Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Bestemmelse af in vitro - og cellulær tændingskinetik til fluorogene RNA-aptamerer

Published: August 9, 2022 doi: 10.3791/64367
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Chemistry and Henry Eyring Center for Cell & Genome Science, University of Utah
* These authors contributed equally

Summary

Protokollen præsenterer to metoder til bestemmelse af kinetikken af de fluorogene RNA-aptamerer Spinat2 og Broccoli. Den første metode beskriver, hvordan man måler fluorogen aptamerkinetik in vitro med en pladelæser, mens den anden metode beskriver målingen af fluorogen aptamerkinetik i celler ved flowcytometri.

Abstract

Fluorogene RNA-aptamerer er blevet anvendt i levende celler til at mærke og visualisere RNA'er, rapportere om genekspression og aktivere fluorescerende biosensorer, der detekterer niveauer af metabolitter og signalmolekyler. For at studere dynamiske ændringer i hvert af disse systemer er det ønskeligt at opnå realtidsmålinger, men målingernes nøjagtighed afhænger af, at kinetikken af den fluorogene reaktion er hurtigere end prøveudtagningsfrekvensen. Her beskriver vi metoder til at bestemme in vitro- og cellulær tændskinetik for fluorogene RNA-aptamerer ved hjælp af en pladelæser udstyret med henholdsvis en prøveinjektor og et flowcytometer. Vi viser, at in vitro-kinetikken for fluorescensaktiveringen af spinat2- og broccoli-aptamererne kan modelleres som tofasede associeringsreaktioner og har forskellige hurtige fasehastighedskonstanter på henholdsvis 0,56 s-1 og 0,35 s-1. Derudover viser vi, at den cellulære kinetik for fluorescensaktiveringen af spinat2 i Escherichia coli, som yderligere er begrænset af farvestofdiffusion i de gramnegative bakterier, stadig er tilstrækkelig hurtig til at muliggøre nøjagtig prøveudtagningsfrekvens på minutskalaen. Disse metoder til analyse af fluorescensaktiveringskinetik kan anvendes på andre fluorogene RNA-aptamerer, der er udviklet.

Introduction

Fluorogene reaktioner er kemiske reaktioner, der genererer et fluorescenssignal. Fluorogene RNA-aptamerer udfører typisk denne funktion ved at binde et lille molekylefarvestof for at forbedre dets fluorescenskvanteudbytte (figur 1A)1. Forskellige fluorogene RNA-aptamersystemer er udviklet og består af specifikke RNA-aptamersekvenser og de tilsvarende farvestofligander1. Fluorogene RNA-aptamerer er blevet tilføjet til RNA-transkripter som fluorescerende tags, der muliggør levende cellebilleddannelse af mRNA'er og ikke-kodende RNA'er 2,3,4. De er også blevet placeret efter promotorsekvenser som fluorescerende reportere af genekspression, svarende til brugen af grønt fluorescerende protein (GFP) som reporter, bortset fra at rapporteringsfunktionen er på RNA-niveau 5,6. Endelig er fluorogene RNA-aptamerer blevet inkorporeret i RNA-baserede fluorescerende biosensorer, som er designet til at udløse den fluorogene reaktion på et specifikt lille molekyle. RNA-baserede fluorescerende biosensorer er udviklet til levende cellebilleddannelse af forskellige ikke-fluorescerende metabolitter og signalmolekyler 7,8,9,10,11.

Der er stigende interesse for udviklingen af fluorogene RNA-aptamerer til at visualisere dynamiske ændringer i RNA-lokalisering, genekspression og små molekylesignaler. For hver af disse anvendelser er det ønskeligt at opnå realtidsmålinger, men målingernes nøjagtighed afhænger af, at kinetikken af den fluorogene reaktion er hurtigere end prøveudtagningsfrekvensen. Her beskriver vi metoder til at bestemme in vitro-kinetikken for fluorogene RNA-aptamerer Spinat2 12 og Broccoli13 ved hjælp af en pladelæser udstyret med en prøveinjektor og til at bestemme den cellulære tændingskinetik forspinat2 udtrykt i Escherichia coli ved hjælp af et flowcytometer. Disse to RNA-aptamerer blev valgt, fordi de er blevet anvendt til at studere RNA-lokalisering 2,3,4, de er blevet brugt i journalister 5,6 og biosensorer 7,8,9,10,11, og de tilsvarende farvestofligander (DFHBI eller DFHBI-1T) er kommercielt tilgængelige. Et resumé af deres in vitro-egenskaber bestemt i litteraturen findes i tabel 1 4,13,14, som dannede grundlag for protokoludviklingen (f.eks. de anvendte bølgelængder og farvestofkoncentrationer). Disse resultater viser, at de fluorogene reaktioner, der påvirkes af RNA-aptamerer, er hurtige og ikke bør hindre nøjagtige målinger for de ønskede cellebiologiske anvendelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. In vitro kinetik eksperiment

