Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Superupplösningsmikroskopi av det synaptonemala komplexet inom Caenorhabditis elegans Germline

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64363
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1,3, 1
1Cell Biology and Biophysics, European Molecular Biology Laboratory, 2Collaboration for joint PhD degree between EMBL and Heidelberg University, Faculty of Biosciences, 3EMBL Imaging Centre, European Molecular Biology Laboratory

Summary

Superupplösningsmikroskopi kan ge en detaljerad inblick i organisationen av komponenter inom det synaptonemala komplexet i meios. Här demonstrerar vi ett protokoll för att lösa enskilda proteiner i Caenorhabditis elegans synaptonemala komplex.

Abstract

Under meios måste homologa kromosomer känna igen och hålla fast vid varandra för att möjliggöra korrekt segregering. En av de viktigaste händelserna som säkerställer interaktionen mellan homologa kromosomer är sammansättningen av det synaptonemala komplexet (SC) i meiotisk profas I. Även om det finns liten sekvenshomologi mellan proteinkomponenter inom SC mellan olika arter, har SC: s allmänna struktur bevarats mycket under evolutionen. I elektronmikrografer framträder SC som en tredelad, stegliknande struktur bestående av laterala element eller axlar, tvärgående filament och ett centralt element.

Att exakt identifiera lokaliseringen av enskilda komponenter inom komplexet med elektronmikroskopi för att bestämma SC: s molekylära struktur är dock fortfarande utmanande. Däremot möjliggör fluorescensmikroskopi identifiering av enskilda proteinkomponenter inom komplexet. Men eftersom SC endast är ~ 100 nm bred kan dess understruktur inte lösas med diffraktionsbegränsad konventionell fluorescensmikroskopi. Således kräver bestämning av SC: s molekylära arkitektur superupplösta ljusmikroskopitekniker såsom strukturerad belysningsmikroskopi (SIM), stimulerad emission utarmning (STED) mikroskopi eller enmolekylär lokaliseringsmikroskopi (SMLM).

För att upprätthålla strukturen och interaktionerna mellan enskilda komponenter inom SC är det viktigt att observera komplexet i en miljö som ligger nära dess ursprungliga miljö i bakteriecellerna. Därför demonstrerar vi ett immunhistokemi- och avbildningsprotokoll som möjliggör studier av SC: s understruktur i intakt, extruderad Caenorhabditis elegans bakterievävnad med SMLM- och STED-mikroskopi. Direkt fixering av vävnaden på täckglaset minskar provernas rörelse under avbildning och minimerar avvikelser i provet för att uppnå den höga upplösning som krävs för att visualisera SC: s understruktur i dess biologiska sammanhang.

Introduction

Att minska antalet kromosomer med hälften under meios är nyckeln till att generera hälsosam avkomma i sexuellt reproducerande organismer. För att uppnå denna minskning av kromosomantalet måste homologa kromosomer para ihop och separera under meios I. För att säkerställa korrekt segregering av homologa kromosomer genomgår könsceller en förlängd profas I, under vilken homologa kromosomer parar, synaps och rekombineras för att generera fysiska länkar mellan homologer1. SC har framstått som den centrala strukturen som är nyckeln till att reglera rätt progression genom meiotisk profas2.

SC är ett komplex vars allmänna struktur är evolutionärt bevarad, även om det finns lite homologi mellan dess proteinkomponenter. SC identifierades först i elektronmikrografer som en tredelad, stegliknande struktur bestående av två laterala element eller axlar, en central region bildad av tvärgående filament och ett centralt element 3,4. Att bestämma organisationen av enskilda komponenter inom komplexet är nyckeln till att främja vår förståelse av SC: s roll under meiotisk profas.

Modellorganismen C. elegans är idealisk för att studera SC: s struktur och funktion eftersom dess bakterielinjer innehåller ett stort antal meiotiska kärnor med helt monterade SCs5. Genetiska och biokemiska studier har visat att kromosomaxlarna bildas av tre distinkta kohesinkomplex6,7 och fyra HORMA-domänproteiner som kallas HTP-1/2/3 och HIM-3 7,8,9,10,11 i C. elegans. I den centrala regionen av SC har sex proteiner som innehåller domäner med lindad spole hittills identifierats 12,13,14,15,16,17. För att överbrygga avståndet mellan de två axlarna dimeriseras SYP-1, -5 och -6 på ett head-to-head-sätt (figur 1), medan ytterligare tre proteiner stabiliserar deras interaktion i det centrala elementet16,17,18,19.

Att få detaljerad inblick i organisationen av dessa proteiner är avgörande för att förstå SC: s många funktioner under meios. Eftersom bredden på SC: s centrala region endast är ~ 100 nm, kan dess understruktur inte lösas med diffraktionsbegränsad fluorescensmikroskopi. Visualisering av komponenter i en struktur av denna storlek kan dock lätt uppnås genom superupplösningsmikroskopi. Faktum är att strukturerad belysningsmikroskopi (SIM), expansionsmikroskopi 20, STED-mikroskopi (stimulerad emission utarmning) 21 och enmolekylär lokaliseringsmikroskopi (SMLM)22,23 har framträtt som viktiga verktyg för att studera SC: s molekylära arkitektur över arter 16,24,25,26,27,28,29, 30.

För att övervinna upplösningsgränsen förlitar sig STED-mikroskopi på att överlagra den diffraktionsbegränsade platsen för emissionsljuset med en munkformad stråle från STED-lasern, vilket teoretiskt begränsar punktspridningsfunktionen ner till molekylära dimensioner31,32. Den upplösning som praktiskt taget kan uppnås med STED inom biologiska prover ligger dock kvar i intervallet några tiotals nanometer i xy33.

Ännu högre upplösning i biologiska prover kan erhållas med SMLM-tekniker. SMLM utnyttjar de blinkande egenskaperna hos specifika fluoroforer för att lösa objekt på subdiffraktionsnivån genom att separera rumsligt överlappande fluoroforer i tid. Provet avbildas sedan upprepade gånger för att fånga olika delmängder av fluoroforer. Fluoroforernas position i provet bestäms sedan genom att punktspridningsfunktionen (PSF) anpassas till de erhållna signalerna över alla bilder, vilket kan lösa strukturer ner till 15 nm23,34.

Sammantaget kodar de lokaliserade bilderna positionerna för alla fluoroforer. Upplösningen av SMLM bestäms av märkningstätheten och fluoroforens blinkande egenskaper. Enligt Nyquist-Shannon-kriteriet är det omöjligt att på ett tillförlitligt sätt lösa objekt som är mindre än dubbelt så stora som det genomsnittliga avståndet mellan etikett och etikett. Således behövs en hög märkningstäthet för högupplöst avbildning. För SC i C. elegans kan en hög märkningstäthet uppnås genom att använda epitoptaggar fästa på specifika platser för endogena proteiner med hjälp av genomredigering. Epitoptaggarna kan sedan färgas med hög densitet med hjälp av specifika monoklonala antikroppar med hög affinitet19,30. Samtidigt måste on-cykeln för enskilda fluoroforer vara tillräckligt kort för att säkerställa att rumsligt överlappande fluoroforer inte fångas upp samtidigt35.

På grund av dessa två krav kräver upplösning av strukturen hos stora makromolekylära komplex som SC avbildning av ett tillräckligt stort antal bilder och kan därför ta flera timmar. Fallgropen med långa avbildningstider är att prover tenderar att driva på grund av scenens rörelse eller små strömmar inom provbufferten; Även små rörelser i storleksordningen 10 nm är skadliga vid NM-upplösning och måste korrigeras för. De driftkorrigeringsmetoder som vanligtvis används är dock inte tillräckligt robusta för att exakt lägga över bilder av två kanaler som avbildas sekventiellt36. Detta är problematiskt eftersom biologiska frågor ofta ber om exakt detektion och lokalisering av flera mål inom samma prov. För att kringgå dessa problem har metoder som ratiometrisk avbildning utvecklats. Ratiometrisk avbildning möjliggör samtidig avbildning av flera fluoroforer med överlappande excitations- och emissionsspektra, med en efterföljande tilldelning av varje detekterad signal till dess respektive fluorofor baserat på förhållandet mellan intensiteter i spektralt distinkta kanaler37,38.

Dessutom kräver studier av organisationen av makromolekylära komplex som SC tredimensionell (3D) information. För att uppnå superupplösning i tre dimensioner (3D-SMLM) är en cylindrisk lins integrerad i den optiska vägen för det utsända ljuset som snedvrider formen på PSF för en fluorofor beroende på dess avstånd från fokalplanet. Därför kan den exakta positionen för en fluorofor i z-planet extrapoleras genom att analysera formen på dess emissionssignal35,39. Genom att kombinera dessa framsteg inom SMLM möjliggörs avbildning av 3D-organisationen av makromolekylära komplex, inklusive SC.

Protocol

1. Beredning av lösningar och täckglas

OBS: Se materialförteckningen för detaljer relaterade till alla material och reagenser och tabell 1 för sammansättningen av lösningar som används i detta protokoll.

  1. Poly-L-lysinbelagda täckglas
    1. Bered 0,01% (w/v) poly-L-lysin (se tabell 1).
    2. Tvätta en precisionstäckglas (24 mm diameter; 0,17 ± 0,005 mm, nr 1,5) i etanol i 10-30 min. Skölj täckglaset med ddH2O för att avlägsna etanol och låt täckglaset torka vid rumstemperatur.
    3. Plasma rengör täckglaset med en plasmarengörare.
      OBS: Plasmarengöring ökar täckglasets hydrofilicitet och underlättar följande steg. Om en plasmarengörare inte är tillgänglig kan detta steg hoppas över, även om detta kan kräva justering av volymen och / eller koncentrationen av poly-L-lysinlösningen. Denna modifiering har inte testats.
    4. Placera en droppe (120 μl) av 0,01% (w/v) poly-L-lysin på täckglaset. Inkubera i 10 min vid rumstemperatur.
    5. Efter inkubation, skölj täckglaset iddH2Ooch torka vid rumstemperatur. Förvaras vid 4 °C upp till 1 månad.
  2. F(ab')2 fragment konjugerade med fluorescerande organiska färgämnen
    1. Lägg till följande ordning i ett PCR-rör: 10 μL 0,6-0,7 mg / ml F (ab ') 2 fragment i PBS, 1 μL 0,1 M NaHCO 3 (pH8,3 ) och 1 μL av 1 mM succinimidyl (NHS) esterreaktiv fluorofor i DMSO (molförhållande av F (ab ') 2: färgämne är ~ 1:17). Blanda väl genom att pipettera upp och ner.
    2. Inkubera i 1 h vid rumstemperatur.
    3. Separera F(ab')2-fragmentet från det återstående fria reaktiva färgämnet med hjälp av en avsaltningskolonn (7K MWCO) enligt tillverkarens specifikationer. Använd 1x PBS för jämvikt av kolonnen och eluering av det märkta F(ab')2-fragmentet.
    4. Förvara det märkta F(ab')2-fragmentet vid 4 °C i upp till 3 månader.
      OBS: Lagringstider längre än 3 månader har inte testats.

2. Dissektion och fixering

OBS: Dissektions- och fixeringsförfarandena modifieras från tidigare rekommenderade procedurer16,40 för att erhålla optimala prover för superupplösningsmikroskopi.

  1. Dissekering
    1. Välj åldersmatchade C. elegans-maskar (odlade vid 20 ° C för denna studie) till en 30 μL droppe EBTT (1x äggbuffert41 med 0,2% icke-joniskt tvättmedel, tabell 1) på en täckglas (22 mm x 22 mm, nr 1). Placera lockglidningen på en glasskiva för enklare manipulation. Tvätta med 30 μL EBTT genom att pipettera upp och ner flera gånger. Ta bort 30 μl av lösningen för att lämna en droppe på 30 μl på täckglaset.
      OBS: Små mängder nonjoniskt tvättmedel måste tillsättas till alla lösningar där maskar pipetteras för att förhindra att maskarna fastnar på plastspetsarna.
    2. Använd ett skalpellblad för att skära av huvudena och/eller maskarnas svansar för att extrudera gonaden (figur 2A).
  2. Fixering
    1. Pipet 30 μl fixativ lösning (tabell 1) i droppen av de dissekerade maskarna och pipetten upp och ner för att blanda.
      OBS: Pipetting upp och ner några gånger kan hjälpa till att släppa fler gonader.
    2. Fixera i exakt 1 min efter tillsats av fixeringslösningen.
    3. Stoppa fixeringen genom att överföra maskarna till ett PCR-rör fyllt med TBST (tabell 1). Överför maskarna i så liten volym som möjligt (~ 15 μL).
    4. Snurra ner PCR-röret på en mini-bänkcentrifug (2 000 × g, 10 s). Ta bort supernatanten och tvätta 2x med 200 μL TBST vardera.
    5. Tvätta med 200 μL PBST (Tabell 1) i 5-10 min. Upprepa steg 2.1.1–2.2.5 för upp till fyra prover samtidigt som de dissekerade proverna hålls på is.
      Anmärkning: Om du bearbetar fler än fyra prover, fortsätt med steg 2.2.6 till 2.2.7 efter vart fjärde prov för att säkerställa att provfixeringen förblir konsekvent i alla prover.
    6. Snurra de dissekerade proverna på en mini-bänkcentrifug (2 000 × g, 10 s), ta bort PBST och tillsätt 50–100 μl kall metanol (-20 °C).
      VARNING: Metanol är giftigt. Använd skyddsutrustning och undvik inandning.
    7. Blanda genom pipettering upp och ner och lämna proverna i metanol i 30-60 s. Tvätta proverna 2x i 200 μl PBST.
      Anmärkning: Om fler än fyra prover bearbetas, fortsätt med dissekeringen av de återstående proverna (steg 2.1.1–2.2.7).
    8. Tvätta proverna en tredje gång med 200 μl PBST.

3. Antikroppsinkubationer

  1. Blockering
    1. Blockera proverna i 1x blockeringslösning (tabell 1) i 45-60 min vid rumstemperatur.
      OBS: Inkubationstiden kan variera från 30 min vid rumstemperatur till flera dagar vid 4 °C (testning gjordes upp till 3 dagar).
  2. Primär antikroppslösning
    1. Späd anti-HTP-3 (kyckling42) och anti-HA (mus) antikroppar (eller de antikroppar som valts) till arbetslösningarna (1:250 för SMLM och 1:1 000 för STED-mikroskopiprover) i 1x blockerande lösning.
      OBS: Antikroppar som används för att märka SMLM-prover är mer koncentrerade än för STED-prover eftersom en högre märkningstäthet rekommenderas för SMLM-mikroskopi.
    2. Snurra proverna på en mini-bänkcentrifug (2 000 × g, 10 s), ta bort blockeringsbufferten och tillsätt 30-50 μl av den primära antikroppslösningen. Inkubera över natten vid 4 °C (föredras) eller i 1–2 timmar vid rumstemperatur.
    3. Tvätta 3 x 5-15 min med PBST efter inkubation.
  3. Arbetslösning av F(ab')2 fragment konjugerade till fluorescerande färgämne
    1. Späd de märkta F(ab')2-fragmenten (steg 1.2.4) till arbetslösningarna (1:100 för SMLM och 1:1 000 för STED-mikroskopiprover) i 1x Blocking Solution.
      OBS: För båda superupplösningsteknikerna användes tidigare rapporterade fluoroforpar, nämligen AlexaFluor647 / CF680 för SMLM och AlexaFluor594 / Abberior STAR635P för STED. AlexaFluor647 och STAR645P användes för att märka anti-mus (Fab') 2-fragment för att rikta in sig på C-terminalen för SYP-5 och CF680 / AlexaFluor594-märkta anti-kyckling (Fab') 2-fragment för att rikta in sig på HTP-3.
    2. Snurra proverna på en mini-bänkcentrifug (2 000 × g, 10 s), ta bort PBST och tillsätt 30-50 μl sekundär antikroppslösning. Inkubera i 30 minuter till 2 timmar vid rumstemperatur (rekommenderas) eller över natten vid 4 °C. Tvätta 3 x 5-15 min med PBST.

