Summary
여기서 우리는 유세포 분석을 사용하여 혈관 내 또는 내피 공간에서의 위치를 기반으로 심근 B- 림프구의 정량화 및 분화를위한 프로토콜을보고합니다.
Abstract
점점 더 많은 증거에 따르면 B- 림프구는 심근 생리학 및 심근 적응의 맥락에서 중요한 역할을합니다. 그러나 문헌은 심근 B 세포의 유병률에 대한 대조적 인 데이터를보고합니다. B 세포는 설치류 심장에서 가장 널리 퍼진 면역 세포 중 하나이거나 존재하는 것으로 보고되었지만 골수 세포보다 유병률이 현저히 낮거나 매우 드문 것으로 보고되었습니다. 유사하게, 몇몇 그룹은 급성 허혈성 심근 손상 후 심근 B 세포의 수가 증가한다고 설명했지만, 한 그룹은 손상된 심근의 B 세포 수에 변화가 없다고보고했다. 심근 B 세포의 유병률을 평가하기 위한 공유되고 재현 가능한 방법의 구현은 다양한 연구 그룹의 관찰을 조화시켜 B 세포 심근 상호 작용 연구의 발전을 촉진하는 데 중요합니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 문헌에보고 된 겉보기에 대조적 인 관찰은 쥐의 심근 B 세포가 대부분 혈관 내피에 연결되어 있고 미세 혈관 내피에 연결되어 있다는 사실에서 비롯된 것 같습니다. 따라서 쥐의 심장에서 회수 된 B 세포의 수는 장기를 청소하는 데 사용되는 관류 조건과 사용 된 소화 방법에 절묘하게 민감합니다. 여기에서는 이 두 가지 중요한 변수를 특정 방식으로 설명하는 최적화된 프로토콜을 보고합니다. 이 프로토콜은 쥐 심근 B 세포 수에 대한 재현 가능한 유세포 분석 기반 분석을 강화하고 연구원이 혈관 외 심근 B 세포와 혈관 내 심근 B 세포를 구별 할 수 있도록합니다.
Introduction
B-림프구는 적응면역 반응과 선천성 면역 반응 모두에서 중요한 역할을 하는 고도로 전문화된 면역 세포입니다1. B 세포의 두 가지 주요 집단이 있습니다 : 배아 생활 동안 주로 생성되는 B1 세포의 작은 집단과 골수1에서 성인 생활에서 생성되는 B2 세포의 우세한 집단. 골수에서 성숙 한 후 B 세포는 1 차 및 2 차 림프 기관으로 이동합니다. 거기에서 그들은 혈관과 림프관을 통해 이동하는 림프 기관 사이에서 지속적으로 재순환합니다2. B 세포는 수용체로 기능하는 표면에 특정 항체를 발현합니다. B 세포가 수용체에 결합하는 항원을 만나면 활성화 신호가 트리거 될 수 있습니다. 활성화된 B 세포는 항원이 발견된 조직으로 이동하거나 골수로 돌아가 항체 생성 형질 세포로 성숙할 수 있습니다 3,4.
최근에, 심장에는 상당한 수의 B 세포 집단이 있다는 것이 인식되고 있다. 설치류를 대상으로 한 연구에 따르면 B 세포는 배아 발달 초기에 심장에 식민지화되며5, 심근 관련 B 세포는 대부분 혈관 내 순진한 B2 세포이며 내피 6,7에 부착되어 있으며 B1세포는 적은 비율입니다7. 여전히 많은 불확실성이 있지만 사용 가능한 데이터는 B 세포가 순진한 심장과 부상에 대한 심근 적응의 맥락에서 중요한 역할을한다는 것을 나타냅니다.
순진한 쥐 심장에 대한 연구에 따르면 기준선에서 심근 B 세포는 대부분 혈관 내 공간에 위치하며 내피에 부착되어 있습니다 (> 쥐 심장 B 세포의 95 %가 혈관 내 공간에 위치하는 것으로 밝혀졌습니다). 이들 B 세포는 말초 혈액으로부터 분리된 순환 B 세포와 상이한 유전자 발현 패턴을 갖는 것으로 밝혀졌다. B 세포가 결핍 된 동물과 동종 대조군의 순진한 심장을 분석 한 결과, B 세포가없는 동물은 심장이 더 작고 분출률이 더 높은 것으로 나타났습니다6. 이 모든 증거는 B 세포가 심근 성장 및 / 또는 심근 기능을 조절할 수 있으며 간질뿐만 아니라 혈관 내 B 세포도 그러한 관찰을 담당 할 수 있음을 시사합니다. B 세포는 또한 심근 상주 대식세포의 표현형을 조절하는 것으로 밝혀졌습니다8.
여러 연구에 따르면 B 세포는 손상에 대한 심근 적응의 맥락에서 중요한 역할을합니다 8,9,10,11,12,13. B 세포는 CXCL13-CXCR5 의존성 메커니즘11,13을 통해 손상된 심장에 일시적으로 축적됩니다. 거기에서 B 세포는 사이토 카인 매개 단핵구 모집 9,12를 포함하는 여러 메커니즘을 통해 불리한 심장 리모델링을 촉진합니다. 또한, B- 세포는 여러 메커니즘을 통해 심장 손상 및 불리한 심장 리모델링의 확장을 촉진 할 수있는 심장 단백질에 대한 항체를 생산할 수 있습니다 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . B 세포는 또한 IL-1010의 분비를 통해 손상된 심장에 보호 효과를 발휘할 수 있습니다.