  1. Udarbejdelse af DNA-skabeloner ved PCR
    1. Konfigurer PCR-reaktion(er): For at forberede PCR-reaktioner skal du kombinere følgende reagenser i et tyndvægget PCR-rør:
      33 μL dobbeltdestilleret vand (ddH2O)
      10 μL 5x buffer til hi-fi-DNA-polymerase
      5 μL 2 mM pr. deoxyribonukleosidtrifosfat (dNTP)
      0,5 μL 40 μM fremadgående primer
      0,5 μL 40 μM omvendt primer
      0,5 μL (10-100 ng) DNA-skabelon (kun til spinat2 PCR; Broccoli primere overlapper hinanden)
      0,5 μL hi-fi-DNA-polymerase (tilsæt sidst)
      BEMÆRK: Syntetiske oligonukleotider sendes ofte tørre. For at forberede stamopløsninger tilsættes et kendt volumen (100 μL anbefales) af ddH2O og måle A260 af denne opløsning for at bestemme koncentrationen efter ølens lov, hvor udryddelseskoefficienten kan beregnes ved hjælp af nærmeste naboregler online. Denne stamopløsning kan derefter bruges til at gøre fortyndinger passende til brug i PCR.
    2. Kør termocyklerprotokollen.
      1. Brug følgende termocykliske protokol til at forstærke DNA-skabeloner til spinat2 og broccoli i fuld længde:
        Indledende denaturering:98 °C i 2 minutter
        35 cyklusser:
        Denaturering:98 °C denaturering i 15 s
        Udglødning:72 °C i 30 s
        Udvidelse:72 °C i 30 s
        Endelig forlængelse: 72 °C i 5 min.
      2. Efter reaktionen analyseres en lille aliquot af produktet med 2% agarosegel sammen med en stige med lav molekylvægt (størrelsesområde: 25-766 nukleotider) for at bekræfte tilstedeværelsen af det ønskede DNA-produkt.
      3. Rens produktet ved kommercielt tilgængelige gelekstraktions- eller PCR-oprydningssæt og elutre med ddH2O eller bufferen leveret af producenten.
        BEMÆRK: Sørg for, når du vælger et PCR-oprydningssæt, at kolonnemolekylvægtafskæringen er lav nok til at bevare T7-Broccoli (81 nukleotider), ellers vil PCR-produktet gå tabt.
        BEMÆRK: Valgfrit pausepunkt: Opbevar DNA'et ved -20 °C.
  2. Fremstilling af spinat2 og broccoli RNA ved in vitro transkription (IVT)
    1. Indstil transskriptionsreaktionen (e).
      1. For at forberede en 100 μL transkriptionsreaktion kombineres følgende reagenser i et 1,5 ml mikrocentrifugerør: 10 μL 10x transkriptionsbuffer + 20 μL 10 mM ribonukleosidtrifosfater (rNTP'er) + 1-64 μL DNA-skabelon (i alt 1 μg) + 2 μL uorganisk pyrophosphatase + ddH2 O til 98 μL + 2μL T7 RNA-polymerase (tilsæt sidst).
      2. Denne reaktion inkuberes i 4 timer ved 37 °C. Sluk reaktionen ved at tilsætte 100 μL 2x ureagelbelastningsbuffer (2x ULB), sammensat af 20% saccharose, 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS), 1x Tris-Borat-EDTA (1x TBE) buffer og ~ 18 M urinstof.
        BEMÆRK: Valgfrit pausepunkt: Gem den slukkede reaktion ved -20 °C.
  3. Polyacrylamid gelelektroforese (PAGE) oprensning af RNA
    1. PAGE rensning af spinat2 og broccoli RNA
      FORSIGTIG: Ikke-polymeriseret (flydende eller pulveriseret) acrylamid er ekstremt giftigt. Hvis du vejer pulveriseret acrylamid, skal du gøre det i en røghætte. Brug altid korrekt beskyttelsesudstyr, og fjern straks handsker, der er forurenet med acrylamidpulver eller opløsning, og vask hænderne grundigt. Hvis acrylamid kommer i direkte kontakt med huden, skal du vaske det udsatte område i mindst 15 minutter med sæbe og vand. Hvis akrylamid kommer i direkte kontakt med øjnene, skylles de med vand i 15 min.
      1. Forbered PAGE-gelen: For at fjerne uønskede abortive transkripter og ikke-reagerede rNTP'er fra produktet i fuld længde skal du forberede en 6% urinstof-polyacrylamidgel. Generelt kan 28 cm x 16,5 cm x 1,5 mm geler bruges med en 8-brønds kam. Opsæt gel- og elektroforeseudstyret ved hjælp af 1x TBE-buffer til at fylde reservoirerne.
      2. Indlæs RNA-prøve (er) i PAGE-gelen: Indlæs gelen med en slukket 200 μL-reaktion pr. Bane. I en separat bane indlæses 2x ULB med trackerfarvestoffer xylencyanol og bromophenolblå, som migrerer i gelen ved henholdsvis 106 nukleotider og 26 nukleotider15. Efterlad en tom bane mellem hver prøve for at undgå potentiel forurening i de næste trin.
      3. Kør PAGE-gelen: For at adskille 95-nt Spinat2 og 49-nt Broccoli fra deres respektive afkortede produkter skal du køre gelen i 1,5-2 timer ved 25 W, hvorefter bromophenolblåfarvestoffet vil have migreret ~ 5/6 af gellængden.
      4. Visualiser RNA-prøven (e) i PAGE-gelen: Skil glaspladerne omkring gelen og dæk gelen i plastfolie på begge sider, og mærk banerne på indpakningen. Visualiser RNA-bånd i et mørkt rum ved UV-skygge ved at placere den indpakkede gel på en fluorescerende TLC-plade under UV-lys. Hurtigt skitsere kanten af RNA-båndene, der svarer til produktet, med en markør, og sluk UV-lampen for at minimere skader fra UV-eksponering.
      5. Punktafgift og ekstraktion af RNA-prøven (e) fra PAGE-gelen: Med et frisk barberblad til hver prøve skal du skære de ønskede produktbånd i tern, terninger i ~ 1 mm terninger og tilføje gelstykkerne til et 2 ml mikrocentrifugerør med 500 μL knusningsblødgøringsbuffer for at ekstrahere RNA på en rotator i enten 2 timer ved stuetemperatur (RT) eller natten over ved 4 ° C.
        BEMÆRK: Valgfrit pausepunkt: Prøven kan opbevares ved -20 °C.
      6. Udfælde RNA'et
        1. For at adskille gelstykkerne fra det ekstraherede RNA i buffer centrifugeres prøven ved 13.000 x g i 20 minutter ved 4 °C, og derefter anvendes en smalspidspipette til at ekstrahere supernatanten og fylde den i et nyt 2 ml mikrocentrifugerør.
        2. For at udfælde RNA'et tilsættes 1,5 ml iskold ethanol og 1 μL 20 mg / ml glykogen, hvirvel og opbevares i mindst 1 time ved -20 ° C eller -80 ° C.
          BEMÆRK: Valgfrit pausepunkt: RNA'et kan opbevares ved -20 °C i et par måneder.
      7. Indsamling af RNA-bundfald: Pellet det udfældede RNA ved centrifugering ved 13.000 x g i 20 minutter ved 4 °C. Supernatanten fjernes, og den resterende ethanol fordampes under fri luft (~1 time), før pelleten genanvendes i 30 μL ddH2O- eller 1x TE-buffer.
        BEMÆRK: Denne proces resulterer typisk i en endelig RNA-koncentration på ~ 10 μM.
        BEMÆRK: Valgfrit pausepunkt: RNA-prøven kan opbevares ved -20 ° C i et par måneder.
    2. Bestem RNA-stamkoncentrationerne.
      1. Forbered en RNA-aliquot til hydrolysereaktionen.
        1. For at udføre dette assay skal du først bruge et UV / Vis nanospektrofotometer til at bestemme A260 af stam-RNA-prøven og lave en fortyndet aliquot af prøven til ~ 10 absorbansenheder (AU) i ddH2O.
        2. Følgende reaktion fremstilles i et 0,5 ml PCR-rør: 16 μL ddH2O + 2 μL 10x Na2CO3 buffer + 2 μL RNA aliquot fortyndet til ~ 10 AU. Inkuber reaktionen i 90 minutter ved 95 °C, og lad den derefter køle af til RT.
      2. Bestemmelse af RNA-koncentrationen ved hjælp af nukleotidabsorbanser: Mål A260 af denne prøve med et UV / Vis nanospektrofotometer og beregn RNA-koncentrationen ved hjælp af følgende formel:
        Equation 1
        hvor c er koncentrationen af RNA, b er vejlængden, i er det specifikke nukleotid (A, C, G eller U), n i er hyppigheden af nukleotid i i RNA-sekvensen, og εi er den molære udryddelseskoefficient for nukleotid i. For at bestemme den oprindelige bestand RNA-koncentration multipliceres c med fortyndingsfaktoren.
        BEMÆRK: Valgfrit pausepunkt: RNA'et kan opbevares ved -20 °C i et par måneder.
  4. Udførelse af en in vitro Analyse af pladelæserkinetik
    1. Konfigurer RNA-renatureringsprogrammet: Opret følgende termocykliske protokol ved at vælge Opret nyt program > Tilføj ny fase > Tilføj nyt trin flere gange for at tilføje hvert af følgende trin, før du trykker på Gem:
      70 °C i 3 min
      65 °C for 45 s
      60 °C for 45 s
      55 °C i 45 s
      50 °C for 45 s
      45 °C for 45 s
      40 °C i 45 s
      35 °C i 45 s
      30 °C for 45 s
    2. Renature RNA: For at renaturere Spinat2 og Broccoli RNA'er skal du forberede 2 μM-lagre af hvert RNA i ddH 2Oi et 0,5 ml tyndvægget PCR-rør og derefter tilføje et lige volumen af 2x renaturationsbuffer (80 mM HEPES, pH 7,5 [KOH], 250 mM KCl, 6 mM MgCl2) for at fremstille 1 μM RNA-opløsninger. Føj rørene til termocyklisten, åbn det gemte renatureringsprogram, og tryk på Kør.
      BEMÆRK: Hvis en termocykler ikke er tilgængelig, kan RNA'erne i stedet inkuberes på en 70 ° C varmeblok i 3 minutter og derefter afkøles langsomt til RT på bænken.
    3. Forbered bindingsreaktionsbufferen: For at forberede bufferen til en aptamer-dye-bindingsreaktion fremstilles en masterblanding indeholdende bufferkomponenter (69,5 μL ddH2O + 4 μL af 1 M HEPES, pH 7,5 [KOH] + 6,2 μL af 2 M KCl + 0,3 μL af 1 M MgCl2). Afhængigt af hvor mange prøver og replikater der er behov for, skal du gange disse værdier med antallet af prøver plus en. Generelt er tre replikater pr. RNA-prøve tilfredsstillende.
    4. Forbered pladelæseren.
      1. Indstil pladelæserinjektorprogrammet: På fluorescenspladelæseren skal du vælge Temp og indstille den ønskede temperatur til 37 ° C, og sørg for, at temperaturen er afbalanceret til denne værdi i god tid, før du starter kinetiske eksperimenter. Åbn pladelæsersoftwaren, vælg Indstillinger > anskaffelsesvisning, og indtast følgende program til kinetiske målinger:
        Løkke: For hver brønd
        Indstilling af oprindelig plan: 60 oprindelige læsninger
        SmartInject-indstillinger: 10 μL injektion (som vil ske efter baseline læser)
        Fluorescens (eller FL) lyder:
        Excitering: 448 nm (båndbredde: 9 nm)
        Emission: 506 nm (båndbredde: 15 nm)
        Patron: MONO (s/n 3297)
        Timing:
        Samlet læsetid: 10 min
        Læseinterval: 0,5 sek.
        PMT og Optik: 6 blink pr. læsning
        Løkke: Næste godt
      2. Forbered injektoren
        1. Vask og opsug injektoren: For at forberede pladelæserinjektoren skal du først vælge Injicer på pladelæseren, levere en affaldsopsamlingsplade til pladelæseren, når den er anvist, og derefter vælge Vask, og rengør injektionsrøret ved at følge instruktionerne på pladelæseren med 1 ml volumener af ddH 2 O, 75% ethanol i ddH2O, og derefter ddH2O. Vælg derefter Aspirat, så injektoren kan skubbe overskydende væske ud.
        2. Prime injektoren: Når du er gået ud til den forrige skærm, skal du vælge Prime for at prime injektoren med to 260 μL volumener ligand, der skal injiceres for at sikre, at ren, koncentreret ligand tilsættes til prøver under eksperimenter - i dette tilfælde prime med 100 μM DFHBI i ddH2O.
    5. Udfør in vitro-kinetikeksperimenter : For at udføre et kinetikeksperiment tilsættes først 80 μL tidligere forberedt bindende buffermasterblanding til en brønd af en 96-brønds klarbundplade efterfulgt af 10 μL renatureret RNA. Denne plade og DFHBI-opløsningen i injektoren kan ækvilibreres til 37 °C i 15 minutter i pladelæseren.
    6. I pladelæsersoftwaren Indstillinger under Læseområde skal du vælge den brønd, der skal analyseres, og derefter under fanen Hjem vælge Kør for at udføre det tidligere beskrevne kinetikprogram. Gentag denne proces, indtil alle eksperimenterne er færdige.
      BEMÆRK: Kritisk skal kinetikeksperimenter udføres en brønd ad gangen for at sikre, at RNA-kinetikken måles under identiske forhold mellem replikater og prøver.
    7. Injektoren vaskes: For at fjerne den resterende DFHBI-opløsning fra injektionsrøret vaskes injektionsrøret som beskrevet i trin 1.4.4.2.1 med 1 ml volumener af ddH2O, 75% ethanol i ddH 2 O og derefterddH2O.
      BEMÆRK: Valgfrit pausepunkt.
  5. Analyse af in vitro-kinetikken af fluorogene RNA-aptamerer.
    1. Indtast data i analysesoftwaren: Eksporter eksperimentelle data som et regneark for nemt at kopiere dataene til behandling. I analysesoftwaren skal du oprette en ny datatabel i XY-format. I kolonnen X skal du indtaste hvert læsetidspunkt, hvor t = 0 er tidspunktet for DFHBI-injektion. I kolonnen Y skal du indtaste de gennemsnitlige fluorescensværdier mellem replikater på det respektive tidspunkt startende ved t = 0.
    2. Normaliser og graf dataene: For at normalisere fluorescensværdierne skal du klikke på Analyser > databehandling > normaliser og derefter klikke på OK. Vælg at bruge de mindste og største værdier i datasættet til normalisering, til at præsentere resultater som brøker og til Graph the Results, og klik derefter på OK. Hvis du vil oprette en graf over den normaliserede gennemsnitlige fluorescens over tid, skal du klikke på ikonet Normaliser af [Datasætnavn] og vælge Graffamilie: XY kun med punkter.
      BEMÆRK: Fejllinjer kan være nyttige at se i tilfælde, hvor et lille antal tidspunkter er graferet. Hvis disse ønskes, skal du vælge indstillingen under "Y" for at indtaste replikatværdier i side om side-kolonner, når du vælger en XY-formatdatatabel. Grafering af den resulterende tabel med de valgte standardindstillinger vil producere en graf med fejllinjer.
    3. Udfør kurvetilpasning for at opnå kinetiske parametre: For at tilpasse en kurve til kinetikdataene skal du klikke på Analyser > analysere data og vælge Ikke-lineær regression (kurvetilpasning) under fanen XY-analyser . Under fanen Model skal du klikke på Eksponentiel > tofaseforening for at tilpasse kinetikdataene med følgende tofasede associeringsligning:
      Equation 2
      hvor Y er fluorescensen på tidspunktet X, Y 0 er fluorescensen ved t = 0, K Fast og K Slow er henholdsvis hurtige og langsomme hastighedskonstanter, og SpanFast og SpanSlow er intervallerne for fluorescens-tænding, der forklares af henholdsvis de hurtige og langsomme hastigheder (se repræsentative resultater, figur 1). Klik på fanen Nonlin Fit for at se hastighedskonstanter, t1/2 værdier og PercentFast værdier.
      BEMÆRK: For at opnå en standardafvigelse for alle disse værdier kan individuelle pladelæsereksperimentreplikater behandles på samme måde som beskrevet ovenfor.

2. Eksperiment med cellulær kinetik

  1. Fremstilling af E. coli-stammer
    1. Transform BL21 Star (DE3) E. coli-celler med ~ 100 ng pET31b tRNA-spinat2-konstruktion efter producentens protokol.
      BEMÆRK: Plasmidkonstruktion er kommercielt tilgængelig (Plasmid #79783).
    2. Cellerne hældes på LB-agar indeholdende carbenicillinplader (Carb: 50 mg/ml), og der inkuberes ved 37 °C i 12-16 timer. Celler indeholdende plasmider vil vokse som kolonier på pladen.
      BEMÆRK: Valgfrit pausepunkt: Transformerede BL21-stjerneceller på plader kan opbevares ved 4 °C indpakket i parafilm i 1 uge.
  2. Dyrkning af celler og inducering af ekspression af fluorogen RNA-aptamer
    1. Der podes en 2 ml kultur af ikke-inducerende medier (NI) indeholdende carbenicillin (Carb: 50 mg/ml) med en enkelt koloni af de transformerede BL21-stjerneceller. Gentag dette for mindst tre biologiske replikater. Inkuber kulturerne ved 37 °C i en inkubator/shaker ved 250 o/min i 22-24 timer.
      BEMÆRK: Valgfrit pausepunkt: Celler dyrket i NI-medier bevarer plasmidet og kan opbevares ved 4 ° C i 1 uge.
    2. Efter vækst i NI-medier fortyndes kulturen 100x til en frisk 3 ml ZYP-5052 autoinduktionsmedie (AI) indeholdende carbenicillin (Carb: 50 mg / ml). Cellerne vokser ved 37 °C i en inkubator/shaker ved 250 o / min i 16-18 timer for at fremkalde ekspression.
      BEMÆRK: Den typiske OD600 for kulturer vil variere fra 2,0-3,3 efter 18 timers vækst. Det optimale celletæthedsområde er mellem 2,5-3,0.
  3. Udførelse af det cellulære kinetikeksperiment
    1. Indstil flowcytometeret.
      1. Tænd for flowcytometeret og computeren, der er tilsluttet instrumentet. Når du er logget ind på softwaren til flowcytometeret, skal du klikke på startikonet under fanen Instrument. Følg de trin, der er angivet på softwareskærmen for at sikre korrekt initialisering af instrumentering.
        BEMÆRK: Nogle flowcytometre kalder instrumentets opstartssekvens Priming. Sørg for at følge producentens protokol for flowcytometeret, der vil være i brug til eksperimentet.
      2. Kør en præstationstest (hvis relevant). Under fanen Hovedmenu skal du klikke på Performance Test. I et kulturrør tilsættes tre dråber af producentens præstationssporingsperler i 3 ml fokuseringsvæske.
      3. Anbring kulturrøret i prøverørløfteren, og hæv løfteren. Før du klikker på Kør præstationstest, skal du sørge for, at lot # i røret på sporingsperlerne er det samme som det, der er angivet på skærmen Performance Test Setup . Klik på Effektivitetstest for at køre testen.
      4. Konfigurer flowcytometersoftwaren til dette eksperiment med følgende anskaffelsesparametre for enkeltcellefluorescens:
        Excitation Laser: 488 nm
        Emissionskanal: GFP (også kaldet FITC)
        Anskaffelsesvolumen: 40 μL (med et samlet trækvolumen på 90 μL)
        Strømningshastighed: 200 μL/ min
        Celletal for hver måling: 30.000
        Instrumentindstillinger:
        Spænding:
        FSC: 480 V
        SSC: 400 V
        BL1: 540 V
        BL2: 392 V
        BL3: 422 V
    2. Konfigurer de eksperimentelle filer.
      1. Opret en ny eksperimentfil under fanen Eksperimentstifinder ved at højreklikke på flowcytometerbrugernavnet. Vælg Nyt eksperiment i rullemenuen. Når et nyt vindue på computerskærmen dukker op, skal du vælge OK.
      2. I den nye eksperimentfil skal du højreklikke på mappen "Gruppe" og vælge Tilføj nyt prøverør. Mærk prøverørene for hvert bestemt tidspunkt, og repliker ved at højreklikke på Prøve og vælge Omdøb i rullemenuen. Gentag dette trin for det samlede antal replikater og tidspunkter for det planlagte tidsforløb for undersøgelsen.
    3. Forbered en fortyndet celleopløsning: I et nyt dyrkningsrør tilsættes 1,5 ml 1x PBS-opløsning. Derefter tilsættes 3 μL inducerede celler i AI-medier til 1x PBS-opløsningen for at fremstille en fortyndet celleopløsning. Gentag dette trin for hver biologisk replikat i forskellige kulturrør.
    4. Mål cellernes baggrundsfluorescens: Før du tilføjer farvestof, skal du tage aflæsninger af hvert biologisk replikatkulturrør indeholdende celler i 1x PBS-opløsning. Dette er således, at cellernes fluorescerende baggrund måles for at observere folden tændes over tid, når farvestoffet er tilsat.
      1. For at tage en aflæsning skal du placere kulturrøret i prøverørløfteren og løfte løfteren i hånden til prøveinjektionsnålen. Vælg den korrekte eksempelfil under fanen Samlingspanel , og klik på Optag.
      2. Når kørslen er afsluttet, skal du sænke prøverørløfteren med kulturrøret i hånden. Dette vil starte et skylletrin , der skyller det fluidiske system og minimerer overførsel mellem hver biologisk replikatprøve. Dataene gemmes automatisk på computeren, når kørslen er afsluttet.
      3. Gentag trinnene i punkt 2.3.4 for at måle den cellulære fluorescerende baggrund for mindst tre biologiske replikater. Hvis du vil flytte til den næste eksempelfil, skal du vælge den næste eksempelfil ved at klikke på højre pileikon nær navnet på prøverøret under ikonet Optag .
    5. Mål fluorescens på tidspunkter for celler med farvestof.
      1. Der tilsættes 1,4 μL koncentreret farvestof (50 mM DFHBI-1T i DMSO) i 1x PBS-opløsning med celler for at give en endelig koncentration på 50 μM DFBHI-1T. Fastgør derefter kulturrørets låg, og inverter derefter kulturrør 3x-5x for at blande opløsningen jævnt, før du tager første gangs punktaflæsning.
        BEMÆRK: Den samlede procentdel af DMSO i dyrkningsrørene til E. coli bør ikke overstige 10%, da dette kan påvirke cellelevedygtigheden16.
      2. Fjern låget, og læg kulturrøret i prøverørløfteren. Løft holderen i hånden til prøveinjektionsnålen, og klik på ikonet Optag under den korrekte prøvefil. Start desuden en timer ved at trykke på Start for eksperimentet.
      3. Sænk rørløfteren manuelt, efter at kørslen er afsluttet, og gentag trin 2.3.5.1-2.3.5.2. (med timeren kørende) ved at tilføje 1,4 μL af den koncentrerede DFHBI-1T, invertere kulturrørene og tage aflæsninger for alle de resterende biologiske replikater. Disse første optagelser vil være de aflæsninger, der opnås ved 0 min for alle de biologiske replikater. Gør dette en ad gangen for hver biologisk replikat.
        BEMÆRK: Noter det tidspunkt, hvor record flow cytometri erhvervelse trykkes. Overhold denne tid svimlende for tidspunkter i løbet af eksperimentet.
      4. Fortsæt med at foretage aflæsninger ved at hæve kulturrørene i prøverørløfteren til prøveinjektionsnålen, vælge den korrekte prøvefil, klikke på Optag og sænke løfteren manuelt, når hver kørsel er afsluttet. Gør dette for alle de ekstra tidspunkter og biologiske replikater, der testes. Gentag trinnene, indtil eksperimentet er fuldført.
        BEMÆRK: Hold prøverne ude af lys for at undgå fotoblegning af DFHBI-1T i opløsning ved at dække prøverne med aluminiumsfolie.
    6. Mål fluorescens på tidspunkter for celler uden farvestof (Kontrol).
      1. Kør de relevante rengøringsprotokoller for flowcytometeret, før eksperimentet gentages igen med negative kontroller efter producentens protokol. Dette gøres for at minimere enhver overførsel fra det forrige eksperiment til kontroltidspunktsanalyseeksperimentet. Nedenfor er de trin, der følges for flowcytometeret mellem eksperimenter:
        1. Placer et tomt kulturrør i rørløfteren i hånden, løft rørholderen, og klik på ikonet Fjern klog under fanen Instrument . Dette vil køre en backflush i fluidics-systemet for at rydde op i eventuelle klæbrige prøver. Sænk rørholderen manuelt, og fjern røret, når Unclog-sekvensen er færdig.
        2. Med et nyt dyrkningsrør tilsættes 3 ml af en 10% blegemiddelopløsning, kulturrøret placeres i rørholderen, og holder løftes manuelt til prøveinjektionsnålen. Derudover placeres en ren 96-brøndplade i autosampleren, hvis det er relevant for flowcytometeret.
        3. Klik på ikonet Sanitize SIP / Sanitize Autosampler for at køre en rengøringssekvens med 10% blegemiddel i hele fluidics-systemet. Sænk rørholderen for at fuldføre rengøringssekvensen.
      2. Indstil eksempelfilerne til kontroltidspunktanalysekørslen ved at følge anvisningerne i trin 2.3.3.
      3. I et nyt dyrkningsrør fremstilles en fortyndet celleopløsning i 1,5 ml 1x PBS-opløsning. Tilsæt 3 μL af de inducerede celler i AI-medier i 1x PBS-opløsningen for at fremstille en fortyndet celleopløsning. Gentag dette trin for hver biologisk replikat.
      4. Der tilsættes 1,4 μL DMSO i dyrkningsrøret en ad gangen til 1x PBS-opløsningen med celler og testes på de samme tidspunkter. Fastgør kulturrørets låg, og inverter derefter kulturrørene 3x-5x for at blande opløsningen jævnt, før du tager første gangs punktaflæsning. Gør dette en ad gangen for hver biologisk replikat.
      5. Følg den samme protokol til analyse af kontrolceller som for celler med farvestof ved hjælp af trin 2.3.5.2-2.3.5.4.
    7. Luk flowcytometeret: Følg producentens protokol for korrekt nedlukning af instrumenteringen. For flowcytometeret er instrumentet forberedt til nedlukning på følgende måde:
      1. Den indledende rengøringsprotokol for flowcytometeret udføres ved at følge trin 2.3.6.1.1-2.3.6.1.3.
      2. Udskift kulturrøret med 10% blegemiddelopløsning med et kulturrør med 3 ml fokuseringsvæske. Løft rørholderen manuelt, og klik på rullemenuen under ikonet Shutdown og vælg Thorough.
        BEMÆRK: Valgfrit pausepunkt.
  4. Analyse af flowcytometridata
    1. Eksporter alle FCS-filer til analyse. Åbn FCS-filerne med en flowcytometrianalysesoftware.
    2. Brug en af FCS-filerne kun til celler til at generere en port fra det fremadrettede scatter (FSC) og sidespredningsplottet (FSC-område/SSC-område) ved hjælp af begge logakser til at udelukke signaler fra snavs. For at oprette denne port skal du klikke på AutoGate-ikonet på flowcytometrianalysesoftwaren og navngive den Gate 1. Anvend den samme port på alle de testede prøver under fanen Alle prøver i databehandlingsarbejdsområdet. Dette vil resultere i, at Gate 1 under alle FCS-filer behandles.
    3. Opret en ny undersætfil med cellen kun FCS-filen, der blev brugt i trin 2.4.2 ved at dobbeltklikke på den. Skift akseindstillingerne til FSC-Area/FSC-Height, hvor begge bruger logakser. Klik på AutoGate-ikonet på flowcytometrianalysesoftwaren for at generere en oval port og navngive den Gate 2. Anvend denne port som en delmængde under portsættet i trin 2.4.2 på alle de testede prøver. Dette vil resultere i, at alle prøverne har Gate 1 > Gate 2 tilknyttet hver FCS-fil.
    4. Opret en anden delmængdefil med begge porte indstillet i trin 2.4.2 og trin 2.4.3 anvendt ved at dobbeltklikke på Gate 2. Skift akseindstillingerne til FSC-Area/Histogram. Anvend denne histogramport som en delmængde på alle de testede prøver, hvilket resulterer i, at alle prøverne har Gate 1 > Gate 2 > Gate 2 tilknyttet hver FCS-fil.
      BEMÆRK: Histogrammerne kan omdøbes fra Gate 2 til Histogram for at hjælpe med at flytte histogrammerne ind i layoutvinduet samt for at skabe mere organisation med databehandlingen.
    5. Hvis du vil analysere værdierne for den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI), skal du åbne layoutvinduet. Klik og træk histogrammeportene for hvert tidspunkt ind i layoutvinduet.
    6. Udfør en statistisk analyse for "∑ Mean: BL1-A" (GFP) for hver testet prøve for at vise MFI-resultaterne i layoutvinduet.
    7. Beregn standardafvigelsen for MFI-værdierne pr. tidspunktsanalyse for mindst tre uafhængige biologiske replikater.
    8. Gem histogrammerne og MFI-værdierne for hvert tidspunkt ved at eksportere layoutvinduet som en PDF-fil.
      BEMÆRK: Valgfrit pausepunkt.
  5. Data om grafflowcytometri
    1. Åbn PDF-filen, der indeholder histogrammer og MFI-værdier for hvert tidspunkt. MFI-værdierne kopieres over i en dataanalysesoftware. I datagraferingssoftware skal du oprette en ny datatabel i XY-format.
      1. Vælg for at oprette en XY-tabel med følgende markeret:
        Datatabel: Angive eller importere data til en ny tabel
        Indstillinger:
        X: Forløbne tider
        Y: Indtast (tre til fire) replikerede værdier i side om side underkolonner
      2. Mærk på X-aksen alle tidspunkter for eksperimentet og kontrolkørslerne.
      3. I gruppe A skal MFI-værdierne for alle de biologiske replikater indtastes i hvert tidspunkt for fluorescensanalyse af cellerne med farvestoffet tilsat.
      4. I gruppe B skal du indtaste MFI-værdierne for alle de biologiske replikater i hvert tidspunkt for analyse af cellerne uden farvestof (DMSO) tilføjet.
      5. For at observere resultaterne skal du klikke på [Indsæt datasætnavn] under fanen Grafer . Dette viser datapunkterne som middel med fejlbjælker, der repræsenterer standardafvigelsen (s.d.) på hvert tidspunkt. X-aksen repræsenterer den forløbne tid, og Y-aksen repræsenterer MFI-værdierne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In vitro kinetik
Sekvenserne af DNA-skabeloner og primere, der købes som syntetiske oligonukleotider, er vist i tabel 2, og reagensopskrifterne er vist i supplerende fil 1. PCR-amplifikation bruges til at opskalere mængden af DNA-skabelon med T7-promotoren, hvilket er nødvendigt for den efterfølgende in vitro-transkription (IVT) reaktion. Derudover kan PCR-amplifikation bruges til to formål i samme reaktion: at generere Broccoli DNA-skabelonen i fuld længde ved primerudvidelse samt at opskalere DNA-skabelonen.

Efter IVT-reaktionen for at syntetisere RNA fjerner PAGE-oprensning uønskede afkortede transkripter, nedbrudte produkter og ikke-reagerede rNTP'er fra RNA-produktet i fuld længde. Denne type oprensning foretrækkes, fordi afkortede eller nedbrudte RNA'er vil forårsage unøjagtig bestemmelse af RNA-koncentrationer. Da nukleotidbaser absorberer UV-lys, kan RNA-bånd og rNTP'er på gelen visualiseres under UV som skygger mod en fluorescerende TLC-plade. Således kan bånd svarende til den korrekte produktstørrelse selektivt ekstraheres.

Den nærmeste nabometode overvurderer udryddelseskoefficienterne og dermed koncentrationerne af strukturerede RNA'er, da den ikke tager højde for hypokromicitet på grund af baseparring17. For at bestemme nøjagtige RNA-koncentrationer blev der derfor udført neutrale pH-termiske hydrolyseassays for at hydrolysere RNA'et til individuelle NMP'er18. Den nøjagtige udryddelseskoefficient blev beregnet som en sum af ekstinktionskoefficienterne for NMP'er i RNA-sekvensen.

Kinetikken af DFHBI-binding til spinat2 og broccoli blev bestemt ved hjælp af et pladelæserassay. RNA blev først renatureret for at sikre, at det ville være i den korrekte konformation for farvebinding. Reaktionsbetingelserne for pladelæserkinetikassayet bestod af 40 mM HEPES, pH 7,5 (KOH), 125 mM KCl, 3 mM MgCl2, 100 nM renatureret RNA og 10 μM DFHBI, og reaktionen blev målt ved 37 °C. Denne temperatur og koncentration af MgCl2 blev valgt til at efterligne fysiologiske tilstande19, selvom betingelser på 28 °C og 10 mM MgCl2også kan anvendes til forbedret aptamerfoldning.

Både fluorogene aptamere Spinat2 og Broccoli viser tofaset associeringskinetik til binding til DFHBI-farvestoffet (figur 2). Kinetikdataene passede bedre ved tofaset forening end enfaset association for begge aptamerer (supplerende figur 1). Hastighedskonstanterne og t1/2-værdierne for de hurtige og langsomme foreninger blev bestemt af den bedst egnede kurve (tabel 3). PercentFast, som beskriver, hvor stor en procentdel af fluorescens-tændingsstørrelsen der skyldes den hurtigere DFHBI-bindende RNA-population, blev også bestemt.

Spinat2 i bindingskompetent tilstand viser hurtigere tænding end Broccoli (t 1/2 =1,2 s vs. 2,0 s). Den anden fase kinetik for begge aptamerer er ens (t1/2 = 180 s) og svarer sandsynligvis til et fælles hastighedsbegrænsende trin for en delpopulation af prøven (PercentFast = 68% og 60% for henholdsvis Spinat2 og Broccoli). Samlet set viser disse resultater, at godt foldede spinat2- og broccoli-aptamerer udviser meget hurtig tændskinetik med den indledende halvmaksimale tænding inden for 1-2 s efter farvetilsætning.

Cellulær kinetik
Sekvenserne af DNA-konstruktionerne, som klones ind i pET31b-plasmidet, er vist i tabel 2, og reagensopskrifter er vist i supplerende fil 1. DNA-konstruktionerne af fluorogene RNA-aptamerer er typisk indeholdt i et tRNA-stillads til cellulære eksperimenter. BL21 Star (DE3) E. coli-stammen er en ekspressionsstamme med en mutation i RNase E, der øger RNA-stabiliteten.

Fluorescenstidsmålingerne blev registreret hvert 5. minut i de første 45 minutter, efterfulgt af aflæsninger ved 1 time, 1,5 timer og 2 timer, hvilket gav i alt 12 tidspunkter plus celleaflæsningen. Da det korteste tidsinterval var 5 minutter, var det tilladt at måle flere biologiske replikater på hvert tidspunkt med regelmæssig afstand mellem replikatmålingerne på 30 s til 1 min. Det samlede volumen af celler fortyndet i 1x PBS-opløsning, der blev anvendt til tidsforløbsforsøget, var 1,5 ml.

Cellerne blev indhegnet, inden den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) blev bestemt for populationen af enkeltceller. Gating vælger et område på spredningsplottet for at bestemme den cellepopulation, der skal analyseres. Denne proces forhindrer, at snavs eller multipletaflæsninger medtages i analysen. For den viste flowcytometrianalyse blev der registreret 30.000 hændelser, hvilket resulterede i 10.000-20.000 hændelser analyseret efter gating.

Den cellulære fluorescenskinetik er en funktion af både farvestofdiffusion i E. coli og farvestofbindende kinetik til RNA-aptameren i det cellulære miljø (figur 1B). For celler, der udtrykker spinat2-tRNA, blev det observeret, at den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) stiger øjeblikkeligt ved "0" -tidspunktet på grund af den korte tidsforsinkelse (i sekunder) mellem farvestoftilsætning og prøveanalyse (figur 3A). Desuden har cellulær fluorescens allerede nået sin maksimale ækvivalente MFI-værdi (40.441 ± 990) ved det første punkt på 5 min. I modsætning hertil viser kontrolceller lav baggrundsfluorescens (416) og ingen ændring i MFI-værdi med DMSO-tilføjelse (figur 3B). En sammenligning mellem celler med farvestof og celler uden farvestof afslører, at fluorescensaktivering er 98 gange ± 2 i celler. Samlet set viser disse resultater, at spinat2-tRNA udtrykt i E. coli-celler udviser hurtig tændskinetik med maksimal tænding inden for mindre end 5 minutters farvestoftilsætning.

Figure 1
Figur 1: Skematisk fluorescensaktivering. Fluorescensaktivering sker på RNA-aptamer, der binder til farvestofmolekyler (A) in vitro og (B) i celler. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: In vitro-kinetik af de fluorogene aptamerer. Repræsentativ in vitro-kinetik af de fluorogene aptamerer (A,B) Spinat2 eller (C,D) Broccoli modelleret ved tofaset association, hvor t = 0 s er tidspunktet for DFHBI-tilsætning (endelig DFHBI-koncentration: 10 μM). Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer. Alle fejllinjer repræsenterer standardafvigelser fra gennemsnittet. Fra pasformen blev t1/2 værdier opnået for både de hurtige og langsomme associeringsreaktionskomponenter. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Repræsentativ cellulær kinetik af spinat2 i et tRNA-stillads . (A) Tidspunktsanalyse af tRNA-spinat2-farvestofoptagelse i løbet af 2 timer. En celle-kun baseline blev taget før tilføjelse i DFHIB-1T eller DMSO. Tidspunkter blev taget hvert 5. minut i de første 45 minutter, efterfulgt af en tidspunktsaflæsning på 1 time, 1,5 time og 2 timer. Pilen repræsenterer, hvornår DFHBI-1T eller DMSO blev tilsat til 1x PBS-opløsning med BL21-stjerneceller. Den endelige koncentration af DFHBI-1T til analyse er 50 μM. Til DMSO-kontrollen var tilsætningen af DMSO på et lige volumen (1,4 μL), der blev anvendt til DFHBI-1T-farvestoftilsætning. (B) Et nærbillede af DMSO-kontroltidspunktsanalysen med BL21-stjerne E. coli-celler. Gennemsnitlig fluorescensintensitet (MFI) angiver den samlede fluorescerende aflæsning af BL21-stjerneceller med farvestof eller DMSO. Data repræsenterer den gennemsnitlige ± standardafvigelse for tre biologiske replikater. Klik her for at se en større version af denne figur.

Aptamer-farvestof par Længde (nt) Max abs (nm) Maks. em (nm) Udryddelseskoefficient (M-1· cm-1) Kvanteudbytte Lysstyrke Kd (nm) Tm (°C) Henvisning
Spinat2-DFHBI 95 445 501 26100 0.7 63 1450 37 4
Spinat2-DFHBI-1T 95 482 505 31000 0.94 100 560 37 13, 14
Broccoli-DFHBI-1T 49 472 507 29600 0.94 96 360 48 13

Tabel 1: Tidligere offentliggjorte fotofysiske og biokemiske egenskaber af spinat2-DFHBI4, spinat2-DFHBI-1T 13,14 og Broccoli-DFHBI-1T 13.

Spinat2 + T7 promotor 5'-CGATCCCGGAAATTAATACGACTCACTATAGGATGTAACTGAATGAAATGGTGAA
GGACGGGTCCAGTAGGCTGCTTCGGCAGCCTACTTGTTGAGTAGAGTGAGCTCC
GTAACTAGTTACATC-3'
Broccoli + T7 promotor 5'-CGATCCCGGAAATTAATACGACTCACTATAGgagacggtcgg
gtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgggctc-3'
tRNA-spinat2 konstruktion (i pET31b plasmid) 5'-CGATCCCGGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGCCCGGATAGCTCAGTCGGT
AGAGCAGCGGCCGGATGTAACTGAATGAAATGGTGAAGGACGGGTCCAGTAGGCT
GCTTCGGCAGCCTACTTGTTGAGTAGAGTGAGCTCCGTAACTAGTTACATCCGG
CCGCGGGTCCAGGGTTCAAGTCCCTGTTCGGGCGCCA
TAGCATAACCCCTTGGGGTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTTTG-3'
Spinat2 Fremad Primer 5'-CGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAG-3'
Spinat2 omvendt primer 5'-GATGTAACTAGTTACGGAGC-3'
Broccoli Fremad Primer 5'-CGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGgagacggtcgggtccagatattcgtatctg-3'
Broccoli omvendt primer 5'-gagcccacactactcgacagatacgaatctggacccgaccgtctc-3'

Tabel 2: DNA-sekvenstabel indeholdende DNA-sekvenser og primere, der anvendes til in vitro - og cellulære kinetikundersøgelser. Fed= T7 promotor; Understreget = tRNA-stillads; hætter = spinat2; små bogstaver = Broccoli; Fed kursiv = T7 terminator.

Aptamer Hurtig t1/2 (s) Langsom t1/2 (s) KHurtig (s-1) KLangsom (s-1) Procent hurtigt
Spinat2 1.2 ± 0,2 180 ± 10 0,56 ± 0,07 0,0039 ± 0,0002 68 ± 5
Broccoli 2.0 ± 0,2 180 ± 30 0,35 ± 0,05 0,0039 ± 0,0006 60 ± 3

Tabel 3: In vitro-kinetikværdier for spinat2- og broccoli-aptamerer afledt af tilpassede data. Dataene rapporteres som middelværdien ± standardafvigelsen for tre replikater.

Supplerende figur 1: Repræsentativ in vitro-kinetik af de fluorogene aptamerer. Repræsentativ in vitro-kinetik af de fluorogene aptamerer (A,C) Spinat2 eller (B,D) Broccoli modelleret efter enfaset association ved (A,B) 600 s eller (C,D) 20 s måletider, med pile, der angiver tidspunktet for DFHBI-tilsætning (endelig DFHBI-koncentration: 10 μM). Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer. Samlet set passer disse data mindre godt til en enfaset associeringsmodel end en tofaset associeringsmodel, når fluorescenssignalet overvåges i længere tid. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 1: Opskrifter på in vitro kinetikforsøg. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For in vitro-kinetikeksperimentet kan den samme generelle protokol modificeres til at måle in vitro-kinetikken af en RNA-baseret fluorescerende biosensor, der indeholder både et ligandbindende og fluorophorebindende domæne8. I dette tilfælde skal RNA'et inkuberes med fluoroforen inden målinger ved injektion af liganden for at opnå ligandresponskinetik. Hvis der observeres høj variabilitet mellem replikaterne, kan man fejlfinde ved at kontrollere, at hver prøve får lov til at balancere i samme tid i 96-brøndspladen før måling. Hver prøve eller replikat skal fremstilles individuelt i en brønd og måles lige efter 15 minutters ækvilibreringstrinnet i stedet for at forberede alle prøver på én gang.

For det cellulære kinetikeksperiment kan protokollen ændres til kortere eller længere tidsforløb, men det er vigtigt at planlægge antallet af biologiske replikater og justere det nødvendige celleopløsningsvolumen. Det anbefales at placere hver biologisk replikataflæsning mellem 30 s og 1 minut for at have tilstrækkelig tid til at udføre trinene omhyggeligt. En anden modifikation er at teste et andet fluorogent farvestof, der ikke binder RNA-aptameren som en alternativ negativ kontrol, som ikke bør vise fluorescensaktivering over baggrunden. Hvis der observeres inkonsekvente resultater, kan man fejlfinde ved at kontrollere, at flowcytometeret rengøres korrekt efter producentens protokol mellem forskellige eksperimentelle kørsler for at forhindre blødning af celler eller farvestoffer fra den forrige kørsel til den næste.

Mens den præsenterede in vitro-metode er nyttig til sammenligning af kinetikken mellem fluorogene aptamerer eller RNA-baserede fluorogene biosensorer, kan de opnåede kinetiske værdier ændre sig afhængigt af temperaturen, magnesiumkoncentrationen eller andre anvendte bufferkomponenter. Mens denne metode giver veldefinerede betingelser, der tidligere er blevet brugt til at karakterisere forskellige fluorogene RNA-systemer, kan det intracellulære miljø ikke være perfekt repræsenteret på grund af tilstedeværelsen af andre biologiske makromolekyler.

Mens fluorescenspladelæseren udstyret med en programmerbar injektor ikke har nogen død tid til dataindsamling, har flowcytometerinstrumentet begrænset tidsmæssig nøjagtighed på grund af observerbar dødtid. Der er en ~ 5 s forsinkelse mellem, når der klikkes på knappen "Optag", og når dataindsamling starter. En yderligere ~ 5 s forsinkelse opstår for instrumentet til at måle 30.000 begivenheder; denne prøveoptagelsestid vil variere lidt afhængigt af, hvor fortyndet cellerne er i 1x PBS.

En anden potentiel begrænsning for cellulære eksperimenter er cellelevedygtigheden i 1x PBS. Ved længere tidsanalyser kan cellelevedygtighed kontrolleres ved hjælp af propidiumiodid til at plette døde celler20. Farveaggregation kan også begrænse nøjagtigheden af fluorescensmålinger foretaget af flowcytometeret. Farvestoffer med meget begrænset opløselighed i vandige opløsninger kan aggregeres og fremstå som partikler, der er store nok til at blive talt som celler på flowcytometeret. Det er derfor vigtigt at køre farvestof-kun eksperimentelle kontroller for at kontrollere for aggregater i det lukkede område.

Tidligere blev det vist, at Broccoli har sammenlignelig lysstyrke med spinat2 ved 1 mM Mg2 + in vitro, men Broccoli-tRNA udviser ~ to gange større fluorescensintensitet i levende E. coli sammenlignet med spinat2-tRNA13. Så vidt vi ved, er farvebindingskinetikken for Spinat2 og Broccoli fluorogene aptamere ikke blevet sammenlignet før og modelleret af en tofaset forening. De indledende hurtige hastighedskonstanter for begge RNA-aptamerer understøtter, at farvestofbindingslommen er forfoldet, og at der ikke er behov for strukturelle ændringer for at farvestoffet kan binde, hvilket er i overensstemmelse med røntgenkrystallografi og UV-smelteeksperimenter21,22. Den anden fase med en langsommere hastighedskonstant er ikke tidligere rapporteret, fordi andre eksperimenter såsom stop-flow og fluorescens levetidsmålinger analyserede spinataptameren i en kortere varighed (20 s og 300 s) 23,24. Den meget langsommere anden fase resulterer i en observeret bieksponentiel stigning i fluorescens, når data analyseres for 600 s. Dette langsomme trin kan tilskrives enten et hastighedsbegrænsende refoldingstrin fra en binding-inkompetent til bindingskompetent RNA-tilstand eller et hastighedsbegrænsende fotokonverteringstrin fra trans- til cis-former af det bundne farvestof. Sidstnævnte mekanisme blev tidligere modelleret til at give en bieksponentiel fluorescensprofil24 og understøttes af en nylig analyse af forskellen mellem absorptions- og excitationsspektre på den relaterede aptamer, Baby Spinat25. 

Den overordnede betydning af in vitro-resultaterne er, at de viser, at farvestofforening til den fluorogene RNA-aptamer ikke begrænser RNA-lokalisering i realtid og genekspressionsundersøgelser. For RNA-baserede fluorescerende biosensorer, der anvender Spinat2, svarer den målte tændskinetik til den anden fasekinetik, der måles her10 , fordi biosensorerne kræver et genfoldningstrin og derfor skal være tilstrækkeligt hurtige til at muliggøre næsten realtidssignalundersøgelser.

Det forventedes, at den cellulære kinetik ville være forskellig fra den observerede in vitro-kinetik for spinat2. En vigtig forskel er, at der er et ekstra trin af farvestofdiffusion i E. coli-cellerne , hvilket indebærer at krydse de ydre og indre membraner. Derudover udgør det cellulære miljø forskellige betingelser for farvestof-aptamer-foreningen med hensyn til molekylær trængsel, ionsammensætning og koncentrationer samt RNA- og farvestofkoncentrationer.

Den overordnede betydning af resultaterne er, at cellulær fluorescens når maksimalt signal på mindre end 5 minutter og forbliver stabil i mindst 2 timer, hvilket muliggør RNA-lokalisering i realtid og genekspressionsundersøgelser i dette tidsinterval. For en RNA-baseret biosensor, der anvender spinat2, viste vi tidligere, at et signifikant fluorescensrespons kunne observeres inden for 4-5 minutter efter ligandtilsætning, men at det tager længere tid at nå det maksimale signal (15-30 min)8. Samlet set indikerer disse fund, at farvestofdiffusion i celler ikke er det praktiske hastighedsbegrænsende trin for in vivo-eksperimenter med RNA-baserede biosensorer. Endelig kan denne eksperimentelle protokol anvendes til at analysere andre fluorogene RNA-systemer i celler.

De eksperimentelle protokoller, der præsenteres her, kan anvendes til at analysere andre fluorogene RNA-systemer. Ud over de to aptamerer, der blev analyseret i denne undersøgelse, Spinat2 og Broccoli, er der udviklet andre fluorogene RNA-systemer, der giver forskellige emissionsprofiler, forbedret fotostabilitet, strammere bindingsaffiniteter og evnen til at ændre fluorophorer (for nylig gennemgået1). Ud over deres fluorescensegenskaber er benchmarking af tændingskinetikken for disse systemer in vitro og i celler vigtig for at vurdere deres egnethed til forskellige cellebiologiske anvendelser. Resultaterne kan også understøtte strukturel forfoldning eller omarrangering af aptameren. Som diskuteret er disse protokoller med nogle ændringer også blevet anvendt til at analysere RNA-baserede biosensorer8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af følgende tilskud til MCH: NSF-BSF 1815508 og NIH R01 GM124589. MRM blev delvist støttet af uddannelsestilskud NIH T32 GM122740.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Thermo Fischer Scientific BP160500
Agarose gel electrophoresis equipment Thermo Fischer Scientific B1A-BP
Alpha D-(+)-lactose monohydrate Thermo Fischer Scientific 18-600-440
Amber 1.5 mL microcentrifuge tubes Thermo Fischer Scientific 22431021
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) Sigma-Aldrich A4418
Attune NxT Flow cytometer Thermo Fischer Scientific A24861
Attune 1x Focusing Fluid Thermo Fischer Scientific A24904
Attune Shutdown Solution Thermo Fischer Scientific A24975
Attune Performance Tracking Beads Thermo Fischer Scientific 4449754
Attune Wash Solution Thermo Fischer Scientific  J24974
Boric acid Sigma-Aldrich B6768
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
Carbenicillin disodium salt Sigma-Aldrich C3416
Chlorine Bleach Amazon B07J6FJR8D
Corning Costar 96-well plate Daigger Scientific EF86610A
Culture Tubes, 12 mm x 75 mm, 5 mL with attached dual position cap Globe Scientific 05-402-31
DFHBI Sigma-Aldrich SML1627
DFHBI-1T Sigma-Aldrich SML2697
D-Glucose (anhydrous) Acros Organics AC410955000
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich DTT-RO
DNA loading dye New England Biolabs B7025S
DNA LoBind Tubes (2.0 mL) Eppendorf 22431048
dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP New England Biolabs N0446S
EDTA, pH 8.0 Gibco, Life Technologies AM9260G
Ethanol (EtOH) Sigma-Aldrich E7023
Filter-tip micropipettor tips Thermo Fischer Scientific AM12635, AM12648, AM12655, AM12665
FlowJo Software BD Biosciences N/A FlowJo v10 Software
Fluorescent plate reader with heating control VWR 10014-924
Gel electrophoresis power supply Thermo Fischer Scientific EC3000XL2
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Glycogen AM95010 Thermo Fischer Scientific AM95010
GraphPad Prism Dotmatics N/A Analysis software from Academic Group License 
Heat block  Thomas Scientific 1159Z11
HEPES Sigma-Aldrich H-4034
Inorganic pyrophosphatase Sigma-Aldrich I1643-500UN
Low Molecular Weight DNA Ladder New England Biolabs N3233L Supplied with free vial of Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS (NEB #B7025).
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2) Sigma-Aldrich M2670
Magnesium sulfate (MgSO4) Fisher Scientific MFCD00011110
Microcentrifuge tubes (1.5 mL) Eppendorf 22363204
Microcentrifuge with temperature control Marshall Scientific EP-5415R
Micropipettors Gilson FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M
Micropipettor tips Sigma-Aldrich Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR
Millipore water filter with BioPak unit Sigma-Aldrich CDUFBI001, ZRQSVR3WW
Narrow micropipettor pipette tips DOT Scientific RN005R-LRS
PBS, 10x Thermo Fischer Scientific BP39920
PCR clean-up kit Qiagen 28181
PCR primers and templates Integrated DNA technologies
PCR thermocycler for thin-walled PCR tubes Bio-Rad 1851148
PCR thermocycler for 0.5 mL tubes Techne 5PRIME/C
pET31b-T7-Spinach2 Plasmid Addgene Plasmid #79783
Phusion High-Fidelity DNA polymerase  New England Biolabs M0530L Purchase of Phusion High-Fideldity Enzyme is supplied with 5x Phusion HF Buffer, 5x Phusion GC Buffer, and MgCl2 and DMSO solutions.
Polyacrylamide gel electrophoresis gel comb, C.B.S. Scientific C.B.S. Scientific VGC-1508
Polyacrylamide gel electrophoresis equipment C.B.S. Scientific ASG-250
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9333
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655
Razor blades Genesee Scientific 38-101
rNTPs: ATP, CTP, GTP, UTP New England Biolabs N0450L
SDS Sigma-Aldrich L3771
Short wave UV light source Thermo Fischer Scientific 11758221
Sodium carbonate (Na2CO3) Sigma-Aldrich S7795
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S8045
Sodium phosphate dibasic, anhydrous Thermo Fischer Scientific S375-500
SoftMax Pro Molecular Devices N/A SoftMax Pro 6.5.1 (platereader software) obtained through Academic Group License
Sterile filter units Thermo Fischer Scientific 09-741-88
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
SYBR Safe DNA gel stain Thermo Fischer Scientific S33102
TAE buffer for agarose gel electrophoresis Thermo Fischer Scientific AM9869
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
Tris base Sigma-Aldrich TRIS-RO
Tryptone (granulated) Thermo Fischer Scientific M0251S
T7 RNA polymerase New England Biolabs M0251S
Urea-PAGE Gel system  National Diagnostics EC-833
UV fluorescent TLC plate Sigma-Aldrich 1.05789.0001
UV/Vis spectrophotometer Thermo Fischer Scientific ND-8000-GL
Vortex mixer Thermo Fischer Scientific 2215415
Xylene cyanol Sigma-Aldrich X4126
Yeast Extract (Granulated) Thermo Fischer Scientific BP9727-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Su, Y., Hammond, M. C. RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of small molecules and RNAs. Current Opinion in Biotechnology. 63, 157-166 (2020).
  2. Zhang, J., et al. Tandem spinach array for mRNA Imaging in living bacterial cells. Scientific Reports. 5, 17295 (2015).
  3. Wang, Z., et al. In spatial complementation of aptamer-mediated recognition enables live-cell imaging of native RNA transcripts in real time. Angewandte Chemie. 57 (4), 972-976 (2018).
  4. Strack, R. L., Disney, M. D., Jaffrey, S. R. A superfolding Spinach2 reveals the dynamic nature of trinucleotide repeat-containing RNA. Nature Methods. 10 (12), 1219-1224 (2013).
  5. Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
  6. You, M., Litke, J. L., Jaffrey, S. R. Imaging metabolite dynamics in living cells using a Spinach-based riboswitch. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2756-2765 (2015).
  7. Kellenberger, C. A., Wilson, S. C., Sales-Lee, J., Hammond, M. C. RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of second messengers cyclic di-GMP and cyclic AMP-GMP. Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 4906-4909 (2013).
  8. Manna, S., Truong, J., Hammond, M. C. Guanidine biosensors enable comparison of cellular turn-on kinetics of riboswitch-based biosensor and reporter. ACS Synthetic Biology. 10 (3), 566-578 (2021).
  9. Bose, D., Su, Y., Marcus, A., Raulet, D. H., Hammond, M. C. An RNA-based fluorescent biosensor for high-throughput analysis of the cGAS-cGAMP-STING pathway. Cell Chemical Biology. 23 (12), 1539-1549 (2016).
  10. Wang, X. C., Wilson, S. C., Hammond, M. C. Next-generation RNA-based fluorescent biosensors enable anaerobic detection of cyclic di-GMP. Nucleic Acids Research. 44 (17), 139 (2016).
  11. Paige, J. S., Thinh, N. -D., Wenjiao, S., Jaffrey, S. R. Fluorescence imaging of cellular metabolites with RNA. Science. 335 (6073), 1194 (2012).
  12. Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333 (6042), 642-646 (2011).
  13. Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Jaffrey, S. R. Broccoli: Rapid selection of an RNA mimic of green fluorescent protein by fluorescence-based selection and directed evolution. Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).
  14. Song, W., Strack, R. L., Svensen, N., Jaffrey, S. R. Plug-and-play fluorophores extend the spectral properties of spinach. Journal of the American Chemical Society. 136 (4), 1198-1201 (2014).
  15. Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).
  16. Basch, H., Gadebusch, H. H. In vitro antimicrobial activity of dimethylsulfoxide. Applied Microbiology. 16 (12), 1953-1954 (1968).
  17. Kallansrud, G., Ward, B. A comparison of measured and calculated single- and double-stranded oligodeoxynucleotide extinction coefficients. Analytical Biochemistry. 236 (1), 134-138 (1996).
  18. Wilson, S. C., Cohen, D. T., Wang, X. C., Hammond, M. C. A neutral pH thermal hydrolysis method for quantification of structured RNAs. RNA. 20 (7), 1153-1160 (2014).
  19. Szatmári, D., et al. Intracellular ion concentrations and cation-dependent remodelling of bacterial MreB assemblies. Scientific Reports. 10, 12002 (2020).
  20. Boulos, L., Prévost, M., Barbeau, B., Coallier, J., Desjardins, R. LIVE/DEAD® BacLightTM: Application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking water. Journal of Microbiological Methods. 37 (1), 77-86 (1999).
  21. Huang, H., et al. A G-quadruplex-containing RNA activates fluorescence in a GFP-like fluorophore. Nature Chemical Biology. 10 (8), 686-691 (2014).
  22. Jeng, S. C. Y., Chan, H. H. Y., Booy, E. P., McKenna, S. A., Unrau, P. J. Fluorophore ligand binding and complex stabilization of the RNA Mango and RNA Spinach aptamers. RNA. 22 (12), 1884-1892 (2016).
  23. Han, K. Y., Leslie, B. J., Fei, J., Zhang, J., Ha, T. Understanding the photophysics of the Spinach-DFHBI RNA aptamer-fluorogen complex to improve live-cell RNA imaging. Journal of the American Chemical Society. 135 (50), 19033-19038 (2013).
  24. Wang, P., et al. Photochemical properties of Spinach and its use in selective imaging. Chemical Science. 4 (7), 2865-2873 (2013).
  25. Dao, N. T., et al. Photophysics of DFHBI bound to RNA aptamer Baby Spinach. Scientific Reports. 11, 7356 (2021).

Tags

Biokemi udgave 186 fluorescens flowcytometri pladelæser spinat2 aptamer broccoliaptamer E. coli
Bestemmelse af <em>in vitro</em> - og cellulær tændingskinetik til fluorogene RNA-aptamerer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mumbleau, M. M., Meyer, M. R.,… More

Mumbleau, M. M., Meyer, M. R., Hammond, M. C. Determination of In Vitro and Cellular Turn-on Kinetics for Fluorogenic RNA Aptamers. J. Vis. Exp. (186), e64367, doi:10.3791/64367 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter