Summary
Protokollet presenterar två metoder för att bestämma kinetiken hos de fluorogena RNA-aptamererna Spenat2 och Broccoli. Den första metoden beskriver hur man mäter fluorogen aptamerkinetik in vitro med en plattläsare, medan den andra metoden beskriver mätningen av fluorogen aptamerkinetik i celler genom flödescytometri.
Abstract
Fluorogena RNA-aptamerer har applicerats i levande celler för att märka och visualisera RNA, rapportera om genuttryck och aktivera fluorescerande biosensorer som detekterar nivåer av metaboliter och signalmolekyler. För att studera dynamiska förändringar i vart och ett av dessa system är det önskvärt att erhålla realtidsmätningar, men mätningarnas noggrannhet beror på att kinetiken för den fluorogena reaktionen är snabbare än provtagningsfrekvensen. Här beskriver vi metoder för att bestämma in vitro- och cellulära turn-on-kinetiken för fluorogena RNA-aptamerer med hjälp av en plattläsare utrustad med en provinjektor respektive en flödescytometer. Vi visar att in vitro-kinetiken för fluorescensaktiveringen av spenat2- och broccoliaptamererna kan modelleras som tvåfasassociationsreaktioner och har olika snabba fashastighetskonstanter på 0,56 s−1 respektive 0,35 s−1. Dessutom visar vi att den cellulära kinetiken för fluorescensaktivering av spenat2 i Escherichia coli, som ytterligare begränsas av färgämnesdiffusion i de gramnegativa bakterierna, fortfarande är tillräckligt snabb för att möjliggöra exakt provtagningsfrekvens på minuttidsskalan. Dessa metoder för att analysera fluorescensaktiveringskinetik är tillämpliga på andra fluorogena RNA-aptamerer som har utvecklats.
Introduction
Fluorogena reaktioner är kemiska reaktioner som genererar en fluorescenssignal. Fluorogena RNA-aptamerer utför vanligtvis denna funktion genom att binda ett litet molekylfärgämne för att förbättra dess fluorescenskvantutbyte (figur 1A)1. Olika fluorogena RNA-aptamersystem har utvecklats och består av specifika RNA-aptamersekvenser och motsvarande färgämnesligander1. Fluorogena RNA-aptamerer har bifogats RNA-transkript som fluorescerande taggar som möjliggör levande cellavbildning av mRNA och icke-kodande RNA 2,3,4. De har också placerats efter promotorsekvenser som fluorescerande rapportörer av genuttryck, liknande användningen av grönt fluorescerande protein (GFP) som reporter, förutom att rapporteringsfunktionen är på RNA-nivå 5,6. Slutligen har fluorogena RNA-aptamerer införlivats i RNA-baserade fluorescerande biosensorer, som är utformade för att utlösa den fluorogena reaktionen som svar på en specifik liten molekyl. RNA-baserade fluorescerande biosensorer har utvecklats för levande cellavbildning av olika icke-fluorescerande metaboliter och signalmolekyler 7,8,9,10,11.
Det finns ett växande intresse för utvecklingen av fluorogena RNA-aptamerer för att visualisera dynamiska förändringar i RNA-lokalisering, genuttryck och småmolekylsignaler. För var och en av dessa applikationer är det önskvärt att erhålla realtidsmätningar, men mätningarnas noggrannhet beror på att kinetiken för den fluorogena reaktionen är snabbare än provtagningsfrekvensen. Här beskriver vi metoder för att bestämma in vitro-kinetiken för fluorogena RNA-aptamerer Spenat2 12 och Broccoli13 med hjälp av en plattläsare utrustad med en provinjektor och för att bestämma den cellulära påslagskinetiken för spenat2 uttryckt i Escherichia coli med hjälp av en flödescytometer. Dessa två RNA-aptamerer valdes eftersom de har tillämpats för att studera RNA-lokalisering 2,3,4, de har använts i reportrar5,6 och biosensorer 7,8,9,10,11, och motsvarande färgämnesligander (DFHBI eller DFHBI-1T) är kommersiellt tillgängliga. En sammanfattning av deras in vitro-egenskaper som bestämts i litteraturen ges i tabell 1 4,13,14, som informerade om protokollutvecklingen (t.ex. de våglängder och färgämneskoncentrationer som använts). Dessa resultat visar att de fluorogena reaktionerna som påverkas av RNA-aptamerer är snabba och inte bör hindra noggranna mätningar för de önskade cellbiologiska applikationerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. In vitro-kinetikexperiment
- Beredning av DNA-mallar med PCR
- Ställ in PCR-reaktion(er): För att bereda PCR-reaktioner, kombinera följande reagenser i ett tunnväggigt PCR-rör:
33 μl dubbeldestillerat vatten (ddH2O)
10 μL 5x buffert för högkvalitativt DNA-polymeras
5 μl 2 mM vardera deoxiribonukleosidtrifosfat (dNTP)
0,5 μL 40 μM framåtprimer
0,5 μL 40 μM omvänd primer
0,5 μL (10-100 ng) DNA-mall (endast för spenat2 PCR; Broccoli primers överlappar varandra)
0,5 μL dna-polymeras med hög trohet (lägg till sist)
OBS: Syntetiska oligonukleotider skickas ofta torra. För att förbereda stamlösningar, tillsätt en känd volym (100 μL rekommenderas)ddH2Ooch mät A260 i den lösningen för att bestämma koncentrationen enligt ölens lag, där utrotningskoefficienten kan beräknas med närmaste grannregler online. Denna stamlösning kan sedan användas för att göra utspädningar lämpliga för användning i PCR. - Kör termocyklerprotokollet.
- Använd följande termocyklerprotokoll för att förstärka spenat2- och broccoli-DNA-mallar i full längd:
Initial denaturering: 98 ° C i 2 minuter
35 cykler:
Denaturering:98 °C denaturering i 15 s
Glödgning:72 °C i 30 s
Förlängning: 72 ° C i 30 s
Slutlig förlängning: 72 °C i 5 min. - Efter reaktionen analysera en liten alikvot av produkten med 2% agarosgel tillsammans med en lågmolekylär viktstege (storleksintervall: 25-766 nukleotider) för att bekräfta närvaron av den önskade DNA-produkten.
- Rena produkten genom kommersiellt tillgängliga gelextraktions- eller PCR-rengöringssatser och eluera medddH2O-värdeeller den buffert som tillhandahålls av tillverkaren.
OBS: Var säker på när du väljer ett PCR-rengöringssats att kolonnens molekylviktsavgränsning är tillräckligt låg för att behålla T7-Broccoli (81 nukleotider), annars kommer PCR-produkten att gå förlorad.
OBS: Valfri pauspunkt: förvara DNA vid −20 °C.
- Använd följande termocyklerprotokoll för att förstärka spenat2- och broccoli-DNA-mallar i full längd:
- Ställ in PCR-reaktion(er): För att bereda PCR-reaktioner, kombinera följande reagenser i ett tunnväggigt PCR-rör:
- Beredning av spenat2 och broccoli-RNA genom in vitro-transkription (IVT)
- Ställ in transkriptionsreaktionerna .
- För att bereda en 100 μL transkriptionsreaktion, kombinera följande reagens i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör: 10 μL 10x transkriptionsbuffert + 20 μL 10 mM ribonukleosidtrifosfater (rNTP) + 1-64 μL DNA-mall (totalt 1 μg) + 2 μL oorganiskt pyrofosfatas + ddH 2 O till 98 μL +2μL T7 RNA-polymeras (tillsätt sist).
- Inkubera denna reaktion i 4 timmar vid 37 °C. Släck reaktionen genom att tillsätta 100 μL 2x ureagelladdningsbuffert (2x ULB), bestående av 20% sackaros, 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS), 1x Tris-Borat-EDTA (1x TBE) buffert och ~ 18 M urea.
OBS: Valfri pauspunkt: förvara den släckta reaktionen vid −20 °C.
- Ställ in transkriptionsreaktionerna .
- Polyakrylamidgelelektrofores (PAGE) rening av RNA
- SIDA rening av spenat2 och broccoli RNA
VARNING: Icke-polymeriserad (flytande eller pulveriserad) akrylamid är extremt giftig. Om du väger ut pulveriserad akrylamid, gör det i en dragskåp. Använd alltid ordentlig skyddsutrustning och ta omedelbart bort handskar som är förorenade med akrylamidpulver eller lösning, tvätta händerna noggrant. Om akrylamid kommer i direkt kontakt med huden, tvätta det utsatta området i minst 15 minuter med tvål och vatten. Om akrylamid kommer i direkt kontakt med ögonen, spola dem med vatten i 15 minuter.- Förbered PAGE-gelén: För att ta bort oönskade aborterande transkript och oreagerade rNTP: er från fullängdsprodukten, förbered en 6% urea-polyakrylamidgel. I allmänhet kan 28 cm x 16,5 cm x 1,5 mm geler användas med en 8-brunnkam. Ställ in gel- och elektroforesutrustningen med 1x TBE-buffert för att fylla behållarna.
- Ladda RNA-prover i PAGE-gelén: Ladda gelén med en släckt 200 μl-reaktion per körfält. I en separat körfält, ladda 2x ULB med trackerfärgämnen xylencyanol och bromfenolblå, som migrerar i gelén vid 106 nukleotider respektive 26 nukleotider15. Lämna ett tomt körfält mellan varje prov för att undvika potentiell kontaminering i nästa steg.
- Kör PAGE-gelén: För att separera 95-nt spenat2 och 49-nt broccoli från sina respektive stympade produkter, kör gelén i 1,5-2 h vid 25 W, vid vilken tidpunkt bromfenolblått färgämne kommer att ha migrerat ~ 5/6 av gellängden.
- Visualisera RNA-proverna i PAGE-gelén: Demontera glasplattorna runt gelén och täck gelén i plastfolie på båda sidor och märk banorna på omslaget. Visualisera RNA-band i ett mörkt rum genom UV-skuggning genom att placera den inslagna gelén på en fluorescerande TLC-platta under UV-ljus. Beskriv snabbt kanten på RNA-banden som motsvarar produkten med en markör och stäng av UV-lampan för att minimera skador från UV-exponering.
- Skär ut och extrahera RNA-proverna från PAGE-gelén: Med ett nytt rakblad för varje prov, skär ut de önskade produktbanden, tärna i ~ 1 mm kuber och tillsätt gelbitarna till ett 2 ml mikrocentrifugrör med 500 μL krossblötläggningsbuffert för att extrahera RNA på en rotator i antingen 2 timmar vid rumstemperatur (RT) eller över natten vid 4 ° C.
OBS: Valfri pauspunkt: Provet kan förvaras vid −20 °C. - Fäll ut RNA
- För att separera gelbitarna från det extraherade RNA i buffert, centrifugera provet vid 13 000 x g i 20 minuter vid 4 °C och använd sedan en smalspetspipett för att extrahera supernatanten och ladda den i ett nytt 2 ml mikrocentrifugrör.
- För att fälla ut RNA, tillsätt 1,5 ml iskall etanol och 1 μl 20 mg/ml glykogen, virvel, och förvara i minst 1 timme vid −20 °C eller −80 °C.
OBS: Valfri pauspunkt: RNA kan förvaras vid −20 °C i några månader.
- Uppsamling av RNA-fällning: Pelletera det utfällda RNA genom centrifugering vid 13 000 x g i 20 minuter vid 4 °C. Ta bort supernatanten och låt den återstående etanolen avdunsta utomhus (~ 1 h) innan pelleten åter åter åter i 30 μL ddH2O eller 1x TE-buffert.
OBS: Denna process resulterar vanligtvis i en slutlig RNA-koncentration på ~ 10 μM.
OBS: Valfri pauspunkt: RNA-provet kan förvaras vid −20 °C i några månader.
- Bestäm RNA-stamkoncentrationerna.
- Bered en RNA-alikvot för hydrolysreaktionen.
- För att utföra denna analys, använd först en UV / Vis nanospektrofotometer för att bestämma A260 av stam-RNA-provet och gör en utspädd alikvot av provet till ~ 10 absorbansenheter (AU) iddH2O.
- Förbered följande reaktion i ett 0,5 ml PCR-rör: 16 μL ddH2O + 2 μL10xNa2CO3-buffert + 2 μL RNA-alikvot utspädd till ~ 10 AU. Inkubera reaktionen i 90 minuter vid 95 °C och låt den sedan svalna till RT.
- Bestäm RNA-koncentrationen med hjälp av nukleotidabsorbanser: Mät A260 i detta prov med en UV / Vis nanospektrofotometer och beräkna RNA-koncentrationen med följande formel:
där c är koncentrationen av RNA, b är väglängden, i är den specifika nukleotiden (A, C, G eller U), n i är frekvensen av nukleotid i i RNA-sekvensen och ε i är den molära extinktionskoefficienten för nukleotid i. För att bestämma den ursprungliga stam-RNA-koncentrationen, multiplicera c med utspädningsfaktorn.
OBS: Valfri pauspunkt: RNA kan lagras vid −20 °C i några månader.
- Bered en RNA-alikvot för hydrolysreaktionen.
- SIDA rening av spenat2 och broccoli RNA
- Utföra en in vitro Analys av plåtläsarens kinetik
- Ställ in RNA-renaturationsprogrammet: Skapa följande termocyklerprotokoll genom att välja Skapa nytt program > Lägg till nytt fas > Lägg till nytt steg flera gånger för att lägga till vart och ett av följande steg innan du trycker på Spara:
70 °C i 3 min
65 °C i 45 s
60 °C i 45 s
55 °C i 45 s
50 °C i 45 s
45 °C i 45 s
40 °C i 45 s
35 °C i 45 s
30 °C i 45 s - Renaturera RNA: För att renaturera spenat2 och broccoli-RNA, förbered 2 μM-aktier av varje RNA iddH2Oi ett 0,5 ml tunnväggigt PCR-rör och tillsätt sedan en lika stor volym 2x renatureringsbuffert (80 mM HEPES, pH 7,5 [KOH], 250 mM KCl, 6 mM MgCl2) för att göra 1 μM RNA-lösningar. Lägg till rören i termocyclern, öppna det sparade renaturationsprogrammet och tryck på Kör.
OBS: Om en termocykler inte är tillgänglig kan RNA istället inkuberas på ett 70 °C värmeblock i 3 minuter och sedan få svalna långsamt till RT på bänken. - Förbered bindningsreaktionsbufferten: För att förbereda bufferten för en aptamer-färgbindningsreaktion, gör en huvudblandning innehållande buffertkomponenter (69,5 μLddH2O+ 4 μL av 1 M HEPES, pH 7,5 [KOH] + 6,2 μL av 2 M KCl + 0,3 μL av 1 M MgCl2). Beroende på hur många prover och replikat som behövs multiplicerar du dessa värden med antalet prover plus ett. I allmänhet är tre replikat per RNA-prov tillfredsställande.
- Förbered plattläsaren.
- Ställ in plattläsarinjektorprogrammet: På fluorescensplattläsaren väljer du Temp och ställer in önskad temperatur på 37 ° C, se till att temperaturen har utjämnats till detta värde väl innan kinetiska experiment påbörjas. Öppna programvaran för plattläsare, välj Inställningar > förvärvsvyn och mata in följande program för kinetikmätningar:
Slinga: För varje brunn
Originalinställning: 60 baslinjeläsningar
SmartInject-inställningar: 10 μL injektion (vilket kommer att hända efter att baslinjen har lästs)
Fluorescens (eller FL) lyder:
Excitation: 448 nm (bandbredd: 9 nm)
Utsläpp: 506 nm (bandbredd: 15 nm)
Patron: MONO (s/n 3297)
Timing:
Total lästid: 10 min
Läsintervall: 0,5 s
PMT och optik: 6 blixtar per läsning
Loop: Nästa brunn - Förbered injektorn
- Tvätta och aspirera injektorn: För att förbereda plattläsarinjektorn, välj först Injicera på plattläsaren, leverera en avfallsuppsamlingsplatta till plattläsaren när den riktas och välj sedan Tvätta och rengör injektionsröret enligt instruktionerna på plattläsaren med 1 ml volymer ddH2O, 75% etanol i ddH2O, och sedan ddH2O. Välj sedan Aspirat, så att injektorn kan mata ut överskottsvätska.
- Prime injektorn: Efter att ha lämnat till föregående skärm, välj Prime för att primera injektorn med två 260 μL volymer ligand som ska injiceras för att säkerställa att ren, koncentrerad ligand tillsätts till prover under experiment - i detta fall, prima med 100 μM DFHBI i ddH2O.
- Ställ in plattläsarinjektorprogrammet: På fluorescensplattläsaren väljer du Temp och ställer in önskad temperatur på 37 ° C, se till att temperaturen har utjämnats till detta värde väl innan kinetiska experiment påbörjas. Öppna programvaran för plattläsare, välj Inställningar > förvärvsvyn och mata in följande program för kinetikmätningar:
- Utför in vitro-kinetikexperiment: För att utföra ett kinetikexperiment, tillsätt först 80 μL tidigare beredd bindningsbufferthuvudblandning till en brunn av en 96-brunns klar bottenplatta, följt av 10 μL renaturerat RNA. Låt denna platta och DFHBI-lösningen i injektorn balansera till 37 °C i 15 minuter i plattläsaren.
- I plattläsarprogramvaran Inställningar under Läsområde väljer du den brunn som ska analyseras och väljer sedan Kör under fliken Start för att köra kinetikprogrammet som beskrivits tidigare. Upprepa denna process tills alla experiment är klara.
OBS: Kritiskt bör kinetiska experiment utföras en brunn i taget för att säkerställa att RNA-kinetiken mäts under identiska förhållanden mellan replikat och prover. - Tvätta injektorn: För att avlägsna den återstående DFHBI-lösningen från injektionsröret, tvätta injektionsröret enligt beskrivningen i steg 1.4.4.2.1 med 1 ml volymer ddH 2O, 75% etanol i ddH2O och sedan ddH2O.
OBS: Valfri pauspunkt.
- Ställ in RNA-renaturationsprogrammet: Skapa följande termocyklerprotokoll genom att välja Skapa nytt program > Lägg till nytt fas > Lägg till nytt steg flera gånger för att lägga till vart och ett av följande steg innan du trycker på Spara:
- Analys av in vitro-kinetiken hos fluorogena RNA-aptamerer.
- Mata in data i analysprogramvaran: Exportera experimentella data som ett kalkylblad för att enkelt kopiera över data för bearbetning. I analysprogramvaran skapar du en ny datatabell i XY-format. I kolumnen X anger du varje lästidpunkt, där t = 0 är tiden för DFHBI-injektion. I Y-kolumnen anger du de genomsnittliga fluorescensvärdena mellan replikaten vid respektive tidpunkt som börjar vid t = 0.
- Normalisera och diagram data: För att normalisera fluorescensvärdena, klicka på Analysera > databehandling > normalisera och klicka sedan på OK. Välj att använda de minsta och största värdena i datauppsättningen för normalisering, för att presentera resultat som bråktal och för att rita upp resultaten och klicka sedan på OK. Om du vill skapa ett diagram över normaliserad genomsnittlig fluorescens över tid klickar du på ikonen Normalisera för [Datauppsättningens namn] och väljer Diagramfamilj: XY med endast punkter.
Felstaplar kan vara användbara att se i fall där ett litet antal tidpunkter är graferade. Om du vill kan du välja en datatabell i XY-format genom att välja alternativet under "Y" för att ange replikeringsvärden i kolumner sida vid sida. Om du ritar den resulterande tabellen med de valda standardalternativen skapas ett diagram med felstaplar. - Utför kurvanpassning för att få kinetiska parametrar: För att anpassa en kurva till kinetikdata klickar du på Analysera > analysera data och väljer Icke-linjär regression (kurvpassning) under fliken XY-analyser . Under fliken Modell klickar du på Exponentiell > tvåfasassociation för att passa kinetikdata med följande tvåfasassociationsekvation:
där Y är fluorescensen vid tiden X, Y 0 är fluorescensen vid t = 0, K Fast och K Slow är snabba respektive långsamma hastighetskonstanter, och SpanFast och SpanSlow är intervallen för fluorescenspåslagning som förklaras av de snabba respektive långsamma hastigheterna (se representativa resultat, figur 1). Klicka på fliken Nonlin Fit för att visa hastighetskonstanter, t1/2-värden och PercentFast-värden.
OBS: För att erhålla en standardavvikelse för alla dessa värden kan enskilda plattläsarexperiment bearbetas på samma sätt som beskrivits ovan.
2. Cellulärt kinetikexperiment
- Beredning av E. coli-stammar
- Transformera BL21 Star (DE3) E. coli-celler med ~ 100 ng pET31b tRNA-Spenat2-konstruktion enligt tillverkarens protokoll.
OBS: Plasmidkonstruktion är kommersiellt tillgänglig (Plasmid #79783). - Platta cellerna på LB-agar som innehåller karbenicillinplattor (kolhydrat: 50 mg / ml) och inkubera vid 37 ° C i 12-16 timmar. Celler som innehåller plasmider kommer att växa som kolonier på plattan.
OBS: Valfri pauspunkt: Omvandlade BL21-stjärnceller på plattor kan förvaras vid 4 °C inslagna i parafilm i 1 vecka.
- Transformera BL21 Star (DE3) E. coli-celler med ~ 100 ng pET31b tRNA-Spenat2-konstruktion enligt tillverkarens protokoll.
- Växande celler och inducera uttrycket av fluorogen RNA-aptamer
- Inokulera en 2 ml odling av icke-inducerande medier (NI) innehållande karbenicillin (kolhydrat: 50 mg / ml) med en enda koloni av de transformerade BL21-stjärncellerna. Upprepa detta för minst tre biologiska replikat. Inkubera kulturerna vid 37 °C i en inkubator/shaker vid 250 rpm i 22–24 timmar.
OBS: Valfri pauspunkt: Celler som odlas i NI-media behåller plasmiden och kan förvaras vid 4 °C i 1 vecka. - Efter tillväxt i NI-media, späd kulturen 100x till en ny 3 ml ZYP-5052 autoinduktionsmedia (AI) innehållande karbenicillin (kolhydrat: 50 mg / ml). Odla cellerna vid 37 °C i en kuvös/shaker vid 250 rpm i 16-18 timmar för att framkalla uttryck.
OBS: Den typiska OD600 för kulturer kommer att sträcka sig från 2,0-3,3 efter 18 timmars tillväxt. Det optimala celldensitetsområdet är mellan 2,5-3,0.
- Inokulera en 2 ml odling av icke-inducerande medier (NI) innehållande karbenicillin (kolhydrat: 50 mg / ml) med en enda koloni av de transformerade BL21-stjärncellerna. Upprepa detta för minst tre biologiska replikat. Inkubera kulturerna vid 37 °C i en inkubator/shaker vid 250 rpm i 22–24 timmar.
- Utföra cellulära kinetikexperiment
- Ställ in flödescytometern.
- Slå på flödescytometern och datorn som är ansluten till instrumentet. När du är inloggad i programvaran för flödescytometern, under fliken Instrument , klickar du på startikonen . Följ stegen som anges på programvaruskärmen för att säkerställa korrekt instrumenteringsinitiering.
OBS: Vissa flödescytometrar kallar instrumentets startsekvens Priming. Se till att följa tillverkarens protokoll för flödescytometern som kommer att användas för experimentet. - Kör ett prestandatest (om tillämpligt). Under fliken Huvudmeny klickar du på Prestandatest. I ett odlingsrör, tillsätt tre droppar av tillverkarens prestandaspårningspärlor i 3 ml fokuseringsvätska.
- Placera odlingsröret i provrörslyftaren och lyft upp lyftaren. Innan du klickar på Kör prestandatest, se till att del # av röret på spårningspärlorna är densamma som vad som anges på skärmen Inställningar för prestandatest. Klicka på Prestandatest för att köra testet.
- Konfigurera flödescytometerprogramvaran för det här experimentet med följande förvärvsparametrar för encellsfluorescens:
Excitation laser: 488 nm
Emissionskanal: GFP (även kallad FITC)
Anskaffningsvolym: 40 μL (med en total dragvolym på 90 μL)
Flödeshastighet: 200 μl / min
Antal celler för varje mätning: 30 000
Instrumentinställningar:
Spänning:
FSC: 480 V
SSC: 400 V
BL1: 540 V
BL2: 392 V
BL3: 422 V
- Slå på flödescytometern och datorn som är ansluten till instrumentet. När du är inloggad i programvaran för flödescytometern, under fliken Instrument , klickar du på startikonen . Följ stegen som anges på programvaruskärmen för att säkerställa korrekt instrumenteringsinitiering.
- Konfigurera experimentfilerna.
- Skapa en ny experimentfil på fliken Experimentutforskaren genom att högerklicka på användarnamnet för flödescytometern. Välj Nytt experiment i listrutan. När ett nytt fönster på datorskärmen dyker upp väljer du OK.
- I den nya experimentfilen högerklickar du på mappen "Grupp" och väljer Lägg till nytt provrör. Märk provrören för varje specifik tidpunkt och replikera genom att högerklicka på Exempel och välja Byt namn i rullgardinsmenyn. Upprepa detta steg för det totala antalet replikat och tidpunkter för studiens avsedda tidsförlopp.
- Förbered en utspädd celllösning: Tillsätt 1,5 ml 1x PBS-lösning i ett nytt odlingsrör. Tillsätt sedan 3 μL inducerade celler i AI-media i 1x PBS-lösningen för att göra en utspädd celllösning. Upprepa detta steg för varje biologiskt replikat i olika odlingsrör.
- Mät cellernas bakgrundsfluorescens: Innan du tillsätter färgämne, ta avläsningar av varje biologiskt replikatodlingsrör som innehåller celler i 1x PBS-lösning. Detta är så att cellernas fluorescerande bakgrund mäts för att observera att vikningen slås på över tiden när färgämnet tillsätts.
- För att ta en avläsning, placera odlingsröret i provrörslyftaren och lyft lyftaren för hand till provinjektionsnålen. Välj rätt exempelfil på fliken Samlingspanel och klicka på Spela in.
- När körningen är klar, sänk provrörslyftaren med odlingsröret för hand. Detta kommer att initiera ett sköljsteg som spolar vätskesystemet och minimerar överföringen mellan varje biologiskt replikatprov. Data sparas automatiskt på datorn när körningen är klar.
- Upprepa stegen i 2.3.4 för att mäta den cellulära fluorescerande bakgrunden för minst tre biologiska replikat. Om du vill gå till nästa exempelfil väljer du nästa exempelfil genom att klicka på högerpilen nära exempelrörsnamnet under ikonen Spela in .
- Mät fluorescens vid tidpunkter för celler med färgämne.
- Tillsätt 1,4 μL av ett koncentrerat färgämne (50 mM DFHBI-1T i DMSO) i 1x PBS-lösning med celler för att ge en slutlig koncentration på 50 μM DFBHI-1T. Säkra sedan odlingsrörets lock och invertera sedan odlingsrören 3x-5x för att blanda lösningen jämnt innan du tar den första tidspunktsläsningen.
OBS: Den totala procentandelen DMSO i odlingsrören för E. coli bör inte överstiga 10%, eftersom detta kan påverka cellviabiliteten16. - Ta bort locket och placera odlingsröret i provrörslyftaren. Lyft upp hållaren för hand till provinjektionsnålen och klicka på ikonen Spela in under rätt provfil. Börja dessutom en timer genom att trycka på Start för experimentet.
- Sänk rörlyftaren för hand efter att körningen är klar och upprepa steg 2.3.5.1–2.3.5.2. (med timern igång) genom att tillsätta 1,4 μL av den koncentrerade DFHBI-1T, invertera odlingsrören och ta avläsningar för alla återstående biologiska replikat. Dessa första inspelningar kommer att vara de avläsningar som erhålls vid 0 min för alla biologiska replikat. Gör detta en i taget för varje biologiskt replikat.
OBS: Anteckna den tid då inhämtningen av rekordflödescytometri trycks in. Håll dig till den här tiden svindlande för tidspunkter under experimentets gång. - Fortsätt att ta avläsningar genom att höja odlingsrören i provrörslyftaren till provinjektionsnålen, välja rätt provfil, klicka på Spela in och sänka lyftaren för hand efter att varje körning är klar. Gör detta för alla ytterligare tidpunkter och biologiska replikat som testas. Upprepa stegen tills experimentet är klart.
OBS: Håll proverna borta från ljus för att undvika fotoblekning av DFHBI-1T i lösning genom att täcka proverna med aluminiumfolie.
- Tillsätt 1,4 μL av ett koncentrerat färgämne (50 mM DFHBI-1T i DMSO) i 1x PBS-lösning med celler för att ge en slutlig koncentration på 50 μM DFBHI-1T. Säkra sedan odlingsrörets lock och invertera sedan odlingsrören 3x-5x för att blanda lösningen jämnt innan du tar den första tidspunktsläsningen.
- Mät fluorescens vid tidpunkter för celler utan färgämne (Kontroll).
- Kör lämpliga rengöringsprotokoll för flödescytometern innan du upprepar experimentet igen med negativa kontroller enligt tillverkarens protokoll. Detta görs för att minimera eventuell överföring från föregående experiment till kontrolltidsanalysexperimentet. Nedan följer stegen som följs för flödescytometern mellan experiment:
- Placera ett tomt odlingsrör i rörlyftaren för hand, lyft upp rörhållaren och klicka på ikonen Unclog på fliken Instrument . Detta kommer att köra en backflush i fluidiksystemet för att städa upp eventuella klibbiga prover. Sänk rörhållaren för hand och ta bort röret när Unclog-sekvensen är klar.
- Med ett nytt odlingsrör, tillsätt 3 ml av en 10% blekmedelslösning, placera odlingsröret i rörhållaren och lyft upp hållaren för hand till provinjektionsnålen. Placera dessutom en ren 96-brunnsplatta i autosamplern om tillämpligt på flödescytometern.
- Klicka på ikonen Sanitize SIP / Sanitize Autosampler SIP för att köra en rengöringssekvens med 10% blekmedel i hela fluidiksystemet. Sänk rörhållaren för att slutföra rengöringssekvensen.
- Ställ in exempelfilerna för kontrolltidspunktsanalyskörningen enligt anvisningarna i steg 2.3.3.
- Bered i ett nytt odlingsrör en utspädd celllösning i 1,5 ml 1x PBS-lösning. Tillsätt 3 μl av de inducerade cellerna i AI-media i 1x PBS-lösningen för att göra en utspädd celllösning. Upprepa detta steg för varje biologiskt replikat.
- Tillsätt 1,4 μl DMSO i odlingsröret en i taget till 1x PBS-lösningen med celler och testa samma tidpunkter. Säkra odlingsrörets lock och vänd sedan odlingsrören 3x-5x för att blanda lösningen jämnt innan du tar den första tidspunktsavläsningen. Gör detta en i taget för varje biologiskt replikat.
- Följ samma protokoll för analys av kontrollceller som för celler med färgämne, med hjälp av steg 2.3.5.2-2.3.5.4.
- Kör lämpliga rengöringsprotokoll för flödescytometern innan du upprepar experimentet igen med negativa kontroller enligt tillverkarens protokoll. Detta görs för att minimera eventuell överföring från föregående experiment till kontrolltidsanalysexperimentet. Nedan följer stegen som följs för flödescytometern mellan experiment:
- Stäng av flödescytometern: Följ tillverkarens protokoll för korrekt avstängning av instrumenteringen. För flödescytometern förbereds instrumentet för avstängning på följande sätt:
- Utför det inledande rengöringsprotokollet för flödescytometern enligt stegen 2.3.6.1.1-2.3.6.1.3.
- Byt ut odlingsröret med 10% blekmedelslösning med ett odlingsrör med 3 ml fokuseringsvätska. Lyft rörhållaren för hand och klicka på rullgardinsmenyn under ikonen Stäng av och välj Grundlig.
OBS: Valfri pauspunkt.
- Ställ in flödescytometern.
- Analys av flödescytometridata
- Exportera alla FCS-filer för analys. Öppna FCS-filerna med en programvara för flödescytometrianalys.
- Använd en av FCS-filerna med endast celler för att generera en grind från punktdiagrammet för framåtriktad spridning (FSC) och sidospridning (SSC) (FSC-område/SSC-område), med hjälp av båda loggaxlarna för att utesluta signaler från skräp. För att skapa den här porten, klicka på AutoGate-ikonen i programvaran för flödescytometrianalys och ge den namnet Gate 1. Använd samma grind på alla exempel som testats under fliken Alla exempel på arbetsytan för databearbetning. Detta kommer att resultera i gate 1 under alla FCS-filer som behandlas.
- Skapa en ny delmängdsfil med FCS-filen Cell only som användes i steg 2.4.2 genom att dubbelklicka på den. Ändra axelinställningarna till FSC-Area/FSC-Height, där båda använder loggaxlar. Klicka på AutoGate-ikonen i programvaran för flödescytometrianalys för att generera en oval grind och namnge den Gate 2. Applicera den här grinden som en delmängd under grinduppsättningen i steg 2.4.2 på alla prov som testats. Detta resulterar i att alla prover har Gate 1 > Gate 2 associerade med varje FCS-fil.
- Skapa en annan delmängdsfil med båda grindarna inställda i steg 2.4.2 och steg 2.4.3 tillämpas genom att dubbelklicka på Gate 2. Ändra axelinställningarna till FSC-område/histogram. Använd den här histogramporten som en delmängd på alla testade prover, vilket resulterar i att alla prover har Gate 1 > Gate 2 > Gate 2 associerade med varje FCS-fil.
OBS: Histogrammen kan döpas om från Gate 2 till Histogram för att hjälpa till med att flytta histogrammen till layoutfönstret, samt för att skapa mer organisation med databehandlingen. - Om du vill analysera MFI-värdena (Mean Fluorescence Intensity (MFI) öppnar du layoutfönstret. Klicka och dra histogramgrindarna för varje tidpunkt till layoutfönstret.
- Utför en statistisk analys för "∑ Mean: BL1-A" (GFP) för varje prov som testas för att visa MFI-resultaten i layoutfönstret.
- Beräkna standardavvikelsen för MFI-värdena per tidspunktsanalys för minst tre oberoende biologiska replikat.
- Spara histogrammen och MFI-värdena för varje tidpunkt genom att exportera layoutfönstret som en PDF-fil.
OBS: Valfri pauspunkt.
- Grafflödescytometridata
- Öppna PDF-filen som innehåller histogrammen och MFI-värdena för varje tidpunkt. MFI-värdena kopieras över till en dataanalysprogramvara. I datagrafprogramvara skapar du en ny datatabell i XY-format.
- Välj det här alternativet om du vill skapa en XY-tabell med följande markerat:
Datatabell: Ange eller importera data till en ny tabell
Alternativ:
X: Förfluten tid
Y: Ange (tre till fyra) replikeringsvärden i underkolumner sida vid sida - Etikettera på X-axeln alla tidpunkter för experimentet och kontrollkörningarna.
- I grupp A matar du in MFI-värdena för alla biologiska replikat i varje tidpunkt för fluorescensanalys av cellerna med färgämnet tillsatt.
- I grupp B matar du in MFI-värdena för alla biologiska replikat i varje tidpunkt för analys av cellerna utan tillsatt färgämne (DMSO).
- För att observera resultaten, klicka på [Infoga datauppsättningsnamn] under fliken Grafer . Detta visar datapunkterna som medel, med felstaplar som representerar standardavvikelsen (s.d.) vid varje tidpunkt. X-axeln representerar den förflutna tiden och Y-axeln representerar MFI-värdena.
- Välj det här alternativet om du vill skapa en XY-tabell med följande markerat:
- Öppna PDF-filen som innehåller histogrammen och MFI-värdena för varje tidpunkt. MFI-värdena kopieras över till en dataanalysprogramvara. I datagrafprogramvara skapar du en ny datatabell i XY-format.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kinetik in vitro
Sekvenserna av DNA-mallarna och primrarna, som köps som syntetiska oligonukleotider, visas i tabell 2 och reagensrecepten visas i tilläggsfil 1. PCR-förstärkning används för att skala upp mängden DNA-mall med T7-promotorn, vilket krävs för den efterföljande in vitro-transkriptionsreaktionen (IVT). Dessutom kan PCR-förstärkning användas för två ändamål i samma reaktion: för att generera Broccoli DNA-mallen i full längd genom primerförlängning, samt för att skala upp DNA-mallen.
Efter IVT-reaktionen för att syntetisera RNA kommer PAGE-rening att ta bort oönskade trunkerade transkript, nedbrutna produkter och oreagerade rNTP: er från RNA-produkten i full längd. Denna typ av rening är att föredra eftersom stympade eller nedbrutna RNA kommer att orsaka felaktig bestämning av RNA-koncentrationer. Eftersom nukleotidbaser absorberar UV-ljus kan RNA-band och rNTP på gelén visualiseras under UV som skuggor mot en fluorescerande TLC-platta. Således kan band som motsvarar rätt produktstorlek extraheras selektivt.
Metoden med närmaste granne överskattar utrotningskoefficienterna och därmed koncentrationerna av strukturerade RNA eftersom den inte tar hänsyn till hypokromicitet på grund av basparning17. För att bestämma exakta RNA-koncentrationer utfördes därför neutrala pH-termiska hydrolysanalyser för att hydrolysera RNA till enskilda NMP18. Den exakta extinktionskoefficienten beräknades som en summa av extinktionskoefficienterna för NMP i RNA-sekvensen.
Kinetiken för DFHBI-bindning till spenat2 och broccoli bestämdes med hjälp av en plattläsaranalys. RNA renaturerades först för att säkerställa att det skulle vara i rätt konformation för färgbindning. Reaktionsbetingelserna för plattläsarkinetikanalysen bestod av 40 mM HEPES, pH 7,5 (KOH), 125 mM KCl, 3 mM MgCl2, 100 nM renaturerat RNA och 10 μM DFHBI, och reaktionen mättes vid 37 °C. Denna temperatur och koncentration av MgCl 2 valdes för att efterlikna fysiologiska förhållanden 19, även om förhållanden på 28 °C och10 mM MgCl2 också kan användas för förbättrad aptamervikning.
Båda fluorogena aptamererna Spenat2 och Broccoli visar tvåfasassociationskinetik för bindning till DFHBI-färgämnet (Figur 2). Kinetikdata passade bättre genom tvåfasassociation än enfasassociation för båda aptamererna (kompletterande figur 1). Hastighetskonstanterna och t1/2-värdena för de snabba och långsamma associationerna bestämdes av den bästa passformskurvan (tabell 3). PercentFast, som beskriver vilken procent av fluorescensens påslagningsstorlek som står för den snabbare DFHBI-bindande RNA-populationen, bestämdes också.
Spenat2 i bindningskompetent tillstånd visar snabbare påslagning än Broccoli (t 1/2 = 1,2 s vs.2,0 s). Den andra fasens kinetik för båda aptamererna är likartade (t1/2 = 180 s) och motsvarar sannolikt ett vanligt hastighetsbegränsande steg för en delpopulation av provet (PercentFast = 68% och 60% för spenat2 respektive broccoli). Sammantaget visar dessa resultat att välvikta spenat2- och broccoli-aptamerer uppvisar mycket snabb påslagningskinetik, med den initiala halvmaximala påslagningen inom 1-2 s färgtillsats.
Cellulär kinetik
Sekvenserna av DNA-konstruktionerna, som klonas till pET31b-plasmiden, visas i tabell 2 och reagensrecept visas i tilläggsfil 1. DNA-konstruktionerna av fluorogena RNA-aptamerer finns vanligtvis i en tRNA-ställning för cellulära experiment. BL21 Star (DE3) E. coli-stammen är en uttrycksstam med en mutation i RNas E som ökar RNA-stabiliteten.