4. Montering av prover på en täckskiva

  1. Postfixering
    OBS: Bearbeta prover individuellt genom steg 4.1.1-4.2.1.
    1. Snurra ner de färgade proverna och ta bort supernatanten. Tillsätt 50 μL PBST0,2 och överför de färgade maskarna till en 22 mm x 22 mm nr 1 täckglidning.
      OBS: Använd färskt PBST 0,2 med0,2 % nonjoniskt tvättmedel (tabell 1) för detta steg för att förhindra att maskarna fäster vid täckglaset.
    2. Pipet 5,7-6,3 μL postfixativ lösning på en poly-L-lysinöverdrag.
      OBS: Poly-L-lysinöverdrag som förvaras vid 4 °C bör först bringas till rumstemperatur.
    3. Pipa av de dissekerade maskarna i samma volym (5,7-6,3 μl) och överför till fixeringsdroppen på poly-L-lysinöverdraget (figur 2B).
      OBS: I detta och följande steg är det mycket viktigt att behålla den dissekerade vävnaden i mitten av den poly-L-lysinbelagda täckglaset. Detta är särskilt viktigt om du monterar proverna i en anpassad hållare för att passa det specialbyggda SMLM-mikroskopet som används här (se steg 5.1, figur 2B).
    4. Täck provet med ett litet täckglas (12 mm diameter, figur 2B). Ta bort överflödig vätska med en liten bit filterpapper (figur 2B). Fixa i 3-5 min i en mörk kammare.
  2. "Fryssprickor"
    1. Frys proverna genom att placera dem på ett aluminiumblock i torris (figur 2B).
      OBS: Aluminiumblocket måste kylas väl i torrisen innan proverna placeras på det. Fortsätt med postfixering av de återstående proverna (steg 4.1.1-4.2.1). Provet måste ligga på torris i minst 20 minuter eller upp till 1 timme före nästa steg (4.2.2).
    2. Ta bort det mindre täckglaset med en rakhyvel (bild 2B).
      OBS: För STED, fortsätt till steg 5.2.1. För SMLM fortsätter du med steg 4.2.3.
    3. Doppa täckglaset i ett 50 ml koniskt rör som innehåller iskall PBS (föredras) eller -20 °C metanol i cirka 10 s.
      OBS: Temperaturen är en mycket viktig faktor för detta steg. Använd därför PBS som är nytinat eller förvaras i ett is/ etanolbad.
    4. Placera täckglaset i en brunn på en sexbrunnsplatta fylld med PBST-buffert. Ta bort PBST från brunnarna och tillsätt färsk PBS. Lämna proverna i PBS i 5 min.
      OBS: Rör PBS på sidan av brunnen för att undvika att skada och lossa proverna.
    5. Tvätta med färsk PBS och lämna proverna vid 4 °C tills de är upptagna.
      OBS: Proverna är stabila i upp till 2 veckor, men de bästa resultaten uppnås om proverna avbildas inom 2 dagar.
    6. Innan du bildar, bedöma kvaliteten på provmonteringen under ett stereomikroskop.
      OBS: Framgångsrikt monterade bakterielinjer är stabilt fastsatta utan märkbar rörelse i förhållande till täckglaset. Dåligt fastsatta bakterielinjer kommer att klaffa i buffertlösningen.

5. Bildbehandling

  1. Enmolekylär lokaliseringsmikroskopi
    OBS: Bilder förvärvades vid EMBL Imaging Center med hjälp av ett specialbyggt enmolekylärt lokaliseringsmikroskop som konstruerades runt en anpassad kropp, som tidigare rapporterats38,43, med de unika egenskaper som anges i Tabell över material; Se https://www.embl.org/about/info/imaging-centre
    1. Skaffa 3D-pärlkalibrering
      1. Förbered ett precisionsskydd (24 mm diameter; 0,17 ± 0,005 mm, nr 1,5) med vidhäftande 100 nm fluorescerande pärlor enligt beskrivningen tidigare38,44.
      2. Placera kalibreringsprovet från steg 5.1.1.1 på en provhållare.
      3. Tillsätt en droppe nedsänkningsolja på det rena 100x/1,5 oljemålet och montera kalibreringsprovet på mikroskopet.
      4. Inom MicroManager 2 45,46, ange15-20 positioner i kalibreringsprovet.
      5. Inom EMU-plugin-fönstret47, ställ in förvärvet av en z-stack-bild för var och en av positionerna från steg 5.1.1.5.
        OBS: Här ger en sammansatt cylindrisk lins den astigmatism som krävs för 3D-avbildning, och 201 z-skivor förvärvades för varje position som spänner över intervallet mellan -1 μm till 1 μm, med en ökning av 10 nm. En 2 kW/cm2 640 nm laserbelysning användes för 25 ms för varje z-skiva.
      6. Hämta z-stackbilderna av de 100 nm fluorescerande pärlorna genom en identisk optisk bana som kommer att användas för att hämta exempelbilder i steg 5.1.11.
      7. Använd den superupplösta mikroskopianalysplattformen (SMAP48) för att generera en cspline-modell av den experimentella punktspridningsfunktionen (PSF) som kommer att användas för att passa 3D-SMLM-data i steg 5.1.13.
    2. Förbered provhållaren. För den specialbyggda hållaren som används här som använder en magnetisk ring för att skapa bildkammaren (figur 2B), linda in magnetringen med parafilm.
      OBS: Alternativt kan ett mikroskopglas med en konkav fördjupningshålighet användas för att montera prover för mikroskop med glidhållare.
    3. Förbered 1 ml bildbuffert44 (tabell 1).
    4. Ta en täckskiva från steg 4.2.6 och placera den i den skräddarsydda hållaren. Fäst täckglaset i hållaren med den parafilmförpackade magnetringen (steg 5.1.2).
    5. Rör försiktigt bildbufferten (steg 5.1.3) i kammaren som skapas av magnetringen ovanpå provet (figur 2B). Försegla kammaren med en bit parafilm.
    6. För att montera provet, tillsätt en droppe nedsänkningsolja på det rena 100x/1,5 oljemålet. Utan att föra in någon luft i nedsänkningsoljan, placera försiktigt provhållaren med det monterade provet (steg 5.1.5) på mikroskopsteget.
      OBS: Innan du placerar provet på mikroskopet, rengör botten av täckglaset med vävnad och 70% etanol.
    7. Använd EMU-plugin-fönstret47 i MicroManager 245,46 och flytta piezosteget tills signalen från fokuslåslasern detekteras vid kvadrantfotodioden (QPD).
      OBS: För att upprätthålla ett fast fokus över bildtiden uppnås fokuslåsning genom total intern reflektion av en nära infraröd fiberkopplad laser från täckglaset och efterföljande höjdkänslig detektering på en kvadrantfotodiod (QPD). QPD-signalen gav sluten slingkontroll av objektivlinsens piezofäste.
    8. Skaffa en bakre fokalplansbild med en 640 nm excitationslaser vid låg effekt (dvs. 1-5%) för att bekräfta frånvaron av luftbubblor i nedsänkningsoljan.
      OBS: Ta bort provet från scenen om en luftbubbla detekteras. Rengör botten av täckglaset och målet och upprepa steg 5.1.6-5.1.8. Annars fortsätter du att låsa fokus i EMU-programvaran47.
    9. Lokalisera gonadvävnaden med hjälp av ljusfältbelysningen. Använd en lågintensiv belysning på 640 nm, fokusera på den del av vävnaden som innehåller många SC-sträckor.
      OBS: Fokusera inte på strukturer som är mer än 2 μm från täckglaset. Använd inte en högre lasereffekt för att lokalisera provet, eftersom det kan förvandla vissa fluoroforer till ett blinkande tillstånd i förtid. Här användes 1 kW/cm 2 i stigande läge med en puls inställd på 1 000.
    10. Fortsätt att exponera provet med 640 nm belysning vid hög bestrålning (27 kW/cm2) i ~ 30 s tills en lämplig blinkningshastighet uppnås (kompletterande video 1).
    11. Skaffa 200 000 bilder med en exponeringstid på 20 ms med hjälp av det flerdimensionella förvärvsverktyget i MicroManager 245,46.
    12. Under tiden ställer du in UV-aktiveringen med aktiveringsalternativet för EMU-plugin38,47 för att bibehålla önskad blinkningshastighet.
      OBS: Använd UV-lasern vid en 3 kW / cm2 bestrålning i stigande läge med maximal pulslängd inställd på 10 000.
    13. Utför SMLM-bildrekonstruktion och efterbehandling.
      Om du vill rekonstruera bilder från råa SMLM-data läser du publicerade metoder. De data som presenteras här behandlades med hjälp av programvaran SMAP48,49. Superupplöst bildrekonstruktion, kanaltilldelning, driftkorrigering och filtrering av lokaliseringar med dålig lokaliseringsprecision och ett maximalt sannolikhetsfilter utfördes i SMAP48-programvaran.
  2. Stimulerad emissionsutarmningsmikroskopi
    OBS: Bilder förvärvades på det integrerade STED-mikroskopiska systemet utrustat med en vit ljuslaser, en 775 nm pulserad STED-laser och FALCON Fluorescence Lifetime IM-åldringsmodulen (Materialtabell) vid EMBL Imaging Center (https://www.embl.org/about/info/imaging-centre).
    1. Placera en droppe 20 μL monteringsmedium (Materialtabell) på ett mikroskopglas. Ta ett täckglas från steg 4.2.2 och placera provet försiktigt på den glidbana som är vänd mot monteringsmediet (figur 2B).
      OBS: Undvik att införa luftfickor i monteringsmediet.
    2. Låt monteringsmediet härda över natten.
      OBS: Avbilda proverna följande dag eller förvara dem vid 4 °C tills de bildas.
    3. För att montera provet, tillsätt en droppe nedsänkningsolja på provets täckglas från steg 5.2.2. Placera försiktigt provet på mikroskopsteget med ett oljemål på 100x/1,40.
    4. Fokusera på provet och lokalisera könsvävnaden med hjälp av ljusfältbelysningen.
    5. Använd mikroskopprogramvaran och ange den intressanta regionen för vilken TauSTED-bilden kommer att förvärvas.
    6. Välj excitationslasrarna och deras lämpliga effekt som används för att excitera fluoroforerna som används i provet.
      OBS: Här användes 580 nm-lasern med 4% effekt för att avbilda AlexaFluor 594-konjugerade F (ab') 2 sekundära antikroppsfragment och 635 nm vid 3% effekt för att avbilda STAR 635P-konjugerade F (ab') 2-fragment.
    7. Använd mikroskopprogramvaran för att välja en lämplig STED-utarmningslaserkraft och ställ in bilddetekteringen.
      OBS: Här var 775 nm STED-utarmningslasereffekten inställd på 40%. Detektorn användes i räkningsläge med ett förstärkningsvärde på 10 för fotondetektering, med en skanningshastighet på 100 Hz och med en pixelstorlek på 17 nm. Fyra-linjers ackumulering användes för TauSTED-förvärv.

