Summary
ここでは、フローサイトメトリーを用いた血管内または内皮腔内の位置に基づく心筋Bリンパ球の定量と分化のためのプロトコルを報告します。
Abstract
Bリンパ球が心筋生理学および傷害への心筋適応の文脈において重要な役割を果たすことを示す証拠が増えています。しかし、文献は心筋B細胞の有病率に関する対照的なデータを報告しています。B細胞は、げっ歯類の心臓で最も一般的な免疫細胞の中にあるか、存在すると報告されていますが、骨髄系細胞よりも有病率が著しく低いか、非常にまれです。同様に、いくつかのグループは、急性虚血性心筋損傷後に心筋B細胞の数が増加すると記載しているが、1つのグループは、損傷心筋のB細胞数に変化がないことを報告した。心筋B細胞の有病率を評価するための共有された再現可能な方法の実装は、さまざまな研究グループからの観察を調和させ、B細胞心筋相互作用の研究の進歩を促進するために重要です。私たちの経験に基づくと、文献で報告されている一見対照的な観察結果は、マウス心筋B細胞がほとんど血管内であり、微小血管内皮に接続されているという事実に由来する可能性があります。したがって、マウス心臓から回収されるB細胞の数は、臓器をきれいにするために使用される灌流条件と使用される消化方法に非常に敏感です。ここでは、これら2つの重要な変数を特定の方法で説明する最適化されたプロトコルを報告します。このプロトコルは、マウス心筋B細胞の数の再現性のあるフローサイトメトリーベースの分析を可能にし、研究者が血管外心筋B細胞と血管内心筋B細胞を区別することを可能にします。
Introduction
Bリンパ球は高度に特殊化された免疫細胞であり、適応免疫応答と自然免疫応答の両方に重要な役割を果たしています1。B細胞には2つの主要な集団があります:主に胚期に産生されるB1細胞のより小さな集団と、骨髄1で成人期に産生されるB2細胞の優勢集団です。骨髄で成熟した後、B細胞は一次および二次リンパ器官に移動します。そこから、血管とリンパ管を通過するリンパ器官の間を継続的に再循環します2。B細胞は、受容体として機能する特異的抗体を表面に発現します。B細胞が受容体に結合する抗原に遭遇すると、活性化シグナルがトリガーされる可能性があります。活性化されたB細胞は、抗原が発見された組織に移動するか、骨髄に戻り、そこで抗体産生形質細胞に成熟することができます3,4。
最近、心臓にはかなりの数のB細胞が宿っていることが評価されています。げっ歯類の研究は、B細胞が胚発生の早い段階で心臓にコロニーを形成することを示しており5、心筋関連B細胞は主に血管内のナイーブなB2細胞であり、内皮に接着しており6,7、B1細胞の割合はわずかです7。不確実性の領域はまだたくさんありますが、入手可能なデータは、B細胞がナイーブ心臓と損傷への心筋適応の文脈の両方で重要な役割を果たすことを示しています。
ナイーブマウス心臓での研究では、ベースライン時に心筋B細胞が主に血管内腔に位置し、内皮に接着していることが示されています(マウス心臓B細胞の>95%が血管内腔にあることがわかりました)。これらのB細胞は、末梢血から単離された循環B細胞のものとは異なる遺伝子発現パターンを有することがわかった。B細胞欠損動物および同系対照からのナイーブ心臓の分析は、B細胞を欠く動物がより小さく、駆出率が高いことを発見しました6。これらすべての証拠は、B細胞が心筋の成長および/または心筋機能を調節する可能性があり、間質性だけでなく血管内のB細胞もそのような観察の原因である可能性があることを示唆しています。B細胞は、心筋常在マクロファージの表現型を調節することも見出された8。
いくつかの研究は、B細胞が損傷に対する心筋適応の文脈において重要な役割を果たすことを示している8、9、10、11、12、13。B細胞は、おそらくCXCL13-CXCR5依存性機構を介して、損傷した心臓に一過性に蓄積する11,13。そこから、B細胞は、サイトカインを介した単球の動員を含むいくつかのメカニズムを通じて、有害な心臓リモデリングを促進します9,12。さらに、B細胞は、いくつかのメカニズムを介して心臓損傷の拡張および有害な心臓リモデリングを促進することができる心臓タンパク質に対する抗体を産生することができる14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25.B細胞はまた、IL-1010の分泌を介して損傷した心臓に保護効果を発揮することができる。
