Summary
このプロトコルは、蛍光発生RNAアプタマーであるホウレンソウ2とブロッコリーの動態を決定するための2つの方法を提示します。最初の方法では、プレートリーダーを使用してin vitro で蛍光発生アプタマー動態を測定する方法を説明し、2番目の方法では、フローサイトメトリーによる細胞内の蛍光発生アプタマー動態の測定を詳述します。
Abstract
蛍光発生RNAアプタマーは、RNAのタグ付けと視覚化、遺伝子発現の報告、代謝物やシグナル伝達分子のレベルを検出する蛍光バイオセンサーの活性化のために生細胞に適用されています。これらの各システムの動的変化を研究するためには、リアルタイムの測定値を得ることが望ましいが、測定の精度は、蛍光発生反応の速度論がサンプリング周波数よりも速いことに依存する。ここでは、試料注入器とフローサイトメーターを備えたプレートリーダーを使用して、蛍光発生RNAアプタマーのin vitroおよび細胞のターンオン速度を決定する方法について説明します。ホウレンソウ2とブロッコリーのアプタマーの蛍光活性化のin vitro動態は、二相会合反応としてモデル化でき、それぞれ0.56 s-1と0.35 s-1の異なる高速相速度定数を持つことを示しています。さらに、グラム陰性菌への色素拡散によってさらに制限される大腸菌におけるホウレンソウ2の蛍光活性化の細胞動態は、微小なタイムスケールで正確なサンプリング周波数を可能にするのに十分迅速であることを示しています。蛍光活性化速度論を解析するこれらの方法は、開発されている他の蛍光発生RNAアプタマーに適用可能である。
Introduction
蛍光発生反応は、蛍光シグナルを生成する化学反応です。蛍光発生RNAアプタマーは通常、低分子色素を結合させて蛍光量子収率を高めることでこの機能を果たします(図1A)1。異なる蛍光発生RNAアプタマーシステムが開発されており、特定のRNAアプタマー配列および対応する色素リガンドからなる1。蛍光発生RNAアプタマーは、mRNAおよびノンコーディングRNAの生細胞イメージングを可能にする蛍光タグとしてRNA転写物に付加されています2,3,4。それらはまた、レポーターとしての緑色蛍光タンパク質(GFP)の使用と同様に、遺伝子発現の蛍光レポーターとしてプロモーター配列の後に配置されていますが、報告機能はRNAレベル5,6です。最後に、蛍光発生RNAアプタマーは、特定の低分子に応答して蛍光発生反応を引き起こすように設計されたRNAベースの蛍光バイオセンサーに組み込まれています。RNAベースの蛍光バイオセンサーは、様々な非蛍光代謝物およびシグナル伝達分子の生細胞イメージングのために開発されている7、8、9、10、11。
RNAの局在、遺伝子発現、および低分子シグナルの動的な変化を可視化するための蛍光発生RNAアプタマーの開発への関心が高まっています。これらの各アプリケーションでは、リアルタイムの測定値を取得することが望ましいですが、測定の精度は、蛍光発生反応の速度論がサンプリング周波数よりも速いことに依存します。ここでは、試料注入器を備えたプレートリーダーを用いて蛍光発生RNAアプタマーSmallach2 12およびBroccoli13のin vitro動態を決定する方法と、フローサイトメーターを使用して大腸菌で発現するSpinach2の細胞ターンオン動態を決定する方法について説明します。これら2つのRNAアプタマーが選ばれたのは、RNA局在2,3,4の研究に適用されており、レポーター5,6およびバイオセンサー7,8,9,10,11で使用されており、対応する色素リガンド(DFHBIまたはDFHBI-1T)が市販されているためです。文献で決定されたそれらのインビトロ特性の要約は、表14、13、14に与えられ、これはプロトコール開発(例えば、使用される波長および色素濃度)を知らせた。これらの結果は、RNAアプタマーの影響を受ける蛍光発生反応が迅速であり、目的の細胞生物学的用途の正確な測定を妨げるべきではないことを示しています。
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Protocol
1. インビトロ 動態実験
- PCRによるDNAテンプレートの調製
- PCR反応のセットアップ:PCR反応を準備するには、薄肉PCRチューブで次の試薬を混ぜ合わせます。
33 μL の二重蒸留水 (ddH2O)
10 μLの5xバッファー(ハイフィデリティDNAポリメラーゼ用)
デオキシリボヌクレオシド三リン酸(dNTP)2 mM各5 μL
0.5 μL 40 μM フォワードプライマー
0.5 μL の 40 μM リバースプライマー
0.5 μL(10-100 ng)のDNAテンプレート(ホウレンソウ2 PCRのみ;ブロッコリープライマーが重複)
0.5 μLのハイフィデリティDNAポリメラーゼ(最後に追加)
注:合成オリゴヌクレオチドは、多くの場合、乾燥状態で出荷されます。ストック溶液を調製するには、ddH2Oの既知の容量(100 μLを推奨)を追加し、その溶液のA260 を測定して、吸光係数をオンラインで最近傍ルールで計算できるベールの法則によって濃度を決定します。その後、このストック溶液を使用して、PCRでの使用に適した希釈を行うことができます。 - サーモサイクラープロトコルを実行します。
- 次のサーモサイクラープロトコルを使用して、完全長のほうれん草2およびブロッコリーDNAテンプレートを増幅します。
初期変性:98°Cで2分間
35サイクル:
変性:98°Cで15秒間の変性
アニーリング:72°Cで30秒
伸長:72°Cで30秒
最終延長:72°Cで5分間。 - 反応後、低分子量ラダー(サイズ範囲:25〜766ヌクレオチド)とともに2%アガロースゲルで生成物の少量のアリコートを分析し、目的のDNA産物の存在を確認します。
- 市販のゲル抽出またはPCRクリーンアップキットで生成物を精製し、ddH2Oまたはメーカーが提供するバッファーで溶出します。
注:PCRクリーンアップキットを選択するときは、カラムの分子量カットオフがT7-ブロッコリー(81ヌクレオチド)を保持するのに十分低いことを確認してください。
注:オプションの一時停止ポイント:DNAを-20°Cで保存します。
- 次のサーモサイクラープロトコルを使用して、完全長のほうれん草2およびブロッコリーDNAテンプレートを増幅します。
- PCR反応のセットアップ:PCR反応を準備するには、薄肉PCRチューブで次の試薬を混ぜ合わせます。
- インビトロ転写(IVT)によるホウレンソウ2およびブロッコリーRNAの調製
- 転写反応を設定します。
- 100 μLの転写反応を調製するには、1.5 mLの微量遠心チューブで次の試薬を組み合わせます:10 μLの10x転写バッファー+ 20 μLの10 mMリボヌクレオシド三リン酸(rNTP)+ 1-64 μLのDNAテンプレート(合計1 μg)+ 2 μLの無機ピロホスファターゼ+ ddH 2 Oから98 μL +2μLのT7 RNAポリメラーゼ(最後に追加)。
- この反応液を37°Cで4時間インキュベートします。 20%スクロース、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、1xトリスホウ酸EDTA(1x TBE)バッファー、および~18 M尿素からなる2x尿素ゲルローディングバッファー(2x ULB)を100 μL添加して反応を停止します。
注:オプションの一時停止ポイント:クエンチ反応を-20°Cで保存します。
- 転写反応を設定します。
- RNAのポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)精製
- ほうれん草2およびブロッコリーRNAのページ精製
注意: 非重合(液体または粉末)アクリルアミドは非常に有毒です。粉末アクリルアミドの重量を量る場合は、ドラフトで計量してください。常に適切な保護具を着用し、アクリルアミド粉末または溶液で汚染された手袋をすぐに取り外し、手をよく洗ってください。アクリルアミドが皮膚に直接触れた場合は、露出部分を石鹸と水で少なくとも15分間洗ってください。アクリルアミドが目に直接入った場合は、水で15分間洗い流してください。- PAGEゲルの調製:全長製品から不要な中絶転写物および未反応rNTPを除去するには、6%尿素ポリアクリルアミドゲルを調製します。一般に、28 cm x 16.5 cm x 1.5 mmのゲルは8ウェルコームで使用できます。1x TBEバッファーを使用してリザーバーを満たすゲルおよび電気泳動装置をセットアップします。
- PAGEゲルにRNAサンプルをロードする:レーンごとに1回のクエンチされた200 μL反応でゲルをロードします。別のレーンに、トラッカー色素キシレンシアノールとブロモフェノールブルーを含む2x ULBを負荷し、それぞれ106ヌクレオチドと26ヌクレオチドでゲル中を移動します15。次のステップで汚染の可能性を回避するために、各サンプルの間に空のレーンを残します。
- PAGEゲルを実行する:95 ntのほうれん草2と49 ntのブロッコリーをそれぞれの切り捨てられた製品から分離するには、25 Wで1.5〜2時間ゲルを実行し、その時点でブロモフェノールブルー染料はゲル長の~5/6に移動します。
- PAGEゲル中のRNAサンプルを視覚化する:ゲルの周りのガラス板を分解し、両面をラップでゲルを覆い、ラップのレーンにラベルを付けます。UV光の下で蛍光TLCプレート上にラップされたゲルを置くことにより、UVシャドウイングによって暗い部屋でRNAバンドを視覚化します。製品に対応するRNAバンドの端をマーカーですばやく輪郭を描き、UVランプをオフにして、UV曝露による損傷を最小限に抑えます。
- PAGEゲルからRNAサンプルを切除して抽出する:各サンプルの新しいカミソリブレードを使用して、目的の製品バンドを切り取り、~1 mmの立方体にダイスし、ゲル片を500 μLのクラッシュソークバッファーを含む2 mLのマイクロ遠心チューブに追加して、室温(RT)で2時間、または4°Cで一晩ローテーターでRNAを抽出します。
注:オプションの一時停止ポイント:サンプルは-20°Cで保存できます。 - RNAを沈殿させる
- バッファー中の抽出されたRNAからゲル片を分離するには、サンプルを13,000 x g で4°Cで20分間遠心分離し、次にナローチップピペットを使用して上清を抽出し、新しい2 mLマイクロ遠心チューブにロードします。
- RNAを沈殿させるには、1.5 mLの氷冷エタノールと1 μLの20 mg/mLグリコーゲン、ボルテックスを加え、-20°Cまたは-80°Cで少なくとも1時間保存します。
注:オプションの一時停止ポイント:RNAは-20°Cで数か月間保存できます。
- RNA沈殿物の収集:沈殿したRNAを13,000 x g で4°Cで20分間遠心分離することによりペレット化します。 上清を除去し、残りのエタノールを屋外(~1時間)で蒸発させてから、ペレットを30 μLのddH2Oまたは1x TEバッファーに再懸濁します。
注:このプロセスにより、通常、最終的なRNA濃度は~10 μMになります。
注:オプションの一時停止ポイント:RNAサンプルは-20°Cで数か月間保存できます。
- RNAストック濃度を決定します。
- 加水分解反応用のRNAアリコートを調製します。
- このアッセイを実行するには、まずUV/Visナノ分光光度計を使用してストックRNAサンプルのA260 を測定し、サンプルの希釈アリコートをddH2Oで~10吸光度単位(AU)に希釈します。
- 0.5 mL PCRチューブで以下の反応液を調製します:16 μLのddH 2 O + 2 μLの10x Na2CO3バッファー +2μLのRNAアリコートを~10 AUに希釈します。反応液を95°Cで90分間インキュベートし、室温まで冷却します。
- ヌクレオチド吸光度を使用してRNA濃度を決定する:UV/Visナノ分光光度計でこのサンプルのA260 を測定し、次の式を使用してRNA濃度を計算します。
ここで、cはRNAの濃度、bはパス長、iは特定のヌクレオチド(A、C、G、またはU)、niはRNA配列中のヌクレオチドiの頻度、ε iはヌクレオチドiのモル吸光係数です。元のストックRNA濃度を決定するには、cに希釈係数を掛けます。
注:オプションの一時停止ポイント:RNAは-20°Cで数ヶ月間保存できます。
- 加水分解反応用のRNAアリコートを調製します。
- ほうれん草2およびブロッコリーRNAのページ精製
- を実行する in vitro プレートリーダー動態アッセイ
- RNA再生プログラムを設定します。 [新しいプログラムの作成] > [新しい フェーズの追加] > [新しいステップの追加] を 複数回選択して、次のサーモサイクラー プロトコルを作成し、[ 保存] を押す前に次の各ステップを追加します。
70°Cで3分間
65 °C で 45 秒間
60°Cで45秒間
55 °C で 45 秒間
50°Cで45秒間
45 °C で 45 秒間
40°Cで45秒間
35 °C で 45 秒間
30 °C で 45 秒間 - RNAの再生:ホウレンソウ2およびブロッコリーRNAを再生するには、0.5 mL薄肉PCRチューブ内のddH 2 O中の各RNAの2 μMストックを調製し、次に等量の2x再生バッファー(80 mM HEPES、pH 7.5 [KOH]、250 mM KCl、6 mM MgCl2)を加えて1 μM RNA溶液を作製します。チューブをサーモサイクラーに追加し、保存した再生プログラムを開いて、[実行]を押します。
注:サーモサイクラーが利用できない場合は、代わりにRNAを70°Cのヒートブロックで3分間インキュベートしてから、ベンチでRTまでゆっくりと冷却することができます。 - 結合反応バッファーの調製:1つのアプタマー-色素結合反応用のバッファーを調製するには、バッファー成分を含むマスターミックスを作成します(69.5 μLのddH 2O + 4 μLの1 M HEPES、pH 7.5 [KOH] + 6.2 μLの2 M KCl + 0.3 μLの1 M MgCl2)。必要なサンプルと反復の数に応じて、これらの値にサンプル数に1を加えた数を掛けます。一般に、RNAサンプルあたり3回の反復が満足できる。
- プレートリーダーを準備します。
- プレートリーダーインジェクタープログラムのセットアップ:蛍光プレートリーダーで 温度を選択し、 希望の温度を37°Cに設定し、速度論実験を開始する前に温度がこの値に平衡化されていることを確認してください。プレートリーダーソフトウェアを開き、[設定] >[取得ビュー]を選択し、キネティクス測定用に次のプログラムを入力します。
ループ:各ウェル
ベースライン設定: 60 ベースライン読み取り
スマートインジェクション設定:10 μLインジェクション(ベースライン読み取り後に行われます)
蛍光(またはFL)は次のように読みます。
励起: 448 nm (帯域幅: 9 nm)
発光: 506 nm (帯域幅: 15 nm)
カートリッジ: モノ (s/n 3297)
タイミング：
合計読み取り時間:10分
読み取り間隔:0.5秒
PMTおよび光学部品:読み取りあたり6回の点滅
ループ:次の井戸 - インジェクターを準備する
- インジェクターを洗浄して吸引する:プレートリーダーインジェクターを準備するには、最初にプレートリーダーで[注入]を選択し、指示されたときにプレートリーダーに廃棄物収集プレートを供給してから、[洗浄]を選択し、プレートリーダーの指示に従って注入チューブを1mL容量のddH 2 O、ddH2O中の75%エタノールで洗浄します。 そしてddH2O。次に、[吸引]を選択して、インジェクターが余分な液体を排出できるようにします。
- インジェクターのプライミング:前の画面に戻った後、[ Prime ]を選択して、注入する260 μL容量のリガンドを2つインジェクターでプライミングし、実験中に純粋で濃縮されたリガンドがサンプルに追加されるようにします(この場合、ddH2O中の100 μM DFHBIでプライミングします)。
- プレートリーダーインジェクタープログラムのセットアップ:蛍光プレートリーダーで 温度を選択し、 希望の温度を37°Cに設定し、速度論実験を開始する前に温度がこの値に平衡化されていることを確認してください。プレートリーダーソフトウェアを開き、[設定] >[取得ビュー]を選択し、キネティクス測定用に次のプログラムを入力します。
- in vitroキネティクス実験の実行:1回のキネティクス実験を実行するには、まず、事前に調製した結合バッファーマスターミックス80 μLを96ウェルクリアボトムプレートの1ウェルに加え、次に10 μLの変性RNAを加えます。このプレートとインジェクター内のDFHBI溶液をプレートリーダーで37°Cで15分間平衡化させます。
- プレートリーダーソフトウェア の設定 で、 読み取り領域で分析するウェルを選択し、[ ホーム ]タブで[ 実行 ]を選択して、前述の動力学プログラムを実行します。すべての実験が完了するまで、このプロセスを繰り返します。
注:重要なことに、リピュートとサンプルの間で同じ条件下でRNAキネティクスが測定されることを確認するために、キネティクス実験は一度に1ウェルずつ実行する必要があります。 - インジェクターを洗浄する:注入チューブから残りのDFHBI溶液を除去するには、ステップ1.4.4.2.1の説明に従って、1mL容量のddH 2 O、ddH2O中の75%エタノール、次にddH2Oで注入チューブを洗浄します。
注: オプションの一時停止ポイント。
- RNA再生プログラムを設定します。 [新しいプログラムの作成] > [新しい フェーズの追加] > [新しいステップの追加] を 複数回選択して、次のサーモサイクラー プロトコルを作成し、[ 保存] を押す前に次の各ステップを追加します。
- 蛍光発生RNAアプタマーの インビトロ 動態の解析。
- 解析ソフトへのデータ入力:実験データをスプレッドシートとしてエクスポートし、データを簡単にコピーして処理します。解析ソフトウェアで、XY形式の新しいデータテーブルを作成します。X列に、各読み取りタイムポイントを入力し、t = 0をDFHBI注射の時間とします。Y列に、t = 0から始まるそれぞれの時点での反復間の平均蛍光値を入力します。
- データの正規化とグラフ化:蛍光値を正規化するには、[ 分析>データ処理] > [正規化] をクリックし、[ OK] をクリックします。正規化にデータセットの最小値と最大値を使用し、結果を分数として表示し、 結果をグラフ化することを選択し、[ OK] をクリックします。正規化された平均蛍光の経時的なグラフを作成するには、[ データセット名]の正規化 アイコンをクリックし、 グラフファミリー: ポイントのみのXYを選択します。
注: 誤差範囲を見ると、少数の時点がグラフ化されている場合に役立ちます。これらが必要な場合は、XY 形式のデータ テーブルを選択するときに、[Y] の下のオプションを選択して、並べて列にレプリケート値を入力します。デフォルトのオプションを選択して結果のテーブルをグラフ化すると、エラーバー付きのグラフが生成されます。 - カーブフィットを実行してキネティックパラメータを取得する:カーブをキネティクスデータにフィットするには、[分析]>[データの分析]をクリックし、[XY分析]タブで[非線形回帰(カーブフィット)]を選択します。[モデル]タブで、[指数>2相の関連付け]をクリックして、速度論データを次の2相関連方程式に適合させます。
ここで、Yは時間Xにおける蛍光、Y 0はt = 0における蛍光、K FastおよびK Slowはそれぞれ高速および低速速度定数であり、SpanFastおよびSpanSlowは、それぞれ高速および低速によって説明される蛍光ターンオンの範囲である(代表的な結果、図1を参照)。[ノンリンフィット]タブをクリックして、速度定数、t1/2値、およびパーセントファスト値を表示します。
注:これらすべての値の標準偏差を取得するには、個々のプレートリーダー実験の反復を上記と同じ方法で処理できます。
2. 細胞動態実験
- 大腸菌株の調製
- BL21スター(DE3) 大腸菌 細胞を、メーカーのプロトコルに従って~100 ngのpET31b tRNA-Spinach2コンストラクトで形質転換します。
注:プラスミド構築物は市販されています(プラスミド#79783)。 - カルベニシリン(炭水化物:50 mg / mL)プレートを含むLB寒天培地に細胞をプレートし、37°Cで12〜16時間インキュベートします。プラスミドを含む細胞は、プレート上のコロニーとして成長します。
注:オプションの一時停止ポイント:プレート上の形質転換BL21スター細胞は、パラフィルムで包んで4°Cで1週間保存できます。
- BL21スター(DE3) 大腸菌 細胞を、メーカーのプロトコルに従って~100 ngのpET31b tRNA-Spinach2コンストラクトで形質転換します。
- 細胞の増殖と蛍光発生RNAアプタマーの発現誘導
- カルベニシリン(Carb:50 mg/mL)を含む非誘導培地(NI)の2 mL培養液に、形質転換BL21 Star細胞の単一コロニーを接種します。少なくとも3回の生物学的複製についてこれを繰り返します。培養物をインキュベーター/シェーカーで37°C、250 rpmで22〜24時間インキュベートします。
メモ: オプションの一時停止ポイント:NI培地で増殖した細胞はプラスミドを保持し、4°Cで1週間保存できます。 - NI培地で増殖後、培養液を100倍に希釈して、カルベニシリン(炭水化物:50 mg/mL)を含む新しい3 mLのZYP-5052自己誘導培地(AI)にします。細胞をインキュベーター/シェーカーで37°C、250 rpmで16〜18時間増殖させ、発現を誘導します。
注:培養物の典型的なOD600 は、18時間の成長後に2.0〜3.3の範囲になります。最適なセル密度範囲は2.5〜3.0です。
- カルベニシリン(Carb:50 mg/mL)を含む非誘導培地(NI)の2 mL培養液に、形質転換BL21 Star細胞の単一コロニーを接種します。少なくとも3回の生物学的複製についてこれを繰り返します。培養物をインキュベーター/シェーカーで37°C、250 rpmで22〜24時間インキュベートします。
- 細胞動態実験の実施
- フローサイトメーターをセットアップします。
- 機器に接続されているフローサイトメーターとコンピューターの電源を入れます。フローサイトメーターのソフトウェアにログインしたら、[ 機器 ]タブで[ スタートアップ ]アイコンをクリックします。ソフトウェア画面に表示される手順に従って、インストゥルメンテーションが正しく初期化されていることを確認します。
注:一部のフローサイトメーターでは、機器の起動シーケンスを プライミングと呼びます。実験に使用するフローサイトメーターの製造元のプロトコルに必ず従ってください。 - パフォーマンス テストを実行します (該当する場合)。 [メインメニュー ]タブで、[ パフォーマンステスト]をクリックします。培養チューブに、メーカーの性能追跡ビーズを3 mLのフォーカシング液に3滴加えます。
- 培養チューブをサンプルチューブリフターに入れ、リフターを持ち上げます。[パフォーマンステスト の実行]をクリックする前に、トラッキングビーズのチューブのロット#が [パフォーマンステストのセットアップ ]画面に示されているものと同じであることを確認してください。[ パフォーマンス テスト ] をクリックしてテストを実行します。
- この実験用のフローサイトメーターソフトウェアを、単一細胞蛍光の以下の取得パラメータでセットアップします。
励起レーザー: 488 nm
放出チャネル:GFP(FITCとも呼ばれます)
取得量:40 μL(総吸引量90 μL)
流量:200μL/分
各測定のセル数:30,000
機器設定:
電圧：
FSC: 480 V
SSC: 400 V
BL1: 540 V
BL2: 392 V
BL3: 422 V
- 機器に接続されているフローサイトメーターとコンピューターの電源を入れます。フローサイトメーターのソフトウェアにログインしたら、[ 機器 ]タブで[ スタートアップ ]アイコンをクリックします。ソフトウェア画面に表示される手順に従って、インストゥルメンテーションが正しく初期化されていることを確認します。
- 実験用ファイルを設定します。
- [ 実験エクスプローラー ] タブでフロー サイトメーターのユーザー名を右クリックして、新しい実験ファイルを作成します。ドロップダウン ウィンドウで [ 新しい実験 ] を選択します。コンピューター画面に新しいウィンドウが表示されたら、[ OK] を選択します。
- 新しい実験ファイルで、「グループ」フォルダを右クリックし、[ 新しいサンプルチューブの追加]を選択します。特定の時点ごとにサンプルチューブにラベルを付け、 サンプル を右クリックしてドロップダウンメニューで [名前の変更 ]を選択して複製します。スタディの目的の時間経過の反復数と時間ポイントの合計数について、この手順を繰り返します。
- 希釈細胞溶液を調製する:新しい培養チューブに、1.5 mLの1x PBS溶液を加えます。次に、AI培地中の誘導細胞3 μLを1x PBS溶液に加え、希釈細胞溶液を作ります。異なる培養チューブで複製する各生物学的複製について、この手順を繰り返します。
- 細胞のバックグラウンド蛍光を測定する:色素を添加する前に、1x PBS溶液中の細胞を含む各生物学的複製培養チューブの読み取り値を取得します。これは、細胞の蛍光バックグラウンドを測定して、色素が添加されると時間の経過とともに折り目がオンになるのを観察するためです。
- 読み取りを行うには、培養チューブをサンプルチューブリフターに入れ、リフターを手でサンプル注入針に持ち上げます。[ コレクション パネル ] タブで適切なサンプル ファイルを選択し、[ 記録] をクリックします。
- 実行が完了したら、培養チューブでサンプルチューブリフターを手で下げます。これにより、流体システムをフラッシュし、各生物学的複製サンプル間のキャリーオーバーを最小限に抑える すすぎ ステップが開始されます。実行が完了すると、データは自動的にコンピューターに保存されます。
- 2.3.4の手順を繰り返して、少なくとも3回の生物学的複製の細胞蛍光バックグラウンドを測定します。次のサンプルファイルに移動するには、 記録 アイコンの下にあるサンプルチューブ名の近くにある右矢印アイコンをクリックして、次のサンプルファイルを選択します。
- 色素を含む細胞の時点での蛍光を測定します。
- 1.4 μLの濃縮色素ストック(50 mM DFHBI-1T溶液)を細胞を含む1x PBS溶液に加え、最終濃度50 μM DFBHI-1Tを得ました。次に、培養チューブの蓋を固定し、培養チューブを3x〜5x反転させて溶液を均一に混合してから、最初のポイント読み取りを行います。
注: 大腸菌 の培養チューブ内のDMSOの合計パーセンテージは、細胞の生存率に影響を与える可能性があるため、10%を超えてはなりません16。 - 蓋を外し、培養チューブをサンプルチューブリフターに入れます。ホルダーを手でサンプル注入針まで持ち上げ、適切なサンプルファイルの下で、 記録 アイコンをクリックします。さらに、実験の [開始 ] を押してタイマーを開始します。
- 実行が完了したら、チューブリフターを手で下げ、手順2.3.5.1〜2.3.5.2を繰り返します。(タイマー作動状態で)濃縮DFHBI-1Tを1.4 μL添加し、培養チューブを反転させ、残りのすべての生物学的複製の読み取りを行います。これらの最初の記録は、すべての生物学的複製について0分で得られた測定値になります。生物学的複製ごとに一度に1つずつこれを行います。
注:レコードフローサイトメトリーの取得が押された時間をメモします。実験の過程で、この時間をずらして時間に固執します。 - サンプルチューブリフターの培養チューブをサンプル注入針まで上げ、適切なサンプルファイルを選択し、[ 記録]をクリックして、各実行が完了したらリフターを手で下げて、読み取りを続けます。テスト対象のすべての追加の時点と生物学的複製に対してこれを行います。実験が完了するまで手順を繰り返します。
注意: サンプルをアルミホイルで覆うことにより、溶液中のDFHBI-1Tの光退色を避けるために、サンプルを光から遠ざけてください。
- 1.4 μLの濃縮色素ストック(50 mM DFHBI-1T溶液)を細胞を含む1x PBS溶液に加え、最終濃度50 μM DFBHI-1Tを得ました。次に、培養チューブの蓋を固定し、培養チューブを3x〜5x反転させて溶液を均一に混合してから、最初のポイント読み取りを行います。
- 色素を含まない細胞の時点で蛍光を測定します(コントロール)。
- フローサイトメーターの適切な洗浄プロトコルを実行してから、メーカーのプロトコルに従ってネガティブコントロールで実験を再度繰り返します。これは、前の実験から制御時点分析実験への持ち越しを最小限に抑えるために行われます。以下は、実験間のフローサイトメーターについて従う手順です。
- 空の培養チューブをチューブリフターに手で入れ、チューブホルダーを持ち上げて、[機器]タブの[詰まり解除]アイコンをクリックします。これにより、流路系システムでバックフラッシュが実行され、粘着性のあるサンプルがクリーンアップされます。チューブホルダーを手で下げ、詰まりのないシーケンスが完了したらチューブを取り外します。
- 新しい培養チューブで、10%漂白剤溶液3 mLを追加し、培養チューブをチューブホルダーに入れ、ホルダーを手でサンプル注入針に持ち上げます。さらに、フローサイトメーターに該当する場合は、清潔な96ウェルプレートをオートサンプラーに入れます。
- サニタイズ SIP/サニタイズオートサンプラーSIP アイコンをクリックして、流路系システム全体で10%の漂白剤を使用したクリーニングシーケンスを実行します。チューブホルダーを下げて、クリーニングシーケンスを完了します。
- 制御時間ポイント分析のサンプル・ファイルを、ステップ 2.3.3 の指示に従って設定します。
- 新しい培養チューブで、1x PBS溶液1.5 mL中の希釈細胞溶液を調製します。AI培地中の誘導細胞3 μLを1x PBS溶液に加え、希釈細胞溶液を作ります。生物学的複製ごとにこの手順を繰り返します。
- 1.4 μLのDMSOを培養チューブに1つずつ加え、細胞を含む1x PBS溶液に添加し、同じ時点でテストします。培養チューブの蓋を固定し、培養チューブを3x〜5x反転させて溶液を均一に混合してから、最初のポイント読み取りを行います。生物学的複製ごとに一度に1つずつこれを行います。
- コントロール細胞の分析には、色素を含む細胞と同じプロトコルに従い、ステップ2.3.5.2-2.3.5.4を使用します。
- フローサイトメーターの適切な洗浄プロトコルを実行してから、メーカーのプロトコルに従ってネガティブコントロールで実験を再度繰り返します。これは、前の実験から制御時点分析実験への持ち越しを最小限に抑えるために行われます。以下は、実験間のフローサイトメーターについて従う手順です。
- フローサイトメーターのシャットダウン:機器の適切なシャットダウンについては、製造元のプロトコルに従ってください。フローサイトメーターの場合、機器は以下の方法でシャットダウンの準備をします。
- フローサイトメーターの初期クリーニングプロトコルを、ステップ2.3.6.1.1-2.3.6.1.3に従って実行します。
- 培養チューブを10%漂白剤溶液と交換し、3 mLの集束液を入れた培養チューブと交換します。チューブホルダーを手で持ち上げ、[ シャットダウン ]アイコンの下でドロップダウンメニューをクリックして、[ 完全]を選択します。
注: オプションの一時停止ポイント。
- フローサイトメーターをセットアップします。
- フローサイトメトリーデータの解析
- 分析のためにすべての FCS ファイルをエクスポートします。フローサイトメトリー解析ソフトウェアでFCSファイルを開きます。
- セルのみのFCSファイルの1つを使用して、前方散乱(FSC)と側方散乱(SSC)ドットプロット(FSCエリア/SSCエリア)からゲートを生成し、両方のログ軸を使用してデブリから信号を除外します。このゲートを作成するには、フローサイトメトリー分析ソフトウェアの AutoGate アイコンをクリックし、 Gate 1という名前を付けます。これと同じゲートを、データ処理ワークスペースの [すべてのサンプル ] タブでテストされたすべてのサンプルに適用します。これにより、処理されるすべてのFCSファイルの下に ゲート1 が表示されます。
- 手順 2.4.2 で使用した [セルのみ] FCS ファイルをダブルクリックして、新しいサブセット ファイルを作成します。軸設定をFSC面積/FSC高さに変更し、どちらも対数軸を使用します。フローサイトメトリー分析ソフトウェアの AutoGate アイコンをクリックして楕円形ゲートを生成し、 ゲート2と名付けます。このゲートを、手順2.4.2で設定したゲートの下のサブセットとして、テストするすべてのサンプルに適用します。これにより、すべてのサンプルに ゲート 1 >ゲート 2 が各 FCS ファイルが関連付けられます。
- ゲート 2 をダブルクリックして、手順 2.4.2 と手順 2.4.3 で設定した別のサブセット ファイルを作成します。軸の設定をFSCエリア/ヒストグラムに変更します。このヒストグラムゲートをサブセットとしてテストするすべてのサンプルに適用すると、すべてのサンプルにゲート1>ゲート2>ゲート2が各FCSファイルに関連付けられます。
注: ヒストグラムの名前を ゲート 2 からヒストグラムに変更して、 ヒストグラム をレイアウト ウィンドウに移動したり、データ処理でより多くの組織を作成したりできます。 - 平均蛍光強度 (MFI) 値を分析するには、レイアウト ウィンドウを開きます。各時点のヒストグラム ゲートをクリックして、レイアウト ウィンドウにドラッグします。
- テストされた各サンプルについて∑平均:BL1-A」(GFP)の統計分析を実行して、MFI結果をレイアウトウィンドウに表示します。
- 少なくとも3つの独立した生物学的反復の時点分析ごとのMFI値の標準偏差を計算します。
- 各時点のヒストグラムと MFI 値を保存するには、レイアウト ウィンドウを PDF ファイルとしてエクスポートします。
注: オプションの一時停止ポイント。
- フローサイトメトリーデータのグラフ
- 各時点のヒストグラムと MFI 値を含む PDF ファイルを開きます。MFI値はデータ分析ソフトウェアにコピーされます。データグラフ作成ソフトウェアで、XY形式の新しいデータテーブルを作成します。
- 選択すると、次の項目が選択された XY テーブルが作成されます。
データテーブル: 新しいテーブルにデータを入力またはインポートします
オプション：
X: 経過時間
Y: 横並びのサブ列に (3 から 4 の) レプリケート値を入力します。 - X 軸に、実験とコントロールの実行のすべての時点のラベルを付けます。
- グループAでは、色素を添加した細胞の蛍光分析のために、すべての生物学的複製のMFI値を各時点に入力します。
- グループBでは、色素(DMSO)を添加していない細胞の分析のために、すべての生物学的複製のMFI値を各時点に入力します。
- 結果を確認するには、グラフタブの[データセット名を挿入]をクリックします。これにより、データポイントが平均として表示され、エラーバーは各時点での標準偏差(s.d.)を表します。X 軸は経過時間を表し、Y 軸は MFI 値を表します。
- 選択すると、次の項目が選択された XY テーブルが作成されます。
- 各時点のヒストグラムと MFI 値を含む PDF ファイルを開きます。MFI値はデータ分析ソフトウェアにコピーされます。データグラフ作成ソフトウェアで、XY形式の新しいデータテーブルを作成します。
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Representative Results
インビトロ 動態
合成オリゴヌクレオチドとして購入したDNAテンプレートとプライマーの配列を 表2 に、試薬レシピを 補足ファイル1に示します。PCR増幅は、その後の in vitro 転写(IVT)反応に必要なT7プロモーターによるDNAテンプレートの量をスケールアップするために使用されます。さらに、PCR増幅は、プライマー伸長による完全長ブロッコリーDNAテンプレートの生成と、DNAテンプレートのスケールアップという2つの目的に使用することができます。
RNAを合成するためのIVT反応の後、PAGE精製は、全長RNA産物から不要なトランケート転写物、分解産物、および未反応rNTPを除去します。このタイプの精製は、RNAの切断または分解がRNA濃度の不正確な決定を引き起こすため、好ましい。ヌクレオチド塩基はUV光を吸収するため、ゲル上のRNAバンドとrNTPは、蛍光TLCプレートに対する影としてUV下で視覚化できます。これにより、正しい製品サイズに対応するバンドを選択的に抽出することができる。
最近傍法は、塩基対形成による低色素性を考慮しないため、吸光係数、したがって構造化RNAの濃度を過大評価します17。したがって、正確なRNA濃度を決定するために、RNAを個々のNMPに加水分解するために中性pH熱加水分解アッセイを実施した18。正確な吸光係数は、RNA配列中のNMPの吸光係数の合計として計算した。
ホウレンソウ2およびブロッコリーに結合するDFHBIの動態をプレートリーダーアッセイを用いて決定した。RNAは、色素結合に対して正しい立体配座にあることを確認するために最初に再変性されました。プレートリーダー動態アッセイの反応条件は、40 mM HEPES、pH 7.5(KOH)、125 mM KCl、3 mMMgCl2、100 nM変性RNA、および10 μM DFHBIで構成され、反応は37°Cで測定されました。 この温度および濃度のMgCl2は、生理学的条件19を模倣するように選択されたが、28°Cおよび10mMMgCl2の条件もまた、改善されたアプタマーフォールディングのために使用され得る。
蛍光発生アプタマーのホウレンソウ2とブロッコリーは、DFHBI色素に結合するための二相会合動態を示します(図2)。動態データは、両方のアプタマーについて、1相会合よりも二相会合の方が適合していた(補足図1)。高速および低速関連の速度定数およびt1/2 値は、ベストフィット曲線によって決定された(表3)。蛍光ターンオンの大きさの何パーセントが、より速いDFHBI結合RNA集団によって占められるかを記述するPercentFastも決定した。
結合能力状態のほうれん草2は、ブロッコリーよりも速いターンオンを示します(t 1/2 = 1.2秒対2.0 秒)。両方のアプタマーの第2相動態は類似しており(t1/ 2 = 180秒)、サンプルの亜集団の共通の律速段階に対応する可能性があります(PercentFast = ほうれん草2とブロッコリーでそれぞれ68%と60%)。全体として、これらの結果は、よく折りたたまれたホウレンソウ2およびブロッコリーアプタマーが非常に速いターンオン速度論を示し、色素添加から1〜2秒以内に最初の半最大ターンオンを示すことを示しています。
細胞動態
pET31bプラスミドにクローニングされたDNA構築物の配列を 表2に、試薬レシピを 補足ファイル1に示します。蛍光発生RNAアプタマーのDNA構築物は、通常、細胞実験用のtRNAスキャフォールド内に含まれています。BL21スター(DE3) 大腸菌 株は、RNA安定性を高めるRNase Eの変異を有する発現株である。
蛍光時点の測定は、最初の45分間は5分ごとに記録され、その後、1時間、1.5時間、および2時間で読み取りが行われ、合計12の時点と細胞のみの読み取りが得られました。最短の時間間隔が5分であるため、各時点で複数の生物学的複製を測定でき、反復測定の間隔は30秒から1分です。経時変化実験に用いた1x PBS溶液で希釈した細胞の総量は1.5mLであった。
単一細胞の集団の平均蛍光強度(MFI)を決定する前に細胞をゲーティングした。ゲーティングは散布図上の領域を選択して、分析される細胞集団を決定します。このプロセスにより、破片やマルチプレットの読み取り値が分析に含まれなくなります。示されているフローサイトメトリー分析では、30,000のイベントが記録され、ゲーティング後に10,000〜20,000のイベントが分析されました。
細胞蛍光動態は、 大腸菌 への色素拡散と細胞環境内のRNAアプタマーへの色素結合動態の両方の関数です(図1B)。Spinach2-tRNAを発現する細胞では、色素添加とサンプル分析の間のタイムラグ(秒単位)が短いため、平均蛍光強度(MFI)が「0」の時点で直ちに増加することが観察されました(図3A)。さらに、細胞蛍光は、最初の5分時点ですでに最大平衡化MFI値(40,441 ± 990)に達しています。対照的に、対照細胞は低いバックグラウンド蛍光を示し(416)、DMSO添加によるMFI値の変化はない(図3B)。色素を含む細胞と色素を含まない細胞を比較すると、細胞内で蛍光活性化が98倍±2であることがわかります。全体として、これらの結果は、 大腸菌 細胞で発現したホウレンソウ2-tRNAが速いターンオン動態を示し、色素添加から5分以内に最大のターンオンを示すことを示しています。
図1:蛍光活性化の模式図。 蛍光活性化は、RNAアプタマーが色素分子(A) in vitro および(B)細胞に結合すると発生します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:蛍光発生アプタマーのインビトロ動態。蛍光発生アプタマー(A,B)ホウレンソウ2または(C,D)ブロッコリーの代表的なインビトロ動態は、二相会合によってモデル化され、t = 0 sはDFHBI添加の時点です(最終DFHBI濃度:10 μM)。実験は三連で行った。すべてのエラーバーは、平均からの標準偏差を表します。適合度から、速い会合反応成分と遅い会合反応成分の両方についてt1/2値が得られた。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:tRNA足場におけるホウレンソウ2の代表的な細胞動態 。 (A)2時間経過におけるtRNA-ホウレンソウ2色素の取り込みのタイムポイント解析。DFHIB-1TまたはDMSOを添加する前に、細胞のみのベースラインを採取した。最初の45分間は5分ごとに時点が取得され、その後、1時間、1.5時間、および2時間で時点の読み取りが行われました。矢印は、DFHBI-1TまたはDMSOをBL21スター細胞を有する1x PBS溶液に添加したときを表す。分析用のDFHBI-1Tの最終濃度は50μMです。DMSOコントロールの場合、DMSOの添加はDFHBI-1T色素添加に用いた等量(1.4μL)でした。(B)BL21スター 大腸菌 細胞を用いたDMSO制御時点分析のクローズアップ。平均蛍光強度(MFI)は、色素またはDMSOを用いたBL21スター細胞の全体的な蛍光読み出しを示します。データは、3回の生物学的反復の平均±標準偏差を表す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| アプタマー-染料ペア | 長さ (NT) | 最大腹筋(nm) | 最大エム(nm) | 吸光係数(M-1·cm-1) | 量子収率 | 明るさ | キロド(ナノメートル) | Tm (°C) | 参考 |
| ほうれん草2-DFHBI | 95 | 445 | 501 | 26100 | 0.7 | 63 | 1450 | 37 | 4 |
| ホウレンソウ2-DFHBI-1T | 95 | 482 | 30代 | 31000 | 0.94 | 100 | 560 | 37 | 13, 14 |
| ブロッコリー-DFHBI-1T | 49 | 472 | 507 | 29600 | 0.94 | 96 | 360 | 48 | 13 |
表1:ホウレンソウ2-DFHBI4、ホウレンソウ2-DFHBI-1T 13,14、およびブロッコリー-DFHBI-1T 13の以前に発表された光物理学的および生化学的特性。
| ほうれん草2 + T7プロモーター | 5'-CGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGATGTAACTGAATGAAATGGTGAA GGACGGGTCCAGTAGGCTGCTTCGGCAGCCTACTTGTTGAGTGTGAGCTCC GTAACTAGTTACATC-3' |
||
| ブロッコリー+ T7プロモーター | 5'-CGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGgagacggtcgg GTCCAGATATTCGTATCTGTCGAGTAGGTGGGCTC-3' |
||
| tRNA-ホウレンソウ2コンストラクト(pET31bプラスミド中) | 5'-CGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGCCCGGAGCTCAGTCGGT AGAGCAGCGGCCGGATGTAACTGAATGAATGGTGAAGGGTCCAGTAGGCT GCTTCGGCAGCCTACTTGTTGAGTAGGTGTGCTCCGTAACTAGTTAGTTACATCティッカー CCGCGGGTCCAGGGTTCAAGTCCCTGTTCGGGCGCCA TAGCATAACCCCTTGGGGCCTAAACGGGTCTTGAGGTTTTTTG-3' |
||
| ほうれん草2フォワードプライマー | 5'-CGATCCCGCGAATAATTAATACGACTCACTATAG-3' | ||
| ほうれん草2リバースプライマー | 5'-GATGTAACTAGTTACGGAGC-3' | ||
| ブロッコリーフォワードプライマー | 5'-CGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGgagacggtcgggtccagatattcgtatctg-3' | ||
| ブロッコリーリバースプライマー | 5'-gagcccacactcgacagatacgaatctggacccgaccgtctc-3' | ||
表2: in vitro および細胞動態研究に使用されるDNA配列およびプライマーを含むDNA配列表。 太字= T7プロモーター;下線付き=tRNA足場;キャップ=ほうれん草2;小文字=ブロッコリー;太字の斜体 = T7 ターミネータ。
| アプタマー | 速いt1/2 (秒) | 遅いt1/2 (s) | Kファスト (S-1) | Kスロー (s-1) | 速いパーセント |
| ほうれん草2 | 1.2 ± 0.2 | 180 ± 10 | ±0.56± ±0.07 | 0.0039 ± 0.0002 | 68 ± 5 |
| ブロッコリー | 2.0 ± 0.2 | 180 ± 30 | 0.35± 0.05 | 0.0039± 0.0006 | 60 ± 3 |
表3:適合データから得られたホウレンソウ2およびブロッコリーアプタマーの インビトロ 動態値。 データは、3回の反復の平均±標準偏差として報告されます。
補足図1:蛍光発生アプタマーの代表的なインビトロ動態。蛍光発生アプタマー(A,C)ホウレンソウ2または(B,D)ブロッコリーの代表的なインビトロ動態を、(A,B)600秒または(C,D)20秒の測定時間で一相会合によってモデル化し、矢印はDFHBI添加の時点を示す(最終DFHBI濃度:10μM)。実験は三連で行った。全体として、これらのデータは、蛍光シグナルがより長い期間モニターされる場合、二相関連モデルよりも一相関連モデルによってあまり適合しない。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:in vitro動態実験のレシピ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
インビトロ動態実験のために、同じ一般的なプロトコルを変更して、リガンド結合ドメインとフルオロフォア結合ドメインの両方を含むRNAベースの蛍光バイオセンサーのインビトロ動態を測定することができます8。 この場合、リガンド応答速度論を得るために、リガンドを注入する際の測定前にRNAを蛍光色素とともにインキュベートする必要があります。反復間で大きな変動が観察される場合は、測定前に各サンプルが96ウェルプレートで同じ時間平衡化できることを確認することでトラブルシューティングを行うことができます。各サンプルまたは反復は、すべてのサンプルを一度に調製するのではなく、ウェルで個別に調製し、15分の平衡化ステップの直後に測定する必要があります。
細胞動態実験では、プロトコルをより短いまたはより長い時間コースに変更することができますが、生物学的複製の数を計画し、必要な細胞溶液量を調整することが重要です。手順を慎重に実行するのに十分な時間を確保するために、各生物学的複製の読み取り値を30秒から1分の間に間隔を空けることをお勧めします。別の修正は、RNAアプタマーに結合しない別の蛍光発生色素を代替ネガティブコントロールとして試験することであり、これはバックグラウンド上で蛍光活性化を示すべきではない。一貫性のない結果が観察された場合は、前回の実行から次の実行への細胞または色素のブリードオーバーを防ぐために、異なる実験実行間でフローサイトメーターがメーカーのプロトコルに従って適切に洗浄されていることを確認することでトラブルシューティングを行うことができます。
提示された in vitro 法は、蛍光発生アプタマーまたはRNAベースの蛍光発生バイオセンサ間の動態を比較するのに有用であるが、得られる速度論的値は、使用される温度、マグネシウム濃度、または他の緩衝成分に応じて変化し得る。また、この方法は、異なる蛍光発生RNA系を特徴付けるために以前に使用されてきた明確に定義された条件を提供するが、他の生物学的高分子の存在のために細胞内環境を完全に表現することはできない。
プログラム可能なインジェクターを備えた蛍光プレートリーダーはデータ取得のデッドタイムがありませんが、フローサイトメーター装置は観察可能なデッドタイムのために時間精度が限られています。「記録」ボタンをクリックしてからデータ取得が開始されるまでには~5秒の遅れがあります。機器が30,000イベントを測定するために、さらに~5秒の遅れが発生します。このサンプル取得時間は、細胞が1x PBSでどれだけ希釈されているかによってわずかに異なります。
細胞実験のもう一つの潜在的な制限は、1x PBSにおける細胞生存率である。長時間の時点分析では、ヨウ化プロピジウムを使用して細胞生存率を確認し、死細胞を染色することができます20。色素の凝集は、フローサイトメーターによる蛍光測定の精度を制限する可能性もあります。水溶液への溶解度が非常に限られている色素は、凝集し、フローサイトメーターで細胞としてカウントされるのに十分な大きさの粒子として現れることがあります。したがって、色素のみの実験対照を実行して、ゲート領域の凝集体をチェックすることが重要です。
以前は、ブロッコリーはin vitroで1 mM Mg2+でホウレンソウ2と同等の明るさを持つことが示されましたが、ブロッコリー-tRNAは、ホウレンソウ2-tRNAと比較して、生きた大腸菌で~2倍高い蛍光強度を示します13。私たちの知る限り、ホウレンソウ2とブロッコリーの蛍光発生アプタマーの色素結合動態はこれまで比較されておらず、二相会合によってモデル化されています。両方のRNAアプタマーの初期高速速度定数は、色素結合ポケットが予め折り畳まれており、色素が結合するために構造変化を必要としないことを裏付けており、これはX線結晶構造解析およびUV融解実験と一致している21,22。速度定数が遅い第2相は、ストップフローや蛍光寿命測定などの他の実験でホウレンソウのアプタマーがより短い期間(20秒と300秒)分析されたため、これまで報告されていません23,24。はるかに遅い第2フェーズでは、データを600秒間分析すると、蛍光の二指数関数的な増加が観察されます。この遅いステップは、結合非コンピテントRNA状態からバインディングコンピテントRNA状態への律速リフォールディングステップ、または結合色素のトランス型からシス型への律速光変換ステップのいずれかに起因し得る。後者のメカニズムは、双指数蛍光プロファイル24を与えるように以前にモデル化されており、関連するアプタマーであるベビーホウレンソウ25の吸収スペクトルと励起スペクトルの違いに関する最近の分析によって裏付けられています。
in vitroの知見の全体的な意義は、蛍光発生RNAアプタマーへの色素の会合がリアルタイムのRNA局在および遺伝子発現研究を制限しないことを示していることである。Spinach2を使用するRNAベースの蛍光バイオセンサの場合、バイオセンサはリフォールディングステップを必要とし、したがって、ほぼリアルタイムのシグナル伝達研究を可能にするのに十分迅速でなければならないため、測定されたターンオン速度論はここで測定された第2相動態と同様である10。
細胞動態は、ホウレンソウ2で観察された in vitro 動態とは異なることが予想されました。1つの重要な違いは、大腸 菌 細胞への色素拡散の追加ステップがあり、これには外膜と内膜を交差させることが含まれることです。さらに、細胞環境は、分子の混雑、イオン組成、濃度、およびRNAと色素の濃度に関して、色素-アプタマー会合に異なる条件をもたらします。
この結果の全体的な意義は、細胞蛍光が5分以内に最大シグナルに到達し、少なくとも2時間安定していることであり、これにより、この時間範囲でのリアルタイムのRNA局在と遺伝子発現の研究が可能になります。Spinach2を用いたRNAベースのバイオセンサーでは、リガンド添加から4〜5分以内に有意な蛍光応答が観察されるが、最大シグナルに達するにはさらに長い(15〜30分)時間がかかることが以前に示されました8。まとめると、これらの知見は、細胞への色素拡散がRNAベースのバイオセンサーを用いた in vivo 実験の実用的な律速ステップではないことを示している。最後に、この実験プロトコルは、細胞内の他の蛍光発生RNAシステムの分析に適用できます。
ここで紹介する実験プロトコルは、他の蛍光発生RNAシステムの解析にも適用できます。本研究で解析した2つのアプタマーであるSpinach2とBroccoli以外にも、異なる発光プロファイル、光安定性の向上、より緊密な結合親和性、および蛍光色素を変化させる能力を提供する他の蛍光発生RNAシステムが開発されています(最近レビュー1)。蛍光特性に加えて、in vitro および細胞内のこれらのシステムのターンオン動態をベンチマークすることは、さまざまな細胞生物学的アプリケーションへの適合性を評価するために重要です。結果はまた、アプタマーの構造的プレフォールディングまたは再配列を支持し得る。論じたように、いくつかの変更を加えて、これらのプロトコルは、RNAベースのバイオセンサを分析するためにも適用されている8。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
この作業は、MCHへの次の助成金によってサポートされました:NSF-BSF 1815508およびNIH R01 GM124589。MRMは、トレーニング助成金NIH T32 GM122740によって部分的にサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Thermo Fischer Scientific | BP160500 | |
| Agarose gel electrophoresis equipment | Thermo Fischer Scientific | B1A-BP | |
| Alpha D-(+)-lactose monohydrate | Thermo Fischer Scientific | 18-600-440 | |
| Amber 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fischer Scientific | 22431021 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| Attune NxT Flow cytometer | Thermo Fischer Scientific | A24861 | |
| Attune 1x Focusing Fluid | Thermo Fischer Scientific | A24904 | |
| Attune Shutdown Solution | Thermo Fischer Scientific | A24975 | |
| Attune Performance Tracking Beads | Thermo Fischer Scientific | 4449754 | |
| Attune Wash Solution | Thermo Fischer Scientific | J24974 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C3416 | |
| Chlorine Bleach | Amazon | B07J6FJR8D | |
| Corning Costar 96-well plate | Daigger Scientific | EF86610A | |
| Culture Tubes, 12 mm x 75 mm, 5 mL with attached dual position cap | Globe Scientific | 05-402-31 | |
| DFHBI | Sigma-Aldrich | SML1627 | |
| DFHBI-1T | Sigma-Aldrich | SML2697 | |
| D-Glucose (anhydrous) | Acros Organics | AC410955000 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| DNA loading dye | New England Biolabs | B7025S | |
| DNA LoBind Tubes (2.0 mL) | Eppendorf | 22431048 | |
| dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP | New England Biolabs | N0446S | |
| EDTA, pH 8.0 | Gibco, Life Technologies | AM9260G | |
| Ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Filter-tip micropipettor tips | Thermo Fischer Scientific | AM12635, AM12648, AM12655, AM12665 | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | N/A | FlowJo v10 Software |
| Fluorescent plate reader with heating control | VWR | 10014-924 | |
| Gel electrophoresis power supply | Thermo Fischer Scientific | EC3000XL2 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycogen AM95010 | Thermo Fischer Scientific | AM95010 | |
| GraphPad Prism | Dotmatics | N/A | Analysis software from Academic Group License |
| Heat block | Thomas Scientific | 1159Z11 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| Inorganic pyrophosphatase | Sigma-Aldrich | I1643-500UN | |
| Low Molecular Weight DNA Ladder | New England Biolabs | N3233L | Supplied with free vial of Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS (NEB #B7025). |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Fisher Scientific | MFCD00011110 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22363204 | |
| Microcentrifuge with temperature control | Marshall Scientific | EP-5415R | |
| Micropipettors | Gilson | FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M | |
| Micropipettor tips | Sigma-Aldrich | Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR | |
| Millipore water filter with BioPak unit | Sigma-Aldrich | CDUFBI001, ZRQSVR3WW | |
| Narrow micropipettor pipette tips | DOT Scientific | RN005R-LRS | |
| PBS, 10x | Thermo Fischer Scientific | BP39920 | |
| PCR clean-up kit | Qiagen | 28181 | |
| PCR primers and templates | Integrated DNA technologies | ||
| PCR thermocycler for thin-walled PCR tubes | Bio-Rad | 1851148 | |
| PCR thermocycler for 0.5 mL tubes | Techne | 5PRIME/C | |
| pET31b-T7-Spinach2 Plasmid | Addgene | Plasmid #79783 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530L | Purchase of Phusion High-Fideldity Enzyme is supplied with 5x Phusion HF Buffer, 5x Phusion GC Buffer, and MgCl2 and DMSO solutions. |
| Polyacrylamide gel electrophoresis gel comb, C.B.S. Scientific | C.B.S. Scientific | VGC-1508 | |
| Polyacrylamide gel electrophoresis equipment | C.B.S. Scientific | ASG-250 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Razor blades | Genesee Scientific | 38-101 | |
| rNTPs: ATP, CTP, GTP, UTP | New England Biolabs | N0450L | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Short wave UV light source | Thermo Fischer Scientific | 11758221 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S7795 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Thermo Fischer Scientific | S375-500 | |
| SoftMax Pro | Molecular Devices | N/A | SoftMax Pro 6.5.1 (platereader software) obtained through Academic Group License |
| Sterile filter units | Thermo Fischer Scientific | 09-741-88 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SYBR Safe DNA gel stain | Thermo Fischer Scientific | S33102 | |
| TAE buffer for agarose gel electrophoresis | Thermo Fischer Scientific | AM9869 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Tryptone (granulated) | Thermo Fischer Scientific | M0251S | |
| T7 RNA polymerase | New England Biolabs | M0251S | |
| Urea-PAGE Gel system | National Diagnostics | EC-833 | |
| UV fluorescent TLC plate | Sigma-Aldrich | 1.05789.0001 | |
| UV/Vis spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | ND-8000-GL | |
| Vortex mixer | Thermo Fischer Scientific | 2215415 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| Yeast Extract (Granulated) | Thermo Fischer Scientific | BP9727-2 |
References
- Su, Y., Hammond, M. C. RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of small molecules and RNAs. Current Opinion in Biotechnology. 63, 157-166 (2020).
- Zhang, J., et al. Tandem spinach array for mRNA Imaging in living bacterial cells. Scientific Reports. 5, 17295 (2015).
- Wang, Z., et al. In spatial complementation of aptamer-mediated recognition enables live-cell imaging of native RNA transcripts in real time. Angewandte Chemie. 57 (4), 972-976 (2018).
- Strack, R. L., Disney, M. D., Jaffrey, S. R. A superfolding Spinach2 reveals the dynamic nature of trinucleotide repeat-containing RNA. Nature Methods. 10 (12), 1219-1224 (2013).
- Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
- You, M., Litke, J. L., Jaffrey, S. R. Imaging metabolite dynamics in living cells using a Spinach-based riboswitch. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2756-2765 (2015).
- Kellenberger, C. A., Wilson, S. C., Sales-Lee, J., Hammond, M. C. RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of second messengers cyclic di-GMP and cyclic AMP-GMP. Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 4906-4909 (2013).
- Manna, S., Truong, J., Hammond, M. C. Guanidine biosensors enable comparison of cellular turn-on kinetics of riboswitch-based biosensor and reporter. ACS Synthetic Biology. 10 (3), 566-578 (2021).
- Bose, D., Su, Y., Marcus, A., Raulet, D. H., Hammond, M. C. An RNA-based fluorescent biosensor for high-throughput analysis of the cGAS-cGAMP-STING pathway. Cell Chemical Biology. 23 (12), 1539-1549 (2016).
- Wang, X. C., Wilson, S. C., Hammond, M. C. Next-generation RNA-based fluorescent biosensors enable anaerobic detection of cyclic di-GMP. Nucleic Acids Research. 44 (17), 139 (2016).
- Paige, J. S., Thinh, N. -D., Wenjiao, S., Jaffrey, S. R. Fluorescence imaging of cellular metabolites with RNA. Science. 335 (6073), 1194 (2012).
- Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333 (6042), 642-646 (2011).
- Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Jaffrey, S. R. Broccoli: Rapid selection of an RNA mimic of green fluorescent protein by fluorescence-based selection and directed evolution. Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).
- Song, W., Strack, R. L., Svensen, N., Jaffrey, S. R. Plug-and-play fluorophores extend the spectral properties of spinach. Journal of the American Chemical Society. 136 (4), 1198-1201 (2014).
- Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).
- Basch, H., Gadebusch, H. H. In vitro antimicrobial activity of dimethylsulfoxide. Applied Microbiology. 16 (12), 1953-1954 (1968).
- Kallansrud, G., Ward, B. A comparison of measured and calculated single- and double-stranded oligodeoxynucleotide extinction coefficients. Analytical Biochemistry. 236 (1), 134-138 (1996).
- Wilson, S. C., Cohen, D. T., Wang, X. C., Hammond, M. C. A neutral pH thermal hydrolysis method for quantification of structured RNAs. RNA. 20 (7), 1153-1160 (2014).
- Szatmári, D., et al. Intracellular ion concentrations and cation-dependent remodelling of bacterial MreB assemblies. Scientific Reports. 10, 12002 (2020).
- Boulos, L., Prévost, M., Barbeau, B., Coallier, J., Desjardins, R. LIVE/DEAD® BacLightTM: Application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking water. Journal of Microbiological Methods. 37 (1), 77-86 (1999).
- Huang, H., et al. A G-quadruplex-containing RNA activates fluorescence in a GFP-like fluorophore. Nature Chemical Biology. 10 (8), 686-691 (2014).
- Jeng, S. C. Y., Chan, H. H. Y., Booy, E. P., McKenna, S. A., Unrau, P. J. Fluorophore ligand binding and complex stabilization of the RNA Mango and RNA Spinach aptamers. RNA. 22 (12), 1884-1892 (2016).
- Han, K. Y., Leslie, B. J., Fei, J., Zhang, J., Ha, T. Understanding the photophysics of the Spinach-DFHBI RNA aptamer-fluorogen complex to improve live-cell RNA imaging. Journal of the American Chemical Society. 135 (50), 19033-19038 (2013).
- Wang, P., et al. Photochemical properties of Spinach and its use in selective imaging. Chemical Science. 4 (7), 2865-2873 (2013).
- Dao, N. T., et al. Photophysics of DFHBI bound to RNA aptamer Baby Spinach. Scientific Reports. 11, 7356 (2021).