Fluorescensmätningarna registrerades var 5: e minut under de första 45 minuterna, följt av avläsningar vid 1 h, 1,5 h och 2 h, vilket gav totalt 12 tidspunkter plus cellavläsningen. Med det kortaste tidsintervallet på 5 min kunde flera biologiska replikat mätas vid varje tidpunkt, med regelbundet avstånd mellan replikatmätningarna på 30 s till 1 min. Den totala volymen celler utspädda i 1x PBS-lösning som användes för tidsförloppsexperimentet var 1,5 ml.
Cellerna gated innan man bestämde den genomsnittliga fluorescensintensiteten (MFI) för populationen av enskilda celler. Gating väljer ett område på spridningsdiagrammet för att bestämma cellpopulationen som ska analyseras. Denna process förhindrar att skräp eller flera avläsningar inkluderas i analysen. För den visade flödescytometrianalysen registrerades 30 000 händelser, vilket resulterade i 10 000-20 000 händelser analyserade efter gating.
Den cellulära fluorescenskinetiken är en funktion av både färgämnesdiffusion i E. coli och färgämnesbindande kinetik till RNA-aptameren i cellmiljön (figur 1B). För celler som uttrycker spenat2-tRNA observerades att den genomsnittliga fluorescensintensiteten (MFI) ökar omedelbart vid "0" -tidpunkten på grund av den korta tidsfördröjningen (i sekunder) mellan färgämnestillsats och provanalys (figur 3A). Dessutom har cellulär fluorescens redan nått sitt maximala utjämnade MFI-värde (40 441 ± 990) vid den första tidpunkten på 5 min. Däremot visar kontrollceller låg bakgrundsfluorescens (416) och ingen förändring i MFI-värde med DMSO-tillägg (figur 3B). En jämförelse mellan celler med färgämne och celler utan färgämne avslöjar att fluorescensaktivering är 98-faldig ± 2 i celler. Sammantaget visar dessa resultat att spenat-tRNA uttryckt i E. coli-celler uppvisar snabb påslagningskinetik, med maximal påslagning inom mindre än 5 minuters färgämnestillsats.
Figur 1: Schematisk för fluorescensaktivering. Fluorescensaktivering sker vid RNA-aptamerer som binder till färgämnesmolekyler (A) in vitro och (B) i celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: In vitro-kinetik hos de fluorogena aptamererna. Representativ in vitro-kinetik för fluorogena aptamerer (A,B) Spenat2 eller (C,D) Broccoli modellerad genom tvåfasassociation, där t = 0 s är tidpunkten för DFHBI-tillsats (slutlig DFHBI-koncentration: 10 μM). Experiment utfördes i tre exemplar. Alla felstaplar representerar standardavvikelser från medelvärdet. Från passformen erhölls t1/2-värden för både de snabba och långsamma associeringsreaktionskomponenterna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Representativ cellulär kinetik för spenat2 i en tRNA-ställning . (A) Analys av upptag av tRNA-spenat2-färgämne under 2 timmar. En baslinje endast för celler togs innan DFHIB-1T eller DMSO lades till. Tidspoäng togs var 5: e minut under de första 45 minuterna, följt av en tidspunktsavläsning vid 1 h, 1,5 h och 2 h. Pil representerar när DFHBI-1T eller DMSO tillsattes i 1x PBS-lösning med BL21-stjärnceller. Den slutliga koncentrationen av DFHBI-1T för analys är 50 μM. För DMSO-kontrollen var tillsatsen av DMSO vid en lika stor volym (1,4 μL) som användes för DFHBI-1T-färgämnestillsats. (B) En närbild av DMSO-kontrollens tidpunkt med BL21 Star E. coli-celler. Genomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) indikerar den totala fluorescerande avläsningen av BL21-stjärnceller med färgämne eller DMSO. Data representerar medelvärdet ± standardavvikelsen för tre biologiska replikat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Aptamer-Dye par | Längd (nt) | Max abs (nm) | Max em (nm) | Extinktionskoefficient (M-1· cm-1) | Kvantutbyte | Intelligens | Kd (nm) | Tm (°C) | Hänvisning |
| Spenat2-DFHBI | 95 | 445 | 501 | 26100 | 0.7 | 63 | 1450 | 37 | 4 |
| Spenat2-DFHBI-1T | 95 | 482 | 505 | 31000 | 0.94 | 100 | 560 | 37 | 13, 14 |
| Broccoli-DFHBI-1T | 49 | 472 | 507 | 29600 | 0.94 | 96 | 360 | 48 | 13 |
Tabell 1: Tidigare publicerade fotofysiska och biokemiska egenskaper hos Spenat2-DFHBI4, Spenat2-DFHBI-1T 13,14 och Broccoli-DFHBI-1T 13.
| Spenat2 + T7 promotor | 5'-CGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGATGTAACTGAATGAAATGGTGAA GGACGGGTCCAGTAGGCTGCTTCGGCAGCCTACTTGTTGAGTAGAGTGTGAGCTCC GTAACTAGTTACATC-3' |
||
| Broccoli + T7 promotor | 5'-CGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGgagacggtcgg gtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctc-3' |
||
| tRNA-Spenat2-konstruktion (i pET31b-plasmid) | 5'-CGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGCCCGGATAGCTCAGTCGGT AGAGCAGCGGCCGGATGTAACTGAATGAAATGGTGAAGGACGGGTCCAGTAGGCT GCTTCGGCAGCCTACTTGTTGAGTAGAGTGTGAGCTCCGTAACTAGTTACATCCGG CCGCGGGTCCAGGGTTCAAGTCCCTGTTCGGGCGCCA TAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG-3' |
||
| Spenat2 Framåt Primer | 5'-CGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAG-3' | ||
| Spenat2 omvänd primer | 5'-GATGTAACTAGTTACGGAGC-3' | ||
| Broccoli framåt primer | 5'-CGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGgagacggtcgggtccagatattcgtatctg-3' | ||
| Broccoli omvänd primer | 5'-gagccacactctactcgacagatacgaatatctggacccgaccgtctc-3' | ||
Tabell 2: DNA-sekvenstabell som innehåller DNA-sekvenser och primers som används för in vitro - och cellulära kinetikstudier. Fetstil= T7-promotor; Understruken = tRNA-ställning; Kepsar = Spenat2; gemener = Broccoli; Fet kursiv = T7 terminator.
| Aptamer | Snabb t1/2 (s) | Långsam t1/2 (s) | KSnabb (s-1) | KLångsam (s-1) | Procent snabbt |
| Spenat2 | 1.2 ± 0,2 | 180 ± 10 | 0,56 ± 0,07 | 0,0039 ± 0,0002 | 68 ± 5 |
| Broccoli | 2,0 ± 0,2 | 180 ± 30 | 0,35 ± 0,05 | 0,0039 ± 0,0006 | 60 ± 3 |
Tabell 3: Kinetikvärden in vitro för spenat2- och broccoliaptamerer härledda från anpassade data. Data rapporteras som medelvärdet ± standardavvikelsen för tre replikat.
Kompletterande figur 1: Representativ in vitro-kinetik för fluorogena aptamerer. Representativ in vitro-kinetik för fluorogena aptamerer (A,C) Spenat2 eller (B,D) Broccoli modellerad genom enfasassociation vid (A,B) 600 s eller (C,D) 20 s mättider, med pilar som anger tidpunkten för DFHBI-tillsats (slutlig DFHBI-koncentration: 10 μM). Experiment utfördes i tre exemplar. Sammantaget passar dessa data mindre bra av en enfasassociationsmodell än en tvåfasassociationsmodell när fluorescenssignalen övervakas under en längre tid. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 1: Recept för in vitro-kinetikexperiment. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För in vitro-kinetikexperimentet kan samma allmänna protokoll modifieras för att mäta in vitro-kinetiken hos en RNA-baserad fluorescerande biosensor som innehåller både en ligandbindande och fluoroforbindande domän8. I detta fall bör RNA inkuberas med fluoroforen före mätningar vid injektion av liganden för att erhålla ligandresponskinetik. Om hög variabilitet observeras mellan replikaten kan man felsöka genom att kontrollera att varje prov får balansera under samma tid i 96-brunnsplattan före mätning. Varje prov eller replikat bör beredas individuellt i en brunn och mätas direkt efter jämviktssteget på 15 minuter, i stället för att alla prover förbereds på en gång.
För cellulära kinetikexperiment kan protokollet modifieras för kortare eller längre tidskurser, men det är viktigt att planera antalet biologiska replikat och justera den nödvändiga celllösningsvolymen. Det rekommenderas att fördela varje biologisk replikatavläsning mellan 30 s och 1 min för att ha tillräckligt med tid för att utföra stegen noggrant. En annan modifiering är att testa ett annat fluorogent färgämne som inte binder RNA-aptameren som en alternativ negativ kontroll, som inte bör visa fluorescensaktivering över bakgrunden. Om inkonsekventa resultat observeras kan man felsöka genom att kontrollera att flödescytometern är ordentligt rengjord enligt tillverkarens protokoll mellan olika experimentella körningar för att förhindra blödning av celler eller färgämnen från föregående körning till nästa.
Medan den presenterade in vitro-metoden är användbar för att jämföra kinetiken mellan fluorogena aptamerer eller RNA-baserade fluorogena biosensorer, kan de erhållna kinetiska värdena förändras beroende på temperatur, magnesiumkoncentration eller andra buffertkomponenter som används. Även om denna metod ger väldefinierade förhållanden som tidigare har använts för att karakterisera olika fluorogena RNA-system, kan den intracellulära miljön inte representeras perfekt på grund av närvaron av andra biologiska makromolekyler.
Medan fluorescensplattläsaren utrustad med en programmerbar injektor inte har någon dödtid för datainsamling, har flödescytometerinstrumentet begränsad tidsnoggrannhet på grund av observerbar dödtid. Det finns en fördröjning på ~ 5 s mellan när du klickar på "Spela in" -knappen och när datainsamlingen startar. Ytterligare ~5 s fördröjning uppstår för att instrumentet ska kunna mäta 30 000 händelser; denna provförvärvstid varierar något beroende på hur utspädda cellerna är i 1x PBS.
En annan potentiell begränsning för cellulära experiment är cellviabiliteten i 1x PBS. För längre tidspunktsanalyser kan cellviabiliteten kontrolleras med hjälp av propidiumjodid för att fläcka döda celler20. Färgaggregering kan också begränsa noggrannheten hos fluorescensmätningar som görs av flödescytometern. Färgämnen med mycket begränsad löslighet i vattenhaltiga lösningar kan aggregeras och framstå som partiklar som är tillräckligt stora för att räknas som celler på flödescytometern. Därför är det viktigt att köra experimentella kontroller med endast färgämne för att kontrollera om det finns aggregat i den gated regionen.
Tidigare visades att broccoli har jämförbar ljusstyrka med spenat2 vid 1 mM Mg2+in vitro, men Broccoli-tRNA uppvisar ~ två gånger större fluorescensintensitet i levande E. coli jämfört med spenat2-tRNA13. Såvitt vi vet har den färgämnesbindande kinetiken för spenat2 och broccoli fluorogena aptamerer inte jämförts tidigare och modellerats av en tvåfasförening. De initiala snabbhastighetskonstanterna för båda RNA-aptamererna stöder att färgämnesbindningsfickan är förvikta och inga strukturella förändringar behövs för att färgämnet ska binda, vilket överensstämmer med röntgenkristallografi och UV-smältningsexperiment21,22. Den andra fasen med en långsammare hastighetskonstant har inte tidigare rapporterats eftersom andra experiment som stoppat flöde och fluorescenslivslängdsmätningar analyserade spenataptameren under en kortare varaktighet (20 s och 300 s)23,24. Den mycket långsammare andra fasen resulterar i en observerad biexponentiell ökning av fluorescens när data analyseras för 600 s. Detta långsamma steg kan hänföras till antingen ett hastighetsbegränsande omveckningssteg från ett bindande inkompetent till bindningskompetent RNA-tillstånd eller ett hastighetsbegränsande fotokonverteringssteg från trans- till cis-former av det bundna färgämnet. Den senare mekanismen modellerades tidigare för att ge en biexponentiell fluorescensprofil24 och stöds av en nyligen genomförd analys av skillnaden mellan absorptions- och excitationsspektra på den relaterade aptameren, Baby Spenat25.
Den övergripande betydelsen av in vitro-fynden är att de visar att färgämnesassociation till den fluorogena RNA-aptameren inte begränsar RNA-lokalisering i realtid och genuttrycksstudier. För RNA-baserade fluorescerande biosensorer som använder spenat2 liknar den uppmätta påslagskinetiken den andra faskinetiken som mäts här10 eftersom biosensorerna kräver ett omveckningssteg och därför bör vara tillräckligt snabba för att möjliggöra signalstudier i nära realtid.
Det förväntades att den cellulära kinetiken skulle skilja sig från den observerade in vitro-kinetiken för spenat2. En viktig skillnad är att det finns ytterligare ett steg av färgämnesdiffusion i E. coli-cellerna , vilket innebär att man korsar de yttre och inre membranen. Dessutom utgör den cellulära miljön olika förutsättningar för färgämnes-aptamerföreningen när det gäller molekylär trängsel, jonkomposition och koncentrationer, liksom RNA- och färgämneskoncentrationer.
Den övergripande betydelsen av resultaten är att cellulär fluorescens når maximal signal på mindre än 5 minuter och förblir stabil i minst 2 timmar, vilket möjliggör RNA-lokalisering i realtid och genuttrycksstudier i detta tidsintervall. För en RNA-baserad biosensor som använder spenat2 har vi tidigare visat att ett signifikant fluorescenssvar kunde observeras inom 4-5 min efter ligandtillsats men att det tar längre tid (15-30 min) 8 att nå den maximala signalen. Sammantaget indikerar dessa fynd att färgämnesdiffusion i celler inte är det praktiska hastighetsbegränsande steget för in vivo-experiment med RNA-baserade biosensorer. Slutligen kan detta experimentella protokoll tillämpas för att analysera andra fluorogena RNA-system i celler.
De experimentella protokollen som presenteras här kan tillämpas för att analysera andra fluorogena RNA-system. Utöver de två aptamerer som analyserats i denna studie, Spenat2 och Broccoli, har andra fluorogena RNA-system utvecklats som ger olika emissionsprofiler, förbättrad fotostabilitet, tätare bindningsaffiniteter och förmågan att ändra fluoroforer (nyligen granskad1). Förutom deras fluorescensegenskaper är det viktigt att jämföra den påslagna kinetiken för dessa system in vitro och i celler för att bedöma deras lämplighet för olika cellbiologiska tillämpningar. Resultaten kan också stödja strukturell förvikning eller omläggning av aptameren. Som diskuterats, med vissa modifieringar, har dessa protokoll också tillämpats för att analysera RNA-baserade biosensorer8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av följande bidrag till MCH: NSF-BSF 1815508 och NIH R01 GM124589. MRM stöddes delvis av utbildningsbidrag NIH T32 GM122740.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Thermo Fischer Scientific | BP160500 | |
| Agarose gel electrophoresis equipment | Thermo Fischer Scientific | B1A-BP | |
| Alpha D-(+)-lactose monohydrate | Thermo Fischer Scientific | 18-600-440 | |
| Amber 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fischer Scientific | 22431021 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| Attune NxT Flow cytometer | Thermo Fischer Scientific | A24861 | |
| Attune 1x Focusing Fluid | Thermo Fischer Scientific | A24904 | |
| Attune Shutdown Solution | Thermo Fischer Scientific | A24975 | |
| Attune Performance Tracking Beads | Thermo Fischer Scientific | 4449754 | |
| Attune Wash Solution | Thermo Fischer Scientific | J24974 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C3416 | |
| Chlorine Bleach | Amazon | B07J6FJR8D | |
| Corning Costar 96-well plate | Daigger Scientific | EF86610A | |
| Culture Tubes, 12 mm x 75 mm, 5 mL with attached dual position cap | Globe Scientific | 05-402-31 | |
| DFHBI | Sigma-Aldrich | SML1627 | |
| DFHBI-1T | Sigma-Aldrich | SML2697 | |
| D-Glucose (anhydrous) | Acros Organics | AC410955000 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| DNA loading dye | New England Biolabs | B7025S | |
| DNA LoBind Tubes (2.0 mL) | Eppendorf | 22431048 | |
| dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP | New England Biolabs | N0446S | |
| EDTA, pH 8.0 | Gibco, Life Technologies | AM9260G | |
| Ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Filter-tip micropipettor tips | Thermo Fischer Scientific | AM12635, AM12648, AM12655, AM12665 | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | N/A | FlowJo v10 Software |
| Fluorescent plate reader with heating control | VWR | 10014-924 | |
| Gel electrophoresis power supply | Thermo Fischer Scientific | EC3000XL2 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycogen AM95010 | Thermo Fischer Scientific | AM95010 | |
| GraphPad Prism | Dotmatics | N/A | Analysis software from Academic Group License |
| Heat block | Thomas Scientific | 1159Z11 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| Inorganic pyrophosphatase | Sigma-Aldrich | I1643-500UN | |
| Low Molecular Weight DNA Ladder | New England Biolabs | N3233L | Supplied with free vial of Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS (NEB #B7025). |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Fisher Scientific | MFCD00011110 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22363204 | |
| Microcentrifuge with temperature control | Marshall Scientific | EP-5415R | |
| Micropipettors | Gilson | FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M | |
| Micropipettor tips | Sigma-Aldrich | Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR | |
| Millipore water filter with BioPak unit | Sigma-Aldrich | CDUFBI001, ZRQSVR3WW | |
| Narrow micropipettor pipette tips | DOT Scientific | RN005R-LRS | |
| PBS, 10x | Thermo Fischer Scientific | BP39920 | |
| PCR clean-up kit | Qiagen | 28181 | |
| PCR primers and templates | Integrated DNA technologies | ||
| PCR thermocycler for thin-walled PCR tubes | Bio-Rad | 1851148 | |
| PCR thermocycler for 0.5 mL tubes | Techne | 5PRIME/C | |
| pET31b-T7-Spinach2 Plasmid | Addgene | Plasmid #79783 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530L | Purchase of Phusion High-Fideldity Enzyme is supplied with 5x Phusion HF Buffer, 5x Phusion GC Buffer, and MgCl2 and DMSO solutions. |
| Polyacrylamide gel electrophoresis gel comb, C.B.S. Scientific | C.B.S. Scientific | VGC-1508 | |
| Polyacrylamide gel electrophoresis equipment | C.B.S. Scientific | ASG-250 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Razor blades | Genesee Scientific | 38-101 | |
| rNTPs: ATP, CTP, GTP, UTP | New England Biolabs | N0450L | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Short wave UV light source | Thermo Fischer Scientific | 11758221 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S7795 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Thermo Fischer Scientific | S375-500 | |
| SoftMax Pro | Molecular Devices | N/A | SoftMax Pro 6.5.1 (platereader software) obtained through Academic Group License |
| Sterile filter units | Thermo Fischer Scientific | 09-741-88 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SYBR Safe DNA gel stain | Thermo Fischer Scientific | S33102 | |
| TAE buffer for agarose gel electrophoresis | Thermo Fischer Scientific | AM9869 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Tryptone (granulated) | Thermo Fischer Scientific | M0251S | |
| T7 RNA polymerase | New England Biolabs | M0251S | |
| Urea-PAGE Gel system | National Diagnostics | EC-833 | |
| UV fluorescent TLC plate | Sigma-Aldrich | 1.05789.0001 | |
| UV/Vis spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | ND-8000-GL | |
| Vortex mixer | Thermo Fischer Scientific | 2215415 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| Yeast Extract (Granulated) | Thermo Fischer Scientific | BP9727-2 |
References
- Su, Y., Hammond, M. C. RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of small molecules and RNAs. Current Opinion in Biotechnology. 63, 157-166 (2020).
- Zhang, J., et al. Tandem spinach array for mRNA Imaging in living bacterial cells. Scientific Reports. 5, 17295 (2015).
- Wang, Z., et al. In spatial complementation of aptamer-mediated recognition enables live-cell imaging of native RNA transcripts in real time. Angewandte Chemie. 57 (4), 972-976 (2018).
- Strack, R. L., Disney, M. D., Jaffrey, S. R. A superfolding Spinach2 reveals the dynamic nature of trinucleotide repeat-containing RNA. Nature Methods. 10 (12), 1219-1224 (2013).
- Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
- You, M., Litke, J. L., Jaffrey, S. R. Imaging metabolite dynamics in living cells using a Spinach-based riboswitch. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2756-2765 (2015).
- Kellenberger, C. A., Wilson, S. C., Sales-Lee, J., Hammond, M. C. RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of second messengers cyclic di-GMP and cyclic AMP-GMP. Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 4906-4909 (2013).
- Manna, S., Truong, J., Hammond, M. C. Guanidine biosensors enable comparison of cellular turn-on kinetics of riboswitch-based biosensor and reporter. ACS Synthetic Biology. 10 (3), 566-578 (2021).
- Bose, D., Su, Y., Marcus, A., Raulet, D. H., Hammond, M. C. An RNA-based fluorescent biosensor for high-throughput analysis of the cGAS-cGAMP-STING pathway. Cell Chemical Biology. 23 (12), 1539-1549 (2016).
- Wang, X. C., Wilson, S. C., Hammond, M. C. Next-generation RNA-based fluorescent biosensors enable anaerobic detection of cyclic di-GMP. Nucleic Acids Research. 44 (17), 139 (2016).
- Paige, J. S., Thinh, N. -D., Wenjiao, S., Jaffrey, S. R. Fluorescence imaging of cellular metabolites with RNA. Science. 335 (6073), 1194 (2012).
- Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333 (6042), 642-646 (2011).
- Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Jaffrey, S. R. Broccoli: Rapid selection of an RNA mimic of green fluorescent protein by fluorescence-based selection and directed evolution. Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).
- Song, W., Strack, R. L., Svensen, N., Jaffrey, S. R. Plug-and-play fluorophores extend the spectral properties of spinach. Journal of the American Chemical Society. 136 (4), 1198-1201 (2014).
- Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).
- Basch, H., Gadebusch, H. H. In vitro antimicrobial activity of dimethylsulfoxide. Applied Microbiology. 16 (12), 1953-1954 (1968).
- Kallansrud, G., Ward, B. A comparison of measured and calculated single- and double-stranded oligodeoxynucleotide extinction coefficients. Analytical Biochemistry. 236 (1), 134-138 (1996).
- Wilson, S. C., Cohen, D. T., Wang, X. C., Hammond, M. C. A neutral pH thermal hydrolysis method for quantification of structured RNAs. RNA. 20 (7), 1153-1160 (2014).
- Szatmári, D., et al. Intracellular ion concentrations and cation-dependent remodelling of bacterial MreB assemblies. Scientific Reports. 10, 12002 (2020).
- Boulos, L., Prévost, M., Barbeau, B., Coallier, J., Desjardins, R. LIVE/DEAD® BacLightTM: Application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking water. Journal of Microbiological Methods. 37 (1), 77-86 (1999).
- Huang, H., et al. A G-quadruplex-containing RNA activates fluorescence in a GFP-like fluorophore. Nature Chemical Biology. 10 (8), 686-691 (2014).
- Jeng, S. C. Y., Chan, H. H. Y., Booy, E. P., McKenna, S. A., Unrau, P. J. Fluorophore ligand binding and complex stabilization of the RNA Mango and RNA Spinach aptamers. RNA. 22 (12), 1884-1892 (2016).
- Han, K. Y., Leslie, B. J., Fei, J., Zhang, J., Ha, T. Understanding the photophysics of the Spinach-DFHBI RNA aptamer-fluorogen complex to improve live-cell RNA imaging. Journal of the American Chemical Society. 135 (50), 19033-19038 (2013).
- Wang, P., et al. Photochemical properties of Spinach and its use in selective imaging. Chemical Science. 4 (7), 2865-2873 (2013).
- Dao, N. T., et al. Photophysics of DFHBI bound to RNA aptamer Baby Spinach. Scientific Reports. 11, 7356 (2021).