ナイーブで負傷した心臓におけるB細胞の役割を調査するグループの数が増えるにつれて、心筋B細胞を適切に定量および評価し、すでに文献に現れ始めている矛盾を回避するための共有プロトコルを定義することがますます重要になっています。これまでのところ、B細胞は実際にげっ歯類の心臓7で最も一般的な免疫細胞の1つであり、骨髄系細胞よりも著しく低い有病率で存在すると報告されています26,27、または非常にまれです28。同様に、いくつかのグループは、急性虚血性心筋損傷後に心筋B細胞の数が増加すると記載している7,9,13が、1つのグループは、損傷心筋のB細胞数に変化を報告しなかった29。心臓免疫細胞の研究では、灌流条件の詳細が説明されることはめったになく、消化条件に関するコンセンサスはありません。げっ歯類の心臓ではB細胞の大部分が血管内であり、心筋からの免疫細胞の抽出は使用する消化方法に大きく依存するため、文献で報告されている違いは臓器灌流と組織消化の違いの結果である可能性があります。
ここでは、灌流および消化条件を最適化することでB細胞回収の収率を最大化し、血管内心筋B細胞と血管外心筋B細胞の識別を可能にする、マウス心筋B細胞のフローサイトメトリーベースの定量の詳細な方法を示します6。このプロトコルは、血管内免疫細胞と間質免疫細胞とを区別する他の類似のプロトコルの適応および最適化である28、30、31。
このプロトコルでは、心筋灌流を標準化して、微小血管内皮に接着した生物学的に関連するB細胞を除去することなく、血管内空間に浮遊するB細胞を排除します。さらに、血管内免疫細胞と間質免疫細胞を区別するための抗体の静脈内注射の使用を説明した以前のプロトコルに基づいて32、B細胞が表面マーカーB220を発現するという事実を利用して33、動物の犠牲および心臓灌流の直前にB220特異的抗体の血管内注射を通じて血管内心筋B細胞を区別する方法を示します。このプロトコルは、ナイーブで負傷した心臓の心筋B細胞の分析を含めることに関心のある科学者の研究に関連しています。このプロトコルの広範な実装は、研究グループ間の不一致を減らし、血管内および血管外の心筋B細胞プールの変化の分析を可能にし、したがって心臓免疫学の分野における発見の進歩を強化します。
要約すると、このプロトコルは、フローサイトメトリーを介して心筋B細胞を定量および分析すると同時に、血管外空間と血管内空間に位置する細胞を区別するための最適化されたワークフローを表しています。
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Protocol
この原稿に記載されているすべての実験は、ジョンズホプキンス大学医学部のIACUCの承認を得て実施されました。
1. 事前準備
- 表 1 の説明に従って、FACS バッファーを準備します。
- 動物を安楽死させるのに十分なCO2 があることを確認してください。
- 解剖スペースを準備します(ベンチパッドを置き、テープと解剖ツールを近くに置きます)。
- 15 mLチューブにラベルを付け、各チューブにカルシウムとマグネシウムを含むHBSSを3 mL入れ(材料の表を参照)、氷上に置きます(心臓ごとに1本のチューブと、参照群/フローサイトメトリーコントロール用に1本追加)。また、小さな(35 mm)ペトリ皿にHBSSを入れます。
- 温度制御されたシェーカーの電源を入れ、37°Cに設定し、遠心分離機を4°Cの温度で事前に冷却します。
- シリンジポンプを準備し、流量を3mL/minに設定します。20 mLシリンジにHBSSを満たし、チューブラインにバッファーをプライミングし、気泡を取り除きます。
2.血管内B細胞染色(in vivo)
- C57BL/6J系統の12週齢の雄マウスの体重を測定します。3/10 ccインスリン注射器に100 μLのB220抗体希釈液(1:10、PBS中)をロードします。光から保護するためにシリンジをアルミホイルで覆います。
- 1匹のマウスを麻酔します。
- 2%2,2,2-トリブロモエタノールを400mg / kgの用量で腹腔内注射し、10〜20分待ちます。.
注意: マウスの呼吸と動きを監視します。マウスの動きが止まったら、つま先をつまんで痛みを刺激します。離脱反射がないことは、適切な麻酔を示しています。 - 20分以内に適切な麻酔が達成されない場合は、100 mg / kgの追加麻酔薬を投与し、マウスの動態、離脱反射、および呼吸の評価を5分ごとに行う必要があります。.
- 2%2,2,2-トリブロモエタノールを400mg / kgの用量で腹腔内注射し、10〜20分待ちます。.
