर फैलने का समय देगा।
  5. आईएसीयूसी नियमों के अनुसार माउस को यूथेनाइज़ करें।
    1. इच्छामृत्यु कक्ष में सीओ 2 प्रवाह को 0.5 एल / मिनट की दर से खोलें, या अपने कक्ष के आकार के आधार पर अनुशंसित प्रवाह दर।
    2. माउस को अनुशंसित समय के लिए कक्ष में रखें, यह सुनिश्चित करते हुए कि यह अब सांस नहीं ले रहा है। इसे हटा दें और इच्छामृत्यु की द्वितीयक विधि के रूप में गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था करें।
    3. एक बार जब माउस को इच्छामृत्यु कर दी जाती है, तो तुरंत अंग कटाई और छिड़काव के लिए आगे बढ़ें।

3. दिल संग्रह

  1. छाती खोलना।
    1. एपिगैस्ट्रिक क्षेत्र में बल के साथ माउस की त्वचा को पकड़ें। कैंची का उपयोग करके त्वचा में 2 मिमी का उद्घाटन करें और छाती और पेट की प्रावरणी परत, एक चमकदार पारभासी परत को प्रकट करने के लिए त्वचा को छीलने के लिए बल का उपयोग करें। पेट की दीवार को खोलने और ज़िफॉइड प्रक्रिया को प्रकट करने के लिए प्रावरणी और पेरिटोनियम के माध्यम से एपिगैस्ट्रियम में काटें। हेमोस्टैटिक फोर्सेस का उपयोग करके xiphoid प्रक्रिया को दबाएं।
    2. कैंची के साथ, प्रत्येक तरफ मध्य-क्लेविकुलर लाइन के स्तर पर छाती की दीवार के माध्यम से एक ऊर्ध्वाधर कट बनाएं और उद्घाटन को बनाए रखने के लिए वजन के रूप में हेमोस्टैटिक फोर्स का उपयोग करके मीडियास्टिनम सामग्री को प्रकट करने के लिए पूर्ववर्ती छाती की दीवार उठाएं।
  2. हृदय छिड़काव और निष्कर्षण।
    1. बल का उपयोग करके, हृदय के आसपास के किसी भी वसा या थाइमिक ऊतक को हटा दें।
    2. फोर्सप्स का उपयोग करके महाधमनी को पीछे से सुरक्षित रूप से पकड़ें। सिरिंज सुई (25 ग्राम) को हृदय के शीर्ष में पेश करें। 3 एमएल /मिनट की दर से 3 एमएल एचबीएसएस के साथ काम करें।
      नोट: छिड़काव की निगरानी करें। जिगर को भरना चाहिए, और कोरोनरी वाहिकाओं में रक्त को पूरी तरह से हटा दिया जाना चाहिए। स्थिर प्रवाह बनाए रखने के लिए 1 एमएल / मिनट तक कैलिब्रेट किए गए सिरिंज पंप का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
    3. कैंची का उपयोग करके महाधमनी को काटें और दिल को बाहर निकालें। किसी भी शेष रक्त को हटाने के लिए एचबीएसएस के साथ पेट्री डिश में दिल को धोएं। कैंची और बल का उपयोग करके, वसा, संयोजी ऊतक और थाइमस को हटा दें, और दिल को सुखाएं। पृथक हृदय का वजन करें और मिलीग्राम में वजन नोट करें। कमरे के तापमान पर दिल को ब्लेड के साथ छोटे टुकड़ों (1-2 मिमी) में काट लें।
      नोट: वयस्क माउस दिल का वजन 0.090-0.210 मिलीग्राम के बीच हो सकता है।
    4. हृदय के ऊतकों के द्रव्यमान को मापें और 60 मिलीग्राम कीमा वाले दिल को 3 एमएल एचबीएसएस के साथ 15 एमएल ट्यूब में पचाने के लिए रखें। शेष हृदय ऊतक को बनाए रखें और "संदर्भ नियंत्रण ऊतक" लेबल वाली ट्यूब में रखें; इसका उपयोग जीवित-मृत संकेत और ऑटोफ्लोरेसेंस के लिए मुआवजा नियंत्रण के लिए किया जाएगा।

