Summary
Il protocollo presenta due metodi per determinare la cinetica degli aptameri fluorogenici dell'RNA Spinaci2 e Broccoli. Il primo metodo descrive come misurare la cinetica dell'aptamero fluorogenico in vitro con un lettore di piastre, mentre il secondo metodo descrive in dettaglio la misurazione della cinetica dell'aptamero fluorogenico nelle cellule mediante citometria a flusso.
Abstract
Gli aptameri di RNA fluorogenico sono stati applicati nelle cellule vive per etichettare e visualizzare gli RNA, riferire sull'espressione genica e attivare biosensori fluorescenti che rilevano i livelli di metaboliti e molecole di segnalazione. Per studiare i cambiamenti dinamici in ciascuno di questi sistemi, è auspicabile ottenere misurazioni in tempo reale, ma l'accuratezza delle misurazioni dipende dalla cinetica della reazione fluorogenica che è più veloce della frequenza di campionamento. Qui, descriviamo i metodi per determinare la cinetica di accensione in vitro e cellulare per gli aptameri di RNA fluorogenico utilizzando un lettore di piastre dotato rispettivamente di un iniettore di campioni e di un citometro a flusso. Mostriamo che la cinetica in vitro per l'attivazione della fluorescenza degli aptameri di Spinaci2 e Broccoli può essere modellata come reazioni di associazione a due fasi e avere diverse costanti di velocità di fase rapida di 0,56 s-1 e 0,35 s-1, rispettivamente. Inoltre, dimostriamo che la cinetica cellulare per l'attivazione della fluorescenza degli Spinaci2 in Escherichia coli, che è ulteriormente limitata dalla diffusione del colorante nei batteri Gram-negativi, è ancora sufficientemente rapida da consentire una frequenza di campionamento accurata sulla scala temporale minuto. Questi metodi per analizzare la cinetica di attivazione della fluorescenza sono applicabili ad altri aptameri di RNA fluorogenico che sono stati sviluppati.
Introduction
Le reazioni fluorogeniche sono reazioni chimiche che generano un segnale di fluorescenza. Gli aptameri di RNA fluorogenico svolgono tipicamente questa funzione legando un colorante a piccole molecole per migliorare la sua resa quantica di fluorescenza (Figura 1A)1. Sono stati sviluppati diversi sistemi di aptameri di RNA fluorogenici costituiti da specifiche sequenze di aptameri di RNA e dai corrispondenti ligandi coloranti1. Gli aptameri di RNA fluorogenico sono stati aggiunti ai trascritti dell'RNA come tag fluorescenti che consentono l'imaging di cellule vive di mRNA e RNA non codificanti 2,3,4. Sono stati anche posizionati dopo sequenze promotrici come reporter fluorescenti di espressione genica, simile all'uso della proteina fluorescente verde (GFP) come reporter, tranne che la funzione di segnalazione è a livello di RNA 5,6. Infine, gli aptameri fluorogenici dell'RNA sono stati incorporati nei biosensori fluorescenti basati sull'RNA, progettati per innescare la reazione fluorogenica in risposta a una specifica piccola molecola. Sono stati sviluppati biosensori fluorescenti basati su RNA per l'imaging di cellule vive di vari metaboliti non fluorescenti e molecole di segnalazione 7,8,9,10,11.
C'è un crescente interesse nello sviluppo di aptameri di RNA fluorogenici per visualizzare i cambiamenti dinamici nella localizzazione dell'RNA, nell'espressione genica e nei segnali di piccole molecole. Per ciascuna di queste applicazioni, è auspicabile ottenere misurazioni in tempo reale, ma l'accuratezza delle misurazioni dipende dalla cinetica della reazione fluorogenica che è più veloce della frequenza di campionamento. Qui, descriviamo i metodi per determinare la cinetica in vitro per gli aptameri fluorogenici dell'RNA Spinaci212 e Broccoli13 utilizzando un lettore di piastre dotato di un iniettore di campione e per determinare la cinetica di accensione cellulare per Spinaci2 espressa in Escherichia coli utilizzando un citometro a flusso. Questi due aptameri di RNA sono stati scelti perché sono stati applicati per studiare la localizzazione dell'RNA 2,3,4, sono stati utilizzati nei reporter5,6 e nei biosensori 7,8,9,10,11, e i corrispondenti ligandi coloranti (DFHBI o DFHBI-1T) sono disponibili in commercio. Un riassunto delle loro proprietà in vitro determinate in letteratura è riportato nella Tabella 1 4,13,14, che ha informato lo sviluppo del protocollo (ad esempio, le lunghezze d'onda e le concentrazioni di colorante utilizzate). Questi risultati dimostrano che le reazioni fluorogeniche influenzate dagli aptameri dell'RNA sono rapide e non dovrebbero impedire misurazioni accurate per le applicazioni biologiche cellulari desiderate.
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Protocol
1. Esperimento di cinetica in vitro
- Preparazione di modelli di DNA mediante PCR
- Impostare le reazioni PCR: Per preparare le reazioni PCR, combinare i seguenti reagenti in una provetta PCR a parete sottile:
33 μL di acqua bidistillata (ddH2O)
10 μL di tampone 5x per DNA polimerasi ad alta fedeltà
5 μL di 2 mM ciascuno desossiribonucleoside trifosfato (dNTP)
0,5 μL di primer forward da 40 μM
0,5 μL di primer inverso da 40 μM
0,5 μL (10-100 ng) di modello di DNA (solo per Spinaci2 PCR; I primer per broccoli si sovrappongono)
0,5 μL di DNA polimerasi ad alta fedeltà (aggiungere per ultimo)
NOTA: Gli oligonucleotidi sintetici vengono spesso spediti a secco. Per preparare le soluzioni stock, aggiungere un volume noto (100 μL raccomandati) di ddH2O e misurare l'A260 di quella soluzione per determinare la concentrazione secondo la legge di Beer, dove il coefficiente di estinzione può essere calcolato dalle regole del vicino più vicino online. Questa soluzione madre può quindi essere utilizzata per rendere le diluizioni appropriate per l'uso nella PCR. - Eseguire il protocollo del termociclatore.
- Utilizzare il seguente protocollo termociclatore per amplificare i modelli di DNA di spinaci2 e broccoli a lunghezza intera:
Denaturazione iniziale:98 °C per 2 min
35 cicli:
Denaturazione:98 °C denaturazione per 15 s
Ricottura:72 °C per 30 s
Estensione:72 °C per 30 s
Estensione finale: 72 °C per 5 min. - Dopo la reazione, analizzare una piccola aliquota del prodotto con gel di agarosio al 2% insieme a una scala a basso peso molecolare (intervallo di dimensioni: 25-766 nucleotidi) per confermare la presenza del prodotto di DNA desiderato.
- Purificare il prodotto mediante kit di estrazione del gel o di pulizia PCR disponibili in commercio ed eluire con ddH2O o il tampone fornito dal produttore.
NOTA: Quando si sceglie un kit di pulizia PCR, assicurarsi che il limite di peso molecolare della colonna sia abbastanza basso da trattenere i broccoli T7 (81 nucleotidi), altrimenti il prodotto PCR andrà perso.
NOTA: Punto di pausa opzionale: conservare il DNA a -20 °C.
- Utilizzare il seguente protocollo termociclatore per amplificare i modelli di DNA di spinaci2 e broccoli a lunghezza intera:
- Impostare le reazioni PCR: Per preparare le reazioni PCR, combinare i seguenti reagenti in una provetta PCR a parete sottile:
- Preparazione dell'RNA di spinaci2 e broccoli mediante trascrizione in vitro (IVT)
- Impostare le reazioni di trascrizione.
- Per preparare una reazione di trascrizione da 100 μL, combinare i seguenti reagenti in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml: 10 μL di tampone trascrizionale 10x + 20 μL di trifosfato ribonucleosidico 10 mM (rNTPs) + 1-64 μL di DNA template (totale di 1 μg) + 2 μL di pirofosfatasi inorganica + ddH 2 O a 98 μL +2μL di T7 RNA polimerasi (aggiungere per ultimo).
- Incubare questa reazione per 4 ore a 37 °C. Estinguere la reazione aggiungendo 100 μL di 2x tampone di carico su gel ureico (2x ULB), composto da 20% di saccarosio, 0,1% di sodio dodecilsolfato (SDS), 1x tampone Tris-Borato-EDTA (1x TBE) e ~18 M urea.
NOTA: Punto di pausa opzionale: conservare la reazione spenta a -20 °C.
- Impostare le reazioni di trascrizione.
- Elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE) purificazione dell'RNA
- PAGE purificazione dell'RNA di Spinaci2 e Broccoli
ATTENZIONE: L'acrilammide non polimerizzata (liquida o in polvere) è estremamente tossica. Se si pesa l'acrilammide in polvere, farlo in una cappa aspirante. Indossare sempre dispositivi di protezione adeguati e rimuovere immediatamente i guanti contaminati da polvere o soluzione di acrilammide, lavandosi accuratamente le mani. Se l'acrilammide viene a diretto contatto con la pelle, lavare l'area esposta per almeno 15 minuti con acqua e sapone. Se l'acrilammide viene a contatto diretto con gli occhi, sciacquarli con acqua per 15 minuti.- Preparare il gel PAGE: per rimuovere trascrizioni abortive indesiderate e rNTP non reagiti dal prodotto a lunghezza intera, preparare un gel urea-poliacrilammide al 6%. In generale, i gel da 28 cm x 16,5 cm x 1,5 mm possono essere utilizzati con un pettine a 8 pozzetti. Impostare l'apparecchiatura per gel ed elettroforesi, utilizzando 1x tampone TBE per riempire i serbatoi.
- Caricare campioni di RNA nel gel PAGE: caricare il gel con una reazione temprata di 200 μL per corsia. In una corsia separata, caricare 2x ULB con coloranti tracker xilene cianolo e blu di bromofenolo, che migrano nel gel a 106 nucleotidi e 26 nucleotidi, rispettivamente15. Lasciare una corsia vuota tra ogni campione per evitare potenziali contaminazioni nelle fasi successive.
- Eseguire il gel PAGE: Per separare 95-nt Spinaci2 e 49-nt Broccoli dai rispettivi prodotti troncati, eseguire il gel per 1,5-2 ore a 25 W, a quel punto il colorante blu di bromofenolo sarà migrato ~ 5/6 della lunghezza del gel.
- Visualizza i campioni di RNA nel gel PAGE: smontare le lastre di vetro attorno al gel e coprire il gel con un involucro di plastica su entrambi i lati, etichettando le corsie sull'involucro. Visualizza le bande di RNA in una stanza buia mediante ombreggiatura UV posizionando il gel avvolto su una piastra TLC fluorescente sotto la luce UV. Delinea rapidamente il bordo delle bande di RNA corrispondenti al prodotto con un pennarello e spegni la lampada UV per ridurre al minimo i danni causati dall'esposizione ai raggi UV.
- Eliminare ed estrarre il/i campione/i di RNA dal gel PAGE: con una lama di rasoio fresca per ogni campione, asportare le fasce di prodotto desiderate, tagliare a dadini ~ 1 mm e aggiungere i pezzi di gel in una provetta da microcentrifuga da 2 ml con 500 μL di tampone di ammollo per estrarre l'RNA su un rotatore per 2 ore a temperatura ambiente (RT) o durante la notte a 4 °C.
NOTA: Punto di pausa opzionale: il campione può essere conservato a -20 °C. - Precipitare l'RNA
- Per separare i pezzi di gel dall'RNA estratto in tampone, centrifugare il campione a 13.000 x g per 20 minuti a 4 °C, quindi utilizzare una pipetta a punta stretta per estrarre il surnatante e caricarlo in una nuova provetta da microcentrifuga da 2 ml.
- Per precipitare l'RNA, aggiungere 1,5 ml di etanolo ghiacciato e 1 μL di 20 mg/ml di glicogeno, vortice e conservare per almeno 1 ora a -20 °C o -80 °C.
NOTA: Punto di pausa opzionale: l'RNA può essere conservato a -20 °C per alcuni mesi.
- Raccolta del precipitato di RNA: pellettare l'RNA precipitato mediante centrifugazione a 13.000 x g per 20 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante e lasciare che l'etanolo rimanente evapori all'aria aperta (~1 h) prima di risospendere il pellet in 30 μL di tampone ddH2O o 1x TE.
NOTA: Questo processo si traduce tipicamente in una concentrazione finale di RNA di ~10 μM.
NOTA: Punto di pausa opzionale: il campione di RNA può essere conservato a -20 °C per alcuni mesi.
- Determinare le concentrazioni di stock di RNA.
- Preparare un'aliquota di RNA per la reazione di idrolisi.
- Per eseguire questo test, in primo luogo, utilizzare un nano spettrofotometro UV / Vis per determinare l'A260 del campione di RNA stock e fare un'aliquota diluita del campione a ~ 10 unità di assorbanza (AU) in ddH2O.
- Preparare la seguente reazione in una provetta PCR da 0,5 ml: 16 μL di ddH 2 O + 2 μL di tampone 10x Na 2 CO3 +2μLdi aliquota di RNA diluita a ~10 UA. Incubare la reazione per 90 minuti a 95 °C, quindi lasciarla raffreddare a RT.
- Determinare la concentrazione di RNA utilizzando assorbanze nucleotidiche: misurare l'A260 di questo campione con un nanospettrofotometro UV/Vis e calcolare la concentrazione di RNA utilizzando la seguente formula:
dove c è la concentrazione di RNA, b è la lunghezza del percorso, i è il nucleotide specifico (A, C, G o U), n i è la frequenza del nucleotide i nella sequenza di RNA e ε i è il coefficiente di estinzione molare del nucleotide i. Per determinare la concentrazione originale di RNA stock, moltiplicare c per il fattore di diluizione.
NOTA: Punto di pausa opzionale: l'RNA può essere conservato a -20 °C per alcuni mesi.
- Preparare un'aliquota di RNA per la reazione di idrolisi.
- PAGE purificazione dell'RNA di Spinaci2 e Broccoli
- Esecuzione di un in vitro Saggio cinetico del lettore di piastre
- Impostare il programma di rinaturazione dell'RNA: creare il seguente protocollo di termociclatore selezionando Crea nuovo programma > Aggiungi nuova fase > Aggiungi nuovo passaggio più volte per aggiungere ciascuno dei seguenti passaggi prima di premere Salva:
70 °C per 3 min
65 °C per 45 s
60 °C per 45 s
55 °C per 45 s
50 °C per 45 s
45 °C per 45 s
40 °C per 45 s
35 °C per 45 s
30 °C per 45 s - Rinaturare l'RNA: Per rinaturare gli RNA di spinaci2 e broccoli, preparare 2 μM di ciascun RNA in ddH 2O in una provetta PCR a parete sottile da 0,5 ml, quindi aggiungere un volume uguale di tampone di rinaturazione 2x (80 mM HEPES, pH 7,5 [KOH], 250 mM KCl, 6 mM MgCl2) per produrre soluzioni di RNA 1 μM. Aggiungere i tubi al termociclatore, aprire il programma di rinaturazione salvato e premere Esegui.
NOTA: Se un termociclatore non è disponibile, gli RNA possono invece essere incubati su un blocco di calore a 70 °C per 3 minuti e quindi lasciati raffreddare lentamente a RT sul banco. - Preparare il tampone di reazione di legame: Per preparare il tampone per una reazione di legame aptamero-colorante, creare una miscela master contenente componenti tampone (69,5 μL di ddH 2 O + 4 μL di HEPES 1 M, pH 7,5 [KOH] + 6,2 μL di 2 M KCl + 0,3 μL di 1 M MgCl2). A seconda del numero di campioni e repliche necessari, moltiplicare questi valori per il numero di campioni più uno. In generale, tre repliche per campione di RNA sono soddisfacenti.
- Preparare il lettore di piatti.
- Impostare il programma dell'iniettore del lettore di piastre: sul lettore di piastre a fluorescenza, selezionare Temp e impostare la temperatura desiderata su 37 °C, assicurandosi che la temperatura si sia equilibrata a questo valore ben prima di iniziare gli esperimenti di cinetica. Aprire il software del lettore di piastre, selezionare Impostazioni > Vista acquisizione e immettere il seguente programma per le misurazioni cinetiche:
Loop: Per ogni pozzo
Impostazione di base: 60 letture della linea di base
Impostazioni SmartInject: iniezione da 10 μL (che avverrà dopo la lettura della linea di base)
La fluorescenza (o FL) recita:
Eccitazione: 448 nm (larghezza di banda: 9 nm)
Emissioni: 506 nm (larghezza di banda: 15 nm)
Cartuccia: MONO (n/s 3297)
Calcolo del tempo:
Tempo di lettura totale: 10 min
Intervallo di lettura: 0,5 s
PMT e ottica: 6 lampeggi per lettura
Loop: Prossimo pozzo - Preparare l'iniettore
- Lavare e aspirare l'iniettore: Per preparare l'iniettore del lettore di piastre, selezionare prima Inietta sul lettore di piastre, fornire una piastra di raccolta dei rifiuti al lettore di piastre quando indicato, quindi selezionare Lava e pulire il tubo di iniezione seguendo le istruzioni sul lettore di piastre con 1 mL di volumi di ddH 2 O, 75% etanolo in ddH2O, e poi ddH2O. Quindi, selezionare Aspira, consentendo all'iniettore di espellere il liquido in eccesso.
- Innescare l'iniettore: dopo essere usciti dalla schermata precedente, selezionare Prime per innescare l'iniettore con due volumi da 260 μL di ligando da iniettare per garantire che il ligando puro e concentrato venga aggiunto ai campioni durante gli esperimenti, in questo caso, primo con DFHBI 100 μM in ddH2O.
- Impostare il programma dell'iniettore del lettore di piastre: sul lettore di piastre a fluorescenza, selezionare Temp e impostare la temperatura desiderata su 37 °C, assicurandosi che la temperatura si sia equilibrata a questo valore ben prima di iniziare gli esperimenti di cinetica. Aprire il software del lettore di piastre, selezionare Impostazioni > Vista acquisizione e immettere il seguente programma per le misurazioni cinetiche:
- Eseguire esperimenti di cinetica in vitro : per eseguire un esperimento di cinetica, aggiungere prima 80 μL di master mix tampone di legame precedentemente preparato a un pozzetto di una piastra a fondo chiaro a 96 pozzetti, seguita da 10 μL di RNA rinaturato. Lasciare che questa piastra e la soluzione di DFHBI nell'iniettore si equilibrino a 37 °C per 15 minuti nel lettore di piastre.
- Nelle impostazioni del software del lettore di piastre in Area di lettura, selezionare il pozzo da analizzare, quindi nella scheda Home , selezionare Esegui per eseguire il programma cinetico descritto in precedenza. Ripetere questo processo fino al completamento di tutti gli esperimenti.
NOTA: Criticamente, gli esperimenti di cinetica dovrebbero essere eseguiti un pozzetto alla volta per garantire che la cinetica dell'RNA sia misurata in condizioni identiche tra repliche e campioni. - Lavare l'iniettore: Per rimuovere la soluzione rimanente di DFHBI dal tubo di iniezione, lavare il tubo di iniezione come descritto al punto 1.4.4.2.1 con 1 mL di volumi di ddH 2 O, etanolo al 75% in ddH 2 O e quindiddH2O.
NOTA: punto di pausa opzionale.
- Impostare il programma di rinaturazione dell'RNA: creare il seguente protocollo di termociclatore selezionando Crea nuovo programma > Aggiungi nuova fase > Aggiungi nuovo passaggio più volte per aggiungere ciascuno dei seguenti passaggi prima di premere Salva:
- Analisi della cinetica in vitro di aptameri di RNA fluorogenici.
- Inserimento dei dati nel software di analisi: esporta i dati sperimentali come foglio di calcolo per copiare facilmente i dati per l'elaborazione. Nel software di analisi, creare una nuova tabella di dati in formato XY. Nella colonna X, immettere ogni timepoint di lettura, dove t = 0 è l'ora dell'iniezione di DFHBI. Nella colonna Y, immettere i valori medi di fluorescenza tra le repliche in quel rispettivo punto temporale a partire da t = 0.
- Normalizzare e rappresentare graficamente i dati: per normalizzare i valori di fluorescenza, fare clic su Analizza > elaborazione dati > Normalizza, quindi fare clic su OK. Scegliere di utilizzare i valori più piccoli e più grandi del set di dati per la normalizzazione, per presentare i risultati come frazioni e per rappresentare graficamente i risultati, quindi fare clic su OK. Per creare un grafico della fluorescenza media normalizzata nel tempo, fare clic sull'icona Normalizza di [Nome set di dati] e selezionare Famiglia grafico: XY con solo punti.
NOTA: le barre di errore possono essere utili da vedere nei casi in cui viene rappresentato un piccolo numero di punti temporali. Se lo si desidera, quando si sceglie una tabella di dati in formato XY, selezionare l'opzione sotto "Y" per immettere i valori di replica in colonne affiancate. Rappresentando graficamente la tabella risultante con le opzioni predefinite selezionate, verrà prodotto un grafico con barre di errore. - Eseguire il raccordo della curva per ottenere i parametri cinetici: per adattare una curva ai dati cinetici, fare clic su Analizza > Analizza dati e selezionare Regressione non lineare (adattamento curva) nella scheda Analisi XY . Nella scheda Modello , fare clic su Associazione esponenziale > bifase per adattare i dati cinetici con la seguente equazione di associazione a due fasi:
dove Y è la fluorescenza al tempo X, Y 0 è la fluorescenza a t = 0, K Fast e K Slow sono rispettivamente costanti veloci e lente, e SpanFast e SpanSlow sono gli intervalli di accensione della fluorescenza rappresentati rispettivamente dalla velocità veloce e lenta (vedi risultati rappresentativi, Figura 1). Fare clic sulla scheda Adattamento Nonlin per visualizzare le costanti di velocità, i valori t1/2 e i valori PercentFast.
NOTA: per ottenere una deviazione standard per tutti questi valori, le singole repliche dell'esperimento del lettore di piastre possono essere elaborate nello stesso modo descritto sopra.
2. Esperimento di cinetica cellulare
- Preparazione di ceppi di E. coli
- Trasformare le cellule di E. coli BL21 Star (DE3) con ~100 ng di costrutto pET31b tRNA-Spinaci2 seguendo il protocollo del produttore.
NOTA: Il costrutto plasmidico è disponibile in commercio (Plasmid #79783). - Placcare le cellule su piastre di agar LB contenenti carbenicillina (Carb: 50 mg/ml) e incubare a 37 °C per 12-16 ore. Le cellule contenenti plasmidi cresceranno come colonie sulla piastra.
NOTA: Punto di pausa opzionale: le celle BL21 Star trasformate su piastre possono essere conservate a 4 °C avvolte in parafilm per 1 settimana.
- Trasformare le cellule di E. coli BL21 Star (DE3) con ~100 ng di costrutto pET31b tRNA-Spinaci2 seguendo il protocollo del produttore.
- Cellule in crescita e induzione dell'espressione di aptameri di RNA fluorogenico
- Inoculare una coltura di 2 mL di mezzi non inducenti (NI) contenenti carbenicillina (Carb: 50 mg/ml) con una singola colonia delle cellule BL21 Star trasformate. Ripeti questa operazione per almeno tre repliche biologiche. Incubare le colture a 37 °C in un incubatore/agitatore a 250 rpm per 22-24 h.
NOTA: Punto di pausa opzionale: Le cellule coltivate nei supporti NI mantengono il plasmide e possono essere conservate a 4 °C per 1 settimana. - Dopo la crescita nei terreni NI, diluire la coltura 100x in un nuovo 3 mL di terreno di autoinduzione (AI) ZYP-5052 contenente carbenicillina (Carb: 50 mg/mL). Far crescere le cellule a 37 °C in un incubatore/agitatore a 250 rpm per 16-18 h per indurre l'espressione.
NOTA: Il tipico OD600 per le colture varia da 2,0-3,3 dopo 18 ore di crescita. L'intervallo di densità cellulare ottimale è compreso tra 2,5-3,0.
- Inoculare una coltura di 2 mL di mezzi non inducenti (NI) contenenti carbenicillina (Carb: 50 mg/ml) con una singola colonia delle cellule BL21 Star trasformate. Ripeti questa operazione per almeno tre repliche biologiche. Incubare le colture a 37 °C in un incubatore/agitatore a 250 rpm per 22-24 h.
- Esecuzione dell'esperimento di cinetica cellulare
- Impostare il citometro a flusso.
- Accendere il citometro a flusso e il computer collegati allo strumento. Una volta effettuato l'accesso al software per il citometro a flusso, nella scheda Strumento , fare clic sull'icona Avvio . Seguire i passaggi indicati nella schermata del software per garantire la corretta inizializzazione della strumentazione.
NOTA: Alcuni citometri a flusso chiamano la sequenza di avvio dello strumento Priming. Assicurati di seguire il protocollo del produttore per il citometro a flusso che verrà utilizzato per l'esperimento. - Eseguire un test delle prestazioni (se applicabile). Nella scheda Menu principale , fare clic su Test delle prestazioni. In un tubo di coltura, aggiungere tre gocce delle perle di monitoraggio delle prestazioni del produttore in 3 ml di fluido di messa a fuoco.
- Posizionare il tubo di coltura nel sollevatore del tubo del campione e sollevare il sollevatore. Prima di fare clic su Esegui test prestazioni, assicurarsi che il lotto # del tubo delle perline di tracciamento corrisponda a quello indicato nella schermata di configurazione del test delle prestazioni . Fare clic su Test delle prestazioni per eseguire il test.
- Impostare il software del citometro a flusso per questo esperimento con i seguenti parametri di acquisizione per la fluorescenza a singola cellula:
Eccitazione laser: 488 nm
Canale di emissione: GFP (chiamato anche FITC)
Volume di acquisizione: 40 μL (con un volume di assorbimento totale di 90 μL)
Portata: 200 μL/ min
Conteggio delle cellule per ogni misurazione: 30.000
Impostazioni dello strumento:
Voltaggio:
FSC: 480 V
SSC: 400 V
BL1: 540 V
BL2: 392 V
BL3: 422 V
- Accendere il citometro a flusso e il computer collegati allo strumento. Una volta effettuato l'accesso al software per il citometro a flusso, nella scheda Strumento , fare clic sull'icona Avvio . Seguire i passaggi indicati nella schermata del software per garantire la corretta inizializzazione della strumentazione.
- Impostare i file sperimentali.
- Creare un nuovo file dell'esperimento nella scheda Esplora esperimenti facendo clic con il pulsante destro del mouse sul nome utente del citometro a flusso. Seleziona Nuovo esperimento nella finestra a discesa. Quando viene visualizzata una nuova finestra sullo schermo del computer, selezionare OK.
- Nel nuovo file dell'esperimento, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla cartella "Gruppo" e selezionare Aggiungi nuova provetta di esempio. Etichettare le provette campione per ogni punto temporale specifico e replicarle facendo clic con il pulsante destro del mouse su Campione e selezionando Rinomina nel menu a discesa. Ripetere questo passaggio per il numero totale di repliche e punti temporali per il corso di tempo previsto dello studio.
- Preparare una soluzione cellulare diluita: in una nuova provetta di coltura, aggiungere 1,5 ml di 1x soluzione PBS. Quindi, aggiungere 3 μL di cellule indotte nei supporti AI nella soluzione 1x PBS per creare una soluzione cellulare diluita. Ripetere questo passaggio per ogni replica biologica in diverse provette di coltura.
- Misurare la fluorescenza di fondo delle cellule: prima di aggiungere il colorante, prendere le letture di ogni tubo di coltura biologico replicato contenente cellule in 1x soluzione PBS. In questo modo viene misurato lo sfondo fluorescente delle cellule per osservare la piega accendersi nel tempo una volta aggiunto il colorante.
- Per effettuare una lettura, posizionare il tubo di coltura nel sollevatore del tubo del campione e sollevare il sollevatore a mano fino all'ago per iniezione del campione. Selezionate il file di esempio appropriato nella scheda Pannello raccolta e fate clic su Registra.
- Al termine della corsa, abbassare il sollevatore del tubo campione con il tubo di coltura a mano. Questo avvierà una fase di risciacquo che laverà il sistema fluidico e ridurrà al minimo il trascinamento tra ciascun campione biologico replicato. I dati verranno salvati automaticamente sul computer al termine dell'esecuzione.
- Ripetere i passaggi all'interno del punto 2.3.4 per misurare il fondo fluorescente cellulare per almeno tre repliche biologiche. Per passare al file di esempio successivo, selezionare il file di esempio successivo facendo clic sull'icona della freccia destra accanto al nome del tubo di esempio sotto l'icona Record .
- Misurare la fluorescenza nei punti temporali per le cellule con colorante.
- Aggiungere 1,4 μL di uno stock di colorante concentrato (50 mM DFHBI-1T in DMSO) in 1x soluzione PBS con celle per ottenere una concentrazione finale di 50 μM DFBHI-1T. Quindi, fissare il coperchio del tubo di coltura, quindi invertire i tubi di coltura 3x-5x per miscelare uniformemente la soluzione prima di eseguire la prima lettura del punto di tempo.
NOTA: La percentuale totale di DMSO all'interno delle provette di coltura per E. coli non deve superare il 10%, poiché ciò può influire sulla vitalità cellulare16. - Rimuovere il coperchio e inserire il tubo di coltura nel sollevatore del tubo del campione. Sollevare manualmente il supporto fino all'ago per iniezione del campione e, sotto il file di campione appropriato, fare clic sull'icona Registra . Inoltre, avviare un timer premendo Start per l'esperimento.
- Abbassare manualmente il sollevatore di tubi dopo aver completato la corsa e ripetere i passaggi 2.3.5.1-2.3.5.2. (con il timer in funzione) aggiungendo 1,4 μL di DFHBI-1T concentrato, invertendo le provette di coltura e prendendo letture per tutte le repliche biologiche rimanenti. Queste prime registrazioni saranno le letture ottenute a 0 min per tutte le repliche biologiche. Fallo uno alla volta per ogni replica biologica.
NOTA: prendere nota del momento in cui viene premuta l'acquisizione della citometria a flusso record. Aderisci a questo tempo sfalsando per i punti temporali nel corso dell'esperimento. - Continuare a prendere le letture sollevando le provette di coltura nel sollevatore del tubo del campione fino all'ago per iniezione del campione, selezionando il file di campione appropriato, facendo clic su Registra e abbassando manualmente il sollevatore al termine di ogni corsa. Fallo per tutti i punti temporali aggiuntivi e le repliche biologiche testate. Ripetere i passaggi fino al completamento dell'esperimento.
NOTA: Tenere i campioni fuori dalla luce per evitare il fotosbiancamento di DFHBI-1T in soluzione coprendo i campioni con un foglio di alluminio.
- Aggiungere 1,4 μL di uno stock di colorante concentrato (50 mM DFHBI-1T in DMSO) in 1x soluzione PBS con celle per ottenere una concentrazione finale di 50 μM DFBHI-1T. Quindi, fissare il coperchio del tubo di coltura, quindi invertire i tubi di coltura 3x-5x per miscelare uniformemente la soluzione prima di eseguire la prima lettura del punto di tempo.
- Misurare la fluorescenza nei punti temporali per le cellule senza colorante (Control).
- Eseguire i protocolli di pulizia appropriati per il citometro a flusso prima di ripetere nuovamente l'esperimento con controlli negativi seguendo il protocollo del produttore. Questa operazione viene eseguita per ridurre al minimo qualsiasi riporto dall'esperimento precedente all'esperimento di analisi del punto temporale di controllo. Di seguito sono riportati i passaggi seguiti per il citometro a flusso tra gli esperimenti:
- Posizionare manualmente un tubo di coltura vuoto nel sollevatore di tubi, sollevare il supporto del tubo e fare clic sull'icona Unclog nella scheda Strumento . Questo eseguirà un backflush nel sistema fluidico per pulire eventuali campioni appiccicosi. Abbassare il supporto del tubo a mano e rimuovere il tubo una volta terminata la sequenza Unclog .
- Con una nuova provetta di coltura, aggiungere 3 ml di una soluzione di candeggina al 10%, inserire la provetta di coltura nel supporto del tubo e sollevare manualmente il supporto fino all'ago per iniezione del campione. Inoltre, posizionare una piastra pulita a 96 pozzetti nell'autocampionatore, se applicabile al citometro a flusso.
- Fare clic sull'icona Sanitize SIP /Sanitize Autosampler SIP per eseguire una sequenza di pulizia con candeggina al 10% in tutto il sistema fluidico. Abbassare il supporto del tubo per completare la sequenza di pulizia.
- Impostare i file di esempio per l'analisi del punto temporale di controllo eseguita seguendo le istruzioni riportate nel punto 2.3.3.
- In una nuova provetta di coltura, preparare una soluzione cellulare diluita in 1,5 ml di soluzione 1x PBS. Aggiungere 3 μL delle cellule indotte nei mezzi AI nella soluzione 1x PBS per creare una soluzione cellulare diluita. Ripetere questo passaggio per ogni replica biologica.
- Aggiungere 1,4 μL di DMSO nella provetta di coltura uno alla volta alla soluzione 1x PBS con cellule e testare gli stessi punti temporali. Fissare il coperchio del tubo di coltura, quindi invertire i tubi di coltura 3x-5x per miscelare uniformemente la soluzione prima di eseguire la prima lettura del punto temporale. Fallo uno alla volta per ogni replica biologica.
- Seguire lo stesso protocollo per l'analisi delle celle di controllo come per le cellule con colorante, utilizzando i passaggi 2.3.5.2-2.3.5.4.
- Eseguire i protocolli di pulizia appropriati per il citometro a flusso prima di ripetere nuovamente l'esperimento con controlli negativi seguendo il protocollo del produttore. Questa operazione viene eseguita per ridurre al minimo qualsiasi riporto dall'esperimento precedente all'esperimento di analisi del punto temporale di controllo. Di seguito sono riportati i passaggi seguiti per il citometro a flusso tra gli esperimenti:
- Spegnimento del citometro a flusso: seguire il protocollo del produttore per il corretto spegnimento della strumentazione. Per il citometro a flusso, lo strumento è preparato per lo spegnimento nel modo seguente:
- Eseguire il protocollo di pulizia iniziale per il citometro a flusso seguendo i passaggi 2.3.6.1.1-2.3.6.1.3.
- Sostituire il tubo di coltura con una soluzione di candeggina al 10% con un tubo di coltura con 3 ml di fluido di messa a fuoco. Sollevare manualmente il supporto del tubo e, sotto l'icona Shutdown , fare clic sul menu a discesa e selezionare Completo.
NOTA: punto di pausa opzionale.
- Impostare il citometro a flusso.
- Analisi dei dati di citometria a flusso
- Esportare tutti i file FCS per l'analisi. Aprire i file FCS con un software di analisi della citometria a flusso.
- Utilizzando uno dei file FCS solo cella, generare un gate dal dot plot FSC (Forward Scatter) e SSC (Side Scatter) (FSC-Area/SSC-Area), utilizzando entrambi gli assi di log per escludere eventuali segnali dai detriti. Per creare questo cancello, fare clic sull'icona AutoGate sul software di analisi della citometria a flusso e chiamarlo Gate 1. Applicare questa stessa porta a tutti gli esempi testati nella scheda Tutti i campioni nell'area di lavoro di elaborazione dati. Ciò comporterà l'elaborazione del Gate 1 sotto tutti i file FCS.
- Creare un nuovo file di sottoinsieme con il file FCS solo cella utilizzato nel passaggio 2.4.2 facendo doppio clic su di esso. Modificate le impostazioni degli assi in FSC-Area/FSC-Height, con entrambi gli assi logaritmici. Fare clic sull'icona AutoGate sul software di analisi della citometria a flusso per generare un cancello ovale, chiamandolo Gate 2. Applicare questo gate come sottoinsieme sotto il gate impostato al punto 2.4.2 a tutti i campioni testati. In questo modo tutti gli esempi avranno Gate 1 > Gate 2 associati a ciascun file FCS.
- Creare un altro file di sottoinsieme con entrambi i gate impostati nel passaggio 2.4.2 e nel passaggio 2.4.3 applicati facendo doppio clic su Gate 2. Modificare le impostazioni dell'asse in FSC-Area/Istogramma. Applicare questo gate dell'istogramma come sottoinsieme a tutti i campioni testati, ottenendo che tutti i campioni abbiano Gate 1 > Gate 2 > Gate 2 associati a ciascun file FCS.
NOTA: gli istogrammi possono essere rinominati da Gate 2 a Histogram per facilitare lo spostamento degli istogrammi nella finestra di layout, nonché per creare più organizzazione con l'elaborazione dei dati. - Per analizzare i valori di intensità media di fluorescenza (MFI), aprire la finestra del layout. Fare clic e trascinare le porte dell'istogramma per ogni punto temporale nella finestra del layout.
- Eseguire un'analisi statistica per "∑ Mean: BL1-A" (GFP) per ogni campione testato per visualizzare i risultati MFI nella finestra di layout.
- Calcolare la deviazione standard per i valori MFI per analisi del punto temporale per almeno tre repliche biologiche indipendenti.
- Salvare gli istogrammi e i valori MFI per ogni punto temporale esportando la finestra di layout come file PDF.
NOTA: punto di pausa opzionale.
- Dati di citometria a flusso grafico
- Aprire il file PDF contenente gli istogrammi e i valori MFI per ogni punto temporale. I valori MFI verranno copiati in un software di analisi dei dati. Nel software di rappresentazione grafica dei dati, creare una nuova tabella dati nel formato XY.
- Selezionare questa opzione per creare una tabella XY con la seguente selezione:
Tabella dati: immettere o importare dati in una nuova tabella
Opzioni:
X: Tempi trascorsi
Y: Immettere (da tre a quattro) valori di replica in sottocolonne affiancate - Etichettare sull'asse X tutti i punti temporali per l'esperimento e le esecuzioni di controllo.
- Nel gruppo A, inserire i valori MFI per tutte le repliche biologiche in ogni punto temporale per l'analisi di fluorescenza delle cellule con il colorante aggiunto.
- Nel gruppo B, inserire i valori MFI per tutte le repliche biologiche in ogni punto temporale per l'analisi delle cellule senza colorante (DMSO) aggiunto.
- Per osservare i risultati, fare clic su [Inserisci nome set di dati] nella scheda Grafici . Questo mostrerà i punti dati come mezzi, con barre di errore che rappresentano la deviazione standard (s.d.) in ogni punto temporale. L'asse X rappresenta il tempo trascorso e l'asse Y rappresenta i valori MFI.
- Selezionare questa opzione per creare una tabella XY con la seguente selezione:
- Aprire il file PDF contenente gli istogrammi e i valori MFI per ogni punto temporale. I valori MFI verranno copiati in un software di analisi dei dati. Nel software di rappresentazione grafica dei dati, creare una nuova tabella dati nel formato XY.
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Representative Results
Cinetica in vitro
Le sequenze dei modelli di DNA e dei primer, che vengono acquistati come oligonucleotidi sintetici, sono mostrate nella Tabella 2 e le ricette dei reagenti sono mostrate nel file supplementare 1. L'amplificazione PCR viene utilizzata per aumentare la quantità di modello di DNA con il promotore T7, che è necessaria per la successiva reazione di trascrizione in vitro (IVT). Inoltre, l'amplificazione PCR può essere utilizzata per due scopi nella stessa reazione: per generare il modello di DNA di broccoli a lunghezza intera mediante estensione di primer, nonché per ingrandire il modello di DNA.
Dopo la reazione IVT per sintetizzare l'RNA, la purificazione PAGE rimuoverà eventuali trascrizioni troncate indesiderate, prodotti degradati e rNTP non reagiti dal prodotto RNA a lunghezza intera. Questo tipo di purificazione è preferito perché gli RNA troncati o degradati causeranno la determinazione imprecisa delle concentrazioni di RNA. Poiché le basi nucleotidiche assorbono la luce UV, le bande di RNA e le rNTP sul gel possono essere visualizzate sotto UV come ombre contro una piastra TLC fluorescente. Pertanto, le bande corrispondenti alla dimensione corretta del prodotto possono essere estratte selettivamente.
Il metodo del vicino più vicino sovrastima i coefficienti di estinzione e, quindi, le concentrazioni di RNA strutturati poiché non tiene conto dell'ipocromaticità dovuta all'accoppiamento di basi17. Pertanto, per determinare concentrazioni accurate di RNA, sono stati eseguiti saggi di idrolisi termica a pH neutro per idrolizzare l'RNA in singoli NMP18. Il coefficiente di estinzione accurato è stato calcolato come somma dei coefficienti di estinzione degli NMP nella sequenza di RNA.
La cinetica del legame di DFHBI a Spinaci2 e Broccoli è stata determinata utilizzando un saggio del lettore di piastre. L'RNA è stato prima rinaturato per garantire che fosse nella corretta conformazione per il legame del colorante. Le condizioni di reazione per il test cinetico del lettore di piastre consistevano in HEPES 40 mM, pH 7,5 (KOH), 125 mM KCl, 3 mM MgCl2, RNA rinaturato 100 nM e 10 μM DFHBI, e la reazione è stata misurata a 37 °C. Questa temperatura e concentrazione di MgCl 2 sono state scelte per imitare le condizioni fisiologiche19, sebbene condizioni di 28 °C e 10 mM MgCl2 possano essere utilizzate anche per migliorare il ripiegamento dell'aptamero.
Entrambi gli aptameri fluorogenici Spinaci2 e Broccoli mostrano una cinetica di associazione bifase per il legame al colorante DFHBI (Figura 2). I dati cinetici erano più adatti per associazione a due fasi rispetto all'associazione monofase per entrambi gli aptameri (Figura supplementare 1). Le costanti di velocità e i valori t1/2 per le associazioni veloce e lenta sono stati determinati dalla curva di adattamento migliore (Tabella 3). È stato anche determinato PercentFast, che descrive quale percentuale della magnitudine di accensione della fluorescenza è rappresentata dalla popolazione di RNA legante DFHBI più veloce.
Gli spinaci2 nello stato competente per il legame mostrano un'accensione più rapida rispetto ai broccoli (t 1/2 = 1,2 s vs2,0 s). La cinetica della seconda fase per entrambi gli aptameri è simile (t1/2 = 180 s) e probabilmente corrisponde a una fase comune di limitazione della velocità per una sottopopolazione del campione (PercentFast = 68% e 60% per Spinaci2 e Broccoli, rispettivamente). Nel complesso, questi risultati mostrano che gli aptameri di spinaci2 e broccoli ben piegati mostrano una cinetica di accensione molto veloce, con l'accensione iniziale semimassima entro 1-2 secondi dall'aggiunta di colorante.
Cinetica cellulare
Le sequenze dei costrutti di DNA, che sono clonati nel plasmide pET31b, sono mostrate nella Tabella 2 e le ricette dei reagenti sono mostrate nel File Supplementare 1. I costrutti di DNA degli aptameri di RNA fluorogenico sono tipicamente contenuti all'interno di un'impalcatura di tRNA per esperimenti cellulari. Il ceppo BL21 Star (DE3) E. coli è un ceppo di espressione con una mutazione nella RNasi E che aumenta la stabilità dell'RNA.
Le misurazioni dei punti temporali di fluorescenza sono state registrate ogni 5 minuti per i primi 45 minuti, seguite da letture a 1 ora, 1,5 ore e 2 ore, per un totale di 12 punti temporali più la lettura della sola cella. Avere l'intervallo di tempo più breve di 5 minuti ha permesso di misurare più repliche biologiche in ogni punto temporale, con una spaziatura regolare tra le misurazioni delle repliche da 30 s a 1 minuto. Il volume totale di cellule diluite in 1x soluzione PBS utilizzata per l'esperimento del corso del tempo era di 1,5 ml.
Le cellule sono state controllate prima di determinare l'intensità media di fluorescenza (MFI) della popolazione di singole cellule. Il gating seleziona un'area sul grafico a dispersione per determinare la popolazione cellulare che verrà analizzata. Questo processo impedisce l'inclusione di detriti o letture multiplette nell'analisi. Per l'analisi di citometria a flusso mostrata, sono stati registrati 30.000 eventi, che hanno portato a 10.000-20.000 eventi analizzati dopo il gating.
La cinetica di fluorescenza cellulare è una funzione sia della diffusione del colorante in E. coli che della cinetica di legame del colorante all'aptamero dell'RNA all'interno dell'ambiente cellulare (Figura 1B). Per le cellule che esprimono Spinaci2-tRNA, è stato osservato che l'intensità media della fluorescenza (MFI) aumenta immediatamente al punto temporale "0", a causa del breve intervallo di tempo (in secondi) tra l'aggiunta del colorante e l'analisi del campione (Figura 3A). Inoltre, la fluorescenza cellulare ha già raggiunto il suo valore massimo di MFI equilibrato (40.441 ± 990) al primo punto temporale di 5 min. Al contrario, le celle di controllo mostrano una bassa fluorescenza di fondo (416) e nessuna variazione nel valore MFI con l'aggiunta di DMSO (Figura 3B). Un confronto tra cellule con colorante e cellule senza colorante rivela che l'attivazione della fluorescenza è 98 volte ± 2 nelle cellule. Nel complesso, questi risultati mostrano che Spinaci2-tRNA espresso nelle cellule di E. coli mostra una rapida cinetica di accensione, con la massima accensione entro meno di 5 minuti dall'aggiunta del colorante.
Figura 1: Schema dell'attivazione della fluorescenza. L'attivazione della fluorescenza avviene quando gli aptameri dell'RNA si legano alle molecole coloranti (A) in vitro e (B) nelle cellule. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Cinetica in vitro degli aptameri fluorogenici. Cinetica rappresentativa in vitro degli aptameri fluorogenici (A,B) Spinaci2 o (C,D) Broccoli modellati mediante associazione bifase, con t = 0 s che rappresenta il punto temporale dell'addizione di DFHBI (concentrazione finale di DFHBI: 10 μM). Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplice copia. Tutte le barre di errore rappresentano deviazioni standard dalla media. Dall'accoppiamento, sono stati ottenuti valori t1/2 sia per le componenti di reazione di associazione veloce che lenta. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Cinetica cellulare rappresentativa di Spinaci2 in uno scaffold di tRNA. (A) Analisi timepoint dell'assorbimento del colorante tRNA-Spinaci2 nel corso di 2 ore. Una linea di base solo cellulare è stata presa prima di aggiungere DFHIB-1T o DMSO. I punti temporali sono stati presi ogni 5 minuti per i primi 45 minuti, seguiti da una lettura del punto temporale a 1 ora, 1,5 ore e 2 ore. Arrow rappresenta quando DFHBI-1T o DMSO è stato aggiunto in una soluzione PBS 1x con celle BL21 Star. La concentrazione finale di DFHBI-1T per l'analisi è di 50 μM. Per il controllo DMSO, l'aggiunta di DMSO era a un volume uguale (1,4 μL) utilizzato per l'aggiunta di colorante DFHBI-1T. (B) Un primo piano dell'analisi del punto temporale di controllo DMSO con cellule BL21 Star E. coli. L'intensità media di fluorescenza (MFI) indica la lettura fluorescente complessiva delle cellule BL21 Star con colorante o DMSO. I dati rappresentano la deviazione media ± standard di tre repliche biologiche. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Coppia aptamero-colorante | Lunghezza (nt) | Massima abs (nm) | Max em (nm) | Coefficiente di estinzione (M-1· cm-1) | Resa quantica | Luminosità | Kd (nm) | Tm (°C) | Riferimento |
| Spinaci2-DFHBI | 95 | 445 | 501 | 26100 | 0.7 | 63 | 1450 | 37 | 4 |
| Spinaci2-DFHBI-1T | 95 | 482 | 505 | 31000 | 0.94 | 100 | 560 | 37 | 13, 14 |
| Broccoli-DFHBI-1T | 49 | 472 | 507 | 29600 | 0.94 | 96 | 360 | 48 | 13 |
Tabella 1: Proprietà fotofisiche e biochimiche precedentemente pubblicate di Spinaci2-DFHBI4, Spinaci2-DFHBI-1T 13,14 e Broccoli-DFHBI-1T 13.
| Promotore Spinaci2 + T7 | 5'-CGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGATGTAACTGAATGAAATGGTGAA GGACGGGTCCAGTAGGCTGCTTCGGCAGCCTACTTGTTGAGTAGAGTGTGAGCTCC GTAACTAGTTACATC-3' |
||
| Promotore Broccoli + T7 | 5'-CGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGgagacggtcgg gtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctc-3' |
||
| Costrutto tRNA-Spinaci2 (nel plasmide pET31b) | 5'-CGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGCCCGGATAGCTCAGTCGGT AGAGCAGCGGCCGGATGTAACTGAATGAAATGGTGAAGGACGGGTCCAGTAGGCT GCTTCGGCAGCCTACTTGTTGAGTAGAGTGTGAGCTCCGTAACTAGTTACATCCGG CCGCGGGTCCAGGGTTCAAGTCCCTGTTCGGGCGCCA TAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTTT-3' |
||
| Spinaci2 Forward Primer | 5'-CGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAG-3' | ||
| Spinaci2 Reverse Primer | 5'-GATGTAACTAGTTACGGAGC-3' | ||
| Broccoli Forward Primer | 5'-CGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGgagacggtcgggtccagatattcgtatctg-3' | ||
| Broccoli Reverse Primer | 5'-gagcccacactactcgacagatacgaatatctggacccgaccgtctc-3' | ||
Tabella 2: Tabella delle sequenze di DNA contenente sequenze di DNA e primer utilizzati per studi in vitro e di cinetica cellulare. Grassetto= promotore T7; Sottolineato = scaffold di tRNA; Tappi = Spinaci2; minuscolo = Broccoli; Grassetto corsivo = terminatore T7.
| Aptamer | Veloce t1/2 (s) | Lento t1/2 (s) | KVeloce (s-1) | KLento (s-1) | Percentuale veloce |
| Spinaci2 | 1,2 ± 0,2 | 180 ± 10 | 0,56 ± 0,07 | 0,0039 ± 0,0002 | 68 ± 5 |
| Broccolo | 2,0 ± 0,2 | 180 ± 30 | 0,35 ± 0,05 | 0,0039 ± 0,0006 | 60 ± 3 |
Tabella 3: Valori cinetici in vitro degli aptameri di spinaci2 e broccoli derivati dai dati adattati. I dati sono riportati come la media ± deviazione standard di tre repliche.
Figura supplementare 1: Cinetica rappresentativa in vitro degli aptameri fluorogenici. Cinetica rappresentativa in vitro degli aptameri fluorogenici (A,C) Spinaci2 o (B,D) Broccoli modellati mediante associazione monofase a (A,B) 600 s o (C,D) 20 s tempi di misurazione, con frecce che indicano il timepoint di addizione DFHBI (concentrazione finale di DFHBI: 10 μM). Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplice copia. Nel complesso, questi dati sono meno adatti a un modello di associazione monofase rispetto a un modello di associazione a due fasi quando il segnale di fluorescenza viene monitorato per una durata maggiore. Clicca qui per scaricare questo file.
File supplementare 1: Ricette per esperimenti di cinetica in vitro. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Per l'esperimento di cinetica in vitro , lo stesso protocollo generale può essere modificato per misurare la cinetica in vitro di un biosensore fluorescente basato su RNA contenente sia un dominio legante il ligando che un dominio legante il fluoroforo8. In questo caso, l'RNA deve essere incubato con il fluoroforo prima delle misurazioni dopo l'iniezione del ligando al fine di ottenere la cinetica di risposta del ligando. Se si osserva un'elevata variabilità tra le repliche, è possibile risolvere i problemi controllando che ogni campione sia autorizzato a equilibrarsi per lo stesso periodo di tempo nella piastra a 96 pozzetti prima della misurazione. Ogni campione o replica deve essere preparato individualmente in un pozzetto e misurato subito dopo la fase di equilibrio di 15 minuti, piuttosto che preparare tutti i campioni contemporaneamente.
Per l'esperimento di cinetica cellulare, il protocollo può essere modificato per cicli di tempo più brevi o più lunghi, ma è fondamentale pianificare il numero di repliche biologiche e regolare il volume della soluzione cellulare necessaria. Si raccomanda di distanziare ogni lettura della replica biologica tra 30 s e 1 minuto per avere il tempo sufficiente per eseguire i passaggi con attenzione. Un'altra modifica è quella di testare un diverso colorante fluorogenico che non lega l'aptamero RNA come controllo negativo alternativo, che non dovrebbe mostrare l'attivazione della fluorescenza sullo sfondo. Se si osservano risultati incoerenti, è possibile risolvere i problemi controllando che il citometro a flusso sia adeguatamente pulito seguendo il protocollo del produttore tra diverse esecuzioni sperimentali per prevenire qualsiasi sanguinamento di cellule o coloranti dalla corsa precedente a quella successiva.
Mentre il metodo in vitro presentato è utile per confrontare la cinetica tra aptameri fluorogenici o biosensori fluorogenici basati su RNA, i valori cinetici ottenuti possono variare a seconda della temperatura, della concentrazione di magnesio o di altri componenti tampone utilizzati. Inoltre, mentre questo metodo fornisce condizioni ben definite che sono state utilizzate in precedenza per caratterizzare diversi sistemi di RNA fluorogenico, l'ambiente intracellulare non può essere perfettamente rappresentato a causa della presenza di altre macromolecole biologiche.
Mentre il lettore di piastre a fluorescenza dotato di iniettore programmabile non ha tempi morti per l'acquisizione dei dati, lo strumento citometro a flusso ha una precisione temporale limitata a causa del tempo morto osservabile. C'è un ritardo di ~ 5 s tra quando si fa clic sul pulsante "Registra" e quando inizia l'acquisizione dei dati. Si verifica un ulteriore ritardo di ~ 5 s per lo strumento per misurare 30.000 eventi; questo tempo di acquisizione del campione varierà leggermente a seconda di quanto sono diluite le cellule in 1x PBS.
Un'altra potenziale limitazione agli esperimenti cellulari è la vitalità cellulare in 1x PBS. Per analisi di punti temporali prolungati, la vitalità cellulare può essere controllata utilizzando lo ioduro di propidio per colorare le cellule morte20. L'aggregazione del colorante può anche limitare l'accuratezza delle misurazioni di fluorescenza effettuate dal citometro a flusso. I coloranti con solubilità molto limitata in soluzioni acquose possono aggregarsi e apparire come particelle abbastanza grandi da essere contate come cellule sul citometro a flusso. Pertanto, è importante eseguire controlli sperimentali solo coloranti per verificare la presenza di aggregati nella regione controllata.
In precedenza, è stato dimostrato che i broccoli hanno una luminosità comparabile agli spinaci2 a 1 mM Mg2 + in vitro, ma i broccoli-tRNA mostrano ~ due volte maggiore intensità di fluorescenza in E. coli vivo rispetto a Spinaci2-tRNA13. Per quanto ne sappiamo, la cinetica di legame del colorante per gli aptameri fluorogenici di spinaci2 e broccoli non è stata confrontata prima e modellata da un'associazione a due fasi. Le costanti iniziali di velocità rapida per entrambi gli aptameri di RNA supportano che la tasca di legame del colorante è pre-piegata e non sono necessari cambiamenti strutturali per il legame del colorante, il che è coerente con la cristallografia a raggi X e gli esperimenti di fusione UV21,22. La seconda fase con una costante di velocità più lenta non è stata precedentemente riportata perché altri esperimenti come le misurazioni del flusso interrotto e della fluorescenza hanno analizzato l'aptamero degli spinaci per una durata più breve (20 s e 300 s)23,24. La seconda fase, molto più lenta, si traduce in un aumento biesponenziale osservato della fluorescenza quando i dati vengono analizzati per 600 s. Questo passo lento può essere attribuito a una fase di ripiegamento limitante della velocità da uno stato di RNA incompetente per il legame a uno stato di RNA competente per il legame o a una fase di fotoconversione limitante la velocità dalle forme trans a cis del colorante legato. Quest'ultimo meccanismo è stato precedentemente modellato per fornire un profilo di fluorescenza biesponenziale24 ed è supportato da una recente analisi della differenza tra gli spettri di assorbimento ed eccitazione sull'aptamero correlato, Baby Spinaci25.
Il significato complessivo dei risultati in vitro è che mostrano che l'associazione del colorante all'aptamero fluorogenico dell'RNA non limita la localizzazione dell'RNA in tempo reale e gli studi di espressione genica. Per i biosensori fluorescenti basati su RNA che impiegano Spinaci2, la cinetica di accensione misurata è simile alla cinetica della seconda fase misurata qui10 perché i biosensori richiedono una fase di ripiegamento e, quindi, dovrebbero essere sufficientemente rapidi da consentire studi di segnalazione quasi in tempo reale.
Ci si aspettava che la cinetica cellulare fosse diversa dalla cinetica in vitro osservata per Spinaci2. Una differenza fondamentale è che c'è un ulteriore passaggio di diffusione del colorante nelle cellule di E. coli , che comporta l'attraversamento delle membrane esterne e interne. Inoltre, l'ambiente cellulare pone condizioni diverse per l'associazione colorante-aptamero in termini di affollamento molecolare, composizione ionica e concentrazioni, nonché concentrazioni di RNA e colorante.
Il significato complessivo dei risultati è che la fluorescenza cellulare raggiunge il segnale massimo in meno di 5 minuti e rimane stabile per almeno 2 ore, il che consente la localizzazione dell'RNA in tempo reale e studi di espressione genica in questo intervallo di tempo. Per un biosensore basato sull'RNA che impiega Spinaci2, abbiamo precedentemente dimostrato che una risposta di fluorescenza significativa potrebbe essere osservata entro 4-5 minuti dall'aggiunta del ligando, ma che raggiungere il segnale massimo richiede più tempo (15-30 minuti)8. Nel loro insieme, questi risultati indicano che la diffusione del colorante nelle cellule non è il passo pratico che limita la velocità per gli esperimenti in vivo con biosensori basati sull'RNA. Infine, questo protocollo sperimentale può essere applicato per analizzare altri sistemi di RNA fluorogenico nelle cellule.
I protocolli sperimentali qui presentati possono essere applicati per analizzare altri sistemi di RNA fluorogenici. Oltre ai due aptameri analizzati in questo studio, Spinaci2 e Broccoli, sono stati sviluppati altri sistemi di RNA fluorogenico che forniscono diversi profili di emissione, una migliore fotostabilità, affinità di legame più strette e la capacità di cambiare i fluorofori (recentemente rivisto1). Oltre alle loro proprietà di fluorescenza, è importante confrontare la cinetica di accensione per questi sistemi in vitro e nelle cellule per valutare la loro idoneità per diverse applicazioni biologiche cellulari. I risultati possono anche supportare il pre-piegamento strutturale o il riarrangiamento dell'aptamero. Come discusso, con alcune modifiche, questi protocolli sono stati applicati anche per analizzare i biosensori basati sull'RNA8.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalle seguenti sovvenzioni a MCH: NSF-BSF 1815508 e NIH R01 GM124589. MRM è stato parzialmente supportato dalla borsa di formazione NIH T32 GM122740.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Thermo Fischer Scientific | BP160500 | |
| Agarose gel electrophoresis equipment | Thermo Fischer Scientific | B1A-BP | |
| Alpha D-(+)-lactose monohydrate | Thermo Fischer Scientific | 18-600-440 | |
| Amber 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fischer Scientific | 22431021 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| Attune NxT Flow cytometer | Thermo Fischer Scientific | A24861 | |
| Attune 1x Focusing Fluid | Thermo Fischer Scientific | A24904 | |
| Attune Shutdown Solution | Thermo Fischer Scientific | A24975 | |
| Attune Performance Tracking Beads | Thermo Fischer Scientific | 4449754 | |
| Attune Wash Solution | Thermo Fischer Scientific | J24974 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C3416 | |
| Chlorine Bleach | Amazon | B07J6FJR8D | |
| Corning Costar 96-well plate | Daigger Scientific | EF86610A | |
| Culture Tubes, 12 mm x 75 mm, 5 mL with attached dual position cap | Globe Scientific | 05-402-31 | |
| DFHBI | Sigma-Aldrich | SML1627 | |
| DFHBI-1T | Sigma-Aldrich | SML2697 | |
| D-Glucose (anhydrous) | Acros Organics | AC410955000 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| DNA loading dye | New England Biolabs | B7025S | |
| DNA LoBind Tubes (2.0 mL) | Eppendorf | 22431048 | |
| dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP | New England Biolabs | N0446S | |
| EDTA, pH 8.0 | Gibco, Life Technologies | AM9260G | |
| Ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Filter-tip micropipettor tips | Thermo Fischer Scientific | AM12635, AM12648, AM12655, AM12665 | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | N/A | FlowJo v10 Software |
| Fluorescent plate reader with heating control | VWR | 10014-924 | |
| Gel electrophoresis power supply | Thermo Fischer Scientific | EC3000XL2 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycogen AM95010 | Thermo Fischer Scientific | AM95010 | |
| GraphPad Prism | Dotmatics | N/A | Analysis software from Academic Group License |
| Heat block | Thomas Scientific | 1159Z11 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| Inorganic pyrophosphatase | Sigma-Aldrich | I1643-500UN | |
| Low Molecular Weight DNA Ladder | New England Biolabs | N3233L | Supplied with free vial of Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS (NEB #B7025). |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Fisher Scientific | MFCD00011110 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22363204 | |
| Microcentrifuge with temperature control | Marshall Scientific | EP-5415R | |
| Micropipettors | Gilson | FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M | |
| Micropipettor tips | Sigma-Aldrich | Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR | |
| Millipore water filter with BioPak unit | Sigma-Aldrich | CDUFBI001, ZRQSVR3WW | |
| Narrow micropipettor pipette tips | DOT Scientific | RN005R-LRS | |
| PBS, 10x | Thermo Fischer Scientific | BP39920 | |
| PCR clean-up kit | Qiagen | 28181 | |
| PCR primers and templates | Integrated DNA technologies | ||
| PCR thermocycler for thin-walled PCR tubes | Bio-Rad | 1851148 | |
| PCR thermocycler for 0.5 mL tubes | Techne | 5PRIME/C | |
| pET31b-T7-Spinach2 Plasmid | Addgene | Plasmid #79783 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530L | Purchase of Phusion High-Fideldity Enzyme is supplied with 5x Phusion HF Buffer, 5x Phusion GC Buffer, and MgCl2 and DMSO solutions. |
| Polyacrylamide gel electrophoresis gel comb, C.B.S. Scientific | C.B.S. Scientific | VGC-1508 | |
| Polyacrylamide gel electrophoresis equipment | C.B.S. Scientific | ASG-250 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Razor blades | Genesee Scientific | 38-101 | |
| rNTPs: ATP, CTP, GTP, UTP | New England Biolabs | N0450L | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Short wave UV light source | Thermo Fischer Scientific | 11758221 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S7795 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Thermo Fischer Scientific | S375-500 | |
| SoftMax Pro | Molecular Devices | N/A | SoftMax Pro 6.5.1 (platereader software) obtained through Academic Group License |
| Sterile filter units | Thermo Fischer Scientific | 09-741-88 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SYBR Safe DNA gel stain | Thermo Fischer Scientific | S33102 | |
| TAE buffer for agarose gel electrophoresis | Thermo Fischer Scientific | AM9869 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Tryptone (granulated) | Thermo Fischer Scientific | M0251S | |
| T7 RNA polymerase | New England Biolabs | M0251S | |
| Urea-PAGE Gel system | National Diagnostics | EC-833 | |
| UV fluorescent TLC plate | Sigma-Aldrich | 1.05789.0001 | |
| UV/Vis spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | ND-8000-GL | |
| Vortex mixer | Thermo Fischer Scientific | 2215415 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| Yeast Extract (Granulated) | Thermo Fischer Scientific | BP9727-2 |
References
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