- マウスを片側に傾けたベンチパッドの実験台に置き、背中の皮膚をそっと引き下げ、体をベンチに軽く押し付けて目を突き出します。
- ステップ2.1の希釈B220抗体を眼窩後注射により注入する。
- マウスの頭矢状面から45°で注射器を目に導入します。溶液をゆっくりと注入します。抵抗が感じられた場合は、シリンジを取り外して再度入力してください。2分間待ちます。
注:インキュベーション時間を長くすると、注入された抗体が血管系外に拡散する時間を与えるため、血管内B細胞と血管外B細胞を区別する能力が危険にさらされます。
- マウスの頭矢状面から45°で注射器を目に導入します。溶液をゆっくりと注入します。抵抗が感じられた場合は、シリンジを取り外して再度入力してください。2分間待ちます。
- IACUCの規制に従ってマウスを安楽死させます。
- 安楽死チャンバーへのCO2 フローを0.5 L / minの速度、またはチャンバーのサイズに基づく推奨流量で開きます。
- マウスを推奨時間チャンバーに入れ、呼吸していないことを確認します。それを取り除き、安楽死の二次的な方法として頸部脱臼を行います。
- マウスが安楽死したら、速やかに臓器摘出と灌流に進みます。
3.ハートコレクション
- 胸の開口部。
- 上腹部で鉗子でマウスの皮膚を保持します。ハサミを使って皮膚に2mmの開口部を作り、鉗子を使って皮膚を剥がすと、胸と腹部の筋膜層、光沢のある半透明の層が現れます。筋膜と腹膜を通して上腹部を切って腹壁を開き、剣状突起を明らかにします。止血鉗子を使用して剣状突起をクランプします。
- はさみで、両側の中央鎖骨線の高さで胸壁を垂直に切り込み、前胸壁を持ち上げて縦隔の内容物を明らかにし、止血鉗子を重りとして使用して開口部を維持します。
- 心臓の灌流と抽出。
- 鉗子を使用して、心臓を取り巻く脂肪や胸腺組織を取り除きます。
- 鉗子を使用して大動脈を後ろからしっかりと保持します。シリンジ針(25 G)を心臓の頂点に導入します。3 mL /分の速度で3 mLのHBSSで灌流します。
注意: 灌流を監視します。肝臓がいっぱいになり、冠状血管内の血液が完全に除去されます。安定した流れを維持するために、1 mL /分に校正されたシリンジポンプの使用をお勧めします。 - ハサミを使って大動脈を切り、心臓を取り出します。残っている血液を取り除くためにHBSSでペトリ皿の心臓を洗います。はさみと鉗子を使用して、脂肪、結合組織、胸腺を取り除き、心臓を乾燥させます。孤立した心臓の重さを量り、ミリグラム単位で体重を書き留めます。室温で心臓を刃で小片(1〜2 mm)にミンチします。
注:成体マウスの心臓の体重は0.090〜0.210mgです。 - 心臓組織の質量を測定し、消化するミンチ心臓60 mgを3 mLのHBSSを含む15 mLチューブに入れます。残りの心臓組織を保持し、「参照対照組織」とラベル付けされたチューブに入れます。これは、生死シグナルと自家蛍光の補償制御に使用されます。
4.心臓の消化と細胞染色
- ミンチ組織を含む各チューブに酵素を追加します( 表1を参照)。DNase 1 0.5 μL/mg (心臓組織 60 mg に対して 300 単位)、コラゲナーゼ II 0.5 μL/mg (心臓組織 60 mg に対して 625 単位)、およびヒアルロニダーゼ 0.2 μL/mg (心臓組織 60 mg に対して 50 単位) をチューブに加えます。
- 消化反応をシェーカーに300rpmで30分間入れます。シェーカーラックを約25°の傾斜に調整します。
- 15 mLの反応チューブのそれぞれに7 mLのHBSSを加え、加速と破壊を中程度または低速に設定して、250 x g で4°Cで5分間遠心分離します。上清をデカントし、各ペレットを5 mLのACK溶解バッファーに再懸濁して赤血球を除去します。ACK溶解バッファー中で室温で5分間インキュベートします。
- 各チューブに10 mLのPBSを加えて混合し、40 μmのストレーナーで50 mLのチューブにろ過します。すべての破片がフィルターチャンバー内にあることを確認してください。フィルターチャンバー内に完全に吊り下げられるまで、シリンジプランジャーでフィルターの破片を粉砕します。
- 容量が心臓あたり25mLに達するまで、フィルターを通してPBSを追加します。これにより、懸濁細胞がフィルターを通過できるようになります。リファレンスコントロール組織チューブにさらに25 mLのPBSを追加し、容量を異なるチューブ(それぞれ25 mL)に分割します。チューブの1つに「染色されていない」というラベルを付け、もう1つに「生きている死者」というラベルを付けます。250 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
注:この時点で、生きている死んだ染色の希釈を準備します(希釈:1x PBSで1:500)。 - 上清をデカントし、ペレットを100μLのPBS中の未染色チューブに再懸濁し、他の各ペレットを100μLの生死染色希釈液に再懸濁する。氷の上で暗闇の中で30分間インキュベートし、アイスバケットをアルミホイルで覆います。
- 各サンプルに500 μLのFACSバッファーを加え、40 μmのフィルターを通して標識されたFACSチューブに移します。FACSチューブを250 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上澄み液を捨てる。ペレットを500 μLのFACSバッファーに再懸濁します。
- 50 μLのFcブロッキング溶液( 表1を参照)を、染色されていないチューブとライブデッドチューブを除く各チューブに追加します。混合して5分間インキュベートします。
- 50 μLの抗体混合溶液( 表1を参照)を、未染色チューブとライブデッドチューブを除く各チューブに加え、暗所で30分間インキュベートし、アイスバケットをアルミホイルで覆います。
- 各チューブに2 mLのFACSバッファーを加え、250 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を除去し、300〜500μLのFACSバッファーに再懸濁します。
5. フローサイトメトリー
- 計測器制御の設定を行います。
注:このプロトコルでは、サンプルは4レーザーCytek Auroraフローサイトメーターで分析されます。別の適切なフローサイトメーターを使用して、目的のマーカーを検出することができます。- 計測器制御ソフトウェアを開きます( 材料表を参照)。ウィンドウの上部で、[ 取得 ]タブを選択し、[ 新規+]をクリックします。 [新しい実験の作成] というウィンドウが表示されます。
- [ライブラリ] セクションの [フィルターに入力] フィールドに、「PE」、「PerCP-Cy5.5」、「BV421」、「Alexa Fluor 700」、「ゾンビ アクア」と入力し、それぞれ入力後に [追加] をクリックします。蛍光色素の名称は右側に表示されます。次に、[次へ]をクリックして[グループ]タブに進みます。
- [ グループ ] タブで、チューブ付きのシンボルをクリックして、解析用のハートを追加します。
- +参照グループをクリックすると、ウィンドウが表示されます。蛍光タグ列でゾンビアクアを選択し、コントロールタイプ列でセルを選択し、[保存]をクリックします。
- [ マーカー>次へ] タブをクリックします。蛍光色素の名前が表に表示されます。各蛍光色素カラムの最初の行に対応する細胞マーカーを入力し、PerCP-Cy5.5の場合はCD45と 入力します。BV421のためのCD19;CD11b for Alexa Fluor 700;PEのためのB220;そしてゾンビアクアのために生きている死者。
- [ 次へ ] を 2 回クリックして、[ 集録 ] タブに移動します。実験グループの [記録するイベント ] に「10,000,000」と入力し、参照グループの行の同じフィールドに「200,000」と入力します。「 保存して開く」をクリックします。その他の設定はデフォルトのままで、[ 停止時間は 10,000]、 [停止ボリューム] は3,000のままにする必要があります。
- 左下の [機器コントロール]をクリックします。 電圧 をFSC-50、SSC-175、SSC-B-175に設定します。次に、 取得コントロールを選択します。[ 流量 ] オプションで、ドロップダウン メニューから [高 ] を選択します。
- サイトメーターで参照サンプルを取得し、ソフトウェアで解凍します。
- 染色されていない心臓チューブをボルテックスし、サンプル注入ポート(SIP)にしっかりと置きます。緑色のインジケーター矢印が正しいサンプルを指していることを確認してから、サイトメーターソフトウェアのデータ収集コントロールパネルで開始をクリックし、イベントが記録されるまで待ちます。生きている死者で染色された心臓組織についても同じことを行います。
- [アンミックス] メニューを選択し、次のコントロールを設定します。
- ライブラリの列で、PE、PerCP-Cy5.5、BV421、Alexa Fluor 700のチェックボックスをオンにします。同じ列でゾンビアクアがオフになっていることを確認します。下部にある、蛍光 タグとしての自家蛍光のオプションをチェックします。
- [ 次へ ] をクリックして、[ 陽性/陰性の母集団の識別 ] タブに進みます。このタブには、FSC-A対SSC-B-Aのプロットが表示されます。ポリゴンのポイントをクリックしてドラッグし、FSC-A 軸で 1.0 M から 4.0 M の間、および SSC-B-A 軸で 0.2 M から 3.0 M の間の領域を選択します。
- 右の次のプロットでは、V5-AがX軸に表示されます。ゲートを移動して、右端のピークの半分を正として選択し、プロットの左側の領域を負として選択します。参照グループ - 染色されていないというタイトルのプロットで、同様の範囲の集団を選択します。このためには、無染色の正負を設定する必要はありません。
- 実験サンプルの取得。
- 個々のマウスのサンプルを含む各チューブについて、チューブをボルテックスし、SIPにしっかりと置きます。緑色のインジケーター矢印が正しいサンプルを指していることを確認してから、サイトメーターソフトウェアの収集コントロールパネルで開始をクリックし、イベントが記録されるまで待ちます。
- ゲーティング戦略。
- デフォルトの混合されていないワークシートタブを選択します。上部のドットプロットツールを使用して、FSC-A対SSC-Aプロットを作成します。ポリゴン選択ツールを使用して、FSC-A 軸で 0.4 M を超えるイベント、SSC-A 軸で 0.8 M を超えるイベントを選択します。この選択をダブルクリックすると、新しいプロットが表示されます。
- 新しく作成したプロットから、X軸ラベルを右クリックし、AF-Aを選択します。Y軸ラベルを右クリックして、ライブデッド染色を選択します。上部の長方形選択ツールをクリックし、下のライブデッド信号に対応するライブデッド軸上の105未満のすべてのイベントを選択します。この選択をダブルクリックすると、新しいプロットが表示されます。
- 新しいプロットで右クリックして、X軸に PerCP-Cy5.5-A を選択し、Y軸に SSC-A を選択します。 長方形選択ツールを使用して、CD45陽性細胞に対応するPerCP-Cy5.5-A軸上の104 より大きいイベントを選択します。選択範囲をダブルクリックすると、新しいプロットが表示されます。
- 新しいプロットで、右クリックしてX軸にFSC-Aを選択し、Y軸にFSC-Hを選択します。ポリゴン選択ツールを使用して、FSC-A 値と SSC-A 値が同じトレンドに従うイベントを選択します。これにより、細胞ダブレットが除去され、選択の集団はCD45 +集団と呼ばれます。選択範囲をダブルクリックして、CD45+母集団の新しいプロットを表示します。
- CD45+母集団プロットを右クリックして、X軸の BV421 とY軸のSSC-Aを選択します。 ポリゴン選択ツールを使用して、 BV421 軸の右側の人口を選択します。これがB細胞集団です。この母集団を2回ダブルクリックして、B細胞母集団で2つの新しいプロットを作成します。
- 右クリックして、X軸にPE-A、Y軸にBV421-Aを持つ最初のBセルプロットを設定します。 右側の集団は血管内B細胞に対応し、左側の集団は間質性B細胞を表します。ポリゴン選択ツールを使用して、両方を選択します。