4. हृदय पाचन और कोशिका धुंधला होना

  1. कीमा ऊतक युक्त प्रत्येक ट्यूब में एंजाइम जोड़ें ( तालिका 1 देखें)। ट्यूब में DNase 1 (60 मिलीग्राम हृदय ऊतक के लिए 300 इकाइयाँ), कोलेजनेज II का 0.5 μL/mg (60 मिलीग्राम हृदय ऊतक के लिए 625 इकाइयाँ), और 0.2 μL/mg hyaluronidase (60 मिलीग्राम हृदय ऊतक के लिए 50 इकाइयाँ) जोड़ें।
  2. पाचन प्रतिक्रिया को 300 आरपीएम पर 30 मिनट के लिए शेकर में रखें। शेकर रैक को लगभग 25° इनक्लाइन में समायोजित करें।
  3. 15 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूबों में से प्रत्येक में 7 एमएल एचबीएसएस जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 250 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें और मध्यम या धीमी गति से सेट तोड़ने के साथ। लाल रक्त कोशिकाओं को हटाने के लिए सतह पर तैरने वाले को अलग करें और प्रत्येक गोली को 5 एमएल एसीके लाइसिस बफर में पुन: निलंबित करें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए एसीके लाइसिस बफर में इनक्यूबेट करें।
  4. प्रत्येक ट्यूब में 10 एमएल पीबीएस जोड़ें, मिलाएं, और फिर 40 μm छन्नी के साथ 50 एमएल ट्यूब में फ़िल्टर करें। सुनिश्चित करें कि सभी मलबे फिल्टर कक्ष के अंदर हैं। एक सिरिंज प्लंजर के साथ फिल्टर पर किसी भी मलबे को तब तक तोड़ दें जब तक कि यह फिल्टर कक्ष के भीतर पूरी तरह से निलंबित न हो जाए।
  5. फ़िल्टर के माध्यम से पीबीएस जोड़ें जब तक कि मात्रा प्रति दिल 25 एमएल तक न पहुंच जाए; यह निलंबित कोशिकाओं को फ़िल्टर के माध्यम से गुजरने की अनुमति देगा। संदर्भ नियंत्रण ऊतक ट्यूब में पीबीएस का एक अतिरिक्त 25 एमएल जोड़ें और मात्रा को विभिन्न ट्यूबों (प्रत्येक 25 एमएल) में विभाजित करें। ट्यूबों में से एक को "बिना दाग वाला" और दूसरे को "लाइव-डेड" के रूप में लेबल करें। सेंट्रीफ्यूज 250 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    नोट: इस बिंदु पर, जीवित-मृत दाग के लिए कमजोर पड़ने की तैयारी करें (कमजोर पड़ना: 1x PBS में 1:500)।
  6. सतह पर तैरने वाले को अलग करते हुए, बिना दाग वाली ट्यूब में पैलेट को पीबीएस के 100 μL में और अन्य छर्रों में से प्रत्येक को 100 μL में जीवित-मृत दाग कमजोर पड़ने के लिए पुन: निलंबित किया जाता है। अंधेरे में 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें, बर्फ की बाल्टी को एल्यूमीनियम पन्नी से कवर करें।
  7. प्रत्येक नमूने में 500 μL FACS बफर जोड़ें और इसे 40 μm फ़िल्टर के माध्यम से लेबल किए गए FACS ट्यूब में स्थानांतरित करें। एफएसीएस ट्यूबों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 250 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें। एफएसीएस बफर के 500 μL में गोली को फिर से निलंबित करें।
  8. बिना दाग वाले और लाइव-डेड ट्यूबों को छोड़कर, प्रत्येक ट्यूब में एफसी ब्लॉकिंग समाधान ( तालिका 1 देखें) के 50 μL जोड़ें। 5 मिनट के लिए मिलाएं और इनक्यूबेट करें।
  9. बिना दाग वाली और जीवित-मृत ट्यूबों को छोड़कर, प्रत्येक ट्यूब में 50 μL एंटीबॉडी मिश्रण समाधान ( तालिका 1 देखें) जोड़ें, और अंधेरे में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, बर्फ की बाल्टी को एल्यूमीनियम पन्नी से कवर करें।
  10. प्रत्येक ट्यूब में 2 एमएल एफएसीएस बफर जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 250 x g पर सेंट्रीफ्यूज जोड़ें। सतह पर तैरने वाले को हटा दें और एफएसीएस बफर के 300-500 μL में पुन: निलंबित करें।

