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Biochemistry

फ्लोरोजेनिक आरएनए एपटामर के लिए इन विट्रो और सेलुलर टर्न-ऑन कैनेटीक्स का निर्धारण

Published: August 9, 2022 doi: 10.3791/64367
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Chemistry and Henry Eyring Center for Cell & Genome Science, University of Utah
* These authors contributed equally

Summary

प्रोटोकॉल फ्लोरोजेनिक आरएनए एपटामर पालक 2 और ब्रोकोली के कैनेटीक्स को निर्धारित करने के लिए दो तरीके प्रस्तुत करता है। पहली विधि बताती है कि प्लेट रीडर के साथ विट्रो में फ्लोरोजेनिक एपटामर कैनेटीक्स को कैसे मापा जाए, जबकि दूसरी विधि प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा कोशिकाओं में फ्लोरोजेनिक एपटामर कैनेटीक्स के माप का विवरण देती है।

Abstract

फ्लोरोजेनिक आरएनए एपटामर को जीवित कोशिकाओं में आरएनए को टैग करने और कल्पना करने, जीन अभिव्यक्ति पर रिपोर्ट करने और फ्लोरोसेंट बायोसेंसर को सक्रिय करने के लिए लागू किया गया है जो मेटाबोलाइट्स और सिग्नलिंग अणुओं के स्तर का पता लगाते हैं। इन प्रणालियों में से प्रत्येक में गतिशील परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए, वास्तविक समय माप प्राप्त करना वांछनीय है, लेकिन माप की सटीकता नमूना आवृत्ति की तुलना में फ्लोरोजेनिक प्रतिक्रिया के कैनेटीक्स पर निर्भर करती है। यहां, हम क्रमशः एक नमूना इंजेक्टर और एक प्रवाह साइटोमीटर से लैस प्लेट रीडर का उपयोग करके फ्लोरोजेनिक आरएनए एपटामर के लिए इन विट्रो और सेलुलर टर्न-ऑन कैनेटीक्स निर्धारित करने के तरीकों का वर्णन करते हैं। हम दिखाते हैं कि पालक 2 और ब्रोकोली एपटामर के प्रतिदीप्ति सक्रियण के लिए इन विट्रो कैनेटीक्स को दो-चरण एसोसिएशन प्रतिक्रियाओं के रूप में मॉडलिंग किया जा सकता है और क्रमशः 0.56 एस -1 और 0.35 एस -1 के अलग-अलग तेज चरण दर स्थिरांक हैं। इसके अलावा, हम दिखाते हैं कि एस्चेरिचिया कोलाई में पालक 2 के प्रतिदीप्ति सक्रियण के लिए सेलुलर कैनेटीक्स, जो ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया में डाई प्रसार द्वारा सीमित है, अभी भी मिनट टाइमस्केल पर सटीक नमूना आवृत्ति को सक्षम करने के लिए पर्याप्त रूप से तेज है। प्रतिदीप्ति सक्रियण कैनेटीक्स का विश्लेषण करने के लिए ये विधियां विकसित किए गए अन्य फ्लोरोजेनिक आरएनए एपटामर पर लागू होती हैं।

Introduction

फ्लोरोजेनिक प्रतिक्रियाएं रासायनिक प्रतिक्रियाएं हैं जो प्रतिदीप्ति संकेत उत्पन्न करती हैं। फ्लोरोजेनिक आरएनए एपटामर आमतौर पर अपनी प्रतिदीप्ति क्वांटम उपज (चित्रा 1 ए) 1 को बढ़ाने के लिए एक छोटे अणु डाई को बांधकर इस कार्य को करते हैं। विभिन्न फ्लोरोजेनिक आरएनए एपटामर सिस्टम विकसित किए गए हैं और इसमें विशिष्ट आरएनए एपटामर अनुक्रम और संबंधित डाई लिगेंड1 शामिल हैं। फ्लोरोजेनिक आरएनए एपटामर को फ्लोरोसेंट टैग के रूप में आरएनए टेप में जोड़ा गया है जो एमआरएनए और गैर-कोडिंग आरएनए 2,3,4 के लाइव सेल इमेजिंग को सक्षम करता है। उन्हें जीन अभिव्यक्ति के फ्लोरोसेंट रिपोर्टरों के रूप में प्रमोटर अनुक्रमों के बाद भी रखा गया है, जो एक रिपोर्टर के रूप में हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) के उपयोग के समान है, सिवाय इसके कि रिपोर्टिंग फ़ंक्शन आरएनए स्तर 5,6 पर है। अंत में, फ्लोरोजेनिक आरएनए एपटामर को आरएनए-आधारित फ्लोरोसेंट बायोसेंसर में शामिल किया गया है, जो एक विशिष्ट छोटे अणु के जवाब में फ्लोरोजेनिक प्रतिक्रिया को ट्रिगर करने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं। आरएनए-आधारित फ्लोरोसेंट बायोसेंसर को विभिन्न गैर-फ्लोरोसेंट मेटाबोलाइट्स और सिग्नलिंग अणुओं 7,8,9,10,11 के लाइव सेल इमेजिंग के लिए विकसित किया गया है।

आरएनए स्थानीयकरण, जीन अभिव्यक्ति और छोटे अणु संकेतों में गतिशील परिवर्तनों की कल्पना करने के लिए फ्लोरोजेनिक आरएनए एपटामर के विकास में रुचि बढ़ रही है। इन अनुप्रयोगों में से प्रत्येक के लिए, वास्तविक समय माप प्राप्त करना वांछनीय है, लेकिन माप की सटीकता फ्लोरोजेनिक प्रतिक्रिया के कैनेटीक्स पर निर्भर करती है जो नमूना आवृत्ति की तुलना में तेज है। यहां, हम एक नमूना इंजेक्टर से लैस प्लेट रीडर का उपयोग करके फ्लोरोजेनिक आरएनए एपटामर पालक 212 और ब्रोकोली13 के लिए इन विट्रो कैनेटीक्स निर्धारित करने के तरीकों का वर्णन करते हैं और प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करके एस्चेरिचिया कोलाई में व्यक्त पालक 2 के लिए सेलुलर टर्न-ऑन कैनेटीक्स निर्धारित करते हैं। इन दो आरएनए एपटामर को चुना गया था क्योंकि उन्हें आरएनए स्थानीयकरण 2,3,4 का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है, उनका उपयोग रिपोर्टर 5,6 और बायोसेंसर 7,8,9,10,11 में किया गया है, और संबंधित डाई लिगेंड (डीएफएचबीआई या डीएफएचबीआई -1 टी) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। साहित्य में निर्धारित उनके इन विट्रो गुणों का सारांश तालिका 14,13,14 में दिया गया है, जिसने प्रोटोकॉल विकास (जैसे, उपयोग किए गए तरंग दैर्ध्य और डाई सांद्रता) को सूचित किया। इन परिणामों से पता चलता है कि आरएनए एपटामर से प्रभावित फ्लोरोजेनिक प्रतिक्रियाएं तेजी से होती हैं और वांछित सेल जैविक अनुप्रयोगों के लिए सटीक माप में बाधा नहीं डालनी चाहिए।