- 右クリックして、Alexa Fluor 700-A をX軸に、 SSC-A をY軸に設定した2番目のB細胞プロットを設定します。左側の集団はCD11b-細胞に対応し、右側のイベント(存在する場合)はCD11b+細胞に対応します。
- 各選択項目を右クリックし、[ ゲートのプロパティ]をクリックします。[ カウント ]と [%親 ]をクリックして、サイズとパーセンテージを表示します。さらにデータ分析するために、イベントの数とパーセンテージを記録します。
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Representative Results
取得が完了し、すべてのイベントが収集されたら、標準的なフローサイトメトリーの実践に従ってデータを分析する必要があります。分析の焦点は、各実験の個々の目標によって異なります。この場合、血管内および血管外のB細胞の定量を追求し、組織1mgあたりの細胞数として表した。
スペクトルサイトメーターを使用する場合は、免疫細胞に対応する範囲にないサイズの破片を除去するための最初のゲーティングから分析を開始し、その後、生死染色+シグナルを除去することをお勧めします。これにより、白血球に対応するCD45陽性細胞のきれいな集団の検出が可能になる(図1)。ダブレットの除去後、ナイーブな無傷の心臓では、CD45+細胞の約20%がCD19+ B細胞になると予想されています(図2A、この代表的な実験では18.1%B細胞)。これらの細胞のうち、平均して5.5%が間質腔に位置し、94.5%が血管内腔に位置しています(図2B)。心臓で見つかったB細胞集団全体のうち、表面マーカーCD11bに基づくB1細胞に対応するのは約1.6%のみであり(通常、マウスCD19+細胞を高い信頼度でB1細胞として分類するのに十分であると考えられています1,34,35)、残りの98.4%はB2細胞に対応します(図2C)。
図1:心筋関連B細胞の検出と特性評価に使用されるフローサイトメトリーゲーティング戦略。 (A)FSC-A対SSC-A:プロットには収集されたすべてのイベントが表示され、白血球のサイズの範囲にあるイベントで分析を充実させるために選択された領域が描画されます。(B)自家蛍光対生死染色:選択された領域は、より低い生死シグナルに対応します。描かれたゲートは、死んだ細胞と、生死染色に結合する他のいくつかの細胞破片を取り除きます。(C)CD45シグナル対SSC-A:選択された領域は、CD45+細胞(すなわち、心筋白血球)に対応する。(D)FSC-A対FSC-H:このゲートは、セルダブレット(選択されていないイベント)を除去するために描画されます。(E)CD19シグナル対SSC-A:選択された領域は心筋B細胞に対応する。(F)B220対CD19:黒い四角の内側の領域は心筋内B細胞(CD19+、B220-)に対応し、赤い四角の内側の領域は血管内B細胞集団に対応します。(G)CD11b対SSC-A:黒い円の内側の領域はCD11b+(B1細胞)に対応し、赤い円の内側の領域はCD11b-(B2細胞)に対応します。各パネルに表示されるパーセンテージは、表示される母集団が親の母集団から表す平均パーセンテージを表します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:心筋組織のミリグラムあたりのB細胞の平均数を報告する代表的なプロット 。 (A)マウス心筋組織のCD45+およびCD19+細胞/mgの平均数。表示されるパーセンテージは、親母集団(CD45+)からの細胞の割合に対応します。(B)CD19+細胞の平均数と血管内空間の間質(血管外)空間にあるB細胞の割合。(C)B1またはB2細胞のマーカーを発現する心筋B細胞の絶対数と割合。エラーバーは平均の標準誤差に対応します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表 1: この表には、手順に必要な溶液と試薬が含まれています。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ますます多くの証拠が、B細胞が心筋生理学および心筋のリモデリング/損傷への適応の文脈で重要な役割を果たすことを示しています7、8、9、10、11、12、13、36。フローサイトメトリーは、あらゆる組織の免疫細胞集団を研究するための優れたツールであり、心臓のB細胞に焦点を当てたあらゆる研究にとってほぼ必須のツールです。
B細胞と心臓に関する新たな文献は、心臓のB細胞の数や損傷に伴う心筋B細胞数の変化など、非常に基本的な側面に関する対照的な発見をすでに報告しています。B細胞は、げっ歯類の心臓で最も一般的な免疫細胞として報告されています7。しかし、他の研究では、他の骨髄系細胞と比較して相対的な有病率を評価し、著しく低い数値を示しました26,27。Pintoら26は、B細胞が全白血球の約9%を占めることを発見したが、Yuら27は10%を報告した。Adamo et al.7は、白血球数に対するB細胞の平均割合は約20%であり、これはこの原稿で報告された18.1%に非常に近いと報告した。他の研究では、B細胞の心筋の有病率が非常に低いことが報告されています28。
いくつかの重要な実験ステップは、文献で報告されているB細胞数の変動を説明することができます。すなわち、心臓の灌流、組織ミンチ、および消化の違いは、心臓組織1mgあたりに回収されるB細胞の数に大きく影響する可能性があります。カルシウムキレート剤を含み、カルシウムを含まないバッファーでの灌流、またはより高い体積または灌流速度での灌流は、内皮に付着したB細胞を剥離し、回収率を低下させる可能性があります。過度に微細な組織ミンチは、組織の過剰消化と細胞の生存能力の喪失につながる可能性があります。細胞生存率の低下は、長時間の消化またはより高い酵素濃度の結果である可能性もあります。
B細胞に対応するCD45+細胞の割合は、野生型マウスでは15%〜30%の範囲である可能性があります。使用するマウスの系統、年齢、および遺伝的背景に応じて、この値は異なる場合があります。ただし、調査対象グループでも割合は類似しているはずです。同じグループに属するマウス間のB細胞の数と割合に大きなばらつきがあることは、実験誤差が発生している可能性があることを示唆しています。パーセンテージが低い場合は、灌流強度と時間が過剰であることを示している可能性があります。CD45 +細胞の全体的な減少は、組織が過剰に消化されていることを示している可能性があります。
ここで説明するプロトコルは、消化されたマウス心臓からのB細胞の一貫した収量を提供し、血管内と血管外のB細胞の識別を可能にするように最適化されています6。血管内B細胞と血管外B細胞の識別は、屠殺の直前に抗体を血管内注射することによって達成されます。血管内に注入された抗体は、血管系全体に容易に拡散し、すべての血管内B細胞に遭遇します。動物が十分に早く犠牲にされ、心臓が速やかに採取された場合、抗体は血管外腔に拡散して血管外B細胞を染色する時間がありません。抗体の血管内注射から臓器採取までの時間が重要であるため、抗体を接種し、一度に1匹のマウス心臓を採取することをお勧めします。抗体の血管内注射は、血管内B細胞と血管外B細胞の区別が目的とされない場合は省略できます。 図1 に示されているゲーティング戦略は、B220ラベルがないために不可能な最後のステップを除いて同じままです。実験デザインに応じて、示されているパネルの蛍光色素は、使用するパネルに適合する色に変更することができます。また、表面マーカーの選択は、それを実行するグループのニーズに応じて変更できることを考慮することが重要です。例えば、実験デザインにおいてB1細胞上のCD11b発現を減少させることができると考えられる場合、IgM、IgD、およびCD537などの異なるマーカーの追加が推奨される。
フローサイトメトリーの補正コントロールを実行するためだけに心臓を処理する必要がある場合があることに注意してください。これは、実験を初めて最適化するときに推奨されます。以下の実験では、心臓採取の瞬間にいくつかの組織を保存することで、負の「染色されていない」対照および正の「生死」染色対照を実行するのに十分な細胞が得られるため、十分である可能性があります。他の色の個々のコントロールは、以前の実験からインポートするか、ビーズを使用して生成することができます。
プロトコルの一部のステップは、実験の結果を変更することなく変更できます。たとえば、麻酔方法は、研究者の経験に応じて好ましい方法に変更することができます。2,2,2-トリブロモエタノールの代わりにイソフルランを使用すると、麻酔投与から心臓採取までの時間を短縮できます。.また、心臓の灌流は、ゆっくりと、穏やかに、そして一貫して行われる限り、シリンジポンプを使用せずに手動で行うことができます。
プロトコルの正確な実行にもかかわらず、経験の浅いオペレーターは、同じ実験セッション内のサンプル間または異なる実験セッション間で大きな変動に遭遇する可能性があります。経験に基づいて、科学者がワークフローに完全に精通する機会を得ると、この変動性は消えます。したがって、このプロトコルを実装したい人は、研究プロジェクトに関する重要なデータを収集する前に、2〜3回の試運転でその再現性を評価することをお勧めします。
要約すると、心臓から免疫細胞を単離し、フローサイトメトリーを介して分析する既存の方法は、通常、免疫細胞が内皮に付着する能力を考慮しておらず、血管内空間の免疫細胞がパージされなければならない汚染物質であるという仮定で、灌流を標準化しないか、広範な灌流を実施しません。これは、内皮に接着した血管内免疫細胞が生物学的関連性を有するという考えを無視している。ここで提示されたプロトコルは、心筋B細胞、血管内および血管外に特に注意を払いながら、心筋免疫細胞の回収を最大化するように最適化されています。このプロトコルは、心臓免疫学の分野で働き、B細胞が健康な心臓や負傷した心臓で果たす可能性のある機能を探求することに関心のあるすべての科学者にとって興味深いものになることを期待しています。
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Disclosures
Luigi Adamoは、心不全の治療のための免疫調節分子の開発に焦点を当てた会社であるi-Cordis、LLCの共同創設者であり、B細胞調節薬ピルフェニドンの誘導体に特に関心を持っています。残りの著者は宣言する矛盾はありません。
Acknowledgments
この研究は、ルイジ・アダモに授与されたNHLBI助成金5K08HLO145108-03および1R01HL160716-01によって資金提供されました。
この研究の開発に使用されたオーロラフローサイトメーターは、NIHグラントS10OD026859によって資金提供されました。JHUロスフローサイトメトリーコアのサポートに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody | 101222 | BioLegend | 100 µg 200 µL |
| (CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 µm, Blue | QBIAP303 | Southern Labware | |
| 0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1605-0000 | SealRite, USA Scientific | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection, USP | 114-055-101 | Quality Biological | 0.90% |
| 1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1615-5500 | SealRite, USA Scientific | |
| 10 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11213810 | USA Scientific | |
| 1000 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11267810 | USA Scientific | |
| 15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430052 | Corning | |
| 1-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT951 | ECT Manufacturing | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | T48402 | Sigma-Aldrich | |
| 200 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11208810 | USA Scientific | |
| 3-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT953 | ECT Manufacturing | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style | 352054 | Falcon, a Corning Brand | |
| 50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430290 | Corning | |
| ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer | 118-156-101 | Quality Biological | Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20 |
| Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63 | 5810759005 | Eppendorf | |
| Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62 | 22638289 | Eppendorf | |
| Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 – 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62 | 22638246 | Eppendorf | |
| Aluminum Foil 12 in x 75' Roll .0007 | UPC 109153 | Reynolds Wrap | |
| Anesthesia Induction Chamber - Mouse | RWD-AICMV-100 | Conduct Science | |
| BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL | 309626 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-Pack | CMD 2613 | Brandzig | |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody | 115537 | BioLegend | 50 µg/mL |
| CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 µm, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile | T9009 | Southern Labware | |
| Carbon Dioxide USP E CGA 940 | CD USPE | AirGas USA | |
| Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL | UX-34502-46 | Cole-Parmer | |
| Collagenase 2 | LS004176 | Sigma-Aldrich | |
| Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barb | Y992611-AG | AirGas USA | |
| Cytek Aurora Flow Cytometer | Cytek Biosciences | ||
| Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP | M-08-12 | AirGas USA | |
| DNase I - 40,000 U | D4527 | Sigma-Aldrich | |
| Easypet 3 - Electronic Pipette Controller | 4430000018 | Eppendorf | |
| Electronic Balance, AX223/E | 30100606 | Ohaus Corp. | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | 5810R | Eppendorf | |
| Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes | Eppendorf | ||
| FlowJo 10.8.1 | BD Becton, Dickinson and Company | ||
| GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100) | Z740287 | Heathrow Scientific | |
| HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+] | 14025076 | gibco | 1x |
| Hyaluronidase | H3506 | Sigma-Aldrich | |
| Kelly Hemostats, Straight | 13018-14 | Fine Science Tools | |
| Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL | 302831 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940 | M1-940-PG | AirGas USA | |
| McKesson Underpads, Moderate | 4033-CS150 | McKesson | |
| Navigator Multi-Purpose Portable Balance | NV2201 | Ohaus Corp. | |
| PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-] | 10010023 | gibco | 1x |
| PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | 103208 | BioLegend | 200 µg/mL |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody | 103132 | BioLegend | 100 µg 500 uL |
| Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene | FB0875711YZ | Fisher Scientific | |
| Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02 | M08-1 | AirGas USA | |
| Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator | LED-6W | AmScope | |
| PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm) | 305122 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO) | 553141 | BD Becton, Dickinson and Company Biosciences | 0.5 mg/mL |
| R 4.1.1 | The R Foundation | ||
| Razor Blades | 9501250000 | Accutec Blades Inc | |
| Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet | Y12244A320-AG | AirGas USA | |
| Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets | Rotor A-4-62 | Eppendorf | |
| Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister | 86.1254.001 | Sarstedt AG & Co KG | |
| Sigma label tape | L8394 | Sigma-Aldrich | |
| SpectroFlo 3.0.0 | Cytek Biosciences | ||
| Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8" Hose Barb; 1/EA | MTLL230-6005 | Spex | |
| Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' Long | CG-730-003 | Excelon Laboratory | |
| Syringe PP/PE without needle, 3 mL | Z683566 | Millipore Sigma | |
| Syringe pump | 55-1199 (95-240) | Harvard Apparatus | |
| Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500 | 9371W13 | Thomas Scientific | |
| Tube Rack, 12 positions, 6 for 5.0 mL and 15 mL tubes and 6 for 25 mL and 50 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119835 | Eppendorf | |
| Tube Rack, 12 positions, for 5.0 mL and 15 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119827 | Eppendorf | |
| TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in. | T8913 (Millipore Sigma) | Tygon, Saint-Gobain | |
| Vortex-Genie 2 | SI-0236 | Scientific Industries, Inc. | |
| VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips | 89259-946 | Avantor, by VWR | |
| VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4½" | 82027-578 | Avantor, by VWR | |
| VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I | 12620-946 | Avantor, by VWR | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | 423102 | BioLegend |
References
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