5. फ्लो साइटोमेट्री

  1. उपकरण नियंत्रण सेटिंग्स सेट करें.
    नोट: इस प्रोटोकॉल में नमूने का विश्लेषण 4 लेजर साइटेक ऑरोरा प्रवाह साइटोमीटर के साथ किया जाता है। रुचि के मार्करों का पता लगाने के लिए एक और उपयुक्त प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग किया जा सकता है।
    1. उपकरण नियंत्रण सॉफ़्टवेयर खोलें ( सामग्री की तालिका देखें)। विंडो के शीर्ष पर, अधिग्रहण टैब का चयन करें और नया + पर क्लिक करें। नया प्रयोग बनाएं नामक एक विंडो प्रदर्शित होगी।
    2. लाइब्रेरी अनुभाग में, फ़ील्ड में फ़िल्टर करने के लिए प्रकार, पीई, PerCP-Cy5.5, BV421, Alexa Fluor 700, और Zombie Aqua टाइप करें, प्रत्येक टाइप करने के बाद जोड़ें पर क्लिक करें। फ्लोरोफोरे नामों को दाईं ओर देखा जाना चाहिए। फिर समूह टैब पर आगे बढ़ने के लिए अगला क्लिक करें।
    3. समूह टैब में, विश्लेषण के लिए दिल जोड़ने के लिए ट्यूब के साथ प्रतीक पर क्लिक करें।
    4. + संदर्भ समूह पर क्लिक करें और एक विंडो प्रदर्शित होगी। फ्लोरोसेंट टैग स्तंभ में ज़ोंबी Aqua का चयन करें, और नियंत्रण प्रकार स्तंभ में कक्षों का चयन करें, फिर सहेजें क्लिक करें.
    5. अगला > मार्कर टैब पर क्लिक करें; फ्लोरोफोरे के नामों के साथ एक तालिका प्रदर्शित होगी। प्रत्येक फ्लोरोफोर कॉलम की पहली पंक्ति में संबंधित सेल मार्कर टाइप करें और टाइप एंटर: परसीपी-Cy5.5 के लिए CD45; बीवी 421 के लिए सीडी 19; एलेक्सा फ्लूर 700 के लिए सीडी 11 बी; पीई के लिए बी 220; और ज़ोंबी एक्वा के लिए लाइव-डेड।
    6. अधिग्रहण टैब पर जाने के लिए अगला दो बार क्लिक करें. प्रयोग समूह के रिकॉर्ड करने के लिए ईवेंट में टाइप 10,000,000, और संदर्भ समूह लाइन प्रकार 200,000 के लिए एक ही फ़ील्ड में। सहेजें और खोलें क्लिक करें. अन्य सेटिंग्स डिफ़ॉल्ट रूप से बनी रहनी चाहिए, स्टॉपिंग टाइम 10,000 तक, और स्टॉपिंग वॉल्यूम 3,000 तक।
    7. नीचे बाईं ओर इंस्ट्रूमेंट कंट्रोल पर क्लिक करें। एफएससी -50, एसएससी -175, एसएससी-बी -175 पर वोल्टेज सेट करें। उसके बाद, अधिग्रहण नियंत्रण का चयन करें। प्रवाह दर विकल्प के लिए, ड्रॉप-डाउन मेनू से उच्च का चयन करें।
  2. साइटोमीटर के साथ संदर्भ नमूने प्राप्त करें और सॉफ्टवेयर में अनमिक्स करें।
    1. भंवर बिना दाग वाली हृदय ट्यूब है और इसे नमूना इंजेक्शन पोर्ट (एसआईपी) पर सुरक्षित रूप से रखें। सुनिश्चित करें कि हरा संकेतक तीर सही नमूने की ओर इशारा कर रहा है, फिर साइटोमीटर सॉफ्टवेयर के अधिग्रहण नियंत्रण कक्ष में प्रारंभ पर क्लिक करें और घटनाओं को रिकॉर्ड किए जाने तक प्रतीक्षा करें। जीवित-मृत-दाग वाले हृदय ऊतक के लिए भी ऐसा ही करें।
    2. अनमिक्स मेनू का चयन करें और निम्न नियंत्रण सेट करें:
      1. लाइब्रेरी से कॉलम में PE, PerCP-Cy5.5, BV421, और Alexa Fluor 700 के लिए चेकबॉक्स का चयन करें। सुनिश्चित करें कि ज़ोंबी एक्वा एक ही कॉलम में अनियंत्रित है। नीचे, फ्लोरोसेंट टैग के रूप में ऑटोफ्लोरेसेंस के विकल्प की जांच करें।
      2. सकारात्मक /नकारात्मक आबादी की पहचान टैब पर आगे बढ़ने के लिए अगला क्लिक करें। इस टैब में, एफएससी-ए बनाम एसएससी-बी-ए का एक प्लॉट प्रदर्शित किया जाएगा। FSC-A अक्ष पर 1.0 M और 4.0 M के बीच और SSC-B-A अक्ष पर 0.2 M और 3.0 M के बीच एक क्षेत्र का चयन करने के लिए बहुभुज के बिंदुओं पर क्लिक करें और खींचें।
      3. दाईं ओर अगले प्लॉट में, वी 5-ए एक्स-अक्ष पर प्रदर्शित किया जाएगा। गेट को दाईं ओर शिखर के आधे हिस्से को सकारात्मक के रूप में और भूखंड के बाईं ओर एक क्षेत्र को नकारात्मक के रूप में चुनने के लिए स्थानांतरित करें। संदर्भ समूह - बिना दाग वाले शीर्षक वाले कथानक में, एक समान सीमा में एक आबादी का चयन करें। इसके लिए बिना दाग वाला कोई सकारात्मक-नकारात्मक सेट नहीं करना पड़ता है।
  3. प्रयोगात्मक नमूने प्राप्त करें।
    1. एक व्यक्तिगत माउस के लिए एक नमूना युक्त प्रत्येक ट्यूब के लिए, ट्यूब को भंवर करें और इसे एसआईपी पर सुरक्षित रूप से रखें। सुनिश्चित करें कि हरा संकेतक तीर सही नमूने की ओर इशारा कर रहा है, फिर साइटोमीटर सॉफ़्टवेयर के अधिग्रहण नियंत्रण कक्ष में प्रारंभ करें पर क्लिक करें, और घटनाओं को रिकॉर्ड किए जाने तक प्रतीक्षा करें।
  4. गेटिंग रणनीति।
    1. डिफ़ॉल्ट अनमिक्स्ड कार्यपत्रक टैब का चयन करें. शीर्ष पर डॉट प्लॉट टूल का उपयोग करके एफएससी-ए बनाम एसएससी-ए प्लॉट बनाएं। बहुभुज चयन उपकरण का उपयोग करके एफएससी-ए अक्ष पर 0.4 मीटर से अधिक और एसएससी-ए अक्ष पर 0.8 मीटर से अधिक घटनाओं का चयन करें। इस चयन में डबल क्लिक करें और एक नया प्लॉट प्रदर्शित होगा।
    2. नए बनाए गए प्लॉट से, एक्स अक्ष लेबल पर राइट-क्लिक करें और एएफ-ए का चयन करें; वाई अक्ष लेबल पर राइट-क्लिक करें और लाइव-डेड दाग का चयन करें। शीर्ष पर आयताकार चयन उपकरण पर क्लिक करें और जीवित-मृत अक्ष पर 105 से नीचे की सभी घटनाओं का चयन करें जो निचले जीवित-मृत संकेत के अनुरूप हैं। इस चयन में डबल क्लिक करें और एक नया प्लॉट प्रदर्शित होगा।
    3. नए प्लॉट में, एक्स अक्ष के लिए PerCP-Cy5.5-A और Y अक्ष के लिए SSC-A का चयन करने के लिए राइट-क्लिक करें। आयत चयन उपकरण का उपयोग करते हुए, PERCP-Cy5.5-A अक्ष पर 104 से अधिक घटनाओं का चयन करें जो CD45 धनात्मक कक्षों के अनुरूप हैं. चयन पर डबल क्लिक करें और एक नया प्लॉट प्रदर्शित होगा।
    4. नए प्लॉट पर, एक्स अक्ष के लिए एफएससी-ए और वाई अक्ष के लिए एफएससी-एच का चयन करने के लिए राइट-क्लिक करें। बहुभुज चयन उपकरण का उपयोग करके उन घटनाओं का चयन करें जो एक प्रवृत्ति का पालन करते हैं जिस पर एफएससी-ए मान और एसएससी-ए मान समान हैं; इसके साथ सेल डबल्स को हटा दिया जाएगा और चयन में आबादी को सीडी 45 + आबादी के रूप में संदर्भित किया जाएगा। CD45+ जनसंख्या के साथ एक नया प्लॉट प्रदर्शित करने के लिए चयन पर डबल क्लिक करें।
    5. सीडी 45+ जनसंख्या प्लॉट से, वाई अक्ष पर एक्स अक्ष बनाम एसएससी-ए पर बीवी 421 का चयन करने के लिए राइट-क्लिक करें। बहुभुज चयन उपकरण का उपयोग करके, BV421 अक्ष पर दाईं ओर की आबादी का चयन करें। यह बी-सेल आबादी है। बी-सेल आबादी के साथ दो नए भूखंड बनाने के लिए इस आबादी में दो बार डबल क्लिक करें।
      1. एक्स अक्ष पर पीई-ए और वाई अक्ष पर बीवी 421-ए के साथ पहला बी-सेल प्लॉट सेटअप करने के लिए राइट-क्लिक करें। दाईं ओर की आबादी इंट्रावास्कुलर बी-कोशिकाओं से मेल खाती है, और बाईं ओर की आबादी अंतरालीय बी-कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करती है। दोनों का चयन करने के लिए बहुभुज चयन उपकरण का उपयोग करें।
      2. एक्स अक्ष पर एलेक्सा फ्लोर 700-ए और वाई अक्ष पर एसएससी-ए के साथ दूसरे बी-सेल प्लॉट को सेटअप करने के लिए राइट-क्लिक करें। बाईं ओर की आबादी सीडी 11 बी- कोशिकाओं से मेल खाती है, और दाईं ओर की घटनाएं (यदि कोई हो) सीडी 11 बी + कोशिकाओं के अनुरूप हैं।
      3. प्रत्येक चयन पर राइट क्लिक करें और फिर गेट गुण क्लिक करें. आकार और प्रतिशत प्रदर्शित करने के लिए गिनती और % माता-पिता पर क्लिक करें। आगे के डेटा विश्लेषण के लिए घटनाओं और प्रतिशत की संख्या रिकॉर्ड करें।

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Representative Results

एक बार अधिग्रहण पूरा हो जाने और सभी घटनाओं को एकत्र करने के बाद, डेटा का विश्लेषण मानक प्रवाह साइटोमेट्री अभ्यास के अनुसार किया जाना चाहिए। विश्लेषण का फोकस प्रत्येक प्रयोग के व्यक्तिगत लक्ष्य के आधार पर अलग-अलग होगा। इस मामले में, इंट्रावास्कुलर और एक्स्ट्रावैस्कुलर बी-कोशिकाओं की मात्रा का पीछा किया गया था, और इसे प्रति मिलीग्राम ऊतक में कोशिकाओं की संख्या के रूप में व्यक्त किया गया था।

वर्णक्रमीय साइटोमीटर का उपयोग करते समय, उन आकारों के साथ मलबे को हटाने के लिए प्रारंभिक गेटिंग के साथ विश्लेषण शुरू करने की सिफारिश की जाती है जो प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अनुरूप सीमा में नहीं हैं, इसके बाद जीवित-मृत दाग + संकेत को हटा दिया जाता है। यह ल्यूकोसाइट्स (चित्रा 1) के अनुरूप सीडी 45 सकारात्मक कोशिकाओं की एक स्वच्छ आबादी का पता लगाने की अनुमति देता है। डबल्स को हटाने के बाद, एक भोले-भाले दिल में, यह उम्मीद की जाती है कि सीडी 45 + कोशिकाओं का लगभग 20% सीडी 19 + बी-कोशिकाएं होंगी (चित्रा 2 ए, इस प्रतिनिधि प्रयोग में 18.1% बी-कोशिकाएं)। इन कोशिकाओं में से, औसतन 5.5% अंतरालीय स्थान में स्थित हैं, जबकि 94.5% इंट्रावास्कुलर स्पेस (चित्रा 2 बी) में स्थित हैं। हृदय में पाई जाने वाली पूरी बी-सेल आबादी से, केवल 1.6% सतह मार्कर सीडी 11 बी के आधार पर बी 1 कोशिकाओं से मेल खाती है (जिसे आमतौर पर एक मुराइन सीडी 19 + सेल को उच्च स्तर के आत्मविश्वास 1,34,35 के साथ बी1 सेल के रूप में वर्गीकृत करने के लिए पर्याप्त माना जाता है), और अन्य 98.4% बी 2 कोशिकाओं से मेल खाता है (चित्रा 2 सी)।

Figure 1
चित्रा 1: मायोकार्डियल-संबद्ध बी-कोशिकाओं का पता लगाने और चिह्नित करने के लिए उपयोग की जाने वाली फ्लो साइटोमेट्री गेटिंग रणनीति। (ए) एफएससी-ए बनाम एसएससी-ए: प्लॉट एकत्र की गई सभी घटनाओं को दर्शाता है, और चयनित क्षेत्र को ल्यूकोसाइट्स के आकार की सीमा में होने वाली घटनाओं के साथ विश्लेषण को समृद्ध करने के लिए तैयार किया जाता है। (बी) ऑटोफ्लोरेसेंस बनाम लाइव-डेड धुंधलापन: चयनित क्षेत्र निचले जीवित-मृत संकेत से मेल खाता है। खींचा गया गेट मृत कोशिकाओं और कुछ अन्य सेल मलबे को हटा देता है जो जीवित-मृत धुंधलापन से बंधते हैं। (सी) सीडी 45 सिग्नल बनाम एसएससी-ए: चयनित क्षेत्र सीडी 45 + कोशिकाओं (यानी, मायोकार्डियल ल्यूकोसाइट्स) से मेल खाता है। (डी) एफएससी-ए बनाम एफएससी-एच: यह गेट सेल डबल्स (अचयनित घटनाओं) को हटाने के लिए खींचा गया है। (ई) सीडी 19 सिग्नल बनाम एसएससी-ए: चयनित क्षेत्र मायोकार्डियल बी-कोशिकाओं से मेल खाता है। (एफ) बी 220 बनाम सीडी 19: काले वर्ग के अंदर का क्षेत्र इंट्रामायोकार्डियल बी-कोशिकाओं (सीडी 19 +, बी 220-) से मेल खाता है, और लाल वर्ग के अंदर का क्षेत्र इंट्रावास्कुलर बी-सेल आबादी से मेल खाता है। (जी) सीडी 11 बी बनाम एसएससी-ए: काले सर्कल के अंदर का क्षेत्र सीडी 11 बी + (बी 1 कोशिकाओं) से मेल खाता है, और लाल सर्कल के अंदर का क्षेत्र सीडी 11 बी- (बी 2 कोशिकाओं) से मेल खाता है। प्रत्येक पैनल पर प्रदर्शित प्रतिशत उस औसत प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करते हैं जो प्रदर्शित आबादी माता-पिता की आबादी से दर्शाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: मायोकार्डियल ऊतक के प्रति मिलीग्राम बी-कोशिकाओं की औसत संख्या की रिपोर्ट करने वाले प्रतिनिधि भूखंड। (ए) सीडी 45+ और सीडी 19 + कोशिकाओं / मिलीग्राम मुराइन मायोकार्डियल ऊतक की औसत संख्या। प्रदर्शित प्रतिशत माता-पिता की आबादी (सीडी 45+) से कोशिकाओं के प्रतिशत से मेल खाता है। (बी) सीडी 19 + कोशिकाओं की औसत संख्या और बी-कोशिकाओं का प्रतिशत जो इंट्रावास्कुलर रिक्त स्थान के अंतरालीय (एक्स्ट्रावस्कुलर) स्थान में हैं। (सी) मायोकार्डियल बी-कोशिकाओं की पूर्ण संख्या और प्रतिशत जो बी 1 या बी 2 कोशिकाओं के मार्करों को व्यक्त करते हैं। त्रुटि पट्टियाँ माध्य की मानक त्रुटि के अनुरूप हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: इस तालिका में प्रक्रिया के लिए आवश्यक समाधान और अभिकर्मक शामिल हैं। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

साक्ष्य का एक बढ़ता शरीर इंगित करता है कि बी-कोशिकाएं मायोकार्डियल फिजियोलॉजी और मायोकार्डियल रीमॉडेलिंग / चोट 7,8,9,10,11,12,13,36 के संदर्भ में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। फ्लो साइटोमेट्री किसी भी ऊतक में प्रतिरक्षा कोशिका आबादी का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण है और किसी भी अध्ययन के लिए लगभग एक अनिवार्य उपकरण है जो हृदय में बी-कोशिकाओं पर केंद्रित है।

बी-कोशिकाओं और हृदय पर उभरते साहित्य पहले से ही बहुत बुनियादी पहलुओं पर विपरीत निष्कर्षों की रिपोर्ट करते हैं, जैसे कि हृदय में बी-कोशिकाओं की संख्या और चोट के साथ मायोकार्डियल बी-सेल संख्या में परिवर्तन। बी-कोशिकाओं को कृंतक दिल में सबसे प्रचलित प्रतिरक्षा कोशिका के रूप मेंबताया गया है। हालांकि, अन्य अध्ययनों ने अन्य माइलॉयड कोशिकाओं की तुलना में उनके सापेक्ष प्रसार का मूल्यांकन किया और स्पष्ट रूप से कम संख्या26,27 दिखाई। पिंटो एट अल.26 ने पाया कि बी-कोशिकाओं में कुल ल्यूकोसाइट्स का लगभग 9% शामिल था, जबकि यू एट अल.27 ने 10% की सूचना दी। एडमो एट अल.7 ने बताया कि ल्यूकोसाइट संख्याओं के सापेक्ष बी-कोशिकाओं का औसत प्रतिशत लगभग 20% था, जो इस पांडुलिपि में रिपोर्ट किए गए 18.1% के बहुत करीब है। अन्य अध्ययनों ने बताया है कि मायोकार्डियम28 में बी-कोशिकाओं का प्रसार बहुत कम है।

कई महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक कदम साहित्य में रिपोर्ट किए गए बी-सेल संख्याओं में भिन्नताओं की व्याख्या कर सकते हैं। अर्थात्, हृदय के छिड़काव, ऊतक कीपिंग और पाचन में अंतर हृदय ऊतक के प्रति मिलीग्राम पुनर्प्राप्त बी-कोशिकाओं की संख्या को काफी प्रभावित कर सकता है। कैल्शियम चेलेटिंग एजेंटों और बिना कैल्शियम वाले बफर के साथ छिड़काव, या उच्च मात्रा या छिड़काव दर के साथ छिड़काव, एंडोथेलियम से जुड़ी बी-कोशिकाओं को अलग कर सकता है और वसूली उपज को कम कर सकता है। अत्यधिक ठीक ऊतक की कमी से ऊतक का अति-पाचन और सेल व्यवहार्यता का नुकसान हो सकता है। सेल व्यवहार्यता में कमी लंबे समय तक या उच्च एंजाइम सांद्रता के साथ पचाने का परिणाम भी हो सकती है।

सीडी 45+ कोशिकाओं का प्रतिशत जो बी-कोशिकाओं के अनुरूप है, जंगली प्रकार के माउस में 15% -30% के बीच की सीमा में हो सकता है। उपयोग किए गए माउस तनाव, उम्र और आनुवंशिक पृष्ठभूमि के आधार पर, यह मान भिन्न हो सकता है। हालांकि, अध्ययन किए गए समूह में प्रतिशत समान रहना चाहिए। एक ही समूह से संबंधित चूहों के बीच बी-कोशिकाओं की संख्या और प्रतिशत में बड़ी परिवर्तनशीलता से पता चलता है कि एक प्रयोगात्मक त्रुटि हो सकती है। कम प्रतिशत छिड़काव शक्ति और समय में अधिकता का संकेत दे सकता है। सीडी 45+ कोशिकाओं में वैश्विक कमी यह संकेत दे सकती है कि ऊतक को अधिक पचाया जा रहा है।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल को पचे हुए मुराइन दिल से बी-कोशिकाओं की लगातार उपज प्रदान करने और इंट्रावास्कुलर बनाम एक्स्ट्रावास्कुलर बी-कोशिकाओं के भेदभाव की अनुमति देने के लिए अनुकूलित किया गयाहै। इंट्रावास्कुलर बनाम एक्स्ट्रावास्कुलर बी-कोशिकाओं का भेदभाव बलिदान से तुरंत पहले एंटीबॉडी के इंट्रावास्कुलर इंजेक्शन के माध्यम से प्राप्त किया जाता है। इंट्रावास्कुलर इंजेक्शन वाला एंटीबॉडी आसानी से पूरे वाहिका में फैलता है और सभी इंट्रावास्कुलर बी-कोशिकाओं का सामना करता है। यदि जानवर को जल्द ही बलिदान किया जाता है और दिल को तुरंत काटा जाता है, तो एंटीबॉडी के पास एक्स्ट्रावस्कुलर स्पेस में फैलने और एक्स्ट्रावस्कुलर बी-कोशिकाओं को दागने का समय नहीं होता है। चूंकि एंटीबॉडी और अंग की फसल के इंट्रावास्कुलर इंजेक्शन के बीच का समय महत्वपूर्ण है, इसलिए एंटीबॉडी के साथ टीका लगाने और एक समय में एक व्यक्तिगत माउस हृदय एकत्र करने की सिफारिश की जाती है। एंटीबॉडी के इंट्रावास्कुलर इंजेक्शन को छोड़ा जा सकता है यदि इंट्रावास्कुलर बनाम एक्स्ट्रावस्कुलर बी-कोशिकाओं का भेदभाव रुचि का नहीं है। चित्रा 1 में प्रदर्शित गेटिंग रणनीति अंतिम चरण को छोड़कर समान रहेगी, जो बी 220 लेबलिंग की कमी के कारण संभव नहीं होगी। प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर, दिखाए गए पैनल से किसी भी फ्लोरोफोरे को एक रंग में संशोधित किया जा सकता है जो उपयोग किए गए पैनल के साथ फिट बैठता है। इसके अलावा, यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि सतह मार्करों के चयन को इसे करने वाले समूह की जरूरतों के अनुसार संशोधित किया जा सकता है; उदाहरण के लिए, यदि प्रयोगात्मक डिजाइन में यह माना जाता है कि बी 1 कोशिकाओं पर सीडी 11 बी अभिव्यक्ति को कम किया जा सकता है, तो विभिन्न मार्करों को जोड़ने की सिफारिश की जाती है, जैसे कि आईजीएम, आईजीडी और सीडी 537।

कृपया ध्यान दें कि प्रवाह साइटोमेट्री के लिए मुआवजा नियंत्रण चलाने के लिए दिल को संसाधित करना आवश्यक हो सकता है। यह पहली बार अनुशंसित है जब प्रयोग अनुकूलित किया गया है। निम्नलिखित प्रयोगों में, हृदय संग्रह के समय कुछ ऊतकों को सहेजना पर्याप्त हो सकता है, क्योंकि यह एक नकारात्मक "बिना दाग" नियंत्रण और एक सकारात्मक "जीवित-मृत" दाग नियंत्रण चलाने के लिए पर्याप्त कोशिकाएं प्रदान करेगा। अन्य रंगों के लिए व्यक्तिगत नियंत्रण या तो पूर्व प्रयोगों से आयात किए जा सकते हैं या मोतियों का उपयोग करके उत्पन्न किए जा सकते हैं।

प्रयोग के परिणामों को बदलने के बिना प्रोटोकॉल के कुछ चरणों को संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एनेस्थीसिया विधि को शोधकर्ता के अनुभव के आधार पर पसंदीदा के लिए बदला जा सकता है; 2,2,2-ट्राइब्रोमोएथेनॉल के बजाय आइसोफ्लुरेन का उपयोग संज्ञाहरण प्रशासन और हृदय संग्रह के बीच बिताए गए समय को कम कर सकता है। इसके अलावा, दिल का छिड़काव सिरिंज पंप के उपयोग के बिना मैन्युअल रूप से किया जा सकता है जब तक कि यह धीरे-धीरे, धीरे-धीरे और लगातार किया जाता है।

प्रोटोकॉल के सटीक निष्पादन के बावजूद, अनुभवहीन ऑपरेटर एक ही प्रयोगात्मक सत्र के भीतर या विभिन्न प्रयोगात्मक सत्रों के बीच नमूनों के बीच उच्च परिवर्तनशीलता का सामना कर सकते हैं। अनुभव के आधार पर, यह परिवर्तनशीलता गायब हो जाती है जब वैज्ञानिक को वर्कफ़्लो से पूरी तरह से परिचित होने का अवसर मिलता है। इसलिए यह अनुशंसा की जाती है कि जो कोई भी इस प्रोटोकॉल को लागू करना चाहता है, वह अपनी शोध परियोजनाओं पर महत्वपूर्ण डेटा एकत्र करने से पहले दो से तीन परीक्षण रन में इसकी प्रजनन क्षमता का आकलन करता है।

सारांश में, हृदय से प्रतिरक्षा कोशिकाओं को अलग करने और फ्लो साइटोमेट्री के माध्यम से उनका विश्लेषण करने के मौजूदा तरीके आम तौर पर एंडोथेलियम से जुड़ने के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं की क्षमता पर विचार नहीं करते हैं, और या तो छिड़काव को मानकीकृत नहीं करते हैं या व्यापक छिड़काव को लागू नहीं करते हैं, इस धारणा के साथ कि इंट्रावास्कुलर स्पेस में कोई भी प्रतिरक्षा कोशिका एक दूषित पदार्थ है जिसे शुद्ध किया जाना चाहिए। यह इस धारणा को अनदेखा करता है कि एंडोथेलियम का पालन करने वाली इंट्रावास्कुलर प्रतिरक्षा कोशिकाओं की जैविक प्रासंगिकता है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल को मायोकार्डियल बी-कोशिकाओं, इंट्रावास्कुलर और एक्स्ट्रावस्कुलर पर विशेष ध्यान देने के साथ मायोकार्डियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं की वसूली को अधिकतम करने के लिए अनुकूलित किया गया है। हम उम्मीद करते हैं कि यह प्रोटोकॉल उन सभी वैज्ञानिकों के लिए रुचि का होगा जो कार्डियक इम्यूनोलॉजी के क्षेत्र में काम करते हैं और उस कार्य की खोज करने में रुचि रखते हैं जो बी-कोशिकाएं स्वस्थ और घायल दिलों में खेल सकती हैं।

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Disclosures

लुइगी अदामो आई-कॉर्डिस, एलएलसी के सह-संस्थापक हैं, जो दिल की विफलता के उपचार के लिए इम्यूनोमॉड्यूलेटरी अणुओं के विकास पर केंद्रित एक कंपनी है, जिसमें बी-सेल मॉड्यूलेटिंग दवा पिरफेनिडोन के डेरिवेटिव में विशिष्ट रुचि है। शेष लेखकों के पास घोषित करने के लिए कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को एनएचएलबीआई अनुदान 5K08HLO145108-03 और 1R01HL160716-01 द्वारा लुइगी अदामो को प्रदान किया गया था।

इस अध्ययन को विकसित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले ऑरोरा फ्लो साइटोमीटर को एनआईएच ग्रांट एस 10ओडी026859 द्वारा वित्त पोषित किया गया था। हम जेएचयू रॉस फ्लो साइटोमेट्री कोर के समर्थन को स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody 101222 BioLegend 100 µg 200 µL
(CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 µm, Blue QBIAP303 Southern Labware
0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube 1605-0000 SealRite, USA Scientific
0.9% Sodium Chloride Injection, USP 114-055-101 Quality Biological 0.90%
1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube 1615-5500 SealRite, USA Scientific
10 µL Graduated TipOne Filter Tips 11213810 USA Scientific
1000 µL Graduated TipOne Filter Tips 11267810 USA Scientific
15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free 430052 Corning
1-Way Stop Valve, Polycarbonate SVPT951 ECT Manufacturing
2,2,2-Tribromoethanol T48402 Sigma-Aldrich
200 µL Graduated TipOne Filter Tips 11208810 USA Scientific
3-Way Stop Valve, Polycarbonate SVPT953 ECT Manufacturing
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style 352054 Falcon, a Corning Brand
50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free 430290 Corning
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer 118-156-101 Quality Biological Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20
Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63 5810759005 Eppendorf
Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62 22638289 Eppendorf
Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 – 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62 22638246 Eppendorf
Aluminum Foil 12 in x 75' Roll .0007 UPC 109153 Reynolds Wrap
Anesthesia Induction Chamber - Mouse RWD-AICMV-100 Conduct Science
BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL 309626 BD Becton, Dickinson and Company
Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-Pack CMD 2613 Brandzig
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody 115537 BioLegend 50 µg/mL
CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 µm, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile T9009 Southern Labware
Carbon Dioxide USP E CGA 940  CD USPE AirGas USA
Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL UX-34502-46 Cole-Parmer
Collagenase 2 LS004176 Sigma-Aldrich
Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barb Y992611-AG AirGas USA
Cytek Aurora Flow Cytometer Cytek Biosciences
Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP M-08-12 AirGas USA
DNase I - 40,000 U D4527 Sigma-Aldrich
Easypet 3 - Electronic Pipette Controller 4430000018 Eppendorf
Electronic Balance, AX223/E 30100606 Ohaus Corp.
Eppendorf 5810R centrifuge 5810R Eppendorf
Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes Eppendorf
FlowJo 10.8.1 BD Becton, Dickinson and Company
GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100) Z740287 Heathrow Scientific
HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+] 14025076 gibco 1x
Hyaluronidase H3506 Sigma-Aldrich
Kelly Hemostats, Straight 13018-14 Fine Science Tools
Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL 302831 BD Becton, Dickinson and Company
M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940 M1-940-PG AirGas USA
McKesson Underpads, Moderate 4033-CS150 McKesson
Navigator Multi-Purpose Portable Balance NV2201 Ohaus Corp.
PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-] 10010023 gibco 1x
PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody 103208 BioLegend 200 µg/mL
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody 103132 BioLegend 100 µg 500 uL
Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene FB0875711YZ Fisher Scientific
Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02 M08-1 AirGas USA
Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator LED-6W AmScope
PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm) 305122 BD Becton, Dickinson and Company
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO) 553141 BD Becton, Dickinson and Company Biosciences 0.5 mg/mL
R 4.1.1 The R Foundation
Razor Blades 9501250000 Accutec Blades Inc
Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet Y12244A320-AG AirGas USA
Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets Rotor A-4-62 Eppendorf
Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister 86.1254.001 Sarstedt AG & Co KG
Sigma label tape L8394 Sigma-Aldrich
SpectroFlo 3.0.0 Cytek Biosciences
Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8" Hose Barb; 1/EA MTLL230-6005 Spex
Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' Long CG-730-003 Excelon Laboratory
Syringe PP/PE without needle, 3 mL Z683566 Millipore Sigma
Syringe pump 55-1199 (95-240) Harvard Apparatus
Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500 9371W13 Thomas Scientific
Tube Rack, 12 positions, 6 for 5.0 mL and 15 mL tubes and 6 for 25 mL and 50 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable 30119835 Eppendorf
Tube Rack, 12 positions, for 5.0 mL and 15 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable 30119827 Eppendorf
TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in. T8913 (Millipore Sigma) Tygon, Saint-Gobain
Vortex-Genie 2 SI-0236 Scientific Industries, Inc.
VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips 89259-946 Avantor, by VWR
VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4½" 82027-578 Avantor, by VWR
VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I 12620-946 Avantor, by VWR
Zombie Aqua Fixable Viability Kit 423102 BioLegend

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References

  1. Adamo, L., Rocha-Resende, C., Mann, D. L. The emerging role of B lymphocytes in cardiovascular disease. Annual Review of Immunology. 38, 99-121 (2020).
  2. Gowans, J. L., Knight, E. J. The route of re-circulation of lymphocytes in the rat. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 159 (975), 257-282 (1964).
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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 186
फ्लो साइटोमेट्री-आधारित परिमाणीकरण और मायोकार्डियल बी-कोशिकाओं का विश्लेषण
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Bermea, K. C., Rousseau, S. T., Adamo, L. Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells. J. Vis. Exp. (186), e64344, doi:10.3791/64344 (2022).

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