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Protocol

1. इन विट्रो कैनेटीक्स प्रयोग

  1. पीसीआर द्वारा डीएनए टेम्प्लेट तैयार करना
    1. पीसीआर प्रतिक्रिया (ओं) को सेट करें: पीसीआर प्रतिक्रियाओं को तैयार करने के लिए, एक पतली दीवार वाले पीसीआर ट्यूब में निम्नलिखित अभिकर्मकों को मिलाएं:
      डबल-डिस्टिल्ड पानी का 33 μL (ddH2O)
      उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ के लिए 5x बफर का 10 μL
      2 mM का 5 μL प्रत्येक डीऑक्सीराइबोन्यूक्लियोसाइड ट्राइफॉस्फेट (dNTP)
      40 μM फॉरवर्ड प्राइमर का 0.5 μL
      40 μM रिवर्स प्राइमर का 0.5 μL
      डीएनए टेम्पलेट के 0.5 μL (10-100 ng) (केवल पालक 2 पीसीआर के लिए; ब्रोकोली प्राइमर ओवरलैप)
      उच्च-निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ का 0.5 μL (अंतिम जोड़ें)
      नोट: सिंथेटिक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को अक्सर सूखा भेज दिया जाता है। स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए, डीडीएच2ओ की एक ज्ञात मात्रा (100 μL अनुशंसित) जोड़ें, और बीयर के नियम द्वारा एकाग्रता निर्धारित करने के लिए उस समाधान के ए260 को मापें, जहां विलुप्त होने के गुणांक की गणना निकटतम-पड़ोसी नियमों द्वारा ऑनलाइन की जा सकती है। इस स्टॉक समाधान का उपयोग पीसीआर में उपयोग के लिए उपयुक्त कमजोर पड़ने के लिए किया जा सकता है।
    2. थर्मोसाइक्लर प्रोटोकॉल चलाएँ।
      1. पूर्ण लंबाई पालक 2 और ब्रोकोली डीएनए टेम्प्लेट को बढ़ाने के लिए निम्नलिखित थर्मोसाइक्लर प्रोटोकॉल का उपयोग करें:
        प्रारंभिक विकृतीकरण: 2 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस
        35 चक्र:
        विकृतीकरण: 15 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस विकृतीकरण
        एनीलिंग: 30 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस
        विस्तार: 30 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस
        अंतिम विस्तार: 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस।
      2. प्रतिक्रिया के बाद, वांछित डीएनए उत्पाद की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए कम आणविक भार सीढ़ी (आकार सीमा: 25-766 न्यूक्लियोटाइड) के साथ 2% अगारोस जेल द्वारा उत्पाद के एक छोटे से एलिकोट का विश्लेषण करें।
      3. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जेल निष्कर्षण या पीसीआर क्लीन-अप किट द्वारा उत्पाद को शुद्ध करें और डीडीएच2ओ या निर्माता द्वारा प्रदान किए गए बफर के साथ एल्यूट करें।
        नोट: पीसीआर क्लीन-अप किट चुनते समय सुनिश्चित करें कि कॉलम आणविक भार कटऑफ टी 7-ब्रोकोली (81 न्यूक्लियोटाइड) को बनाए रखने के लिए पर्याप्त कम है, अन्यथा पीसीआर उत्पाद खो जाएगा।
        नोट: वैकल्पिक विराम बिंदु: डीएनए को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन (आईवीटी) द्वारा पालक 2 और ब्रोकोली आरएनए की तैयारी
    1. प्रतिलेखन प्रतिक्रिया (ओं) को सेट करें।
      1. 100 μL प्रतिलेखन प्रतिक्रिया तैयार करने के लिए, निम्नलिखित अभिकर्मकों को 1.5 mL माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में संयोजित करें: 10x ट्रांसक्रिप्शन बफर का 10 μL + 10 mM राइबोन्यूक्लिओसाइड ट्राइफॉस्फेट्स (rNTPs) का 20 μL + 1-64 μL डीएनए टेम्पलेट (कुल 1 μg) + 2 μL अकार्बनिक पाइरोफॉस्फेट + ddH2O से 98 μL + 2 μL t7 RNA पोलीमरेज़ (अंतिम जोड़ें)।
      2. इस प्रतिक्रिया को 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। 20% सुक्रोज, 0.1% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस), 1x Tris-Borate-EDTA (1x TBE) बफर और ~ 18 M यूरिया से बना 2x यूरिया जेल लोडिंग बफर (2x ULB) के 100 μL जोड़कर प्रतिक्रिया को बुझाएं।
        नोट: वैकल्पिक विराम बिंदु: बुझी हुई प्रतिक्रिया को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (पेज) आरएनए का शुद्धिकरण
    1. पालक 2 और ब्रोकोली आरएनए का पृष्ठ शुद्धिकरण
      चेतावनी: गैर-बहुलक (तरल या पाउडर) एक्रिलामाइड बेहद विषाक्त है। यदि पाउडर एक्रिलामाइड का वजन किया जाता है, तो ऐसा फ्यूम हुड में करें। हमेशा उचित सुरक्षात्मक उपकरण पहनें और तुरंत एक्रिलामाइड पाउडर या घोल से दूषित दस्ताने हटा दें, हाथों को अच्छी तरह से धोएं। यदि एक्रिलामाइड त्वचा के सीधे संपर्क में आता है, तो उजागर क्षेत्र को साबुन और पानी से कम से कम 15 मिनट के लिए धोएं। यदि एक्रिलामाइड आंखों के सीधे संपर्क में आता है, तो उन्हें 15 मिनट के लिए पानी से फ्लश करें।
      1. पेज जेल तैयार करें: पूर्ण लंबाई वाले उत्पाद से अवांछित गर्भपात प्रतिलेख और अनियंत्रित आरएनटीपी को हटाने के लिए, 6% यूरिया-पॉलीक्रिलामाइड जेल तैयार करें। सामान्य तौर पर, 28 सेमी x 16.5 सेमी x 1.5 मिमी जैल का उपयोग 8-वेल कंघी के साथ किया जा सकता है। जलाशयों को भरने के लिए 1x TBE बफर का उपयोग करके जेल और वैद्युतकणसंचलन उपकरण सेट करें।
      2. पेज जेल में आरएनए नमूना लोड करें: प्रति लेन एक बुझे हुए 200 μL प्रतिक्रिया के साथ जेल लोड करें। एक अलग लेन में, ट्रैकर डाई ज़ाइलीन साइनोल और ब्रोमोफेनॉल ब्लू के साथ 2x ULB लोड करें,जो क्रमशः 106 न्यूक्लियोटाइड और 26 न्यूक्लियोटाइड पर जेल में माइग्रेट करते हैं। अगले चरणों में संभावित संदूषण से बचने के लिए प्रत्येक नमूने के बीच एक खाली लेन छोड़ दें।
      3. पेज जेल चलाएं: 95-एनटी पालक 2 और 49-एनटी ब्रोकोली को उनके संबंधित कटे हुए उत्पादों से अलग करने के लिए, जेल को 25 डब्ल्यू पर 1.5-2 घंटे के लिए चलाएं, जिस बिंदु पर ब्रोमोफेनॉल ब्लू डाई जेल की लंबाई का ~ 5/6 माइग्रेट हो जाएगा।
      4. पेज जेल में आरएनए नमूने की कल्पना करें: जेल के चारों ओर ग्लास प्लेटों को अलग करें और जेल को दोनों तरफ प्लास्टिक की चादर में कवर करें, रैप पर लेन को लेबल करें। यूवी प्रकाश के तहत फ्लोरोसेंट टीएलसी प्लेट पर लपेटे गए जेल को रखकर यूवी छायांकन द्वारा एक अंधेरे कमरे में आरएनए बैंड की कल्पना करें। एक मार्कर के साथ उत्पाद के अनुरूप आरएनए बैंड के किनारे को जल्दी से रेखांकित करें और यूवी एक्सपोजर से नुकसान को कम करने के लिए यूवी लैंप को बंद करें।
      5. पेज जेल से आरएनए नमूना निकालें: प्रत्येक नमूने के लिए एक ताजा रेजर ब्लेड के साथ, वांछित उत्पाद बैंड, ~ 1 मिमी क्यूब्स में पासा, और जेल के टुकड़ों को 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 500 μL क्रश सोख बफर के साथ जोड़ें ताकि कमरे के तापमान (आरटी) पर 2 घंटे के लिए या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर आरएनए निकाला जा सके।
        नोट: वैकल्पिक विराम बिंदु: नमूना -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
      6. आरएनए को अवक्षेपित करें
        1. बफर में निकाले गए आरएनए से जेल के टुकड़ों को अलग करने के लिए, नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 13,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, और फिर सुपरनैटेंट निकालने के लिए एक संकीर्ण-टिप पिपेट का उपयोग करें और इसे एक नए 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में लोड करें।
        2. आरएनए को अवक्षेपित करने के लिए, 1.5 एमएल बर्फ-ठंडा इथेनॉल और 20 मिलीग्राम / एमएल ग्लाइकोजन, भंवर का 1 μL जोड़ें, और -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1 घंटे के लिए स्टोर करें।
          नोट: वैकल्पिक विराम बिंदु: आरएनए को कुछ महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
      7. आरएनए अवक्षेप का संग्रह: 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 13,000 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अवक्षेपित आरएनए को गोली मारो। सतह पर तैरने वाले को हटा दें और डीडीएच2ओ या 1 एक्स टीई बफर के 30 μL में गोली को फिर से निलंबित करने से पहले खुली हवा (~ 1 घंटे) के तहत शेष इथेनॉल को वाष्पित होने दें।
        नोट: इस प्रक्रिया के परिणामस्वरूप आम तौर पर ~ 10 μM की अंतिम आरएनए एकाग्रता होती है।
        नोट: वैकल्पिक विराम बिंदु: आरएनए नमूना कुछ महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    2. आरएनए स्टॉक सांद्रता निर्धारित करें।
      1. हाइड्रोलिसिस प्रतिक्रिया के लिए एक आरएनए एलिकोट तैयार करें।
        1. इस परख को करने के लिए, सबसे पहले, स्टॉक आरएनए नमूने के ए260 को निर्धारित करने के लिए यूवी / विस नैनो स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करें और डीडीएच2ओ में ~ 10 अवशोषण इकाइयों (एयू) में नमूने का पतला एलिकोट बनाएं।
        2. 0.5 एमएल पीसीआर ट्यूब में निम्नलिखित प्रतिक्रिया तैयार करें: डीडीएच 2 ओ + 2 10xNa2CO3 बफर का 16 μL + ~ 10 AU तक पतला RNA एलिकोट का 2 μL। प्रतिक्रिया को 95 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, और फिर इसे आरटी में ठंडा होने दें।
      2. न्यूक्लियोटाइड अवशोषण का उपयोग करके आरएनए एकाग्रता निर्धारित करें: यूवी / विस नैनो स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ इस नमूने के ए260 को मापें और निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके आरएनए एकाग्रता की गणना करें:
        Equation 1
        जहां सी आरएनए की एकाग्रता है, बी पथ की लंबाई है, आई विशिष्ट न्यूक्लियोटाइड (ए, सी, जी, या यू) है, एनआई आरएनए अनुक्रम में न्यूक्लियोटाइड आई की आवृत्ति है, और εआई न्यूक्लियोटाइड आई का दाढ़ विलोपन गुणांक है। मूल स्टॉक आरएनए एकाग्रता निर्धारित करने के लिए, कमजोर पड़ने वाले कारक से सी को गुणा करें।
        नोट: वैकल्पिक विराम बिंदु: आरएनए को कुछ महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. प्रदर्शन करना in vitro प्लेट रीडर कैनेटीक्स परख
    1. आरएनए रीन्यूरेशन प्रोग्राम सेट करें: नया प्रोग्राम बनाएँ का चयन करके निम्न थर्मोसाइक्लर प्रोटोकॉल बनाएँ > नया चरण जोड़ें > सहेजें दबाने से पहले निम्न चरणों में से प्रत्येक को जोड़ने के लिए कई बार नया चरण जोड़ें:
      3 मिनट के लिए 70 °C
      45 सेकंड के लिए 65 डिग्री सेल्सियस
      45 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस
      45 सेकंड के लिए 55 डिग्री सेल्सियस
      45 सेकंड के लिए 50 डिग्री सेल्सियस
      45 सेकंड के लिए 45 डिग्री सेल्सियस
      45 सेकंड के लिए 40 डिग्री सेल्सियस
      45 सेकंड के लिए 35 डिग्री सेल्सियस
      45 सेकंड के लिए 30 डिग्री सेल्सियस
    2. आरएनए को फिर से बनाएं: पालक 2 और ब्रोकोली आरएनए को फिर से बनाने के लिए, 0.5 एमएल पतली दीवार वाली पीसीआर ट्यूब में डीडीएच 2 ओ में प्रत्येक आरएनए के2एसएम स्टॉक तैयार करें, और फिर 1 μM आरएनए समाधान बनाने के लिए 2x रीन्यूरेशन बफर (80 mM HEPES, pH 7.5 [KOH], 250 mM KCl, 6 mM MgCl2) की समान मात्रा जोड़ें। ट्यूबों को थर्मोसाइक्लर में जोड़ें, सहेजे गए पुनर्तृप्ति प्रोग्राम खोलें, और चलाएँ दबाएँ।
      नोट: यदि एक थर्मोसाइक्लर अनुपलब्ध है, तो आरएनए को इसके बजाय 3 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक पर इनक्यूबेट किया जा सकता है और फिर बेंच पर आरटी के लिए धीरे-धीरे ठंडा करने की अनुमति दी जा सकती है।
    3. बाइंडिंग प्रतिक्रिया बफर तैयार करें: एक एपटामर-डाई बाइंडिंग प्रतिक्रिया के लिए बफर तैयार करने के लिए, बफर घटकों (69.5 μL ddH2O + 4 μL 1 M HEPES, pH 7.5 [KOH] + 6.2 μL 2 M KCl + 0.3 μL 1 M MgCl2) युक्त एक मास्टर मिश्रण बनाएं। कितने नमूने और प्रतिकृति की आवश्यकता है, इसके आधार पर, इन मूल्यों को नमूनों की संख्या और एक से गुणा करें। आम तौर पर, प्रति आरएनए नमूने में तीन प्रतिकृतियां संतोषजनक होती हैं।
    4. प्लेट रीडर तैयार करें।
      1. प्लेट रीडर इंजेक्टर प्रोग्राम सेट करें: फ्लोरेसेंस प्लेट रीडर पर, टेम्प का चयन करें और वांछित तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि कैनेटीक्स प्रयोगशुरू करने से पहले तापमान इस मान के बराबर हो गया है। प्लेट रीडर सॉफ़्टवेयर खोलें, सेटिंग > अधिग्रहण दृश्य का चयन करें, और कैनेटीक्स माप के लिए निम्न प्रोग्राम इनपुट करें:
        लूप: प्रत्येक कुएं के लिए
        बेसलाइन सेटिंग: 60 बेसलाइन पढ़ता है
        स्मार्ट इंजेक्ट सेटिंग्स: 10 μL इंजेक्शन (जो बेसलाइन पढ़ने के बाद होगा)
        फ्लोरेसेंस (या एफएल) पढ़ता है:
        उत्तेजना: 448 एनएम (बैंडविड्थ: 9 एनएम)
        उत्सर्जन: 506 एनएम (बैंडविड्थ: 15 एनएम)
        कारतूस: मोनो (एस / एन 3297)
        समय:
        कुल पढ़ने का समय: 10 मिनट
        पढ़ें अंतराल: 0.5 सेकंड
        पीएमटी और ऑप्टिक्स: प्रति पठन 6 फ्लैश
        लूप: अगला कुआं
      2. इंजेक्टर तैयार करें
        1. इंजेक्टर को धोएं और एस्पिरेट करें: प्लेट रीडर इंजेक्टर तैयार करने के लिए, पहले प्लेट रीडर पर इंजेक्ट का चयन करें, निर्देशित होने पर प्लेट रीडर को अपशिष्ट संग्रह प्लेट की आपूर्ति करें, और फिर वॉश का चयन करें, और डीडीएच2ओ में 75% इथेनॉल के साथ प्लेट रीडर पर निर्देशों के बाद इंजेक्शन ट्यूब को साफ करें। और फिर ddH2O. इसके बाद, एस्पिरेटेड का चयन करें, जिससे इंजेक्टर अतिरिक्त तरल को बाहर निकाल सके।
        2. इंजेक्टर प्राइम: पिछली स्क्रीन से बाहर निकलने के बाद, प्रयोगों के दौरान नमूनों में शुद्ध, केंद्रित लिगैंड को इंजेक्ट करने के लिए इंजेक्ट किए जाने वाले लिगैंड के दो 260 μL वॉल्यूम के साथ प्राइम टू प्राइम इंजेक्टर का चयन करें - इस मामले में, ddH2O में 100 μM DFHBI के साथ प्राइम।
    5. इन विट्रो कैनेटीक्स प्रयोग करें: एक कैनेटीक्स प्रयोग करने के लिए, पहले 96-अच्छी तरह से स्पष्ट-निचले प्लेट के एक कुएं में पहले से तैयार बाइंडिंग बफर मास्टर मिक्स के 80 μL जोड़ें, इसके बाद 10 μL पुनर्निर्मित आरएनए जोड़ें। इस प्लेट और इंजेक्टर में डीएफएचबीआई समाधान को प्लेट रीडर में 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तक बराबर करने दें।
    6. रीड एरिया के तहत प्लेट रीडर सॉफ्टवेयर सेटिंग्स में, विश्लेषण किए जाने वाले कुएं का चयन करें, और फिर, होम टैब के तहत, पहले वर्णित कैनेटीक्स प्रोग्राम को निष्पादित करने के लिए रन का चयन करें। इस प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि सभी प्रयोग पूरे न हो जाएं।
      नोट: गंभीर रूप से, कैनेटीक्स प्रयोगों को एक समय में एक अच्छी तरह से किया जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि आरएनए कैनेटीक्स को प्रतिकृति और नमूनों के बीच समान परिस्थितियों में मापा जाता है।
    7. इंजेक्टर को धोएं: इंजेक्शन ट्यूब से शेष डीएफएचबीआई समाधान को हटाने के लिए, चरण 1.4.4.2.1 में वर्णित इंजेक्शन ट्यूब को डीडीएच 2 ओ के 1 एमएल वॉल्यूम, डीडीएच2ओ में 75% इथेनॉल और फिर डीडीएच2ओ के साथ धोएं।
      नोट: वैकल्पिक विराम बिंदु।
  5. फ्लोरोजेनिक आरएनए एपटामर के इन विट्रो कैनेटीक्स का विश्लेषण।
    1. विश्लेषण सॉफ्टवेयर में इनपुट डेटा: प्रसंस्करण के लिए डेटा पर आसानी से कॉपी करने के लिए स्प्रेडशीट के रूप में प्रयोगात्मक डेटा निर्यात करें। विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में, XY स्वरूप में एक नई डेटा तालिका बनाएँ। एक्स कॉलम में, प्रत्येक रीडिंग टाइमपॉइंट दर्ज करें, जिसमें टी = 0 डीएफएचबीआई इंजेक्शन का समय है। वाई कॉलम में, टी = 0 से शुरू होने वाले संबंधित समय बिंदु पर प्रतिकृति के बीच औसत प्रतिदीप्ति मान दर्ज करें।
    2. डेटा को सामान्य और ग्राफ़ करें: प्रतिदीप्ति मानों को सामान्य करने के लिए, विश्लेषण > डेटा प्रोसेसिंग > सामान्यीकृत करें पर क्लिक करें, और फिर OK पर क्लिक करें। सामान्यीकरण के लिए डेटासेट के सबसे छोटे और सबसे बड़े मूल्यों का उपयोग करना चुनें, परिणामों को अंशों के रूप में प्रस्तुत करने के लिए, और परिणामों को ग्राफ़ करने के लिए, और फिर ओके पर क्लिक करें। समय के साथ सामान्यीकृत औसत प्रतिदीप्ति का ग्राफ बनाने के लिए, [डेटासेट नाम] आइकन के सामान्यीकरण पर क्लिक करें और ग्राफ परिवार का चयन करें: केवल अंक के साथ XY।
      नोट: त्रुटि पट्टियाँ उन मामलों में देखने के लिए उपयोगी हो सकती हैं जहां समय बिंदुओं की एक छोटी संख्या ग्राफ़ की जाती है। यदि ये वांछित हैं, तो एक्सवाई प्रारूप डेटा तालिका चुनते समय, साइड-बाय-साइड कॉलम में प्रतिकृति मान दर्ज करने के लिए "वाई" के तहत विकल्प का चयन करें। चयनित डिफ़ॉल्ट विकल्पों के साथ परिणामी तालिका को ग्राफ़ करने से त्रुटि पट्टियों के साथ एक ग्राफ़ उत्पन्न होगा.
    3. गतिज पैरामीटर प्राप्त करने के लिए वक्र फिटिंग करें: कैनेटीक्स डेटा में वक्र फिट करने के लिए, विश्लेषण > डेटा का विश्लेषण करें पर क्लिक करें और एक्सवाई विश्लेषण टैब के तहत नॉनलाइनियर रिग्रेशन (वक्र फिट) का चयन करें। मॉडल टैब के तहत, निम्नलिखित दो-चरण एसोसिएशन समीकरण के साथ कैनेटीक्स डेटा फिट करने के लिए घातीय > टू फेज एसोसिएशन पर क्लिक करें:
      Equation 2
      जहां समय X पर Y प्रतिदीप्ति है, Y0 t = 0 पर प्रतिदीप्ति है, KFast और Kस्लो क्रमशः तेज और धीमी दर स्थिरांक हैं, और SpanFast और SpanSlow क्रमशः तेज और धीमी दरों द्वारा जिम्मेदार प्रतिदीप्ति टर्न-ऑन की श्रेणियां हैं (प्रतिनिधि परिणाम देखें, चित्रा 1)। दर स्थिरांक, t1/2 मान, और प्रतिशतFast मान देखने के लिए Nonlin Fit टैब पर क्लिक करें।
      नोट: इन सभी मूल्यों के लिए एक मानक विचलन प्राप्त करने के लिए, व्यक्तिगत प्लेट रीडर प्रयोग प्रतिकृति को उसी तरह से संसाधित किया जा सकता है जैसा कि ऊपर वर्णित है।

2. सेलुलर कैनेटीक्स प्रयोग

  1. ई कोलाई उपभेदों की तैयारी
    1. निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए ~ 100 एनजी पीईटी 31 बी टीआरएनए-पालक 2 निर्माण के साथ बीएल 21 स्टार (डीई 3) ई कोलाई कोशिकाओं को बदलें।
      नोट: प्लास्मिड निर्माण व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है (प्लास्मिड # 79783)।
    2. कार्बेनिसिलिन (कार्ब: 50 मिलीग्राम / एमएल) प्लेटों वाले एलबी एगर पर कोशिकाओं को प्लेट करें और 12-16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। प्लास्मिड युक्त कोशिकाएं प्लेट पर कॉलोनियों के रूप में विकसित होंगी।
      नोट: वैकल्पिक विराम बिंदु: प्लेटों पर रूपांतरित बीएल 21 स्टार कोशिकाओं को 1 सप्ताह के लिए पैराफिल्म में लपेटकर 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. कोशिकाओं का बढ़ना और फ्लोरोजेनिक आरएनए एपटामर की अभिव्यक्ति को प्रेरित करना
    1. रूपांतरित बीएल 21 स्टार कोशिकाओं की एकल कॉलोनी के साथ कार्बेनिसिलिन (कार्ब: 50 मिलीग्राम / एमएल) युक्त नॉनइंड्यूसिंग मीडिया (एनआई) की 2 एमएल संस्कृति को टीका लगाएं। इसे कम से कम तीन जैविक प्रतिकृतियों के लिए दोहराएं। 22-24 घंटे के लिए 250 आरपीएम पर इनक्यूबेटर/शेकर में 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृतियों को इनक्यूबेट करें।
      नोट: वैकल्पिक विराम बिंदु: एनआई मीडिया में उगाई गई कोशिकाएं प्लास्मिड को बनाए रखती हैं और 1 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत की जा सकती हैं।
    2. एनआई मीडिया में वृद्धि के बाद, 100x संस्कृति को ZYP-5052 ऑटोइंडक्शन मीडिया (AI) के एक ताजा 3 एमएल में पतला करें जिसमें कार्ब: 50 मिलीग्राम / एमएल शामिल है। अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए कोशिकाओं को 16-18 घंटे के लिए 250 आरपीएम पर इनक्यूबेटर /शेकर में 37 डिग्री सेल्सियस पर उगाएं।
      नोट: संस्कृतियों के लिए विशिष्ट ओडी600 18 घंटे के विकास के बाद 2.0-3.3 तक होगा। इष्टतम सेल घनत्व सीमा 2.5-3.0 के बीच है।
  3. सेलुलर कैनेटीक्स प्रयोग का प्रदर्शन
    1. प्रवाह साइटोमीटर सेट करें।
      1. उपकरण से जुड़े प्रवाह साइटोमीटर और कंप्यूटर चालू करें। एक बार फ्लो साइटोमीटर के लिए सॉफ्टवेयर में लॉग इन करने के बाद, इंस्ट्रूमेंट टैब के तहत, स्टार्टअप आइकन पर क्लिक करें। उचित इंस्ट्रूमेंटेशन आरंभीकरण सुनिश्चित करने के लिए सॉफ़्टवेयर स्क्रीन पर इंगित चरणों का पालन करें।
        नोट: कुछ प्रवाह साइटोमीटर उपकरण स्टार्टअप अनुक्रम प्राइमिंग कहते हैं। प्रवाह साइटोमीटर के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करना सुनिश्चित करें जो प्रयोग के लिए उपयोग में होगा।
      2. एक प्रदर्शन परीक्षण चलाएँ (यदि लागू हो)। मुख्य मेनू टैब के तहत, प्रदर्शन परीक्षण पर क्लिक करें। एक संस्कृति ट्यूब में, 3 एमएल फोकसिंग तरल पदार्थ में निर्माता के प्रदर्शन ट्रैकिंग मोतियों की तीन बूंदें जोड़ें।
      3. कल्चर ट्यूब को नमूना ट्यूब लिफ्टर में रखें और लिफ्टर को ऊपर उठाएं। रन परफॉर्मेंस टेस्ट पर क्लिक करने से पहले, सुनिश्चित करें कि ट्रैकिंग बीड्स की ट्यूब का लॉट # वही है जो प्रदर्शन परीक्षण सेटअप स्क्रीन पर इंगित किया गया है। परीक्षण चलाने के लिए प्रदर्शन परीक्षण क्लिक करें.
      4. एकल-सेल प्रतिदीप्ति के लिए निम्नलिखित अधिग्रहण मापदंडों के साथ इस प्रयोग के लिए प्रवाह साइटोमीटर सॉफ्टवेयर सेट करें:
        उत्तेजना लेजर: 488 एनएम
        उत्सर्जन चैनल: जीएफपी (जिसे एफआईटीसी भी कहा जाता है)
        अधिग्रहण मात्रा: 40 μL (90 μL की कुल ड्रॉ मात्रा के साथ)
        प्रवाह दर: 200 μL /
        प्रत्येक माप के लिए सेल गणना: 30,000
        उपकरण सेटिंग्स:
        वोल्टेज:
        एफएससी: 480 वी
        एसएससी: 400 वी
        बीएल 1: 540 वी
        बीएल 2: 392 वी
        BL3: 422 V
    2. प्रयोगात्मक फ़ाइलें सेट करें.
      1. फ्लो साइटोमीटर उपयोगकर्ता नाम पर राइट-क्लिक करके प्रयोग एक्सप्लोरर टैब के भीतर एक नई प्रयोग फ़ाइल बनाएँ। ड्रॉप-डाउन विंडो में नया प्रयोग चुनें. जब कंप्यूटर स्क्रीन पर कोई नई विंडो पॉप अप होती है, तो ठीक का चयन करें।
      2. नई प्रयोग फ़ाइल में, "समूह" फ़ोल्डर राइट-क्लिक करें और नई नमूना ट्यूब जोड़ें का चयन करें। प्रत्येक विशिष्ट समय बिंदु के लिए नमूना ट्यूबों को लेबल करें और नमूना पर राइट-क्लिक करके और ड्रॉप-डाउन मेनू में नाम बदलें का चयन करके दोहराएं। अध्ययन के इच्छित समय पाठ्यक्रम के लिए प्रतिकृति और समय बिंदुओं की कुल संख्या के लिए इस चरण को दोहराएं।
    3. एक पतला सेल समाधान तैयार करें: एक नई संस्कृति ट्यूब में, 1.5 एमएल 1x पीबीएस समाधान जोड़ें। इसके बाद, पतला सेल समाधान बनाने के लिए 1x PBS समाधान में AI मीडिया में प्रेरित कोशिकाओं के 3 μL जोड़ें। विभिन्न संस्कृति ट्यूबों में प्रत्येक जैविक प्रतिकृति के लिए इस चरण को दोहराएं।
    4. कोशिकाओं की पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को मापें: डाई जोड़ने से पहले, 1x PBS समाधान में कोशिकाओं वाले प्रत्येक जैविक प्रतिकृति संस्कृति ट्यूब की रीडिंग लें। ऐसा इसलिए है ताकि डाई को जोड़ने के बाद कोशिकाओं की फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि को समय के साथ फोल्ड टर्न ऑन देखने के लिए मापा जाता है।
      1. रीडिंग लेने के लिए, कल्चर ट्यूब को नमूना ट्यूब लिफ्टर में रखें, और लिफ्टर को नमूना इंजेक्शन सुई तक हाथ से उठाएं। संग्रह पैनल टैब में उचित नमूना फ़ाइल का चयन करें, और रिकॉर्ड क्लिक करें.
      2. जब रन पूरा हो जाता है, तो नमूना ट्यूब लिफ्टर को हाथ से संस्कृति ट्यूब के साथ कम करें। यह एक कुल्ला कदम शुरू करेगा जो द्रव प्रणाली को फ्लश करेगा और प्रत्येक जैविक प्रतिकृति नमूने के बीच कैरीओवर को कम करेगा। रन पूरा होने के बाद डेटा स्वचालित रूप से कंप्यूटर पर सहेजा जाएगा।
      3. कम से कम तीन जैविक प्रतिकृतियों के लिए सेलुलर फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि को मापने के लिए 2.3.4 के भीतर चरणों को दोहराएं। अगली नमूना फ़ाइल पर जाने के लिए, रिकॉर्ड आइकन के नीचे नमूना ट्यूब नाम के पास दाएं तीर आइकन पर क्लिक करके अगली नमूना फ़ाइल का चयन करें।
    5. डाई के साथ कोशिकाओं के लिए समय बिंदुओं पर प्रतिदीप्ति मापें।
      1. 50 μM DFBHI-1T की अंतिम सांद्रता देने के लिए कोशिकाओं के साथ 1x PBS समाधान में एक केंद्रित डाई स्टॉक (DMSO में 50 mM DFHBI-1T) का 1.4 μL जोड़ें। इसके बाद, कल्चर ट्यूब ढक्कन को सुरक्षित करें, और फिर पहली बार पॉइंट रीडिंग लेने से पहले समाधान को समान रूप से मिलाने के लिए कल्चर ट्यूब 3x-5x को उलट दें।
        नोट: ई कोलाई के लिए कल्चर ट्यूबों के भीतर डीएमएसओ का कुल प्रतिशत 10% से अधिक नहीं होना चाहिए, क्योंकि यह सेल व्यवहार्यता16 को प्रभावित कर सकता है।
      2. ढक्कन हटा दें और कल्चर ट्यूब को नमूना ट्यूब लिफ्टर में रखें। नमूना इंजेक्शन सुई के लिए धारक को हाथ से उठाएं, और, उचित नमूना फ़ाइल के तहत, रिकॉर्ड आइकन पर क्लिक करें। इसके अतिरिक्त, प्रयोग के लिए स्टार्ट दबाकर टाइमर शुरू करें ।
      3. रन पूरा होने के बाद ट्यूब लिफ्टर को हाथ से नीचे करें, और चरण 2.3.5.1-2.3.5.2 दोहराएं। (टाइमर चलने के साथ) केंद्रित डीएफएचबीआई -1 टी के 1.4 μL को जोड़कर, संस्कृति ट्यूबों को उलटकर, और शेष सभी जैविक प्रतिकृतियों के लिए रीडिंग लेना। ये पहली रिकॉर्डिंग सभी जैविक प्रतिकृतियों के लिए 0 मिनट पर प्राप्त रीडिंग होगी। प्रत्येक जैविक प्रतिकृति के लिए एक बार में ऐसा करें।
        नोट: उस समय का नोट करें जब रिकॉर्ड फ्लो साइटोमेट्री अधिग्रहण दबाया जाता है। प्रयोग के दौरान समय बिंदुओं के लिए इस समय का पालन करें।
      4. नमूना ट्यूब लिफ्टर में कल्चर ट्यूबों को नमूना इंजेक्शन सुई तक उठाकर, उचित नमूना फ़ाइल का चयन करके, रिकॉर्ड पर क्लिक करके और प्रत्येक रन पूरा होने के बाद लिफ्टर को हाथ से नीचे करके रीडिंग लेना जारी रखें। परीक्षण किए जा रहे सभी अतिरिक्त समय बिंदुओं और जैविक प्रतिकृतियों के लिए ऐसा करें। प्रयोग पूरा होने तक चरणों को दोहराएं।
        नोट: एल्यूमीनियम पन्नी के साथ नमूने को कवर करके समाधान में डीएफएचबीआई -1 टी के फोटोब्लीचिंग से बचने के लिए नमूने को प्रकाश से बाहर रखें।
    6. डाई (नियंत्रण) के बिना कोशिकाओं के लिए समय बिंदुओं पर प्रतिदीप्ति मापें।
      1. निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद नकारात्मक नियंत्रण के साथ प्रयोग को फिर से दोहराने से पहले प्रवाह साइटोमीटर के लिए उपयुक्त सफाई प्रोटोकॉल चलाएं। यह नियंत्रण समय बिंदु विश्लेषण प्रयोग में पिछले प्रयोग से किसी भी कैरीओवर को कम करने के लिए किया जाता है। प्रयोगों के बीच प्रवाह साइटोमीटर के लिए नीचे दिए गए चरण हैं:
        1. हाथ से ट्यूब लिफ्टर में एक खाली संस्कृति ट्यूब रखें, ट्यूब धारक को उठाएं, और इंस्ट्रूमेंट टैब में अनलॉग आइकन पर क्लिक करें। यह किसी भी चिपचिपे नमूने को साफ करने के लिए द्रव प्रणाली में एक बैकफ्लश चलाएगा। ट्यूब धारक को हाथ से नीचे करें और अनलॉग अनुक्रम पूरा होने के बाद ट्यूब को हटा दें।
        2. एक नई संस्कृति ट्यूब के साथ, 10% ब्लीच समाधान के 3 एमएल जोड़ें, कल्चर ट्यूब को ट्यूब धारक में रखें, और नमूना इंजेक्शन सुई पर हाथ से धारक उठाएं। इसके अतिरिक्त, प्रवाह साइटोमीटर पर लागू होने पर ऑटोसैंपलर में एक साफ 96-वेल प्लेट रखें।
        3. पूरे फ्लूइडिक्स सिस्टम में 10% ब्लीच के साथ सफाई अनुक्रम चलाने के लिए सैनिटाइज एसआईपी / सैनिटाइज ऑटोसैंपलर एसआईपी आइकन पर क्लिक करें। सफाई अनुक्रम को पूरा करने के लिए ट्यूब धारक को कम करें।
      2. चरण 2.3.3 के भीतर निर्देशों का पालन करते हुए चलाए गए नियंत्रण समय बिंदु विश्लेषण के लिए नमूना फ़ाइलें सेट करें।
      3. एक नई संस्कृति ट्यूब में, 1x PBS समाधान के 1.5 mL में एक पतला सेल समाधान तैयार करें। पतला सेल समाधान बनाने के लिए 1x PBS समाधान में AI मीडिया में प्रेरित कोशिकाओं के 3 μL जोड़ें। प्रत्येक जैविक प्रतिकृति के लिए इस चरण को दोहराएं।
      4. कोशिकाओं के साथ 1x PBS समाधान में एक बार में संस्कृति ट्यूब में 1.4 μL DMSO जोड़ें और समान समय बिंदुओं का परीक्षण करें। कल्चर ट्यूब ढक्कन को सुरक्षित करें, और फिर पहली बार पॉइंट रीडिंग लेने से पहले समाधान को समान रूप से मिश्रण करने के लिए कल्चर ट्यूब 3x-5x को उलट दें। प्रत्येक जैविक प्रतिकृति के लिए एक बार में ऐसा करें।
      5. चरण 2.3.5.2-2.3.5.4 का उपयोग करके डाई के साथ कोशिकाओं के लिए नियंत्रण कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए उसी प्रोटोकॉल का पालन करें।
    7. प्रवाह साइटोमीटर को बंद करें: इंस्ट्रूमेंटेशन के उचित शटडाउन के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें। प्रवाह साइटोमीटर के लिए, उपकरण निम्नलिखित तरीके से शटडाउन के लिए तैयार किया जाता है:
      1. चरण 2.3.6.1.1-2.3.6.1.3 का पालन करते हुए प्रवाह साइटोमीटर के लिए प्रारंभिक सफाई प्रोटोकॉल निष्पादित करें।
      2. कल्चर ट्यूब को 10% ब्लीच समाधान के साथ 3 एमएल फोकसिंग तरल पदार्थ के साथ एक कल्चर ट्यूब के साथ बदलें। ट्यूब धारक को हाथ से उठाएं, और, शटडाउन आइकन के तहत, ड्रॉप-डाउन मेनू पर क्लिक करें और संपूर्ण चुनें।
        नोट: वैकल्पिक विराम बिंदु।
  4. प्रवाह साइटोमेट्री डेटा का विश्लेषण
    1. विश्लेषण के लिए सभी एफसीएस फ़ाइलों को निर्यात करें। प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ एफसीएस फ़ाइलों को खोलें।
    2. सेल-ओनली एफसीएस फाइलों में से एक का उपयोग करके, मलबे से किसी भी सिग्नल को बाहर करने के लिए दोनों लॉग अक्षों का उपयोग करके फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी) और साइड स्कैटर (एसएससी) डॉट प्लॉट (एफएससी-एरिया / एसएससी-एरिया) से एक गेट उत्पन्न करें। इस गेट को बनाने के लिए, फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण सॉफ्टवेयर पर ऑटोगेट आइकन पर क्लिक करें और इसे गेट 1 नाम दें। डेटा प्रोसेसिंग कार्यस्थान में सभी नमूने टैब के तहत परीक्षण किए गए सभी नमूनों के लिए इस समान गेट को लागू करें। इसके परिणामस्वरूप सभी एफसीएस फाइलों के नीचे गेट 1 संसाधित किया जाएगा।
    3. चरण 2.4.2 में उपयोग की जाने वाली सेल केवल FCS फ़ाइल के साथ एक नई उपसमुच्चय फ़ाइल डबल-क्लिक करके बनाएँ। अक्ष सेटिंग्स को FSC-क्षेत्र/FSC-ऊंचाई में बदलें, दोनों लॉग अक्षों का उपयोग करके। एक अंडाकार गेट उत्पन्न करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण सॉफ्टवेयर पर ऑटोगेट आइकन पर क्लिक करें, इसे गेट 2 नाम दें। परीक्षण किए गए सभी नमूनों के लिए चरण 2.4.2 में सेट गेट के नीचे एक उप-समूह के रूप में इस गेट को लागू करें। इसके परिणामस्वरूप प्रत्येक एफसीएस फ़ाइल से जुड़े गेट 1 > गेट 2 वाले सभी नमूने होंगे।
    4. गेट 2 पर डबल-क्लिक करके लागू चरण 2.4.2 और चरण 2.4.3 में सेट किए गए दोनों गेट्स के साथ एक और उप-समूह फ़ाइल बनाएं। अक्ष सेटिंग्स को FSC-क्षेत्र/हिस्टोग्राम में बदलें. परीक्षण किए गए सभी नमूनों के लिए इस हिस्टोग्राम गेट को एक उप-समूह के रूप में लागू करें, जिसके परिणामस्वरूप प्रत्येक एफसीएस फ़ाइल से जुड़े गेट 1 > गेट 2 > गेट 2 वाले सभी नमूने हैं।
      नोट: हिस्टोग्राम को लेआउट विंडो में स्थानांतरित करने में सहायता के साथ-साथ डेटा प्रोसेसिंग के साथ अधिक संगठन बनाने के लिए हिस्टोग्राम का नाम गेट 2 से हिस्टोग्राम तक रखा जा सकता है।
    5. माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) मानों का विश्लेषण करने के लिए, लेआउट विंडो खोलें। लेआउट विंडो में प्रत्येक समय बिंदु के लिए हिस्टोग्राम गेट्स पर क्लिक करें और खींचें।
    6. लेआउट विंडो पर एमएफआई परिणाम प्रदर्शित करने के लिए परीक्षण किए गए प्रत्येक नमूने के लिए "∑ मीन: बीएल 1-ए" (जीएफपी) के लिए एक सांख्यिकीय विश्लेषण करें।
    7. कम से कम तीन स्वतंत्र जैविक प्रतिकृतियों के लिए प्रति समय बिंदु विश्लेषण एमएफआई मूल्यों के लिए मानक विचलन की गणना करें।
    8. लेआउट विंडो को PDF फ़ाइल के रूप में निर्यात करके प्रत्येक समय बिंदु के लिए हिस्टोग्राम और MFI मान सहेजें.
      नोट: वैकल्पिक विराम बिंदु।
  5. ग्राफफ्लो साइटोमेट्री डेटा
    1. प्रत्येक समय बिंदु के लिए हिस्टोग्राम और एमएफआई मानों वाली पीडीएफ फाइल खोलें। एमएफआई मानों को डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर में कॉपी किया जाएगा। डेटा ग्राफ़िंग सॉफ़्टवेयर में, XY स्वरूप में एक नई डेटा तालिका बनाएँ।
      1. निम्न चयनित के साथ एक XY तालिका बनाने के लिए चुनें:
        डेटा तालिका: नई तालिका में डेटा दर्ज करें या आयात करें
        विकल्प:
        X: बीता हुआ समय
        वाई: (तीन से चार) बैकप्ले मानों को साइड-बाय-साइड सबकॉलम में दोहराएं
      2. प्रयोग और नियंत्रण रन के लिए सभी समय बिंदुओं पर एक्स अक्ष पर लेबल करें।
      3. समूह ए में, डाई के साथ कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति विश्लेषण के लिए प्रत्येक समय बिंदु में सभी जैविक प्रतिकृतियों के लिए एमएफआई मूल्यों को इनपुट करें।
      4. ग्रुप बी में, सभी जैविक प्रतिकृतियों के लिए एमएफआई मूल्यों को प्रत्येक समय बिंदु में इनपुट करें ताकि कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए कोई डाई (डीएमएसओ) नहीं जोड़ा जा सके।
      5. परिणामों का निरीक्षण करने के लिए, ग्राफ़ टैब के तहत [डेटा सेट नाम सम्मिलित करें] पर क्लिक करें। यह डेटा बिंदुओं को साधन के रूप में प्रदर्शित करेगा, जिसमें प्रत्येक समय बिंदु पर मानक विचलन (एसडी) का प्रतिनिधित्व करने वाली त्रुटि पट्टियां होंगी। एक्स-अक्ष बीते हुए समय का प्रतिनिधित्व करता है, और वाई-अक्ष एमएफआई मूल्यों का प्रतिनिधित्व करता है।

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Representative Results

इन विट्रो कैनेटीक्स
डीएनए टेम्प्लेट और प्राइमरों के अनुक्रम, जिन्हें सिंथेटिक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के रूप में खरीदा जाता है, तालिका 2 में दिखाए गए हैं, और अभिकर्मक व्यंजनों को पूरक फ़ाइल 1 में दिखाया गया है। पीसीआर प्रवर्धन का उपयोग टी 7 प्रमोटर के साथ डीएनए टेम्पलेट की मात्रा को बढ़ाने के लिए किया जाता है, जो बाद में इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन (आईवीटी) प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, पीसीआर प्रवर्धन का उपयोग एक ही प्रतिक्रिया में दो उद्देश्यों के लिए किया जा सकता है: प्राइमर एक्सटेंशन द्वारा पूर्ण लंबाई वाले ब्रोकोली डीएनए टेम्पलेट को उत्पन्न करने के लिए, साथ ही डीएनए टेम्पलेट को स्केल करने के लिए।

आरएनए को संश्लेषित करने के लिए आईवीटी प्रतिक्रिया के बाद, पेज शुद्धिकरण पूर्ण लंबाई वाले आरएनए उत्पाद से किसी भी अवांछित कटे हुए प्रतिलेख, अवक्रमित उत्पादों और अनियंत्रित आरएनटीपी को हटा देगा। इस प्रकार के शुद्धिकरण को प्राथमिकता दी जाती है क्योंकि कटे हुए या अवक्रमित आरएनए आरएनए सांद्रता के गलत निर्धारण का कारण बनेंगे। चूंकि न्यूक्लियोटाइड बेस यूवी प्रकाश को अवशोषित करते हैं, जेल पर आरएनए बैंड और आरएनटीपी को यूवी के तहत फ्लोरोसेंट टीएलसी प्लेट के खिलाफ छाया के रूप में देखा जा सकता है। इस प्रकार, सही उत्पाद आकार के अनुरूप बैंड को चुनिंदा रूप से निकाला जा सकता है।

निकटतम-पड़ोसी विधि विलुप्त होने के गुणांक को अधिक महत्व देती है और इस प्रकार, संरचित आरएनए की सांद्रता क्योंकि यह बेस पेयरिंग17 के कारण हाइपोक्रोमिसिटी के लिए जिम्मेदार नहीं है। इसलिए, सटीक आरएनए सांद्रता निर्धारित करने के लिए, तटस्थ पीएच थर्मल हाइड्रोलिसिस परख आरएनए को व्यक्तिगत एनएमपी18 में हाइड्रोलाइज करने के लिए किया गया था। सटीक विलोपन गुणांक की गणना आरएनए अनुक्रम में एनएमपी के विलुप्त होने के गुणांक के योग के रूप में की गई थी।

पालक 2 और ब्रोकोली के लिए डीएफएचबीआई बाइंडिंग के कैनेटीक्स को प्लेट रीडर परख का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। आरएनए को पहले यह सुनिश्चित करने के लिए पुन: तैयार किया गया था कि यह डाई बाइंडिंग के लिए सही अनुरूपता में होगा। प्लेट रीडर कैनेटीक्स परख के लिए प्रतिक्रिया की स्थिति में 40 एमएम एचईपीईएस, पीएच 7.5 (केओएच), 125 एमएम केसीएल, 3 एमएम एमजीसीएल2, 100 एनएम पुनर्निर्मित आरएनए और 10 एसएम डीएफएचबीआई शामिल थे, और प्रतिक्रिया को 37 डिग्री सेल्सियस पर मापा गया था। MgCl2 के इस तापमान और एकाग्रता को शारीरिक स्थितियों19 की नकल करने के लिए चुना गया था, हालांकि 28 डिग्री सेल्सियस और 10 mM MgCl2 की स्थितियों का उपयोग बेहतर एपटामर फोल्डिंग के लिए भी किया जा सकता है।

फ्लोरोजेनिक एपटामर पालक 2 और ब्रोकोली दोनों डीएफएचबी डाई (चित्रा 2) से जुड़ने के लिए दो-चरण एसोसिएशन कैनेटीक्स प्रदर्शित करते हैं। कैनेटीक्स डेटा दोनों एपटामर (पूरक चित्रा 1) के लिए एक-चरण एसोसिएशन की तुलना में दो-चरण संघ द्वारा बेहतर फिट थे। तेज और धीमे संघों के लिए दर स्थिरांक और टी1/2 मान सबसे अच्छे फिट वक्र (तालिका 3) द्वारा निर्धारित किए गए थे। प्रतिशतफास्ट, जो बताता है कि फ्लोरेसेंस टर्न-ऑन परिमाण का कितना प्रतिशत तेजी से डीएफएचबीआई-बाध्यकारी आरएनए आबादी द्वारा जिम्मेदार है, यह भी निर्धारित किया गया था।

बाइंडिंग-सक्षम अवस्था में पालक 2 ब्रोकोली (टी1/2 = 1.2 एस बनाम 2.0 एस) की तुलना में तेजी से टर्न-ऑन दिखाता है। दोनों एपटामर के लिए दूसरा चरण कैनेटीक्स समान हैं (टी1/2 = 180 एस) और संभवतः नमूने की उप-आबादी के लिए एक सामान्य दर-सीमित चरण के अनुरूप है (पालक 2 और ब्रोकोली के लिए प्रतिशतफास्ट = 68% और 60%, क्रमशः)। कुल मिलाकर, इन परिणामों से पता चलता है कि अच्छी तरह से मुड़े हुए पालक 2 और ब्रोकोली एपटामर बहुत तेजी से टर्न-ऑन कैनेटीक्स का प्रदर्शन करते हैं, जिसमें डाई जोड़ के 1-2 सेकंड के भीतर प्रारंभिक आधा अधिकतम टर्न-ऑन होता है।

सेलुलर कैनेटीक्स
डीएनए संरचनाओं के अनुक्रम, जिन्हें पीईटी 31 बी प्लास्मिड में क्लोन किया जाता है, तालिका 2 में दिखाए गए हैं, और अभिकर्मक व्यंजनों को पूरक फ़ाइल 1 में दिखाया गया है। फ्लोरोजेनिक आरएनए एपटामर के डीएनए निर्माण आमतौर पर सेलुलर प्रयोगों के लिए एक टीआरएनए पाड़ के भीतर निहित होते हैं। बीएल 21 स्टार (डीई 3) ई कोलाई स्ट्रेन आरएनएस ई में उत्परिवर्तन के साथ एक अभिव्यक्ति तनाव है जो आरएनए स्थिरता को बढ़ाता है।

फ्लोरेसेंस टाइम पॉइंट माप पहले 45 मिनट के लिए हर 5 मिनट में दर्ज किए गए थे, इसके बाद 1 घंटे, 1.5 घंटे और 2 घंटे पर रीडिंग हुई, जिससे कुल 12 समय अंक और सेल-ओनली रीडिंग मिली। सबसे कम समय अंतराल 5 मिनट होने से प्रत्येक समय बिंदु पर कई जैविक प्रतिकृतियों को मापा जा सकता है, जिसमें 30 सेकंड से 1 मिनट के प्रतिकृति माप के बीच नियमित अंतराल होता है। टाइम कोर्स प्रयोग के लिए उपयोग किए जाने वाले 1x PBS समाधान में पतला कोशिकाओं की कुल मात्रा 1.5 mL थी।

एकल कोशिकाओं की आबादी की औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) निर्धारित करने से पहले कोशिकाओं को गेट किया गया था। गेटिंग सेल आबादी को निर्धारित करने के लिए स्कैटर प्लॉट पर एक क्षेत्र का चयन करता है जिसका विश्लेषण किया जाएगा। यह प्रक्रिया किसी भी मलबे या एकाधिक रीडिंग को विश्लेषण में शामिल होने से रोकती है। दिखाए गए फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए, 30,000 घटनाओं को दर्ज किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप गेटिंग के बाद 10,000-20,000 घटनाओं का विश्लेषण किया गया था।

सेलुलर फ्लोरेसेंस कैनेटीक्स सेलुलर वातावरण के भीतर आरएनए एपटामर के लिए ई कोलाई और डाई बाइंडिंग कैनेटीक्स दोनों में डाई प्रसार का एक कार्य है (चित्रा 1 बी)। पालक 2-टीआरएनए को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के लिए, यह देखा गया कि डाई जोड़ और नमूना विश्लेषण (चित्रा 3 ए) के बीच कम समय अंतराल (सेकंड में) के कारण औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) "0" समय बिंदु पर तुरंत बढ़ जाती है। इसके अलावा, सेलुलर फ्लोरेसेंस पहले से ही 5 मिनट के पहले समय बिंदु पर अपने अधिकतम समतुल्य एमएफआई मूल्य (40,441 ± 990) तक पहुंच गया है। इसके विपरीत, नियंत्रण कोशिकाएं कम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति (416) दिखाती हैं और डीएमएसओ जोड़ (चित्रा 3 बी) के साथ एमएफआई मूल्य में कोई बदलाव नहीं होता है। डाई के साथ कोशिकाओं और बिना डाई वाली कोशिकाओं के बीच तुलना से पता चलता है कि प्रतिदीप्ति सक्रियण कोशिकाओं में 2 ± 98 गुना है। कुल मिलाकर, इन परिणामों से पता चलता है कि ई कोलाई कोशिकाओं में व्यक्त पालक 2-टीआरएनए तेजी से टर्न-ऑन कैनेटीक्स प्रदर्शित करता है, जिसमें डाई जोड़ के 5 मिनट से भी कम समय के भीतर अधिकतम टर्न-ऑन होता है।

Figure 1
चित्रा 1: प्रतिदीप्ति सक्रियण का योजनाबद्ध। फ्लोरेसेंस सक्रियण आरएनए एपटामर पर होता है जो कोशिकाओं में डाई अणुओं (ए) और (बी) से जुड़ता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: फ्लोरोजेनिक एपटामर के इन विट्रो कैनेटीक्स। फ्लोरोजेनिक एपटामर (ए, बी) पालक 2 या (सी, डी) ब्रोकोली के प्रतिनिधि इन विट्रो कैनेटीक्स को दो-चरण संघ द्वारा मॉडलिंग किया गया है, जिसमें टी = 0 एस डीएफएचबीआई जोड़ का समय बिंदु है (अंतिम डीएफएचबीआई एकाग्रता: 10 μM)। प्रयोग तीन प्रतियों में किए गए थे। सभी त्रुटि पट्टियाँ माध्य से मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं. फिट से, तेज और धीमी एसोसिएशन प्रतिक्रिया घटकों दोनों के लिए टी1/2 मान प्राप्त किए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: एक टीआरएनए पाड़ में पालक 2 के प्रतिनिधि सेलुलर कैनेटीक्स। (ए) 2 घंटे के दौरान टीआरएनए-पालक 2 डाई अपटेक का टाइमपॉइंट विश्लेषण। डीएफएचआईबी -1 टी या डीएमएसओ में जोड़ने से पहले एक सेल-ओनली बेसलाइन लिया गया था। पहले 45 मिनट के लिए हर 5 मिनट में समय बिंदु लिया गया था, इसके बाद 1 घंटे, 1.5 घंटे और 2 घंटे पर समय बिंदु रीडिंग की गई थी। एरो तब दर्शाता है जब डीएफएचबीआई -1 टी या डीएमएसओ को बीएल 21 स्टार कोशिकाओं के साथ 1 एक्स पीबीएस समाधान में जोड़ा गया था। विश्लेषण के लिए DFHBI-1T की अंतिम सांद्रता 50 μM है। डीएमएसओ नियंत्रण के लिए, डीएमएसओ का जोड़ डीएफएचबीआई -1 टी डाई जोड़ के लिए उपयोग किए जाने वाले समान मात्रा (1.4 μL) पर था। (बी) बीएल 21 स्टार ई कोलाई कोशिकाओं के साथ डीएमएसओ नियंत्रण समय बिंदु विश्लेषण का एक क्लोज-अप। औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) डाई या डीएमएसओ के साथ बीएल 21 स्टार कोशिकाओं के समग्र फ्लोरोसेंट रीडआउट को इंगित करता है। डेटा तीन जैविक प्रतिकृतियों के औसत ± मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एपटामर-डाई जोड़ी लंबाई (nt) अधिकतम पेट (nm) अधिकतम एम (एनएम) विलोपन गुणांक (एम -1 · cm-1) क्वांटम उपज चमक केडी (एनएम) Tm (°C) संदर्भ
पालक 2-डीएफएचबीआई 95 445 501 26100 0.7 63 1450 37 4
पालक 2-DFHBI-1T 95 482 505 31000 0.94 100 560 37 13, 14
ब्रोकोली-डीएफएचबीआई-1टी 49 472 507 29600 0.94 96 360 48 13

तालिका 1: पहले प्रकाशित पालक 2-डीएफएचबीआई4, पालक 2-डीएफएचबीआई -1 टी13,14, और ब्रोकोली-डीएफएचबीआई -1 टी13 के फोटोफिजिकल और जैव रासायनिक गुण।

पालक 2 + टी 7 प्रमोटर 5'-CGATCCCGCAATAATAATACACTACTATAGGATGTAACTGAATGAATGAATGAATGAAATGGTGAA
GGACGGGTCCAGTAGGCTGCTTCGGCAGCCTTGTTGAGTagAGTGTGAGCTCC
GTAACTAGTTACATC-3'
ब्रोकोली + टी 7 प्रमोटर 5'-CGATCCCGCGAATAATAATACACTACTATAGgagacgggg
gtccagatattcgtatctgtcgagtagagtggctc-3'
टीआरएनए-पालक 2 निर्माण (पीईटी 31 बी प्लास्मिड में) 5'-CGATCCCGCAGAATAATAATACACTACTATAGGGGCCCGGATAGCTCAGTCGGT
AGAGCAGCGGCCGGATGTAACTGAATGAATGGTGAGAGAGAGAGAGAGAGGACGGGTCCAGTAGGCT
GCTTCGGCAGCCTTGTTGAGTagAGTGGCTGAGCTCCTAACTAGTACATCCGG
CCGCGGGTCCAGGGTTCAAGTCCCTGTTCGGGCCCA
TAGCATAACCCTGGCCTCTAACGGGTCTTGAGGTTTTTTG-3'
पालक 2 फॉरवर्ड प्राइमर 5'-CGATCCCGCGAATAATAATACACTATAG-3'
पालक 2 रिवर्स प्राइमर 5'-GATGTAACTTACGGAGC-3'
ब्रोकोली फॉरवर्ड प्राइमर 5'-CGATCCCGCGAATAATAACACTATAGgagacggggggtccagatatctatctg-3'
ब्रोकोली रिवर्स प्राइमर 5'-gagccacactactcgacagatacatatctggacccgacctc-3'

तालिका 2: डीएनए अनुक्रम तालिका जिसमें डीएनए अनुक्रम और प्राइमर शामिल हैं जो इन विट्रो और सेलुलर कैनेटीक्स अध्ययन के लिए उपयोग किए जाते हैं। बोल्ड = टी 7 प्रमोटर; रेखांकित = टीआरएनए मचान; कैप = पालक 2; लोअरकेस = ब्रोकोली; बोल्ड इटैलिक = टी 7 टर्मिनेटर।

Aptamer तेज t1/2 (s) धीमा t1/2 (s) KFast (s-1) Kस्लो (s-1) प्रतिशत तेजी से
पालक 2 1.2 ± 0.2 180 ± 10 0.56 ± 0.07 0.0039 ± 0.0002 68 ± 5
ब्रोकोली 2.0 ± 0.2 180 ± 30 0.35 ± 0.05 0.0039 ± 0.0006 60 ± 3

तालिका 3: फिट किए गए डेटा से प्राप्त पालक 2 और ब्रोकोली एपटामर के इन विट्रो कैनेटीक्स मान। डेटा को तीन प्रतिकृतियों के औसत ± मानक विचलन के रूप में रिपोर्ट किया गया है।

पूरक चित्र 1: फ्लोरोजेनिक एपटामर के प्रतिनिधि इन विट्रो कैनेटीक्स। फ्लोरोजेनिक एपटामर (ए, सी) पालक 2 या (बी, डी) ब्रोकोली के प्रतिनिधि इन विट्रो कैनेटीक्स को (ए, बी) 600 एस या (सी, डी) 20 एस माप समय पर एक-चरण एसोसिएशन द्वारा मॉडलकिया गया है, जिसमें तीर डीएफएचबीआई जोड़ (अंतिम डीएफएचबीआई एकाग्रता: 10 एसएम) के समय बिंदु को दर्शाते हैं। प्रयोग तीन प्रतियों में किए गए थे। कुल मिलाकर, ये डेटा दो-चरण एसोसिएशन मॉडल की तुलना में एक-चरण एसोसिएशन मॉडल द्वारा कम अच्छी तरह से फिट होते हैं जब प्रतिदीप्ति संकेत की लंबी अवधि के लिए निगरानी की जाती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: इन विट्रो कैनेटीक्स प्रयोग के लिए व्यंजन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इन विट्रो कैनेटीक्स प्रयोग के लिए, एक ही सामान्य प्रोटोकॉल को आरएनए-आधारित फ्लोरोसेंट बायोसेंसर के इन विट्रो कैनेटीक्स को मापने के लिए संशोधित किया जा सकता है जिसमें लिगैंड-बाइंडिंग और फ्लोरोफोरे-बाइंडिंग डोमेन8 दोनों होते हैं। इस मामले में, लिगैंड प्रतिक्रिया कैनेटीक्स प्राप्त करने के लिए लिगैंड को इंजेक्ट करने पर माप से पहले आरएनए को फ्लोरोफोरे के साथ इनक्यूबेट किया जाना चाहिए। यदि प्रतिकृतियों के बीच उच्च परिवर्तनशीलता देखी जाती है, तो कोई यह जांचकर समस्या निवारण कर सकता है कि प्रत्येक नमूने को माप से पहले 96-वेल प्लेट में समान समय के लिए बराबर करने की अनुमति है। प्रत्येक नमूना या प्रतिकृति को व्यक्तिगत रूप से एक कुएं में तैयार किया जाना चाहिए और एक बार में सभी नमूने तैयार करने के बजाय 15 मिनट के संतुलन चरण के ठीक बाद मापा जाना चाहिए।

सेलुलर कैनेटीक्स प्रयोग के लिए, प्रोटोकॉल को छोटे या लंबे समय के पाठ्यक्रमों के लिए संशोधित किया जा सकता है, लेकिन जैविक प्रतिकृति की संख्या की योजना बनाना और आवश्यक सेल समाधान मात्रा को समायोजित करना महत्वपूर्ण है। चरणों को सावधानीपूर्वक करने के लिए पर्याप्त समय रखने के लिए 30 सेकंड से 1 मिनट के बीच प्रत्येक जैविक प्रतिकृति रीडिंग को स्थान देने की सिफारिश की जाती है। एक अन्य संशोधन एक अलग फ्लोरोजेनिक डाई का परीक्षण करना है जो आरएनए एपटामर को वैकल्पिक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में नहीं बांधता है, जिसे पृष्ठभूमि पर प्रतिदीप्ति सक्रियण नहीं दिखाना चाहिए। यदि असंगत परिणाम देखे जाते हैं, तो कोई यह जांचकर समस्या निवारण कर सकता है कि प्रवाह साइटोमीटर को विभिन्न प्रयोगात्मक रन के बीच निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करके ठीक से साफ किया जाता है ताकि पिछले रन से अगले तक कोशिकाओं या रंगों के किसी भी रक्तस्राव को रोका जा सके।

जबकि प्रस्तुत इन विट्रो विधि फ्लोरोजेनिक एपटामर या आरएनए-आधारित फ्लोरोजेनिक बायोसेंसर के बीच कैनेटीक्स की तुलना करने के लिए उपयोगी है, प्राप्त गतिज मान तापमान, मैग्नीशियम एकाग्रता या उपयोग किए जाने वाले अन्य बफर घटकों के आधार पर बदल सकते हैं। इसके अलावा, जबकि यह विधि अच्छी तरह से परिभाषित स्थितियां प्रदान करती है जिनका उपयोग पहले विभिन्न फ्लोरोजेनिक आरएनए प्रणालियों को चिह्नित करने के लिए किया गया है, इंट्रासेल्युलर वातावरण को अन्य जैविक मैक्रोमोलेक्यूल्स की उपस्थिति के कारण पूरी तरह से प्रतिनिधित्व नहीं किया जा सकता है।

जबकि प्रोग्राम करने योग्य इंजेक्टर से लैस फ्लोरेसेंस प्लेट रीडर में डेटा अधिग्रहण के लिए कोई मृत समय नहीं है, प्रवाह साइटोमीटर उपकरण में अवलोकन योग्य मृत समय के कारण सीमित अस्थायी सटीकता है। "रिकॉर्ड" बटन पर क्लिक किए जाने और डेटा अधिग्रहण शुरू होने पर ~ 5 सेकंड का अंतराल होता है। उपकरण के लिए 30,000 घटनाओं को मापने के लिए एक अतिरिक्त ~ 5 एस अंतराल होता है; यह नमूना अधिग्रहण समय थोड़ा भिन्न होगा जो इस बात पर निर्भर करता है कि 1x PBS में कोशिकाएं कितनी पतली हैं।

सेलुलर प्रयोगों के लिए एक और संभावित सीमा 1x PBS में सेल व्यवहार्यता है। विस्तारित समय बिंदु विश्लेषण के लिए, मृत कोशिकाओं को दागने के लिए प्रोपिडियम आयोडाइड का उपयोग करके सेल व्यवहार्यता की जांच की जा सकतीहै। डाई एकत्रीकरण प्रवाह साइटोमीटर द्वारा किए गए प्रतिदीप्ति माप की सटीकता को भी सीमित कर सकता है। जलीय घोल में बहुत सीमित घुलनशीलता वाले रंग एकत्रित हो सकते हैं और प्रवाह साइटोमीटर पर कोशिकाओं के रूप में गिने जाने के लिए पर्याप्त बड़े कणों के रूप में दिखाई दे सकते हैं। इस प्रकार, गेटेड क्षेत्र में समुच्चय की जांच के लिए डाई-केवल प्रयोगात्मक नियंत्रण चलाना महत्वपूर्ण है।

इससे पहले, यह दिखाया गया था कि ब्रोकोली में इन विट्रो में 1 एमएम एमजी2 + पर पालक 2 के बराबर चमक है, लेकिन ब्रोकोली-टीआरएनए पालक 2-टीआरएनए13 की तुलना में जीवित ई कोलाई में ~ दो गुना अधिक प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रदर्शित करता है। हमारे ज्ञान के लिए, पालक 2 और ब्रोकोली फ्लोरोजेनिक एपटामर के लिए डाई-बाइंडिंग कैनेटीक्स की तुलना पहले नहीं की गई है और दो-चरण संघ द्वारा मॉडलिंग की गई है। दोनों आरएनए एपटामर के लिए प्रारंभिक तेज दर स्थिरांक इस बात का समर्थन करते हैं कि डाई बाइंडिंग पॉकेट पूर्व-मुड़ी हुई है और डाई को बांधने के लिए कोई संरचनात्मक परिवर्तन की आवश्यकता नहीं है, जो एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी और यूवी-पिघलनेप्रयोगों 21,22 के अनुरूप है। धीमी दर स्थिरांक के साथ दूसरे चरण को पहले रिपोर्ट नहीं किया गया है क्योंकि स्टॉप-फ्लो और फ्लोरेसेंस लाइफटाइम माप जैसे अन्य प्रयोगों ने पालक एपटामर का विश्लेषण कम अवधि (20 एस और 300 एस) 23,24 के लिए किया था। जब 600 सेकंड के लिए डेटा का विश्लेषण किया जाता है तो बहुत धीमी गति से दूसरे चरण के परिणामस्वरूप प्रतिदीप्ति में एक द्विघातीय वृद्धि होती है। इस धीमे कदम को या तो बाध्यकारी-अक्षम से बाध्यकारी-सक्षम आरएनए अवस्था में दर-सीमित रीफोल्डिंग चरण या बाध्य डाई के ट्रांस से सीआईएस रूपों में दर-सीमित फोटोकन्वर्जन चरण के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। बाद के तंत्र को पहले एक द्विघातीय प्रतिदीप्ति प्रोफ़ाइल24 देने के लिए मॉडलिंग किया गया था और संबंधित एपटामर, बेबी पालक25 पर अवशोषण और उत्तेजना स्पेक्ट्रा के बीच अंतर के हालिया विश्लेषण द्वारा समर्थित है। 

इन विट्रो निष्कर्षों का समग्र महत्व यह है कि वे दिखाते हैं कि फ्लोरोजेनिक आरएनए एपटामर के लिए डाई एसोसिएशन वास्तविक समय आरएनए स्थानीयकरण और जीन अभिव्यक्ति अध्ययनों को सीमित नहीं करता है। आरएनए-आधारित फ्लोरोसेंट बायोसेंसर के लिए जो पालक 2 को नियोजित करते हैं, मापा टर्न-ऑन कैनेटीक्स यहां मापा गया दूसरे चरण कैनेटीक्सके समान है क्योंकि बायोसेंसर को एक रिफोल्डिंग चरण की आवश्यकता होती है और इस प्रकार, निकट-वास्तविक समय सिग्नलिंग अध्ययन को सक्षम करने के लिए पर्याप्त रूप से तेज होना चाहिए।

यह उम्मीद की गई थी कि सेलुलर कैनेटीक्स पालक 2 के लिए देखे गए इन विट्रो कैनेटीक्स से अलग होगा। एक महत्वपूर्ण अंतर यह है कि ई कोलाई कोशिकाओं में डाई प्रसार का एक अतिरिक्त चरण है, जिसमें बाहरी और आंतरिक झिल्ली को पार करना शामिल है। इसके अलावा, सेलुलर वातावरण आणविक भीड़, आयन संरचना और सांद्रता के साथ-साथ आरएनए और डाई सांद्रता के संदर्भ में डाई-एपटामर एसोसिएशन के लिए अलग-अलग स्थितियां पैदा करता है।

परिणामों का समग्र महत्व यह है कि सेलुलर फ्लोरेसेंस 5 मिनट से कम समय में अधिकतम सिग्नल तक पहुंचता है और कम से कम 2 घंटे तक स्थिर रहता है, जो इस समय सीमा में वास्तविक समय आरएनए स्थानीयकरण और जीन अभिव्यक्ति अध्ययन को सक्षम बनाता है। पालक 2 को नियोजित करने वाले आरएनए-आधारित बायोसेंसर के लिए, हमने पहले दिखाया था कि लिगैंड जोड़ के 4-5 मिनट के भीतर एक महत्वपूर्ण प्रतिदीप्ति प्रतिक्रिया देखी जा सकती है, लेकिन अधिकतम सिग्नल तक पहुंचने में अधिक समय (15-30 मिनट) लगता है। एक साथ लिया गया, इन निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि कोशिकाओं में डाई प्रसार आरएनए-आधारित बायोसेंसर के साथ विवो प्रयोगों के लिए व्यावहारिक दर-सीमित कदम नहीं है। अंत में, इस प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल को कोशिकाओं में अन्य फ्लोरोजेनिक आरएनए सिस्टम का विश्लेषण करने के लिए लागू किया जा सकता है।

यहां प्रस्तुत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल को अन्य फ्लोरोजेनिक आरएनए सिस्टम का विश्लेषण करने के लिए लागू किया जा सकता है। इस अध्ययन में विश्लेषण किए गए दो एपटामर, पालक 2 और ब्रोकोली से परे, अन्य फ्लोरोजेनिक आरएनए सिस्टम विकसित किए गए हैं जो विभिन्न उत्सर्जन प्रोफाइल, बेहतर फोटोस्टेबिलिटी, सख्त बाध्यकारी समानताएं और फ्लोरोफोरे को बदलने की क्षमता प्रदान करते हैं (हाल ही में समीक्षा कीगई 1)। उनके प्रतिदीप्ति गुणों के अलावा, विट्रो और कोशिकाओं में इन प्रणालियों के लिए टर्न-ऑन कैनेटीक्स को बेंचमार्क करना विभिन्न सेल जैविक अनुप्रयोगों के लिए उनकी उपयुक्तता का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है। परिणाम एपटामर के संरचनात्मक पूर्व-तह या पुनर्व्यवस्था का भी समर्थन कर सकते हैं। जैसा कि चर्चा की गई है, कुछ संशोधनों के साथ, इन प्रोटोकॉल को आरएनए-आधारित बायोसेंसर8 का विश्लेषण करने के लिए भी लागू किया गया है।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को एमसीएच को निम्नलिखित अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया था: एनएसएफ-बीएसएफ 1815508 और एनआईएच आर 01 जीएम 124589। एमआरएम को आंशिक रूप से प्रशिक्षण अनुदान एनआईएच टी 32 जीएम 122740 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Thermo Fischer Scientific BP160500
Agarose gel electrophoresis equipment Thermo Fischer Scientific B1A-BP
Alpha D-(+)-lactose monohydrate Thermo Fischer Scientific 18-600-440
Amber 1.5 mL microcentrifuge tubes Thermo Fischer Scientific 22431021
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) Sigma-Aldrich A4418
Attune NxT Flow cytometer Thermo Fischer Scientific A24861
Attune 1x Focusing Fluid Thermo Fischer Scientific A24904
Attune Shutdown Solution Thermo Fischer Scientific A24975
Attune Performance Tracking Beads Thermo Fischer Scientific 4449754
Attune Wash Solution Thermo Fischer Scientific  J24974
Boric acid Sigma-Aldrich B6768
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
Carbenicillin disodium salt Sigma-Aldrich C3416
Chlorine Bleach Amazon B07J6FJR8D
Corning Costar 96-well plate Daigger Scientific EF86610A
Culture Tubes, 12 mm x 75 mm, 5 mL with attached dual position cap Globe Scientific 05-402-31
DFHBI Sigma-Aldrich SML1627
DFHBI-1T Sigma-Aldrich SML2697
D-Glucose (anhydrous) Acros Organics AC410955000
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich DTT-RO
DNA loading dye New England Biolabs B7025S
DNA LoBind Tubes (2.0 mL) Eppendorf 22431048
dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP New England Biolabs N0446S
EDTA, pH 8.0 Gibco, Life Technologies AM9260G
Ethanol (EtOH) Sigma-Aldrich E7023
Filter-tip micropipettor tips Thermo Fischer Scientific AM12635, AM12648, AM12655, AM12665
FlowJo Software BD Biosciences N/A FlowJo v10 Software
Fluorescent plate reader with heating control VWR 10014-924
Gel electrophoresis power supply Thermo Fischer Scientific EC3000XL2
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Glycogen AM95010 Thermo Fischer Scientific AM95010
GraphPad Prism Dotmatics N/A Analysis software from Academic Group License 
Heat block  Thomas Scientific 1159Z11
HEPES Sigma-Aldrich H-4034
Inorganic pyrophosphatase Sigma-Aldrich I1643-500UN
Low Molecular Weight DNA Ladder New England Biolabs N3233L Supplied with free vial of Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS (NEB #B7025).
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2) Sigma-Aldrich M2670
Magnesium sulfate (MgSO4) Fisher Scientific MFCD00011110
Microcentrifuge tubes (1.5 mL) Eppendorf 22363204
Microcentrifuge with temperature control Marshall Scientific EP-5415R
Micropipettors Gilson FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M
Micropipettor tips Sigma-Aldrich Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR
Millipore water filter with BioPak unit Sigma-Aldrich CDUFBI001, ZRQSVR3WW
Narrow micropipettor pipette tips DOT Scientific RN005R-LRS
PBS, 10x Thermo Fischer Scientific BP39920
PCR clean-up kit Qiagen 28181
PCR primers and templates Integrated DNA technologies
PCR thermocycler for thin-walled PCR tubes Bio-Rad 1851148
PCR thermocycler for 0.5 mL tubes Techne 5PRIME/C
pET31b-T7-Spinach2 Plasmid Addgene Plasmid #79783
Phusion High-Fidelity DNA polymerase  New England Biolabs M0530L Purchase of Phusion High-Fideldity Enzyme is supplied with 5x Phusion HF Buffer, 5x Phusion GC Buffer, and MgCl2 and DMSO solutions.
Polyacrylamide gel electrophoresis gel comb, C.B.S. Scientific C.B.S. Scientific VGC-1508
Polyacrylamide gel electrophoresis equipment C.B.S. Scientific ASG-250
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9333
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655
Razor blades Genesee Scientific 38-101
rNTPs: ATP, CTP, GTP, UTP New England Biolabs N0450L
SDS Sigma-Aldrich L3771
Short wave UV light source Thermo Fischer Scientific 11758221
Sodium carbonate (Na2CO3) Sigma-Aldrich S7795
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S8045
Sodium phosphate dibasic, anhydrous Thermo Fischer Scientific S375-500
SoftMax Pro Molecular Devices N/A SoftMax Pro 6.5.1 (platereader software) obtained through Academic Group License
Sterile filter units Thermo Fischer Scientific 09-741-88
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
SYBR Safe DNA gel stain Thermo Fischer Scientific S33102
TAE buffer for agarose gel electrophoresis Thermo Fischer Scientific AM9869
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
Tris base Sigma-Aldrich TRIS-RO
Tryptone (granulated) Thermo Fischer Scientific M0251S
T7 RNA polymerase New England Biolabs M0251S
Urea-PAGE Gel system  National Diagnostics EC-833
UV fluorescent TLC plate Sigma-Aldrich 1.05789.0001
UV/Vis spectrophotometer Thermo Fischer Scientific ND-8000-GL
Vortex mixer Thermo Fischer Scientific 2215415
Xylene cyanol Sigma-Aldrich X4126
Yeast Extract (Granulated) Thermo Fischer Scientific BP9727-2

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References

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