순진하고 손상된 심장에서 B 세포의 역할을 조사하는 그룹의 수가 증가함에 따라 심근 B 세포를 적절하게 정량화하고 평가하여 이미 문헌에 나타나기 시작한 불일치를 피하기 위해 공유 프로토콜을 정의하는 것이 점점 더 중요 해지고 있습니다. 지금까지 B 세포는 실제로 설치류 심장에서 가장 널리 퍼진 면역 세포중 하나이며7 골수 세포26,27보다 현저히 낮은 유병률로 존재하거나 매우 드문 것으로 보고되었습니다28. 유사하게, 몇몇 그룹은 급성 허혈성 심근 손상후에 심근 B 세포의 수가 증가한다고 설명했지만, 한 그룹은 손상된 심근29의 B 세포 수에 변화가 없다고보고했다. 심장 면역 세포에 대한 연구는 관류 상태에 대한 세부 정보를 거의 제공하지 않으며 소화 조건에 대한 합의가 없습니다. 설치류 심장에서 B 세포의 상당 부분이 혈관 내이고 심근에서 면역 세포를 추출하는 것은 사용 된 소화 방법에 크게 의존하기 때문에 문헌에보고 된 차이는 장기 관류 및 조직 소화의 차이의 결과 일 수 있습니다.
여기에 제시된 것은 관류 및 소화 조건을 최적화하여 B 세포 회수의 수율을 최대화하고 혈관 내 대 혈관 외 심근 B 세포의 구별을 허용하는 쥐 심근 B 세포의 유세포 분석 기반 정량화에 대한 자세한 방법입니다6. 이 프로토콜은 혈관내 및 간질 면역 세포 28,30,31을 구별하는 다른 유사한 프로토콜의 적응 및 최적화이다.
이 프로토콜에서 우리는 심근 관류를 표준화하여 미세 혈관 내피에 부착 된 생물학적으로 관련된 B 세포를 제거하지 않고 혈관 내 공간에 떠 다니는 B 세포를 제거합니다. 더욱이, 혈관내 면역 세포(32)와 간질 면역 세포(32)를 구별하기 위해 항체의 정맥내 주사의 사용을 기술한 이전 프로토콜을 구축하고, B-세포가 표면 마커 B220(33)을 발현한다는 사실을 이용하여, 동물 희생 및 심장 관류 직전에 B220-특이적 항체의 혈관내 주사를 통해 혈관내 대 혈관외 심근 B 세포를 구별하는 방법을 입증한다. 이 프로토콜은 순진하고 손상된 심장의 심근 B 세포 분석을 포함하는 데 관심이있는 모든 과학자의 연구와 관련이 있습니다. 이 프로토콜의 광범위한 구현은 연구 그룹 간의 불일치를 줄이고 혈관 내 및 혈관 외 심근 B 세포 풀의 변화를 분석 할 수있게하여 심장 면역학 분야의 발견을 강화할 것입니다.
요약하면, 이 프로토콜은 유세포분석을 통해 심근 B 세포를 정량화 및 분석하는 동시에 혈관외 공간과 혈관내 공간에 위치한 세포를 구별하는 최적화된 워크플로우를 나타냅니다.
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Protocol
이 원고에 설명 된 모든 실험은 존스 홉킨스 의과 대학의 IACUC의 승인을 받아 수행되었습니다.
1. 준비
- 표 1에 설명된 대로 FACS 버퍼를 준비합니다.
- 동물을 안락사시키기에 충분한CO2 가 있는지 확인하십시오.
- 해부 공간을 준비하십시오 (벤치 패드를 놓고 테이프와 해부 도구를 근처에 두십시오).
- 15mL 튜브에 라벨을 붙이고 각 튜브에 칼슘과 마그네슘이 함유된 HBSS 3mL를 넣고(재료 표 참조) 얼음 위에 놓습니다(심장당 튜브 1개, 참조 그룹/유세포분석 대조군의 경우 추가 튜브 1개). 또한 작은(35mm) 페트리 접시에 HBSS를 채웁니다.
- 온도 제어 셰이커를 켜고 37 ° C로 설정 한 다음 4 ° C의 온도에서 원심 분리기를 사전 냉각합니다.
- 주사기 펌프를 준비하고 유속을 3mL/분으로 설정합니다. 20mL 주사기에 HBSS를 채우고 튜브 라인을 버퍼로 프라이밍한 다음 기포를 제거합니다.
2. 혈관내 B세포 염색(생체 내)
- C57BL/6J 균주의 12주령 수컷 마우스의 무게를 측정합니다. 3/10cc 인슐린 주사기에 100μL의 B220 항체 희석액을 넣습니다(PBS의 경우 1:10). 빛으로부터 보호하기 위해 주사기를 알루미늄 호일로 덮으십시오.
- 마우스 한 마리를 마취하십시오.
- 2 mg / kg의 용량으로 2 % 2,2,2- 트리 브로 모 에탄올을 복강 내 주사하고 10-20 분 정도 기다리십시오.
참고: 마우스의 호흡과 움직임을 모니터링합니다. 마우스가 움직이지 않으면 발가락을 꼬집어 통증을 자극하십시오. 금단 반사가 없으면 적절한 마취를 나타냅니다. - 20분 이내에 적절한 마취가 이루어지지 않으면 100mg/kg의 추가 마취제를 투여할 수 있으며 5분마다 마우스 역학, 금단 반사 및 호흡을 평가해야 합니다.
- 2 mg / kg의 용량으로 2 % 2,2,2- 트리 브로 모 에탄올을 복강 내 주사하고 10-20 분 정도 기다리십시오.
- 한쪽으로 기울어진 벤치 패드의 실험실 벤치에 마우스를 놓고 등의 피부를 부드럽게 아래로 당기고 몸을 벤치에 대고 약간 눌러 눈이 튀어나오도록 합니다.
- 단계 2.1로부터 희석된 B220 항체를 역궤도 주사로 주입한다.
- 주사기를 마우스 머리의 시상면에서 45° 떨어진 눈에 삽입합니다. 천천히 용액을 주입하십시오. 저항이 느껴지면 주사기를 제거하고 다시 들어가십시오. 2분 동안 기다립니다.
참고: 배양 시간이 길어지면 주입된 항체가 혈관 구조 외부로 확산될 시간을 주기 때문에 혈관 내 B 세포와 혈관 외 B 세포를 구별하는 능력이 위태로워집니다.
- 주사기를 마우스 머리의 시상면에서 45° 떨어진 눈에 삽입합니다. 천천히 용액을 주입하십시오. 저항이 느껴지면 주사기를 제거하고 다시 들어가십시오. 2분 동안 기다립니다.
- IACUC 규정에 따라 마우스를 안락사시킵니다.
- 안락사 챔버로의 CO2 흐름을 0.5 L / min의 속도 또는 챔버 크기에 따른 권장 유량으로 엽니 다.
- 권장 시간 동안 마우스를 챔버에 넣고 더 이상 호흡하지 않도록하십시오. 그것을 제거하고 안락사의 2 차 방법으로 자궁 경부 탈구를 수행하십시오.
- 마우스가 안락사되면 즉시 장기 적출 및 관류를 진행합니다.
3. 하트 수집
- 가슴 열기.
- 상복부 부위에서 집게로 마우스의 피부를 잡으십시오. 가위를 사용하여 피부에 2mm의 구멍을 만들고 집게를 사용하여 피부를 벗겨내어 가슴과 복부의 반짝이는 반투명 층 인 근막 층을 드러냅니다. 근막과 복막을 통해 상복부를 절단하여 복벽을 열고 xiphoid 과정을 드러냅니다. 지혈 집게를 사용하여 검상돌기를 고정하십시오.
- 가위로 양쪽의 쇄골 중간 선 수준에서 흉벽을 수직으로 자르고 전방 흉벽을 들어 올려 종격동 내용물을 드러내고 지혈 겸자를 무게로 사용하여 개구부를 유지합니다.
- 심장 관류 및 추출.
- 집게를 사용하여 심장 주변의 지방이나 흉선 조직을 제거하십시오.
- 집게를 사용하여 대동맥을 뒤에서 단단히 잡으십시오. 주사기 바늘 (25G)을 심장의 정점에 삽입하십시오. 3mL/분의 속도로 3mL의 HBSS와 관류합니다.
알림: 관류를 모니터링하십시오. 간은 채워야하며 관상 혈관의 혈액은 완전히 제거되어야합니다. 일정한 흐름을 유지하려면 분당 1mL로 보정된 주사기 펌프를 사용하는 것이 좋습니다. - 가위로 대동맥을 자르고 심장을 꺼냅니다. 남은 혈액을 제거하기 위해 HBSS로 페트리 접시의 심장을 씻으십시오. 가위와 집게를 사용하여 지방, 결합 조직 및 흉선을 제거하고 심장을 건조시킵니다. 고립 된 심장의 무게를 측정하고 밀리그램 단위의 무게를 기록하십시오. 실온에서 심장을 칼날로 작은 조각 (1-2mm)으로 만듭니다.
알림: 성인 마우스 심장의 무게는 0.090-0.210mg 사이입니다. - 심장 조직의 질량을 측정하고 다진 심장 60mg을 HBSS 3mL가 포함된 15mL 튜브에 넣습니다. 나머지 심장 조직을 유지하고 "참조 대조 조직"이라고 표시된 튜브에 넣습니다. 이것은 살아있는 죽은 신호 및자가 형광에 대한 보상 제어에 사용됩니다.
4. 심장 소화 및 세포 염색
- 다진 조직이 들어있는 각 튜브에 효소를 첨가하십시오 ( 표 1 참조). 0.5 μL/mg의 DNase 1(심장 조직 60mg에 대해 300단위), 콜라게나제 II 0.5μL/mg(심장 조직 60mg에 대해 625단위) 및 0.2μL/mg의 히알루로니다아제(심장 조직 60mg에 대해 50단위)를 튜브에 추가합니다.
- 소화 반응을 셰이커에 넣고 300rpm에서 30분 동안 둡니다. 셰이커 랙을 경사면에서 약 25°로 조정합니다.
- 각 15mL 반응 튜브에 HBSS 7mL를 추가하고 가속 및 파단을 보통 또는 느리게 설정하여 4°C에서 5분 동안 250 x g 에서 원심분리합니다. 상청액을 따라 내고 각 펠릿을 5mL의 ACK 용해 완충액에 재현탁하여 적혈구를 제거합니다. 실온에서 5분 동안 ACK 용해 완충액에서 인큐베이션한다.
- 각 튜브에 10mL의 PBS를 넣고 혼합한 다음 40μm 스트레이너로 50mL 튜브에 여과합니다. 모든 파편이 필터 챔버 내부에 있는지 확인하십시오. 필터 챔버 내에 완전히 매달릴 때까지 주사기 플런저로 필터의 이물질을 부수십시오.
- 부피가 심장 당 25mL에 도달 할 때까지 필터를 통해 PBS를 추가하십시오. 이렇게하면 부유 된 세포가 필터를 통과 할 수 있습니다. 기준 대조군 조직 튜브에 PBS 25mL를 추가하고 부피를 다른 튜브(각각 25mL)로 나눕니다. 튜브 중 하나는 "염색되지 않음"이라고 표시하고 다른 하나는 "Live-dead"로 표시합니다. 250 x g 에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리합니다.
참고: 이 시점에서 살아있는 죽은 얼룩에 대한 희석을 준비하십시오(희석: 1x PBS에서 1:500). - 상청액을 디캔트하고, 펠렛을 100 μL의 PBS에 염색되지 않은 튜브에 재현탁하고, 각각의 다른 펠렛을 100 μL의 살아있는 염색 희석액으로 재현탁시킨다. 어둠 속에서 30 분 동안 얼음 위에서 배양하고 얼음 양동이를 알루미늄 호일로 덮습니다.
- 각 샘플에 500μL의 FACS 버퍼를 추가하고 40μm 필터를 통해 라벨이 부착된 FACS 튜브로 옮깁니다. FACS 튜브를 250 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 폐기하십시오. 펠릿을 500μL의 FACS 완충액에 재현탁시킨다.
- 50μL의 Fc 차단 용액( 표 1 참조)을 염색되지 않은 튜브와 살아있는 죽은 튜브를 제외한 각 튜브에 추가합니다. 5 분 동안 혼합하고 배양하십시오.
- 염색되지 않은 튜브와 살아있는 죽은 튜브를 제외한 각 튜브에 50μL의 항체 혼합 용액( 표 1 참조)을 추가하고 얼음 양동이를 알루미늄 호일로 덮고 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다.
- 각 튜브에 2mL의 FACS 버퍼를 추가하고 250 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 제거하고 300-500 μL의 FACS 완충액에 재현탁시킨다.
5. 유세포 분석
- 기기 제어 설정을 설정합니다.
참고: 이 프로토콜에서 샘플은 4개의 레이저 Cytek Aurora 유세포분석기로 분석됩니다. 또 다른 적절한 유세포분석기를 사용하여 관심 마커를 검출할 수 있습니다.- 기기 제어 소프트웨어를 엽니다( 재료 표 참조). 창 상단에서 획득 탭을 선택하고 새로 만들기 +를 클릭합니다. 새 실험 만들기 라는 창이 표시됩니다.
- 라이브러리 섹션의 필터링할 유형 필드에 PE, PerCP-Cy5.5, BV421, Alexa Fluor 700 및 좀비 아쿠아를 입력하고 각각을 입력한 후 추가를 클릭합니다. 형광단 이름은 오른쪽에 표시되어야 합니다. 그런 다음 다음을 클릭하여 그룹 탭으로 이동합니다.
- 그룹 탭에서 튜브가 있는 기호를 클릭하여 분석할 하트를 추가합니다.
- + 참조 그룹을 클릭하면 창이 표시됩니다. 형광등 태그 열에서 Zombie Aqua를 선택하고 컨트롤 유형 열에서 셀을 선택한 다음 저장을 클릭합니다.
- 다음 > 마커 탭을 클릭합니다. 형광단의 이름과 함께 테이블이 표시됩니다. 각 형광단 컬럼의 첫 번째 행에 해당 세포 마커를 입력하고 입력 : PerCP-Cy5.5의 경우 CD45; BV421용 CD19; 알렉사 플루오르 700용 CD11b; PE용 B220; 그리고 좀비 아쿠아를 위해 죽은 자.
- 다음을 두 번 클릭하여 획득 탭으로 이동합니다. 실험 그룹의 기록할 이벤트에는 10,000,000을 입력하고 참조 그룹에 대해서는 동일한 필드에 라인 유형을 200,000으로 입력합니다. 저장 후 열기를 클릭합니다. 다른 설정은 기본값으로 유지되어야 하며, 중지 시간은 10,000으로, 중지 볼륨은 3,000으로 유지해야 합니다.
- 왼쪽 하단에서 악기 제어를 클릭합니다. 전압을 FSC-50, SSC-175, SSC-B-175로 설정합니다. 그런 다음 획득 제어를 선택합니다. 유량 옵션의 경우 드롭다운 메뉴에서 높음 을 선택합니다.
- 세포분석기로 기준 샘플을 수집하고 소프트웨어에서 혼합하지 않습니다.
- 염색되지 않은 심장 튜브를 소용돌이하여 샘플 주입 포트(SIP)에 단단히 놓습니다. 녹색 표시기 화살표가 올바른 샘플을 가리키고 있는지 확인한 다음 cytometer 소프트웨어의 수집 제어판에서 시작을 클릭하고 이벤트가 기록 될 때까지 기다립니다. 살아있는 죽은 염색 된 심장 조직에 대해서도 똑같이하십시오.
- Unmix 메뉴를 선택하고 다음 컨트롤을 설정합니다.
- 라이브러리의 열에서 PE, PerCP-Cy5.5, BV421 및 Alexa Fluor 700에 대한 확인란을 선택합니다. 좀비 아쿠아가 동일한 열에서 선택 취소되어 있는지 확인합니다. 하단에서 형광 태그로서의 자가형광 옵션을 선택합니다.
- 다음을 클릭하여 양성/음성 모집단 식별 탭으로 이동합니다. 이 탭에는 FSC-A 대 SSC-B-A의 플롯이 표시됩니다. 다각형의 점을 클릭하고 드래그하여 FSC-A 축에서 1.0M에서 4.0M 사이, SSC-B-A 축에서 0.2M에서 3.0M 사이의 영역을 선택합니다.
- 오른쪽의 다음 플롯에서 V5-A가 X 축에 표시됩니다. 게이트를 이동하여 맨 오른쪽에 있는 피크의 절반을 양수로 선택하고 플롯의 왼쪽에 있는 영역을 음수로 선택합니다. 참조 그룹 - 염색되지 않음이라는 제목의 플롯에서 비슷한 범위의 모집단을 선택합니다. 이를 위해 염색되지 않은 긍정-부정을 설정하지 않아야합니다.
- 실험 샘플을 획득합니다.
- 개별 마우스에 대한 샘플이 들어 있는 각 튜브에 대해 튜브를 와동하여 SIP에 단단히 놓습니다. 녹색 표시기 화살표가 올바른 샘플을 가리키고 있는지 확인한 다음 세포분석기 소프트웨어의 수집 제어판에서 시작을 클릭하고 이벤트가 기록될 때까지 기다립니다.
- 게이팅 전략.
- 혼합되지 않은 기본 워크시트 탭을 선택합니다. 상단의 점 플롯 도구를 사용하여 FSC-A 대 SSC-A 플롯을 생성합니다. 다각형 선택 도구를 사용하여 FSC-A 축에서 0.4M보다 크고 SSC-A 축에서 0.8M보다 높은 이벤트를 선택합니다. 이 선택 항목을 두 번 클릭하면 새 플롯이 표시됩니다.
- 새로 생성된 플롯에서 X축 레이블을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 AF-A를 선택합니다. Y 축 레이블을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 살아있는 죽은 얼룩을 선택합니다. 상단의 사각형 선택 도구를 클릭하고 하단 라이브-데드 신호에 해당하는 라이브-데드 축에서 105 아래의 모든 이벤트를 선택합니다. 이 선택 항목을 두 번 클릭하면 새 플롯이 표시됩니다.
- 새 플롯에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 X축에 PerCP-Cy5.5-A 를 선택하고 Y축에 SSC-A 를 선택합니다. 사각형 선택 도구를 사용하여 CD45 양성 셀에 해당하는 PerCP-Cy5.5-A 축에서 104 보다 큰 이벤트를 선택합니다. 선택 항목을 두 번 클릭하면 새 플롯이 표시됩니다.
- 새 플롯에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 X축에 대해 FSC-A를 선택하고 Y축에 대해 FSC-H를 선택합니다. 다각형 선택 도구를 사용하여 FSC-A 값과 SSC-A 값이 동일한 추세를 따르는 이벤트를 선택합니다. 이를 통해 세포 이중선이 제거되고 선택 항목의 집단을 CD45+ 집단이라고 합니다. 선택 항목을 두 번 클릭하면 CD45+ 모집단이 포함된 새 플롯이 표시됩니다.
- CD45+ 모집단 플롯에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 X축의 BV421 과 Y축의 SSC-A를 선택합니다. 다각형 선택 도구를 사용하여 BV421 축에서 오른쪽에 있는 모집단을 선택합니다. 이것은 B 세포 집단입니다. 이 모집단을 두 번 클릭하여 B 세포 모집단이 있는 두 개의 새 그림을 만듭니다.
- 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 PE-A 가 X축에 있고 BV421-A 가 Y축에 있는 첫 번째 B 셀 플롯을 설정합니다. 오른쪽의 집단은 혈관 내 B 세포에 해당하고 왼쪽의 집단은 간질 B 세포를 나타냅니다. 다각형 선택 도구를 사용하여 둘 다 선택합니다.
- 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 X축에 Alexa Fluor 700-A 가 있고 Y축에 SSC-A 가 있는 두 번째 B 셀 플롯을 설정합니다. 왼쪽의 집단은 CD11b-세포에 대응하고, 오른쪽의 사건(있는 경우)은 CD11b+ 세포에 대응한다.
- 각 선택 항목을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 게이트 속성을 클릭합니다. 개수 및 % 부모 를 클릭하여 크기와 백분율을 표시합니다. 추가 데이터 분석을 위해 이벤트 수와 백분율을 기록합니다.
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Representative Results
수집이 완료되고 모든 이벤트가 수집되면 표준 유세포분석 관행에 따라 데이터를 분석해야 합니다. 분석의 초점은 각 실험의 개별 목표에 따라 다릅니다. 이 경우 혈관내 및 혈관외 B세포의 정량화를 추구하였으며, 조직 mg당 세포수로 표시하였다.
스펙트럼 세포분석기를 사용하는 경우 초기 게이팅으로 분석을 시작하여 면역 세포에 해당하는 범위에 있지 않은 크기의 파편을 제거한 다음 살아있는 염색+ 신호를 제거하는 것이 좋습니다. 이를 통해 백혈구에 해당하는 CD45 양성 세포의 깨끗한 집단을 검출 할 수 있습니다 (그림 1). 더블릿을 제거한 후 순진한 손상되지 않은 심장에서 CD45+ 세포의 약 20%가 CD19+ B 세포가 될 것으로 예상됩니다(그림 2A, 이 대표적인 실험에서 18.1% B 세포). 이 세포 중 평균 5.5 %는 간질 공간에 위치하고 94.5 %는 혈관 내 공간에 위치합니다 (그림 2B). 심장에서 발견되는 전체 B 세포 집단에서 약 1.6%만이 표면 마커 CD11b(일반적으로 쥐 CD19+ 세포를 높은 신뢰도 1,34,35를 갖는 B1 세포로 분류하기에 충분한 것으로 간주됨)에 기초한 B1 세포에 해당하고 나머지 98.4%는 B2 세포에 해당합니다(그림 2C).
그림 1: 심근 관련 B 세포를 검출하고 특성화하는 데 사용되는 유세포분석 게이팅 전략. (A) FSC-A 대 SSC-A: 플롯은 수집된 모든 이벤트를 표시하며, 선택한 영역은 백혈구 크기 범위에 있는 이벤트로 분석을 풍부하게 하기 위해 그려집니다. (B) 자가 형광 대 살아있는 죽은 염색: 선택된 영역은 더 낮은 살아있는 죽은 신호에 해당합니다. 그려진 문은 죽은 세포와 살아있는 죽은 염색에 결합하는 다른 세포 파편을 제거합니다. (C) CD45 신호 대 SSC-A : 선택된 영역은 CD45 + 세포 (즉, 심근 백혈구)에 해당합니다. (D) FSC-A 대 FSC-H: 이 게이트는 셀 이중선(선택되지 않은 이벤트)을 제거하기 위해 그려집니다. (E) CD19 신호 대 SSC-A : 선택된 영역은 심근 B 세포에 해당합니다. (F) B220 대 CD19 : 검은 색 사각형 내부 영역은 심근 내 B 세포 (CD19 +, B220-)에 해당하고 빨간색 사각형 내부 영역은 혈관 내 B 세포 집단에 해당합니다. (G) CD11b 대 SSC-A: 검은색 원 안쪽 영역은 CD11b+(B1 세포)에 해당하고, 빨간색 원 안쪽 영역은 CD11b-(B2 세포)에 해당한다. 각 패널에 표시되는 백분율은 표시된 모집단이 상위 모집단에서 나타내는 평균 백분율을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 심근 조직의 밀리그램당 평균 B 세포 수를 보고하는 대표 그림. (A) 쥐 심근 조직의 평균 CD45+ 및 CD19+ 세포 수/mg. 표시된 백분율은 부모 집단(CD45+)의 세포 백분율에 해당합니다. (B) CD19+ 세포의 평균 수 및 혈관내 공간의 간질(혈관외) 공간에 있는 B 세포의 백분율. (C) B1 또는 B2 세포의 마커를 발현하는 심근 B 세포의 절대 수 및 백분율. 오차 막대는 평균의 표준 오차에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 이 표에는 절차에 필요한 솔루션과 시약이 포함되어 있습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
점점 더 많은 증거에 따르면 B 세포는 심근 생리학 및 심근 리모델링 / 부상에 대한 적응 7,8,9,10,11,12,13,36의 맥락에서 중요한 역할을합니다. 유세포 분석은 모든 조직의 면역 세포 집단을 연구하는 훌륭한 도구이며 심장의 B 세포에 초점을 맞춘 모든 연구에 거의 필수 도구입니다.
B 세포와 심장에 관한 새로운 문헌은 이미 심장의 B 세포 수와 손상으로 인한 심근 B 세포 수의 변화와 같은 매우 기본적인 측면에 대한 대조적 인 결과를보고합니다. B 세포는 설치류 심장에서 가장 널리 퍼진 면역 세포로 보고되었습니다7. 그러나 다른 연구에서는 다른 골수 세포에 비해 상대적 유병률을 평가했으며26,27 수치가 현저히 낮았습니다. Pinto et al.26은 B 세포가 전체 백혈구의 약 9%를 차지하는 반면 Yu et al.27은 10%를 보고했습니다. Adamo et al.7은 백혈구 수에 대한 B 세포의 평균 비율이 약 20%라고 보고했는데, 이는 이 원고에 보고된 18.1%에 매우 가깝습니다. 다른 연구에서는 B 세포가 심근28에서 매우 낮은 유병률을 보인다고보고했습니다.
몇 가지 중요한 실험 단계는 문헌에 보고된 B 세포 수의 변동성을 설명할 수 있습니다. 즉, 심장 관류, 조직 분진 및 소화의 차이는 심장 조직 mg 당 회수 된 B 세포의 수에 상당한 영향을 줄 수 있습니다. 칼슘 킬레이트제를 함유하고 칼슘이 없는 완충액을 사용한 관류 또는 부피 또는 관류 속도가 더 높은 관류는 내피에 부착된 B 세포를 분리하고 회복 수율을 감소시킬 수 있습니다. 지나치게 미세한 조직 절제는 조직의 과도한 소화와 세포 생존력의 손실로 이어질 수 있습니다. 세포 생존력의 감소는 또한 장기간 또는 더 높은 효소 농도로 소화한 결과일 수 있습니다.
B 세포에 해당하는 CD45+ 세포의 비율은 야생형 마우스에서 15%-30% 범위일 수 있습니다. 사용된 마우스 균주, 연령 및 유전적 배경에 따라 이 값은 달라질 수 있습니다. 그러나 백분율은 연구 그룹에서 비슷하게 유지되어야합니다. 동일한 그룹에 속하는 마우스 간의 B 세포 수와 백분율의 큰 변동성은 실험 오류가 발생할 수 있음을 시사합니다. 낮은 백분율은 관류 강도와 시간의 초과를 나타낼 수 있습니다. CD45+ 세포의 전반적인 감소는 조직이 과도하게 소화되고 있음을 나타낼 수 있습니다.
여기에 설명된 프로토콜은 소화된 쥐 심장으로부터 B 세포의 일관된 수율을 제공하고 혈관내 대 혈관외B 세포의 구별을 허용하도록 최적화되었다6. 혈관 내 대 혈관 외 B 세포의 구별은 희생 직전에 항체의 혈관 내 주입을 통해 달성됩니다. 혈관 내에 주입 된 항체는 혈관 구조 전체에 쉽게 확산되고 모든 혈관 내 B 세포와 조우합니다. 동물이 곧 희생되고 심장이 즉시 수확되면 항체는 혈관 외 공간에서 확산되어 혈관 외 B 세포를 염색 할 시간이 없습니다. 항체의 혈관 내 주사와 장기 적출 사이의 시간이 중요하므로 항체를 접종하고 한 번에 하나의 개별 마우스 심장을 수집하는 것이 좋습니다. 항체의 혈관 내 주사는 혈관 내 대 혈관 외 B 세포의 구별이 관심이없는 경우 생략 할 수 있습니다. 그림 1 에 표시된 게이팅 전략은 B220 레이블이 없기 때문에 불가능한 마지막 단계를 제외하고는 동일하게 유지됩니다. 실험 설계에 따라 표시된 패널의 형광단을 사용된 패널에 맞는 색상으로 수정할 수 있습니다. 또한 표면 마커의 선택은 그것을 수행하는 그룹의 필요에 따라 수정 될 수 있다는 점을 고려하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 실험 설계에서 B1 세포에서 CD11b 발현이 감소될 수 있다고 생각되는 경우 IgM, IgD 및 CD537과 같은 다른 마커를 추가하는 것이 좋습니다.
유세포 분석에 대한 보상 제어를 실행하기 위해 심장을 처리해야 할 수도 있습니다. 실험을 처음 최적화할 때 이 방법을 사용하는 것이 좋습니다. 다음 실험에서, 심장 수집 순간에 일부 조직을 저장하는 것은 음성 "염색되지 않은"대조군과 양성 "살아있는 죽음"염색 대조군을 실행하기에 충분한 세포를 제공하기 때문에 충분할 수 있습니다. 다른 색상에 대한 개별 컨트롤은 이전 실험에서 가져오거나 비드를 사용하여 생성할 수 있습니다.
프로토콜의 일부 단계는 실험 결과를 변경하지 않고 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 마취 방법은 연구자의 경험에 따라 선호하는 방법으로 변경 될 수 있습니다. 2,2,2- 트리 브로 모 에탄올 대신 이소 플루 란을 사용하면 마취 투여와 심장 수집 사이에 소요되는 시간을 줄일 수 있습니다. 또한 심장의 관류는 느리고 부드럽고 일관되게 수행되는 한 주사기 펌프를 사용하지 않고 수동으로 수행 할 수 있습니다.
프로토콜의 정확한 실행에도 불구하고 경험이 부족한 작업자는 동일한 실험 세션 내에서 또는 다른 실험 세션 간에 샘플 간에 높은 변동성을 경험할 수 있습니다. 경험에 비추어 볼 때, 과학자가 워크 플로우에 완전히 익숙해 질 수있는 기회를 갖게되면 이러한 가변성이 사라집니다. 따라서 이 프로토콜을 구현하려는 사람은 연구 프로젝트에 대한 중요한 데이터를 수집하기 전에 2-3번의 시험 실행을 통해 재현성을 평가하는 것이 좋습니다.
요약하면, 심장에서 면역 세포를 분리하고 유세포 분석을 통해 분석하는 기존의 방법은 일반적으로 면역 세포가 내피에 부착하는 능력을 고려하지 않으며, 관류를 표준화하지 않거나 광범위한 관류를 구현하지 않으며, 혈관 내 공간의 면역 세포는 제거되어야하는 오염 물질입니다. 이것은 내피에 부착 된 혈관 내 면역 세포가 생물학적 관련성을 가지고 있다는 개념을 무시합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 심근 B 세포, 혈관 내 및 혈관 외래에 특별한주의를 기울여 심근 면역 세포의 회복을 극대화하도록 최적화되었습니다. 우리는이 프로토콜이 심장 면역학 분야에서 일하고 B 세포가 건강하고 손상된 심장에서 할 수있는 기능을 탐구하는 데 관심이있는 모든 과학자들에게 흥미로울 것으로 기대합니다.
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Disclosures
Luigi Adamo는 심부전 치료를위한 면역 조절 분자 개발에 중점을 둔 회사 인 i-Cordis, LLC의 공동 설립자이며 B 세포 조절 약물 피르 페니 돈의 유도체에 특별한 관심을 가지고 있습니다. 나머지 작성자는 선언할 충돌이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 Luigi Adamo에게 수여 된 NHLBI 보조금 5K08HLO145108-03 및 1R01HL160716-01의 지원을 받았습니다.
이 연구를 개발하는 데 사용 된 오로라 유세포 분석기는 NIH Grant S10OD026859의 자금 지원을 받았습니다. 우리는 JHU Ross Flow Cytometry Core의 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody | 101222 | BioLegend | 100 µg 200 µL |
| (CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 µm, Blue | QBIAP303 | Southern Labware | |
| 0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1605-0000 | SealRite, USA Scientific | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection, USP | 114-055-101 | Quality Biological | 0.90% |
| 1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1615-5500 | SealRite, USA Scientific | |
| 10 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11213810 | USA Scientific | |
| 1000 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11267810 | USA Scientific | |
| 15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430052 | Corning | |
| 1-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT951 | ECT Manufacturing | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | T48402 | Sigma-Aldrich | |
| 200 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11208810 | USA Scientific | |
| 3-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT953 | ECT Manufacturing | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style | 352054 | Falcon, a Corning Brand | |
| 50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430290 | Corning | |
| ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer | 118-156-101 | Quality Biological | Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20 |
| Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63 | 5810759005 | Eppendorf | |
| Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62 | 22638289 | Eppendorf | |
| Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 – 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62 | 22638246 | Eppendorf | |
| Aluminum Foil 12 in x 75' Roll .0007 | UPC 109153 | Reynolds Wrap | |
| Anesthesia Induction Chamber - Mouse | RWD-AICMV-100 | Conduct Science | |
| BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL | 309626 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-Pack | CMD 2613 | Brandzig | |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody | 115537 | BioLegend | 50 µg/mL |
| CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 µm, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile | T9009 | Southern Labware | |
| Carbon Dioxide USP E CGA 940 | CD USPE | AirGas USA | |
| Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL | UX-34502-46 | Cole-Parmer | |
| Collagenase 2 | LS004176 | Sigma-Aldrich | |
| Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barb | Y992611-AG | AirGas USA | |
| Cytek Aurora Flow Cytometer | Cytek Biosciences | ||
| Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP | M-08-12 | AirGas USA | |
| DNase I - 40,000 U | D4527 | Sigma-Aldrich | |
| Easypet 3 - Electronic Pipette Controller | 4430000018 | Eppendorf | |
| Electronic Balance, AX223/E | 30100606 | Ohaus Corp. | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | 5810R | Eppendorf | |
| Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes | Eppendorf | ||
| FlowJo 10.8.1 | BD Becton, Dickinson and Company | ||
| GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100) | Z740287 | Heathrow Scientific | |
| HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+] | 14025076 | gibco | 1x |
| Hyaluronidase | H3506 | Sigma-Aldrich | |
| Kelly Hemostats, Straight | 13018-14 | Fine Science Tools | |
| Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL | 302831 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940 | M1-940-PG | AirGas USA | |
| McKesson Underpads, Moderate | 4033-CS150 | McKesson | |
| Navigator Multi-Purpose Portable Balance | NV2201 | Ohaus Corp. | |
| PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-] | 10010023 | gibco | 1x |
| PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | 103208 | BioLegend | 200 µg/mL |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody | 103132 | BioLegend | 100 µg 500 uL |
| Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene | FB0875711YZ | Fisher Scientific | |
| Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02 | M08-1 | AirGas USA | |
| Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator | LED-6W | AmScope | |
| PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm) | 305122 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO) | 553141 | BD Becton, Dickinson and Company Biosciences | 0.5 mg/mL |
| R 4.1.1 | The R Foundation | ||
| Razor Blades | 9501250000 | Accutec Blades Inc | |
| Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet | Y12244A320-AG | AirGas USA | |
| Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets | Rotor A-4-62 | Eppendorf | |
| Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister | 86.1254.001 | Sarstedt AG & Co KG | |
| Sigma label tape | L8394 | Sigma-Aldrich | |
| SpectroFlo 3.0.0 | Cytek Biosciences | ||
| Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8" Hose Barb; 1/EA | MTLL230-6005 | Spex | |
| Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' Long | CG-730-003 | Excelon Laboratory | |
| Syringe PP/PE without needle, 3 mL | Z683566 | Millipore Sigma | |
| Syringe pump | 55-1199 (95-240) | Harvard Apparatus | |
| Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500 | 9371W13 | Thomas Scientific | |
| Tube Rack, 12 positions, 6 for 5.0 mL and 15 mL tubes and 6 for 25 mL and 50 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119835 | Eppendorf | |
| Tube Rack, 12 positions, for 5.0 mL and 15 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119827 | Eppendorf | |
| TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in. | T8913 (Millipore Sigma) | Tygon, Saint-Gobain | |
| Vortex-Genie 2 | SI-0236 | Scientific Industries, Inc. | |
| VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips | 89259-946 | Avantor, by VWR | |
| VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4½" | 82027-578 | Avantor, by VWR | |
| VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I | 12620-946 | Avantor, by VWR | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | 423102 | BioLegend |
References
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