Representative Results

För att avbilda SC i C. elegans bakterievävnad av SMLM har vi använt 2-färgs ratiometric 3D-SMLM för att lokalisera HTP-3, en komponent i kromosomaxlarna, och C-änden av det tvärgående filamentet SYP-5 endogent märkt med en hemagglutinin (HA) -tagg. Placeringen av båda proteinerna inom SC av C. elegans bestämdes tidigare av andra studier16,30.

För att minimera ljusspridning och optiska avvikelser som är inneboende i tjocka biologiska prover, avbildade vi den nedersta z-sektionen av meiotiska kärnor som innehåller SCs (Figur 3, gula linjer). För varje förvärvad bild markerades bildplanets piezostegposition i förhållande till piezostegpositionen när målet fokuserades på täckglaset. Detta möjliggjorde beräkningen av piezoavståndet från täckglaset. Framgångsrikt monterade prover är stabilt fästa nära täckglaset och behåller gonadformen (dvs. vävnaden krossas inte mellan de två täckglasen under postfixeringssteget). Kvaliteten på provmonteringen kan lätt bedömas under ett stereomikroskop eftersom väl anslutna gonader inte visar någon rörelse i lösningen (steg 4.2.6). På grund av monteringsprocessens stokasticitet kommer gonadvävnaden inte nödvändigtvis att läggas ut helt platt på täckglaset. Därför kan bottenplanet för kärnorna som innehåller SCs hittas på varierande avstånd i förhållande till täckglaset inom samma gonad.

För att illustrera hur upplösningen förändras beroende på vävnadens fastsättning i täckglaset fick vi bilder på olika piezoavstånd till täckglaset. För att bedöma kvaliteten på en enskild bild beräknades Fourier-ringkorrelationskurvorna (FRC)50,51 och upplösningen bestämdes med hjälp av FRCResolution-plugin i SMAP-programvaran48. Två representativa kärnor extraherade från två separata 3D-SMLM-bilder tagna på olika avstånd till täckglaset visas i figur 4. I SCs som ligger nära täckglaset är kromosomaxlarna och C-änden av SYP-5::HA väl upplösta i alla tre dimensionerna (figur 4A, 0,8 μm från täckglaset). För att lösa två strukturer åtskilda av ett givet avstånd måste den uppnådda FRC-upplösningen i allmänhet vara mindre än hälften av detta avstånd i den axiella upplösningen.

För att separera samma strukturer i sidled måste ännu mindre FRC-upplösningsvärden uppnås. I prover som ligger i närheten av täckglaset är FRC-upplösningen 38 nm för AlexaFluor 647-kanalen och 34 nm för CF680-kanalen, och därmed långt under det förväntade avståndet på 84 nm mellan C-terminerna för SYP-516. Denna resolution löser därför lätt organisationen av SC inte bara i frontal utan också i laterala vyer (figur 4B i,ii). Däremot försämras upplösningen i SCs som ligger på ett avstånd av 5 μm från täckglaset på grund av ljusspridning och sfäriska avvikelser (figur 4B). FRC-upplösningarna på detta avstånd sjunker till 47 nm (AlexaFluor 647) och 41 nm (CF680), vilket inte helt kan lösa C-termini för SYP-5. Eftersom de optiska avvikelserna försämrar sidoupplösningen allvarligare än den axiella upplösningen, löses HTP-3- och SYP-5-banden inte längre tydligt i tvärsnittet av sidovyn i prover som ligger på ett avstånd av 5 μm från täckglaset (figur 4B ii). En jämförelse av FRC-upplösningen för bilder som förvärvats på olika piezoavstånd från täckglaset visade att den avbildade vävnaden inte bör vara längre än 2 μm från täckglaset (figur 5). Detta resultat belyser vikten av korrekt utförande av postfixeringssteget, under vilket vävnaden framgångsrikt måste tvärbindas till poly-L-lysinbeläggningen av täckglaset.

För att demonstrera den uppnåeliga upplösningen med en annan superupplösningsteknik, avbildade vi också SCs i fast intakt bakterievävnad med TauSTED-mikroskopi. Figur 6A visar TauSTED-bilder med den högsta och lägsta upplösningen som uppnåtts inom denna studie enligt uppskattning från SC:s linjeprofiler i frontalvy (figur 6B). I båda kärnorna kunde vi lösa de två lokaliseringsbanden av HTP-3 i kromosomaxlarna och C-terminerna för SYP-5 i den centrala regionen, vilket visar att upplösningen som kan uppnås i TauSTED med detta optimerade protokoll är under 84 nm. Under optimala förhållanden (figur 6A, överst) kunde vi lösa C-termini i något lutande vyer av SC som separerades med endast 50 nm (figur 6A, gul rektangel och 6C).

Figure 1
Figur 1: Schematisk för organisationen av det synaptonemala komplexet i Caenorhabditis elegans. Tecknad film visar en förenklad struktur av SC i C. elegans som överbryggar två homologa kromosomer (grå). Strukturen visas i frontal-, lateral- och tvärsnittsvyer. Kromosomaxlar visas som röda staplar medan tvärgående filament visas i cyan. Tvärgående filamentproteiner (SYP-1, 5, 6 i C. elegans) är orienterade på ett head-to-head-sätt (cyan ball-stick-grafik) i den centrala regionen för att överbrygga avståndet mellan de två axlarna. De förväntade avstånden mellan axlarna och C-terminerna för tvärgående filament anges. Förkortning: SC = synaptonemal komplex. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Illustration av det provpreparat som använts i studien . (A) Unga vuxna C. elegans dissekeras vid huvudet eller svansen (gröna, streckade linjer) och bearbetas enligt beskrivningen i protokollet. (B) Enskilda steg i metoden indikeras med grafik som är kopplade till grå pilar. Förkortningar: STED = utarmning av stimulerade utsläpp; SMLM = enmolekylär lokaliseringsmikroskopi; PBS = fosfatbuffrad saltlösning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Placering av vävnadssektionen som kan observeras med enmolekylär lokaliseringsmikroskopi. MIP av en snurrande skiva konfokal bild av ett helt fäste C. elegans gonad. Vävnaden färgades för HTP-3 och C-änden av SYP-5 (SYP-5::HA), och den kombinerade signalen visas i grått. Enskilda konfokala bilder syddes med hjälp av Grid / Collection stitching Fiji plugin52 för att skapa en bild av hela gonaden. Indraget visar en xy-vy av det nedersta z-planet som innehåller SCs. Lokaliseringen av detta plan visas i ortogonala vyer av vävnadssektionen som indikeras av en rektangel i MIP-bilden av gonaden (gula linjer). Skalstänger = 10 μm. Förkortningar: MIP = maximal intensitetsprojektion; SCs = synaptonemala komplex. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Enmolekylär lokaliseringsmikroskopi av HTP-3 och C-termini av SYP-5. (A,B) Vänster: SMLM-bilder som visar pachytenkärnor färgade för HTP-3 (röd) och C-änden av SYP-5 (SYP-5::HA, cyan) (skalstreck = 1 μm). Centrum: Inzoomade bilder av intressanta regioner som anges i A och B med motsvarande tvärsnittsvyer som visas under varje bild (i, ii; skalstreck = 100 nm). SC:ns sträckor i inzoomade bilder roteras för att orientera kromosomaxlarna parallellt med y-axeln. Höger: Grafisk representation av lokaliseringen av proteinerna av intresse inom SC som visar SC: s orientering i de inzoomade regionerna som visas i mitten av figuren. Förkortningar: SMLM = enmolekylär lokaliseringsmikroskopi; SC = synaptonemalt komplex. Rådata för att rekonstruera SMLM-bilder är tillgängliga via BioStudies-databasen60 (anslutnings-ID: S-BIAD504). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Fourierringens korrelationsupplösning för enmolekylära lokaliseringsmikroskopibilder beror på avståndet mellan det avbildade z-planet och täckglasets plan. Färgade linjer visar FRC-kurvor för bilder som förvärvats på olika avstånd (som visas av färgfältet) från täckglaset. Tröskelvärdet 1/7 som används för att bestämma FRC-upplösningen indikeras av en svart horisontell linje. Infällningar visar hur FRC-upplösningen är beroende av piezoavståndet från täckglaset. Plottningen utfördes av ett specialskrivet R-skript (version 4.1.2, tilläggsfil 1) där ursprungliga kurvor utjämnades med funktioner från paketet "ggplot2". Förkortningar: FRC = Fourierringskorrelation; SMLM = enmolekylär lokaliseringsmikroskopi; SC = synaptonemalt komplex. Data för FRC-kurvor och SMLM-data finns tillgängliga via BioStudies-databasen60 (Anslutnings-ID: S-BIAD504). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Stimulerad emissionsutarmningsmikroskopi förstärkt av fluorescenslivsbaserad information (TauSTED) löser två lokaliseringsband för både HTP-3 och C-änden av SYP-5. (A) Två representativa TauSTED-bilder visar pachytenkärnor färgade för HTP-3 (röd) och C-änden av SYP-5 (SYP-5:: HA, cyan) med högre (topp) och lägre (nedre) strukturell definition (skalfält = 1 μm). Rektanglarna markerar regioner med de upplösta C-terminerna för SYP-5 i frontal (vit) och en något lutad vy (gul) av SC. (B,C) Fördelning av HTP-3 (röd) och C-änden av SYP-5 (cyan) -signalen upplöst av TauSTED. Linjeprofiler för intressanta regioner som innehåller SC i frontal (B) eller något lutad (C) vy visas som fullständiga linjer med intensitet normaliserad till det maximala värdet. Linjeprofiler genererades med Fiji ImageJ. Streckade linjer i B visar genomsnittliga data för varje protein. Den tjocka cyanlinjen i C motsvarar linjeprofilen med det kortaste upplösta avståndet mellan C-terminerna för SYP-5. För att bestämma avstånden mellan antikropparna riktade mot specifika proteiner utrustades linjeprofilerna (n = 9 (B), n = 7 (C)) med dubbla gaussier med hjälp av ett specialskrivet R-skript (version 4.1.2, tilläggsfil 1). Medelavståndet ± standardavvikelsen (B) och intervallet med minimivärdet markerat med fetstil (C) anges överst i varje diagram. Förkortningar: STED = stimulerad emissionsutarmningsmikroskopi; SC = synaptonemalt komplex. Visade bilder och datapunkter för plottade linjeprofiler är tillgängliga via BioStudies-databasen60 (anslutnings-ID: S-BIAD504). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1: Sammansättning av buffertar och lösningar som används i detta protokoll. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Kompletterande video 1: Förvärv av mikroskopi med en molekyl. Video som visar fluoroforer som blinkar med lämplig hastighet (50 bilder visas, skalstreck = 5 μm, 20 ms / bildruta). Klicka här för att ladda ner den här videon.

Tilläggsfil 1: Dataanalysskript. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

SC: s stegliknande organisation, som är avgörande för korrekt rekombination och segregering av homologa kromosomer, observerades först för nästan 70 år sedan i elektronmikroskopi 3,4. Medan den övergripande organisationen av SC lätt löses i elektronmikroskopi, kräver lokaliseringen av enskilda komponenter inom detta komplex ett mer riktat tillvägagångssätt. Med sin bredd på endast ~ 100 nm kan SC: s understruktur inte lösas med konventionell fluorescensmikroskopi. Superupplösningsmikroskopi har dock blivit en viktig drivkraft för nya upptäckter om strukturen och funktionen hos det synaptonemala komplexet 16,19,24,25,26,27,28,29,30. För att underlätta denna forskning har vi demonstrerat ett monteringsförfarande som gör det möjligt att studera SC: s arkitektur inom C. elegans gonadvävnad med SMLM och STED-mikroskopi.

Ett kritiskt steg för att optimera upplösningen vid SMLM-avbildning är att direkt tvärbinda bakterievävnaden till en poly-L-lysinbelagd täckglas (steg 4). Den kovalenta bindningen av vävnaden till täckglaset är avgörande för att minska rörelser i provet som skulle resultera i stora drifter och göra avbildning under långa tidsperioder för SMLM omöjlig. Dessutom leder även en suboptimal fastsättning som lämnar kärnorna innehållande SCs på ett avstånd från täckglaset till en signifikant minskning av den uppnåeliga upplösningen till följd av sfäriska avvikelser (figur 4). Alternativt till det kovalenta fästet som används här kan färgad könsvävnad också immobiliseras mellan två förseglade täckglas i en liten droppe bildbuffert19,30. Denna immobiliseringsmetod minskar emellertid kraftigt volymen av bildbuffert i provet från 1 ml som används i det optimerade protokollet här till bara några μL, vilket kommer att resultera i en försurning av bildbufferten och kraftigt minska den tid för vilken provet kan avbildas 38,53,54.

Långa förvärvstider för både SMLM- och STED-mikroskopi begränsar användningen av dessa metoder till avbildning av kemiskt fixerade prover. Här säkerställer paraformaldehydfixering att SC: s struktur bevaras under provberedning och avbildning. Trots de försiktighetsåtgärder som vidtagits här för att avbilda SC i intakt vävnad är den resulterande strukturen hos SC efter fixering inte nödvändigtvis identisk med strukturen i sitt ursprungliga tillstånd i en levande organism. Dessutom, eftersom en enda bild av den fasta SC representerar en enda "ögonblicksbild" av den biologiska strukturen, förblir detta tillvägagångssätt blind för dynamiken i den ursprungliga strukturen in vivo.

Information om dynamiken och variationen i makromolekylära strukturer kan emellertid också erhållas genom att förvärva inte bara en enda utan många "ögonblicksbilder". Även om detta tillvägagångssätt kan lösa förändringar i SC: s struktur under pachytene19, finns det flera faktorer som begränsar antalet bilder som kan förvärvas från ett enda prov som framställts med detta protokoll. För det första leder de höga laserkrafterna som används vid bildförvärv till permanent blekning av fluoroforerna och utesluter avbildning av angränsande regioner av intresse eller flera z-plan, vilket avsevärt minskar antalet bilder som kan förvärvas från ett enda prov. För det andra är prov-/vävnadstätheten på täckglaset som framställts med denna metod låg, vilket avsevärt begränsar antalet bilder som kan förvärvas från en enda täckglidning. Den låga provdensiteten förbjuder också användningen av automatiserade bildförvärvsledningar som hjälpte till att belysa andra biologiska frågor 34,55,56,57,58,59. Provdensiteten kan dock ökas något av en erfaren användare.

Protokollet som presenteras här är optimerat för att erhålla en hög märkningstäthet som är nödvändig för att uppnå optimal upplösning i SMLM35. Medan tidigare protokoll kovalent fäster vävnaden på täckglaset före immunfärgning16, tvärbinder detta nya protokoll vävnaden till täckglaset först efter att proverna färgats i lösning. Denna modifiering gör det möjligt för antikropparna som används för immunmärkning att fritt komma åt vävnaden från alla sidor, medan den kovalenta bindningen av vävnaden till täckglaset kan begränsa antikroppar från att nå kärnorna närmast täckglaset, vilket minskar graden av märkning. Tillsammans förbättrar de modifieringar som beskrivs här upplösningen från 40-50 nm (FRC-upplösning)16 till 30-40 nm (detta protokoll).

Viktigt är att även om en hög märkningstäthet och en hög koncentration av antikroppar är avgörande för SMLM, fann vi att bättre STED-mikroskopibilder erhålls med lägre antikroppskoncentrationer (steg 3). Vid en upplösning på tiotals nanometer blir storleken på molekylerna som används för att märka proteinet av intresse allt viktigare. Vi använde därför F(ab')2-fragment som är hälften så stora som fullängdsantikroppar. Förbättringen av lokal kontrast på grund av en mindre signalkälla, och därför upplösning som erhållits genom denna modifiering jämfört med användning av sekundära antikroppar i full längd, möjliggjorde upplösningen av de två C-terminerna av SYP-5 inom den centrala regionen av TauSTED, som inte löses av konventionell STED med användning av antikroppar i full längd (16 och data visas inte). Vi förväntar oss att detta optimerade protokoll för avbildning av SCs i intakta C. elegansbakterieller kommer att underlätta undersökningen av SC: s struktur-funktionsförhållande under meios.

Disclosures

Författare förklarar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Vi vill tacka Jonas Ries och Ries-labbet för att de delar bildbuffertar för SMLM-avbildning. Vi tackar också Yumi Kim för C. elegans-stammen som används i detta protokoll och Abby F. Dernburg för kyckling-anti-HTP-3-antikroppen. Vi tackar Marko Lampe och Stefan Terjung från Advanced Light Microscopy Facility på EMBL Heidelberg för deras stöd i användningen av Olympus iXplore SPIN SR konfokalmikroskop. Detta arbete stöddes av European Molecular Biology Laboratory och Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation - 452616889, SK). Vi erkänner tillgången och tjänsterna som tillhandahålls av Imaging Centre vid European Molecular Biology Laboratory (EMBL IC), generöst stöd av Boehringer Ingelheim Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100x/1.5 oil objective Olympus UPLAPO100XOHR UPLAPO100XOHR
2-mercaptoethylamine (MEA) Sigma-Aldrich 30070-10G Dissolved in MilliQ water to 5 M solution, pH  8.7 adjusted with HCl. Aliquoted to a single-use volume, frozen, and kept at -80 °C.
Additional 640 nm booster laser Toptica IBEAM-SMART-640-S-HP
AlexaFluor 594, NHS ester ThermoFischer Scientific A37572 Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C
AlexaFluor 647, NHS ester ThermoFischer Scientific A37573 Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C
anti-HA Thermo Fisher Scientific 2-2.2.14 Mouse monoclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)
anti-HTP-3 a gift from Abby F. Dernburg MacQueen et al., 2005 Chicken polyclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)
Caenorhabditis elegans strain  YKM349 a gift from Yumi Kim Hurlock et al., 2020 syp-5(kim9[syp-5::HA]) I; meIs8[pie-1p::GFP::cosa-1, unc-119(+)] II
CF6680, NHS ester Biotium 92139 Dissolved in DMSO to 1mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C
Circular cover glass 12 mm No. 1 Menzel-Gläser; VWR 631-0713
Circular cover glass 24 mm No. 1.5 Carl Roth PK26.1
Cylindrical lenses Thorlabs LJ1516RM-A, LK1002RM-A
Egg Buffer (10x) Edgar 1995 250 mM HEPES, 1.18 M NaCl, 480 mM KCl, 20 mM EDTA, 5 mM EGTA, pH 7.4
Ethanol (absolute for analysis) Merck 64-17-5
F(ab’)2 fragment anti-chicken IgY Jackson Immunoresearch AB_2340347 Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)
F(ab’)2 fragment anti-mouse IgG Jackson Immunoresearch AB_2340761 Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)
Fisherbrand Microscope slides T/F Ground 0.8-1.0 mm thick Fisher scientific 7107
Gauge Worm Pick 30 diameter 0.254 mm - Iridium 10% Kisker 789265
Glucose oxidase/Catalase enzyme mix (GlOX/Cat ) a gift from Jonas Ries Hoess, Mund, Reitberger, & Ries, 2018 20x, 1916 U/mL glucose oxidase (Sigma G7141), 42350 U/mL catalase (Sigma C3155),
50 mM Tris-HCl pH 8.0, 51% glycerol, MilliQ water. Stored at -20 °C.
Imaging buffer base a gift from Jonas Ries Hoess, Mund, Reitberger, & Ries, 2018 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM NaCl, 10% D-Glucose.
Aliquoted to a single-use volume (950 μL), frozen, and kept at -80 °C.
Invitrogen ProLong Glass Antifade Mountant ThermoFischer Scientific P36982
Leica Stellaris 8 STED FALCON Leica N/A The microscope is equiped with the latest generation white light laser, a 775nm pulsed STED laser, the FALCON Fluorescence Lifetime IMaging module, HC PL APO CS2 100x/1.40 oil objective, and Leica HyD X detector. The system is capable of FLIM module enhanced Tau-STED which measures the specific fluorescence lifetime of a dye and is therefore capable of removing background signal based on differences in fluorescence lifetimes of the dyes, and dye conditions in the sample.  Additionally, the resolution is increased by accounting for the variation of fluorescence lifetimes in different areas of the depletion donut.
Longwave channel emission filter AHF Analysentechnik F47-702 700/100 nm bandpass
Methanol (absolute for analysis) Merck 67-56-1
NaHCO3 Sigma-Aldrich/Merck S5761-500G 100 mM NaHCO3, pH 8.3
Near-infrared fiber-coupled laser Toptica IBEAM-SMART-PT-CD Custom Design, 808 nm - 75mW
Objective lens piezo mount (PIFOC ) Physik Instrumente P-726.1.CD 100 µm travel range
Orca Fusion BT sCMOS camera Hamamatsu C15440-20UP
PCR tubes Greiner Bio-One 673283 0.2 mL
Phosphate Saline Buffer (PBS 10x) N/A 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4
Pierce 16% formaldehyde (w/v), methanol free ThermoFischer Scientific 28906 16% formaldehyde is transferred from the original glass ampule into 1.5 mL tube and kept at room temperature.
PlasmaPrep2 plasma cleaner GaLa Instrumente GmbH N/A
Poly-L-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich/Merck P2636-25MG 0.1% w/v solution was prepared in Milli-Q water, and stored in aliquots at -20 °C.
Primary dichroic (illumination reflecting) AHF Analysentechnik F73-866S quad bandpass @ 405, 488, 561, 640
Quadnotch filter AHF Analysentechnik F40-072 405/488/561/640 nm
Quadrant photodiode (QPD) Laser Components SD197-23-21-041, LC301DQD-PV
Razor blades Apollo Herkenrath Solinger N/A
Refractive beam shaper AdlOptica PiShaper 6_6_VIS
Roche Blocking Reagent Roche 11096176001 10x solution was prepared according to recommendation. Frozen aliquots were stored at -20 °C.
Scalpel blade (Feather brand #11, No. 3) Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH 1110911
Scalpel removal box Fisher scientific 10002-50
Secondary dichroic (emission reflecting) AHF Analysentechnik F38-785S 750 nm longpass
Shortpass filter Semrock BSP01-785R-25  750 nm
Shortwave channel emission filter AHF Analysentechnik F37-677  676/37 nm bandpass
Single molecule localization microscope EMBL Imaging Centre Diekmann et al., 2020 with modifications The microscope provides widefield epi-illumination via a single-mode fiber-coupled laser engine, additional booster laser, and refractive beam shaper to provide a uniform illumination field (Stehr et al, 2019). Widefield images are captured on a sCMOS camera  and appropriate relay optics for a system magnification of 61x and a pixel size of 106 nm.
For ratiometric imaging of spectrally overlapping far-red dyes, an image splitter produces two spectrally distinct images on the camera (splitting dichroic: 665 nm long pass, shortwave channel emission filter: 676/37 nm bandpass, longwave emission filter: 700/100 nm bandpass. An additional 405/488/561/640 nm quadnotch filter and 750 nm shortpass filter are common to the two paths and provide additional laser blocking).
A compound cylindrical lens provides the astigmatism required for 3D imaging.
To maintain a fixed focus across acquisitions exceeding 2 hours in time (comprising 200 000 - 250 000 images), focus locking is achieved by total internal reflection of a near-infrared fiber-coupled laser  from the coverslip and subsequent height sensitive detection on a quadrant photodiode (QPD). The QPD signal provided closed-loop control of the objective lens piezo mount.
For access to this microscope, refer to https://www.embl.org/about/info/imaging-centre or contact ic-contact@embl.de
Single-mode fiber-coupled multi-laser engine Toptica iCHROME MLE-LFA-HP Provides widefield epi-illumination of 100 mW at 405, 488, 561, 640 nm
Splitting dichroic AHF Analysentechnik F48-665SG 665 nm long pass
Square cover glass 22 x 22 mm No.1 Menzel-Gläser; VWR 630-2882
STAR 635P, NHS ester Abberior ST635P-0002-1MG Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C
Stereo microscope Stemi 305 Stand K LAB Zeiss N/A
Tetramisole hydrochloride Sigma-Aldrich/Merck T1512-2G 1% (w/v) solution was prepared in Milli-Q water. Frozen aliquots were stored at -20 °C.
Thawed aliquot was kept at 4 °C and used for several months.
TetraSpeck Microspheres ThermoFischer Scientific T7279  0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red
Tris Saline Buffer (TBS 10x) N/A 200 mM Tris-HCl, 1.5 M NaCl, pH 7.5
TWEEN 20 Sigma-Aldrich/Merck P9416-50ML Kept at room temperature in original packaging.
WormStuff worm pick Kisker 789277
XY microscope stage  Smaract N/A Custom Design
Zeba Micro Spin Desalting Column ThermoFischer Scientific 89877  7K MWCO, 75 µL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zickler, D., Kleckner, N. Meiotic chromosomes: integrating structure and function. Annual Review of Genetics. 33, 603 (1999).
  2. Ur, S. N., Corbett, K. D. Architecture and dynamics of meiotic chromosomes. Annual Review of Genetics. 55, 497-526 (2021).
  3. Fawcett, D. W. The fine structure ot chromosomes in the meiotic prophase of vertebrate spermatocytes. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 2 (4), 403-406 (1956).
  4. Moses, M. J. Chromosomal structures in crayfish spermatocytes. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 2 (2), 215-218 (1956).
  5. Hillers, K. J., Jantsch, V., Martinez-Perez, E., Yanowitz, J. L. Meiosis. WormBook. , 433-434 (2017).
  6. Pasierbek, P., et al. A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction. Genes & Development. 15 (11), 1349-1360 (2001).
  7. Severson, A. F., Ling, L., Van Zuylen, V., Meyer, B. J. The axial element protein HTP-3 promotes cohesin loading and meiotic axis assembly in C. elegans to implement the meiotic program of chromosome segregation. Genes & Development. 23 (15), 1763-1778 (2009).
  8. Zetka, M. C., Kawasaki, I., Strome, S., Müller, F. Synapsis and chiasma formation in Caenorhabditis elegans require HIM-3, a meiotic chromosome core component that functions in chromosome segregation. Genes & Development. 13 (17), 2258-2270 (1999).
  9. Martinez-Perez, E. HTP-1-dependent constraints coordinate homolog pairing and synapsis and promote chiasma formation during C. elegans meiosis. Genes & Development. 19 (22), 2727-2743 (2005).
  10. Couteau, F., Zetka, M. HTP-1 coordinates synaptonemal complex assembly with homolog alignment during meiosis in C. elegans. Genes & Development. 19 (22), 2744-2756 (2005).
  11. Goodyer, W., et al. HTP-3 Links DSB Formation with Homolog Pairing and Crossing Over during C. elegans Meiosis. Developmental Cell. 14 (2), 263-274 (2008).
  12. Colaiácovo, M. P., et al. Synaptonemal complex assembly in C. elegans is dispensable for loading strand-exchange proteins but critical for proper completion of recombination. Developmental Cell. 5 (3), 463-474 (2003).
  13. MacQueen, A. J., Colaiácovo, M. P., McDonald, K., Villeneuve, A. M. Synapsis-dependent and -independent mechanisms stabilize homolog pairing during meiotic prophase in C. elegans. Genes & Development. 16 (18), 2428-2442 (2002).
  14. Smolikov, S., et al. Synapsis-defective mutants reveal a correlation between chromosome conformation and the mode of double-strand break repair during Caenorhabditis elegans meiosis. Genetics. 176 (4), 2027-2033 (2007).
  15. Smolikov, S., Schild-Prüfert, K., Colaiácovo, M. P. A yeast two-hybrid screen for SYP-3 interactors identifies SYP-4, a component required for synaptonemal complex assembly and chiasma formation in Caenorhabditis elegans meiosis. PLoS Genetics. 5 (10), 1000669 (2009).
  16. Hurlock, M. E., et al. Identification of novel synaptonemal complex components in C. Elegants. The Journal of Cell Biology. 219 (5), (2020).
  17. Zhang, Z., et al. Multivalent weak interactions between assembly units drive synaptonemal complex formation. The Journal of Cell Biology. 219 (5), (2020).
  18. Schild-Prüfert, K., et al. Organization of the synaptonemal complex during meiosis in Caenorhabditis elegans. Genetics. 189 (2), 411-421 (2011).
  19. Köhler, S., Wojcik, M., Xu, K., Dernburg, A. F. The interaction of crossover formation and the dynamic architecture of the synaptonemal complex during meiosis. bioRxiv. , (2020).
  20. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6621), 543-548 (2015).
  21. Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8206-8210 (2000).
  22. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  23. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  24. Schücker, K., Holm, T., Franke, C., Sauer, M., Benavente, R. Elucidation of synaptonemal complex organization by super-resolution imaging with isotropic resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (7), 2029-2033 (2015).
  25. Cahoon, C. K., et al. Superresolution expansion microscopy reveals the three-dimensional organization of the Drosophila synaptonemal complex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (33), 6857-6866 (2017).
  26. Zwettler, F. U., et al. Tracking down the molecular architecture of the synaptonemal complex by expansion microscopy. Nature Communications. 11 (1), 1-11 (2020).
  27. Yoon, S., Choi, E. H., Kim, J. W., Kim, K. P. Structured illumination microscopy imaging reveals localization of replication protein A between chromosome lateral elements during mammalian meiosis. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-12 (2018).
  28. Prakash, K., et al. Superresolution imaging reveals structurally distinct periodic patterns of chromatin along pachytene chromosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (47), 14635-14640 (2015).
  29. Xu, H., et al. Molecular organization of mammalian meiotic chromosome axis revealed by expansion STORM microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (37), 18423-18428 (2019).
  30. Köhler, S., Wojcik, M., Xu, K., Dernburg, A. F. Superresolution microscopy reveals the three-dimensional organization of meiotic chromosome axes in intact Caenorhabditis elegans tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (24), 4734-4743 (2017).
  31. Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  32. Hein, B., Willig, K. I., Hell, S. W. Stimulated emission depletion (STED) nanoscopy of a fluorescent protein-labeled organelle inside a living cell. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (38), 14271-14276 (2008).
  33. Jahr, W., Velicky, P., Danzl, J. G. Strategies to maximize performance in STimulated Emission Depletion (STED) nanoscopy of biological specimens. Methods. 174, 27-41 (2019).
  34. Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative superresolution microscopy. Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
  35. Xu, K., Shim, S. -H., Zhuang, X. Super-resolution imaging through stochastic switching and localization of single molecules: an overview. Far-Field Optical Nanoscopy. , 27-64 (2013).
  36. Wang, Y., et al. Localization events-based sample drift correction for localization microscopy with redundant cross-correlation algorithm. Optics Express. 22 (13), 15982 (2014).
  37. Winterflood, C. M., Platonova, E., Albrecht, D., Ewers, H. Dual-color 3D superresolution microscopy by combined spectral-demixing and biplane imaging. Biophysical Journal. 109 (1), 3-6 (2015).
  38. Diekmann, R., et al. Optimizing imaging speed and excitation intensity for single molecule localization microscopy. Nature Methods. 17 (9), 909 (2020).
  39. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  40. Phillips, C. M., McDonald, K. L., Dernburg, A. F. Cytological analysis of meiosis in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 558, 171-195 (2009).
  41. Edgar, L. G. Blastomere culture and analysis. Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).
  42. MacQueen, A. J., et al. Chromosome sites play dual roles to establish homologous synapsis during meiosis in C. elegans. Cell. 123 (6), 1037-1050 (2005).
  43. Stehr, F., Stein, J., Schueder, F., Schwille, P., Jungmann, R. Flat-top TIRF illumination boosts DNA-PAINT imaging and quantification. Nature Communications. 10 (1), 1-8 (2019).
  44. Hoess, P., Mund, M., Reitberger, M., Ries, J. Dual-color and 3D super-resolution microscopy of multi-protein assemblies. Methods in Molecular Biology. 1764, 237-251 (2018).
  45. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer Control of microscopes using µManager. Current Protocols in Molecular Biology. 92 (1), 14-20 (2010).
  46. Edelstein, A. D., et al. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), 10 (2014).
  47. Deschamps, J., Ries, J. EMU: reconfigurable graphical user interfaces for Micro-Manager. BMC Bioinformatics. 21 (1), 1-13 (2020).
  48. Ries, J. SMAP: a modular super-resolution microscopy analysis platform for SMLM data. Nature Methods. 17 (9), 870-872 (2020).
  49. Li, Y., et al. Global fitting for high-accuracy multi-channel single-molecule localization. Nature Communications. 13 (1), 1-11 (2022).
  50. Nieuwenhuizen, R. P. J., et al. Measuring image resolution in optical nanoscopy. Nature Methods. 10 (6), 557-562 (2013).
  51. Banterle, N., Bui, K. H., Lemke, E. A., Beck, M. Fourier ring correlation as a resolution criterion for super-resolution microscopy. Journal of Structural Biology. 183 (3), 363-367 (2013).
  52. Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
  53. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
  54. Olivier, N., Keller, D., Rajan, V. S., Gönczy, P., Manley, S. Simple buffers for 3D STORM microscopy. Biomedical Optics Express. 4 (6), 885-899 (2013).
  55. Mund, M., et al. Superresolution microscopy reveals partial preassembly and subsequent bending of the clathrin coat during endocytosis. bioRxiv. , (2022).
  56. Mund, M., et al. Systematic nanoscale analysis of endocytosis links efficient vesicle formation to patterned actin nucleation. Cell. 174 (4), 884-896 (2018).
  57. Sabinina, V. J., et al. Three-dimensional superresolution fluorescence microscopy maps the variable molecular architecture of the nuclear pore complex. Molecular Biology of the Cell. 32 (17), 1523-1533 (2021).
  58. Cieslinski, K., et al. Nanoscale structural organization and stoichiometry of the budding yeast kinetochore. bioRxiv. , (2021).
  59. Sieben, C., Banterle, N., Douglass, K. M., Gönczy, P., Manley, S. Multicolor single-particle reconstruction of protein complexes. Nature Methods. 15 (10), 777-780 (2018).
  60. Sarkans, U., et al. The BioStudies database—one stop shop for all data supporting a life sciences study. Nucleic Acids Research. 46, (2018).

Tags

Biologi utgåva 187 C. elegans meios synaptonemalt komplex immunohistokemi superupplösningsmikroskopi lokaliseringsmikroskopi med en molekyl stimulerad emissionsutarmningsmikroskopi
Superupplösningsmikroskopi av det synaptonemala komplexet inom <em>Caenorhabditis elegans</em> Germline
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Čavka, I., Power, R. M., Walsh, … More

Čavka, I., Power, R. M., Walsh, D., Zimmermann, T., Köhler, S. Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline. J. Vis. Exp. (187), e64363, doi:10.3791/64363 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter