Summary
Præsenteret her er en metode til at sekvensere enkeltkerner isoleret fra musens dentate gyrus, der udelukker de fleste neuroner gennem fluorescensaktiverede kerner (FAN) -sortering. Denne tilgang genererer ekspressionsprofiler af høj kvalitet og letter undersøgelsen af de fleste andre celletyper, der er repræsenteret i nichen, herunder knappe populationer såsom neurale stamceller.
Abstract
Voksen hippocampal neurogenese (AHN), som består af en livslang vedligeholdelse af proliferative og hvilende neurale stamceller (NSC'er) inden for den subgranulære zone (SGZ) af dentate gyrus (DG) og deres differentiering fra nyfødte neuroner til granulceller i granulellagen, er godt valideret på tværs af adskillige undersøgelser. Brug af genetisk modificerede dyr, især gnavere, er et værdifuldt værktøj til at undersøge signalveje, der regulerer AHN, og til at studere rollen for hver celletype, der udgør den hippocampus neurogene niche. For at løse sidstnævnte har metoder, der kombinerer enkeltkerneisolering med næste generations sekventering, haft en betydelig indflydelse inden for AHN til at identificere gensignaturer for hver cellepopulation. Der er imidlertid behov for yderligere forfining af disse teknikker for at fænotypisk profilere sjældnere cellepopulationer inden for GD. Her præsenterer vi en metode, der bruger fluorescensaktiveret kernesortering (FANS) til at udelukke de fleste neuronale populationer fra en enkelt kernesuspension isoleret fra frisk dissekeret DG ved at vælge ufarvede kerner til NeuN-antigenet for at udføre enkeltkerner RNA-sekventering (snRNA-seq). Denne metode er et potentielt springbræt til yderligere at undersøge intercellulær regulering af AHN og afdække nye cellulære markører og mekanismer på tværs af arter.
Introduction
Den kontinuerlige generation af hippocampale neuroner i voksenalderen, også kendt som Adult Hippocampal Neurogenesis (AHN), er forbundet med kognitive funktioner såsom læring, hukommelsesoptagelse / clearance og mønsterseparation og ser ud til at være en vigtig mekanisme for modstandsdygtighed i aldring og neurodegenerative sygdomme for at forhindre kognitive underskud 1,2,3 . Gnavere har været den valgte model til at studere AHN ved hjælp af flere metoder, herunder immunocytokemi og næste generations sekventering (NGS) metoder. Oversættelsen af disse resultater til andre arter er fortsat kontroversiel. Faktisk er AHN blevet observeret i de fleste arter, men i hvilket omfang det vedvarer gennem hele livet, især hos mennesker 4,5,6,7,8, diskuteres regelmæssigt.
Til dato er forskellige indre og ydre signalveje blevet bekræftet til at modulere AHN1. Imidlertid er virkningen af intercellulær kommunikation på AHN kun lige ved at dukke op9. Dette kan først tilskrives utilstrækkelig specificitet af de nuværende kendte cellemarkører til at foretage in vivo-analyser med genetisk modificerede dyr. Faktisk har mange undersøgelser været afhængige af markører som doublecortin eller glialfibrillært surt protein (GFAP), der udtrykkes i flere celletyper1. For det andet bringer kompleksiteten og den høje grad af cellediversitet i den voksne hippocampus niche10 tekniske udfordringer med at profilere hver celletype. Dette er især tilfældet for bioinformatisk analyse med overlappende cellulære markører, der anvendes i analytiske rørledninger til forskellige populationer, såsom NSC'er eller gliaceller, hvilket resulterer i kontroversielle konklusioner ved vurdering af AHN 7,11. For det tredje underminerer det store antal neuroner undersøgelsen af mindre rigelige cellepopulationer, såsom astrocytter, oligodendrocytter eller ependymale celler, selvom deres rolle i finjusteringsreguleringen af AHN bliver fremtrædende9. Tilsammen påvirker disse begrænsninger evnen til at oversætte resultater fra gnavere til andre arter. Dette forstærkes især af vanskeligheden ved at rekapitulere in vitro et komplekst væv, såsom hippocampus neurogen niche, og af de mange forhindringer for at få adgang til væv af høj kvalitet sammen med mangel på standardiserede protokoller til vævsbehandling i undersøgelser, der involverer humant væv12,13. Det er derfor afgørende at udvikle nye tilgange til at profilere cellepopulationer og identificere nye cellulære markører inden for dentatgyrus (DG), der i sidste ende vil føre til en bedre forståelse af de forskellige bidrag fra hver celletype til AHN-regulering.
For at opnå dette er enkeltcelle- (sc) og enkeltkerneisolering (sn) kombineret med RNA-sekventering blevet medvirkende til at undersøge komplekse væv som DG14. Som sådan er strategier for cellulær berigelse for at isolere enkeltceller fra musens voksne hippocampale niche blevet udført for det meste for at undersøge NSC'er15,16. En interessant strategi til at berige ikke-neuronale celler fra DG blev anvendt ved sekventering af GluR1/Cd24 dobbeltnegative enkeltceller, hvilket resulterede i, at 1.408 celler blev sekventeret uden forskellige klynger mellem astrocytter og NSC'er efter bioinformatisk analyse17. Dette kan skyldes den hårde enzymatiske fordøjelse, der kræves til enkeltcellepræparation, der skader celleintegritet og RNA. For at omgå dette tekniske problem er der udviklet flere metoder, der i stedet bruger enkeltkerneisolering, og de er særligt velegnede til indviklede væv11,18. Imidlertid genererer overvægten af neuroner inden for DG eller mere bredt inden for hippocampal-entorhinalsystemet en prøveudtagningsbias for at studere hele cellepopulationerne, der er til stede inden for disse hjerneområder. Derudover fremhæver det begrænsede antal celler, der skal indlæses til forberedelse af enkeltcellebiblioteker, tilstedeværelsen af den største cellepopulation i analytiske rørledninger af sekventerede enkeltkerner. Faktisk bliver store neuronale klynger ofte kommenteret og analyseret, mens andre cellepopulationer bliver underrepræsenteret eller savnet 5,11.
I et forsøg på at overvinde disse skævheder og være i stand til at profilere andre celletyper end neuroner, der er til stede i muse-DG, blev der i denne undersøgelse udtænkt en metode ved hjælp af princippet om fluorescensaktiveret kernesortering (FANS)18 , der udelukker de fleste neuronale populationer ved negativ udvælgelse af farvede enkeltkerner med neuronalt nukleart antigen (NeuN, også kendt som Rbfox3). Dette valg af antigen blev styret af litteraturen, der beskriver NeuN som en pålidelig neuronal markør19 og af nødvendigheden af at anvende et nukleart protein til denne tilgang. NeuN-negative FACS-sorterede celler blev derefter forberedt til RNA-sekventering på en 10x Genomics-platform. Resultaterne viser, at udelukkelse af NeuN-ekspressive celler tillader en celletypespecifik transkriptomisk profilering af glial og sjældne cellepopulationer af høj kvalitet.
Protocol
Dyrepleje og eksperimentelle procedurer blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra Francis Crick Institute samt det britiske indenrigsministeriums retningslinjer og love.
Figur 1: Forberedelse af en enkelt kernesuspension fra det dissekerede DG af voksne mus til snRNA-seq af ikke-neuronale populationer. Flowdiagram, der beskriver de vigtigste trin i protokollen, der inkluderer dissektion af muse-DG, forberedelse af en suspension af enkeltkerner, NeuN-immunostaining og negativ NeuN-FANS-sortering, inden du fortsætter med snRNA-seq. Klik her for at se en større version af denne figur.
1. Dissektion af GD'et (Tidspunkt: 15 min)
- Forbered kerneisoleringsmedier 1 og 2 (NIM1 og NIM2), homogeniseringsbuffer (HB) og vaskemedier (WM) (supplerende tabel 1). Placer alle buffere, medier, reagenser og værktøjer på is, indtil det er nødvendigt. Sæt Dounce-homogenisatoren (se Materialetabel) på is under forberedelsen (mindst 1 time før homogeniseringstrinnet).
BEMÆRK: NIM1 kan tilberedes og opbevares ved 4 °C i op til 6 måneder. NIM2, HB og WM skal være frisklavede.
FORSIGTIG: Manipuler DTT, proteasehæmmeren og Triton X-100 med omhu. Disse forbindelser er hud- og øjenirriterende, akut giftige og farlige for vandmiljøet. Mens du bruger disse kemikalier, skal du bære beskyttelseshandsker, tøj, øjen- og ansigtsbeskyttelse, vaske hænderne grundigt efter håndtering og undgå frigivelse til miljøet. - Afliv en 22 måneder gammel C57Bl/6J-hanmus ved cervikal forskydning efter indenrigsministeriets skema 1-procedure20.
BEMÆRK: Se diskussion for begrundelse for brugen af 22 måneder gammel mus i denne undersøgelse. Denne protokol kan dog udføres i alle aldre i hele levetiden. - Disseker hjernen ud fra en aflivet mus og overfør den til en 10 cm petriskål fyldt med iskold 1x PBS (figur 1). Læg petriskålen på is. Fjern lillehjernen ved hjælp af en skalpel og skær hjernen i halve mellem begge halvkugler (langs sagittalaksen).
- Fyld en ny 10 cm petriskål med iskold PBS og læg den på is. Overfør den ene halvdel af hjernen til den nye petriskål. Brug kikkert til at dissekere DG og gentag dette trin for at få det andet DG fra anden halvdel af hjernen.
BEMÆRK: Disse trin (trin 1.2-1.4) blev tilpasset fra en tidligere beskrevet procedure21. Det er vigtigt at fortsætte så hurtigt som muligt på dette stadium for at bevare cellernes integritet. - Overfør de to GD'er til den forkølede Dounce-homogenisator, og tilsæt 1 ml kold HB.
2. Vævsdissociation, enkeltkerneisolering og anti-NeuN-immunofarvning (Timing: 2 timer)
- Homogeniser vævet med 10 slag af den løse "A" -pistel efterfulgt af 15 slag af den stramme "B" -pistel.
BEMÆRK: Dounce homogenisering skal udføres med mørtel på is med blide slag for at reducere varme forårsaget af friktion og skumdannelse. Alle buffere og udstyr skal forkøles og opbevares på is under proceduren. - Overfør homogenatet til et forkølet 15 ml rør; skyl Dounce-homogenisatoren med 1 ml kold HB og kombiner til det samme rør. Tilsæt 3 ml HB til 15 ml røret og inkuber 5 min på is. Bland 2x ved at vende røret forsigtigt.
- Forvåd en 70 μm silhætte med 0,5 ml HB over et 50 ml reagensglas. Træk kernesuspensionen fra trin 2.2 ved at vippe forsigtigt over 15 ml røret ind i cellesilen. Vask cellesilen med 0,5 ml HB.
- Fjern cellesien, og centrifuger reagensglasset ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C ved hjælp af en svingspandcentrifuge. Kassér supernatanten.
BEMÆRK: Belastning af homogenatet vil hjælpe med at reducere affaldet, hvilket er kritisk for flowcytometrien og snRNA-seq nedstrøms trin. - Pelleten genoptages forsigtigt i 4 ml HB ved hjælp af en P1000-pipette. Inkuber på is i 5 min. Spin ved 500 x g i 10 minutter ved 4 °C. Kassér supernatanten og suspender pelleten i 3 ml WM.
- Forvåd en 35 μm silhætte over et 15 ml reagensglas med 0,5 ml WM. Spænd kernesuspensionen fra trin 2,5 gennem cellesilen, og pipetter forsigtigt 0,5 ml ad gangen ved hjælp af en P1000-pipette.
- Vask silhætten med 0,5 ml WM og læg røret på is. Filtratet overføres til et nyt 15 ml rør og centrifuger i 5 min og 4 °C ved 500 x g. Kassér supernatanten og suspender pelleten i 3 ml WM.
- Drej ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten kasseres, og pelleten genindtages i 1 ml WM med musens anti-NeuN, Alexa Fluor 488-konjugerede antistof (anti-NeuN-AF488, 1:32.000) og 1 μg/ml DAPI. Inkuber i 45 min på is i mørke.
BEMÆRK: For at optimere immunostaining af isolerede kerner anbefales det at titrere antistoffet for at bestemme den optimale fortynding til flowcytometrianalyse og sortering. Kør derefter passende kontroller for at bekræfte, at farvningsforholdene er optimale. For eksempel med det konjugerede anti-NeuN-AF488-antistof blev der kørt en negativ kontrol (dvs. ingen tilsætning af antistoffet, supplerende figur 1A) og en positiv kontrol (dvs. farvning med antistoffet, supplerende figur 1B) for at vurdere adskillelse af ufarvede og farvede populationer. Når du begynder at arbejde med et AF488-konjugeret antistof, anbefales det at køre en AF488-konjugeret isotypekontrol for at vurdere specificiteten. Hvis der anvendes et ikke-konjugeret antistof, kan yderligere kontrol, såsom kun at tilføje et sekundært antistof til et kernepræparat, være nødvendigt for at vurdere uspecifik binding af det sekundære antistof.
3. Fluorescensaktiveret kernesortering (FANS) for at udelukke neuronale populationer (Timing: 45 min)
- Overfør den immunfarvede kernesuspension til et 5 ml reagensglas og hold det på is indtil starten af flowcytometriproceduren.
BEMÆRK: Hvis der arbejdes med større stykker væv end to mus DG, kan yderligere fortynding med WM-buffer være nødvendig for at undgå tilstopning af FACS, hvis kernetætheden i opløsningen bliver høj. - Hvirvel prøverne i 3 s ved lav hastighed, før rørene placeres i FACS-instrumentet (se Materialetabel).
BEMÆRK: (FACS-opsætning) Sorteringsmaskiner skal justeres i starten af proceduren med kalibreringspartikler i henhold til producentens anbefalinger. Dråbeforsinkelsen blev kalibreret med perler eller mikrosfærer (se Materialetabel) i henhold til FACS-modellen. Prøverne blev sorteret ved 4 °C ved renhedstilstand. For at reducere opsamlingsvolumenet blev kernerne sorteret gennem en 70 μm dyse ved det anbefalede tryk for flowcytometeret. Kerner blev sorteret i 1,5 ml lavbindende rør (se Materialetabel) indeholdende 50 μL WM. Alle opsamlingsrør blev belagt med PBS + 5% BSA ved 4 °C natten over for at reducere risikoen for, at kerner klæber til rørets vægge. - For at erhverve dataene fra en prøve af den farvede kernesuspension indstilles portene i DAPI-højde og DAPI-området for at udelukke celleaffaldet og de aggregerede kerner (figur 2A). Desuden adskilles enkeltkerner fra eventuelle resterende DAPI-farvede aggregater eller celleaffald ved at indstille portene i log Side scatter (SSC)-området og log Forward scatter (FCS)-området (figur 2B).
- Indstil portene til anti-NeuN-AF488 og FSC-området for at isolere den NeuN-AF488-negative population, som vist i figur 2C.
- Efter analyse, ved hjælp af den ovenfor beskrevne gatingstrategi, sorteres NeuN-AF488-negativ population i et 1,5 ml opsamlingsrør fyldt med 50 μL WM.
BEMÆRK: Efter den ovenfor beskrevne gatingstrategi og dissektionsproceduren for at isolere DG fra hjernen hos en voksen mus forventes den NeuN-AF488-negative population at repræsentere ~ 14% af de enkelte kerner.
Figur 2: Isolering og transkriptomisk profilering af ikke-neuronale cellepopulationer fra DG. (AC) Gating-strategi for at isolere NeuN-AF488 negative enkeltkerner og udelukke celleaffald. (A) FANS dot plot af en repræsentativ prøve af isolerede kerner, der viser portindstillingen for udvælgelse af DAPI+ kerner og udelukkelse af celleaffald og aggregater. (B) Yderligere udvælgelse af relevante enkeltkerner ved hjælp af FSC-område og SSC-område. (C) Portene til NeuN-AF488 for at udelukke den positive population og sortere efter de negative enkeltkerner. (D) Mikrograf af en god enkeltkerne suspension med minimal mængde snavs og højere andel af kerner af god kvalitet (rund form, sort pil) sammenlignet med kerner af dårlig kvalitet (hvid pil). Skalastænger = 50 μm, 10 μm (indsat). (E,F) Analyse af snRNA-seq-data og profilering af de forskellige cellepopulationer isoleret fra DG for 22 måneder gamle C57BL/6J hanmus. Uniform Manifold Approximation and Projection for Dimension Reduction (UMAP) plots af enkeltkerneprofiler fra (E) ikke-FACS-sorterede celler og (F) NeuN-negative FACS-sorterede celler, farvet efter celletype. (G) Cirkeldiagrammer, der sammenligner frekvenserne af identificerede celletyper i begge prøver. (H) Respektive målinger for de sekventerede prøver: antal kerner, median antal gener og transkriptioner pr. kerne. (I) Violinplotter, der viser fordelingen af antallet af gener og transkripter, der er påvist for hver celletype i begge prøver. Astr. = astrocytter, Olig. = oligodendrocytter, Vasc. = vaskulære celler, CRC'er = Cajal-Retzius-celler, Neur. = neuroner, Imm. = immunceller, OPC'er = oligodendrocytterprækursorceller. Klik her for at se en større version af denne figur.
4. Forberedelse af enkeltkernesuspensionen til at udføre enkeltkerner RNA-sekventering (Timing: 30 min)
- Efter sortering tilsættes 1 ml PBS indeholdende 1% BSA til opsamlingsrøret for at samle dråber på rørets væg og dreje ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Kassér supernatanten, og efterlad 50 μL.
BEMÆRK: Håndter de centrifugerede kerner med omhu, da det kan være svært at observere nogen pellet i bunden af røret. Brug af en svingspand centrifuge hjælper med at kassere supernatanten uden at forstyrre pelleten. - Pipet forsigtigt for at resuspendere centrifugerede kerner. Der tilsættes 5 μL kernesuspension til 5 μL Trypan blå i et 0,5 ml mikrorør.
FORSIGTIG: Håndter Trypan blue med omhu, da det er sundhedsfarligt, kan forårsage kræft og mistænkes for at skade fertiliteten eller det ufødte barn. Brug beskyttelseshandsker, tøj og øjen- og ansigtsbeskyttelse. Håndter ikke, før alle sikkerhedsforanstaltninger er blevet læst og forstået. - Koncentrationen måles, og levedygtigheden af enkeltcellesuspensionen måles ved hjælp af et hæmocytometer eller en automatiseret celletæller (se Materialetabel). Udfør biblioteksforberedelse og sekventering af kernerne som beskrevet i trin 5.
BEMÆRK: Prøver, der blev anset for at være af god kvalitet til sekventering, viste runde og regelmæssige kerneformer under mikroskopet uden celleaffald (figur 2D). Tilstedeværelsen af en halo omkring kernemembranen eller aggregeringen af flere kerner sammen er tegn på beskadigede kerner, og sådanne cellesuspensioner bør ikke overvejes for snRNA-seq (figur 2D). Den målte koncentration af kerner lå inden for området 300-700 kerner/μL.
5. Forberedelse og sekventering af bibliotek
BEMÆRK: Beskrivelse af følgende trin er baseret på den interne sekventeringsplatform, der anvendes i denne undersøgelse (se Materialetabel). Derfor kan nogle indstillinger variere, når du bruger en anden platform. Her beskrives kun de vigtigste trin, og hver parameter skal bestemmes efter vejledning og protokoller fra den valgte producent, omend med optimering inden første brug. Det er afgørende at sikre, at forberedelse af biblioteker udføres så hurtigt som muligt efter koncentrering af sorterede kernesuspensioner for at undgå RNA-nedbrydning og sikre optimal kvalitet af sekventeringen.
- Læg mellem 7.000 og 10.000 kerner i en mikrofluidics enkeltcellechip.
- Partitionsbelastede kerner i nanoliter skaladråber ved hjælp af den medfølgende controller og reagenserne fra den valgte leverandør. Lyse kerner i hver dråbe og omvendt transskribere RNA.
BEMÆRK: I en dråbe delte alt det resulterende cDNA den samme cellestregkode. - Forbered biblioteker til snRNA-seq efter retningslinjer fra den valgte leverandør og sikre kompatibilitet med sekventeringsplatform. Kontroller kvaliteten og koncentrationen af endelige biblioteker ved hjælp af elektroforese, fluorometri eller qPCR-baserede metoder, og hvis det er relevant, saml dem jævnt inden sekventering.
- Denature samlede 3ʹ genekspressionsbiblioteker og fortyndes i henhold til producentens anbefaling.
- Udfør parrings-, enkelt- eller dobbeltindekseringssekvensering på en næste generations sekventeringsplatform med sekventeringsdybde på 50.000 læsepar pr. celle.
Representative Results
Protokollen, der præsenteres her, beskriver en metode til fremstilling af en suspension af ikke-neuronale enkeltkerner isoleret fra DG til at udføre snRNA-seq. Med eller uden FANS afslørede bioinformatisk klyngedannelse godt adskilte grupper af kerner svarende til kendte celletyper inden for GD'et (figur 2E, F). Inden for den ikke-FACS-sorterede prøve bestod størstedelen af kernerne af høj kvalitet, der blev sekventeret, af tre grupper af neuroner (84,9% af de samlede kerner for denne prøve, figur 2E, G, H). Sådanne resultater forventes, i betragtning af at de mest repræsenterede cellepopulationer i DG er granulneuroner, andre excitatoriske neuroner (mærket excitatoriske neuroner) og hæmmende neuroner10. De ikke-neuronale klynger, der blev identificeret, var for det meste lavet af gliacelletyper (11,1%), herunder astrocytter, oligodendrocytter og oligodendrocytprecursorceller (OPC'er), immunceller (3,3%) og Cajal-Retzius-celler (0,6%). Ved udførelse af FANS for at udelukke NeuN-positive populationer (NeuN-negativ FACS-sorteret prøve; Figur 2F, G, H), klynger af gliaceller blev dominerende (81,3%). Isoleringen af et større antal glialkerner tillader en bedre segmentering af forskellige populationer, der ville klynge sig sammen uden FANS. Ved re-clustering og analyse af specifikke gener enten udtrykt i NSC'er eller i astrocytter adskilt fire underklynger (supplerende figur 2A, B). Ser man på mere specifikke cellulære markører og vurderer genekspressionsniveauer på tværs af celletyperne, blev der påvist en lille klynge af NSC'er, der adskilte sig separat fra de vigtigste astrocytiske populationer med højere ekspression af Hopx og Notch2 og næsten ingen ekspression af Aldh1a1 eller Aqp4 (supplerende figur 2C). På grund af overlapningen i genekspression mellem astrocytter og NSC'er ville der imidlertid være behov for yderligere analyse for specifikt at profilere og identificere forskellige undertyper af celler. Desuden havde den NeuN-negative FANS-prøve yderligere klynger mærket som vaskulære celler (2,3%), der omfatter endotelceller, pericytter og vaskulære leptomeningeale celler, når de krydsrefereres til ekspression af cellespecifikke markører (data ikke vist).
Efter vejledningen til den valgte protokol til generering af biblioteker til sekventering blev der opnået udtryksprofiler af høj kvalitet med eller uden FANS. For prøver sekventeret ved 50.000 læsninger / kerne blev der i gennemsnit påvist 2.510 gener pr. kerne for den ikke-FACS-sorterede prøve (5.578 transkripter, figur 2H) og 1.665,5 gener (3.508 transkripter) for NeuN-negativ FANS-prøve efter filtrering af kerner af lav kvalitet (figur 2H, I). Disse målinger bekræfter, at denne protokol genererer transkriptomisk profilering af høj kvalitet af enkeltkerner, der kan sammenlignes med undersøgelser ved hjælp af forskellige tilgange22,23, og at processen med FACS-sortering ikke beskadiger kerner for efterfølgende snRNA-seq. Især skyldes forskellen i antallet af gener og transkripter pr. kerne mellem de to prøver ikke lavere datakvalitet, men den høje andel af neuroner i den ikke-FACS-sorterede prøve (84,9% sammenlignet med 1,7% i NeuN-negativ FANS-prøve), som har en højere transkriptionel aktivitet (2,660 gener / kerne og 6,170 transkripter / kerne i ikke-FACS-sorteret prøve) end den gennemsnitlige transkriptionelle aktivitet af alle de ikke-neuronale celletyper (1,090 gener / kerne og 1,785 udskrifter/kerne, figur 2I).
Tilsammen viser disse repræsentative resultater, at udvælgelsen af NeuN-negative kerner ved hjælp af FANS er et kraftfuldt værktøj til at isolere celletyper med lav overflod fra frisk dissekeret hjernevæv og udføre transkriptomisk profilering af høj kvalitet af disse forskellige cellepopulationer via snRNA-seq-metoder.
Supplerende figur 1: Validering af immunfarvning for FANS. Nuclei-suspensionen blev inkuberet (A) uden anti-NeuN-AF 488-antistoffet som en negativ kontrol eller (B) med antistoffet og kørt gennem FACS-sortereren for at validere immunostaining-tilstande. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Genekspressionsanalyse og re-clustering af astrocytklyngen. (A) Uniform Manifold Approximation and Projection for Dimension Reduction (UMAP) plot, der viser klyngedannelsen af 4968 kerner baseret på genom-dækkende ekspressionsprofiler fra figur 2F. Celletypeopkald blev udført baseret på markører af celletype. (B) Astrocytklynge bestående af 2579 kerner valgt fra (A) til yderligere underindstilling for at undersøge potentielle cellulære undertyper. Fire undertyper blev detekteret ved Seurat (0-3) klyngedannelse, vist ved forskellige farver. (C) Genekspressionsniveauer af specifikke cellulære markører på tværs af de fire celletyper. Alle grunde blev opnået ved hjælp af Seurat R-pakken24. Kort fortalt blev RNA-seq-tællinger normaliseret for hver celle ved det samlede udtryk og ganget med skalafaktoren (10.000). Dette resultat blev derefter logforvandlet. De transformerede værdier blev skaleret (varians skaleret til én) og centreret (middelværdi sat til nul) i hver celle, før UMAP blev anvendt til at beregne indlejringerne, som blev brugt som værdier på x- og y-akser. Grafer repræsenterer outputtet af en dimensionel reduktionsteknik på et 2D-spredningsplot, hvor hvert punkt repræsenterer en celle med respektive x- og y-koordinater baseret på celleindlejringerne bestemt af reduktionsteknikken. Celler med lignende gensignaturer er placeret tæt på hinanden ved indlejringerne. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 3: Genekspressionsanalyse af NeuN i den neurogene afstamning. (A) UMAP-plot, der viser klyngedannelsen af neurogen afstamning fra offentligt tilgængeligt datasæt15. UMAP'er blev genereret som i supplerende figur 2. (B) Genekspressionsniveauer af specifikke cellulære markører på tværs af den neurogene afstamning, der viser Astrocyt (Aquaporin 4 = Aqp4), NSC'er (protein, der kun indeholder homeodomainer = Hopx), NeuN/Rbfox3 (NSC'er og mellemliggende stamceller [IPC'er]) og cykelceller (cyclinafhængig kinase 6 = Cdk6). Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 1: Sammensætninger af medier og buffere, der anvendes i undersøgelsen. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
For at kunne gennemføre denne protokol med succes er dissektionen af GD det første kritiske skridt, som kræver en vis praksis for at holde den ubeskadiget og for at begrænse forurening fra det omgivende væv. Erfaringen viser, at adskillelsen af generaldirektoratet fra hippocampus meget hurtigt kunne erhverves af en dygtig forsker, som derefter kunne arbejde på at forfine deres teknik for at øge dissektionens hurtighed og dermed forbedre vævets friskhed for at generere data af høj kvalitet. På samme måde kræver forberedelse og resuspension af enkeltkerner konsistens på tværs af de forskellige betingelser, der anvendes i et enkelt eksperiment, men også undgåelse af overdreven pipettering, der kan forstyrre nuklear membranfrigivende omgivende RNA'er, der vil skævvride sekventeringsresultaterne. Ud over tidligere nævnte anbefalinger til fremstilling af kerner af høj kvalitet skal koncentrationen af enkeltkernesuspensionen også overvejes, inden man fortsætter med sekventering. I henhold til producentens retningslinjer bør et præparat med en koncentration på over 1 200 nuc/μL fortyndes, da dette kernekoncentrationsniveau vil have større risiko for at danne multipleter, der påvirker bioinformatiske analyser nedstrøms. Bemærk, at sekventering af prøver med kernekoncentrationer under 500 nuc / μL muligvis ikke er umagen værd på grund af de involverede omkostninger. Det anbefales også at følge rådene fra en avanceret FACS-bruger om at konfigurere al gating og forblive i overensstemmelse med indstillingerne på tværs af prøver og biologiske replikater. Ligeledes indebærer forberedelse af biblioteker til RNA-sekventering en vis træning for at opnå resultater af høj kvalitet, og de fleste leverandører har fremragende support til at opnå dette effektivt. Denne metode blev kun testet med frisk væv i denne undersøgelse; FANS er dog også blevet udført med frossent væv25. Det er derfor rimeligt at antage, at denne protokol kunne udføres med frosset væv, omend med mindre optimering.
Denne protokol er udviklet med en bestemt downstream-applikation i tankerne, som er at undersøge andre cellepopulationer end neuroner inden for den hippocampus neurogene niche. Faktisk tyder stigende bevislinjer på, at forringelse af AHN ved aldring kan tilskrives de omgivende celler inden for niche 1,2,3,9. Især astrocytter og oligodendrocytter fremstår som nøgleregulatorer for AHN; imidlertid har deres isolation fra GD kombineret med RNA-sekventering genereret blandede resultater, hvilket gør denne hypotese udfordrende at vurdere med denne teknik 1,17. Denne tilgang med FACS-sortering af NeuN-negative kerner tillod isolering af flere astrocytter og oligodendrocytter sammenlignet med prøver, der ikke var FACS-sorterede, hvilket muliggør bedre bioinformatisk analyse. Denne protokol gælder i alle aldre på tværs af levetid, og de repræsentative data, der præsenteres her med væv fra gamle dyr, giver et bevis på, at denne metode er robust til at undersøge den aldrende hippocampale neurogene niche. For at udvide brugen af denne metode og tilpasse den til forskellige biologiske spørgsmål er det vigtigt at overveje, at andre neuronale nukleare membranantigener kan testes sammen med en grundig titrering af de bedst validerede antistoffer til disse markører. For eksempel, når man studerer processen med neuronal differentiering fra NSC'er i DG, begynder nogle celletyper såsom type 2-celler eller neuroblaster at udtrykke NeuN (supplerende figur 3). Derfor ville der være behov for et andet antigen for specifikt at undersøge disse celletyper. Omvendt blev nogle neuroner stadig identificeret i denne undersøgelse efter NeuN-negativ FACS-sortering muligvis på grund af lav eller ingen ekspression af NeuN i disse populationer (f.eks. Cortical Cajal-Retzius neuroner19). Derudover er NeuN blevet rapporteret at blive udtrykt i underpopulationer af oligodendrocytter26, hvilket kunne give partiske resultater, hvis disse underpopulationer var af interesse. Valget af antigen ved påbegyndelse af FANS bør derfor overvejes nøje for at undgå inklusion eller udelukkelse af cellepopulationer, der ville udelukke et nøjagtigt svar på et specifikt biologisk spørgsmål. I overensstemmelse hermed anbefales det også, at hvert sekventeringsresultat valideres yderligere ved ortogonale assays (f.eks. Immunohistokemi eller RNA-omfang), før det valideres eller tilbagevises den testede hypotese med denne protokol. Endelig kunne trinnet, der involverer FANS, videreudvikles til at omfatte mere end et antistof med en mere uddybet sorteringsstrategi for at udelukke og / eller inkludere ønskede cellepopulationer.
I sidste ende kan teknologier, der er beskrevet i denne protokol, have nogle begrænsninger, når de bruges sammen med andre arter. For eksempel er nichen meget veldefineret hos gnavere med tilstedeværelsen af proliferative og hvilende NSC'er eller nyfødte neuroner begrænset inden for specifikke underregioner i DG, men det er stadig ikke klart, hvordan den hippocampus neurogene niche skal afgrænses i andre arter. Proliferative celler er faktisk ikke justeret inden for en kontinuerlig zone af DG hos ikke-menneskelige primater og mennesker, men er snarere spredt omkring det og kan også være til stede i amygdala7. Derfor vil dissekering og isolering af bredere områder end GD'et i andre arter potentielt påvirke anvendelsen af denne protokol. Især skal dissociations- og triturationstrinnene til fremstilling af væv optimeres, mens der arbejdes med større stykker væv27,28. Med hensyn til bioinformatisk analyse, mens indavlede gnavere har et meget homogent og meget godt kommenteret genom, kræver den genetiske variation i det menneskelige genom kombineret med utilstrækkeligt antal cellulære markører til klart at skelne mellem forskellige cellepopulationer (f.eks. NSC'er og astrocytter) en masse normalisering til analyse, der kan føre til forskellige konklusioner, når en lille klynge af celler identificeres7, 11. I sådanne situationer kan celleberigelse stadig være en foretrukken mulighed eller bør anvendes sammen med andre strategier for at øge analysekraften.
Ikke desto mindre kan den nuværende tilgang gøre det muligt at undersøge den rolle, som understuderede, omend potentielt vigtige cellepopulationer spiller i reguleringen af AHN. Dette kan især være tilfældet for populationer af astrocytter, som spiller en central rolle i begyndelsen og udviklingen af neurodegenerative sygdomme29,30. Denne undersøgelse viste, at astrocytter og andre sjældne cellepopulationer kan identificeres og profileres ved blot at udelukke langt de fleste neuroner, der er til stede i DG. Andre undersøgelser, der anvender forskellige tilgange, har ikke været i stand til at opnå lignende genopretning af kerner fra det samme interval af cellepopulationer 5,11,17. Desuden viser resultaterne fra denne undersøgelse, at det er muligt at anvende denne tilgang til at isolere en NSC-klynge uden specifik berigelse af denne cellepopulation15.
Afslutningsvis ville det at følge og forbedre denne metode være et skridt fremad for at løse udestående spørgsmål relateret til den kontekstuelle rolle for den hippocampus neurogene niche til modulering af AHN. Det kan især give ny indsigt i genekspressionsniveauer i ældre og syge hjerner i cellepopulationer, der er forbundet med reguleringen af AHN9, understøtte identifikationen af en potentiel heterogenitet af NSC'erne1 eller behandle vaskulaturens rolle i AHN. I sidste ende kan denne metode tilpasses andre voksne stamcellenicher med lignende spørgsmål og problemer.
Disclosures
SG, TL og SK er ansatte i Merck Sharp & Dohme LLC, et datterselskab af Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, USA kendt som MSD uden for USA og Canada. SG er aktionær i Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, USA.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Lachlan Harris og Piero Rigo for teknisk support og Jason M. Uslaner og Ditte Lovatt for at give feedback på manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra MRC og et præ-konkurrencedygtigt forskningssamarbejde med MSD, Francis Crick Institute, som modtager sin finansiering fra Cancer Research UK (FC0010089), UK Medical Research Council (FC0010089), Wellcome Trust (FC0010089) og af en Wellcome Trust Investigator Award til FG (106187/Z/14/Z). Vi undskylder over for de mange forfattere, hvis arbejde vi ikke kunne diskutere og citere på grund af pladsmangel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5ml microtube | Eppendorf | 30124537 | |
| 10.00µm Flouresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 15700-10 | |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 2 pairs of sterile Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma Aldrich | D9564-10MG | |
| 4150 TapeStation System | Agilent | N/A | |
| 5 mL round bottom high clarity polypropylene test tube with snap cap | Falcon | 352063 | |
| 5 mL round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | Falcon | 352235 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430829 | |
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 8 peak SPHERO Rainbow Calibration Particles | BD Biosciences | RCP-30-5A | |
| Accudrop Beads | BD Biosciences | N/A | |
| Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | N/A | |
| Anti-NeuN antibody, clone A60, Alexa Fluor 488 conjugated | Millipore | MAB377X | |
| BD FACSAria Fusion Flow Cytometer | BD Biosciences | N/A | |
| Beckman Coulter MoFlo XDP | Beckman Coulter | N/A | |
| Chromium Controller | 10x Genomics | N/A | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 | 10x Genomics | PN-1000121; PN-1000120; PN-1000213 | |
| BSA 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0861 | |
| Dounce tissue grinder set: mortar, loose pestle (A) and tight pestle (B) | KIMBLE | D8938-1SET | |
| Eppendorf Tubes Protein LoBind 1.5ml | Eppendorf | 30108116 | |
| Halt, 100x Protease inhibitor | ThermoFisher | 78429 | |
| HiSeq 4000 Sequencing System | Illumina | N/A | Sequencing configuration: 28-8-0-91 |
| KCl | Any chemical supplier | Laboratory made | |
| LUNA-FX7 Automated Cell counter | Logos Biosystems | N/A | |
| MgCl2 | Any chemical supplier | Laboratory made | |
| N°10 guarded sterile disposable scalpels | Swann-Morton | 6601 | |
| Nuclease-free water | Sigma Aldrich | W4502-1L | |
| Pair of sterile student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-12 | |
| PBS | Any chemical supplier | Laboratory made | |
| RNase Inhibitor 40 U µl-1 | Ambion | AM2684 | |
| RNasin 40 U µl-1 | Promega | N211A | |
| Sterile Petri dish | Corning | 430167 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 59378-500G | |
| Tris buffer, pH 8.0 | Any chemical supplier | Laboratory made | |
| Triton X-100 10% (v/v) | Sigma Aldrich | T8787-250ML | |
| Trypan blue | Invitrogen | T10282 |
References
- Gillotin, S. Targeting impaired adult hippocampal neurogenesis in ageing leveraging intrinsic mechanisms regulating neural stem cell activity. Ageing Research Reviews. 71, 101447 (2021).
- Urban, N., Blomfield, I. M., Guillemot, F. Quiescence of adult mammalian neural stem cells: A highly regulated rest. Neuron. 104 (5), 834-848 (2019).
- Hanspal, M. A., Gillotin, S. A new age in understanding adult hippocampal neurogenesis in Alzheimer's disease. Neural Regeneration Research. 17 (12), 2615-2618 (2022).
- Zhang, H., et al. Single-nucleus transcriptomic landscape of primate hippocampal aging. Protein & Cell. 12 (9), 695-716 (2021).
- Franjic, D., et al. Transcriptomic taxonomy and neurogenic trajectories of adult human, macaque, and pig hippocampal and entorhinal cells. Neuron. 110 (3), 452-469 (2022).
- Moreno-Jimenez, E. P., Terreros-Roncal, J., Flor-Garcia, M., Rabano, A., Llorens-Martin, M. Evidences for adult hippocampal neurogenesis in humans. Journal of Neuroscience. 41 (12), 2541-2553 (2021).
- Sorrells, S. F., et al. Positive controls in adults and children support that very few, if any, new neurons are born in the adult human hippocampus. Journal of Neuroscience. 41 (12), 2554-2565 (2021).
- Zhou, Y., et al. Molecular landscapes of human hippocampal immature neurons across lifespan. Nature. 607, 527-533 (2022).
- Bonafina, A., Paratcha, G., Ledda, F. Deciphering new players in the neurogenic adult hippocampal niche. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 548 (2020).
- Amaral, D. G., Scharfman, H. E., Lavenex, P. The dentate gyrus: fundamental neuroanatomical organization (dentate gyrus for dummies). Progress in Brain Research. 163, 3-22 (2007).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- Flor-Garcia, M., et al. Unraveling human adult hippocampal neurogenesis. Nature Protocols. 15 (2), 668-693 (2020).
- Moreno-Jimenez, E. P., et al. Adult hippocampal neurogenesis is abundant in neurologically healthy subjects and drops sharply in patients with Alzheimer's disease. Nature Medicine. 25 (4), 554-560 (2019).
- Kalinina, A., Lagace, D. Single-cell and single-nucleus RNAseq analysis of adult neurogenesis. Cells. 11 (10), 1633 (2022).
- Harris, L., et al. Coordinated changes in cellular behavior ensure the lifelong maintenance of the hippocampal stem cell population. Cell Stem Cell. 28 (5), 863-876 (2021).
- Shin, J., et al. Single-cell RNA-seq with Waterfall reveals molecular cascades underlying adult neurogenesis. Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).
- Artegiani, B., et al. A single-cell RNA sequencing study reveals cellular and molecular dynamics of the hippocampal neurogenic niche. Cell Reports. 21 (11), 3271-3284 (2017).
- Nott, A., Schlachetzki, J. C. M., Fixsen, B. R., Glass, C. K. Nuclei isolation of multiple brain cell types for omics interrogation. Nature Protocols. 16 (3), 1629-1646 (2021).
- Sarnat, H. B., Nochlin, D., Born, D. E. Neuronal nuclear antigen (NeuN): a marker of neuronal maturation in early human fetal nervous system. Brain Development. 20 (2), 88-94 (1998).
- Guidance on the Operation of ASPA. , Available from: https://assets.publishing.service.gov.uk/government/uploads/system/uploads/attachment_dat/file/662364/Guidance_on_the_Operation_of_ASPA.pdf (2022).
- Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (33), e1543 (2009).
- Habib, N., et al. Disease-associated astrocytes in Alzheimer's disease and aging. Nature Neuroscience. 23 (6), 701-706 (2020).
- Ding, J., et al. Systematic comparison of single-cell and single-nucleus RNA-sequencing methods. Nature Biotechnology. 38 (6), 737-746 (2020).
- Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
- Mussa, Z., Tome-Garcia, J., Jiang, Y., Akbarian, S., Tsankova, N. M. Isolation of adult human astrocyte populations from fresh-frozen cortex using fluorescence-activated nuclei sorting. Journal of Visualized Experiments. (170), e62405 (2021).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Marti-Mengual, U., Varea, E., Crespo, C., Blasco-Ibanez, J. M., Nacher, J. Cells expressing markers of immature neurons in the amygdala of adult humans. European Journal of Neuroscience. 37 (1), 10-22 (2013).
- Zhang, X. M., et al. Doublecortin-expressing cells persist in the associative cerebral cortex and amygdala in aged nonhuman primates. Frontiers in Neuroanatomy. 3, 17 (2009).
- Ding, Z. B., et al. Astrocytes: a double-edged sword in neurodegenerative diseases. Neural Regeneration Research. 16 (9), 1702-1710 (2021).
- Phatnani, H., Maniatis, T. Astrocytes in neurodegenerative disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (6), 020628 (2015).
