Summary
Presentert her er en metode for å sekvensere enkeltkjerner isolert fra musen dentate gyrus som utelukker de fleste nevroner gjennom fluorescensaktiverte kjerner (FAN) -sortering. Denne tilnærmingen genererer uttrykksprofiler av høy kvalitet og letter studiet av de fleste andre celletyper som er representert i nisjen, inkludert knappe populasjoner som nevrale stamceller.
Abstract
Voksen hippocampal neurogenese (AHN), som består av et livslangt vedlikehold av proliferative og hvilende nevrale stamceller (NSC) innenfor den subgranulære sonen (SGZ) av dentate gyrus (DG) og deres differensiering fra nyfødte nevroner til granulatceller i granulatcellelaget, er godt validert på tvers av mange studier. Bruk av genmodifiserte dyr, spesielt gnagere, er et verdifullt verktøy for å undersøke signalveier som regulerer AHN og for å studere rollen til hver celletype som komponerer hippocampal nevrogen nisje. For å adressere sistnevnte har metoder som kombinerer enkeltkjerneisolasjon med neste generasjons sekvensering hatt en betydelig innvirkning innen AHN for å identifisere gensignaturer for hver cellepopulasjon. Ytterligere forbedring av disse teknikkene er imidlertid nødvendig for å fenotypisk profilere sjeldnere cellepopulasjoner innen DG. Her presenterer vi en metode som benytter fluorescensaktivert kjernesortering (FANS) for å ekskludere de fleste nevronpopulasjoner fra en enkelt kjernesuspensjon isolert fra nydissekert DG, ved å velge ufargede kjerner for NeuN-antigenet, for å utføre enkeltkjerner RNA-sekvensering (snRNA-seq). Denne metoden er et potensielt springbrett for å undersøke intercellulær regulering av AHN videre og for å avdekke nye cellulære markører og mekanismer på tvers av arter.
Introduction
Den kontinuerlige generasjonen av hippocampale nevroner i voksen alder, også kjent som Adult Hippocampal Neurogenesis (AHN), er assosiert med kognitive funksjoner som læring, minneoppkjøp / klaring og mønsterseparasjon og ser ut til å være en viktig mekanisme for motstandskraft i aldring og nevrodegenerative sykdommer for å forhindre kognitive underskudd 1,2,3 . Gnagere har vært den foretrukne modellen for å studere AHN ved hjelp av flere metoder, inkludert immunocytokjemi og neste generasjons sekvenseringsmetoder (NGS). Oversettelsen av disse resultatene til andre arter er fortsatt kontroversiell. Faktisk har AHN blitt observert i de fleste arter, men i hvilken grad det vedvarer gjennom livet, spesielt hos mennesker 4,5,6,7,8, diskuteres regelmessig.
Til dags dato har ulike indre og ekstrinsiske signalveier blitt bekreftet for å modulere AHN1. Imidlertid er virkningen av intercellulær kommunikasjon på AHN bare så vidt fremvoksende9. Dette kan først tilskrives utilstrekkelig spesifisitet av de kjente cellemarkørene til å utføre in vivo-analyse med genmodifiserte dyr. Faktisk har mange studier stolt på markører som doublecortin eller glial fibrillary acidic protein (GFAP) som uttrykkes i flere celletyper1. For det andre gir kompleksiteten og den høye graden av cellediversitet i den voksne hippocampale nisje10 tekniske utfordringer for å profilere hver celletype. Dette er spesielt tilfelle for bioinformatisk analyse med overlappende cellulære markører som brukes i analytiske rørledninger for forskjellige populasjoner, for eksempel NSC eller gliaceller, noe som resulterer i kontroversielle konklusjoner ved vurdering av AHN 7,11. For det tredje undergraver det store antallet nevroner undersøkelsen av mindre rikelige cellepopulasjoner, som astrocytter, oligodendrocytter eller ependymale celler, selv om deres rolle i finjusteringsreguleringen av AHN blir fremtredende9. Sammen påvirker disse begrensningene evnen til å oversette resultater fra gnagere til andre arter. Dette forsterkes spesielt av vanskeligheten med å rekapitulere in vitro et komplekst vev, som hippocampal nevrogen nisje, og av de mange hindringene for å få tilgang til vev av høy kvalitet sammen med mangel på standardiserte protokoller for vevsbehandling i studier som involverer humant vev12,13. Det er derfor viktig å utvikle nye tilnærminger for å profilere cellepopulasjoner og identifisere nye cellulære markører innenfor dentate gyrus (DG) som til slutt vil føre til en bedre forståelse av de forskjellige bidragene til hver celletype til AHN-regulering.
For å oppnå dette har enkeltcelle (sc) og enkeltkjerner (sn) isolasjon kombinert med RNA-sekvensering blitt medvirkende til å undersøke komplekse vev som DG14. Som sådan har strategier for cellulær anrikning for å isolere enkeltceller fra musens voksne hippocampale nisje blitt utført for det meste for å undersøke NSC15,16. En interessant strategi for å berike ikke-nevronale celler fra DG ble brukt ved sekvensering av GluR1 / Cd24 dobbeltnegative enkeltceller som resulterte i at 1,408 celler ble sekvensert uten distinkte klynger mellom astrocytter og NSC etter bioinformatisk analyse17. Dette kan skyldes den harde enzymatiske fordøyelsen som kreves for enkeltcellepreparasjon som skader celleintegritet og RNA. For å omgå dette tekniske problemet, har flere metoder som bruker enkeltkjerneisolasjon i stedet blitt utviklet og er spesielt egnet til intrikate vev11,18. Imidlertid genererer overvekten av nevroner i DG eller mer generelt innenfor hippocampal-entorhinalsystemet en prøvetakingsskjevhet for å studere hele cellepopulasjonene som er tilstede i disse hjerneområdene. I tillegg fremhever det begrensede antallet celler som skal lastes for fremstilling av enkeltcellebiblioteker tilstedeværelsen av hovedcellepopulasjonen i analytiske rørledninger av sekvenserte enkeltkjerner. Faktisk blir store nevronklynger ofte kommentert og analysert mens andre cellepopulasjoner blir underrepresentert eller savnet 5,11.
I et forsøk på å overvinne disse skjevhetene og for å kunne profilere andre celletyper enn nevroner som er tilstede i musens DG, ble det utviklet en metode i denne studien ved hjelp av prinsippet om fluorescensaktivert kjernesortering (FANS)18 som utelukker de fleste nevronpopulasjoner ved negativt utvalg av fargede enkeltkjerner med nevronalt nukleært antigen (NeuN, også kjent som Rbfox3). Dette valget av antigen ble styrt av litteraturen som beskriver NeuN som en pålitelig nevronmarkør19 og av nødvendigheten av å bruke et nukleært protein for denne tilnærmingen. NeuN-negative FACS-sorterte celler ble deretter forberedt for RNA-sekvensering på en 10x Genomics-plattform. Resultatene viser at utelukkelse av NeuN-uttrykkende celler tillater en celletypespesifikk transskriptomisk profilering av glial og sjeldne cellepopulasjoner av høy kvalitet.
Protocol
Dyrepleie og eksperimentelle prosedyrer ble utført i samsvar med retningslinjene fra Francis Crick Institute, samt det britiske innenriksdepartementets retningslinjer og lover.
Figur 1: Fremstilling av en enkelt kjernesuspensjon fra dissekert DG hos voksne mus for snRNA-seq av ikke-nevronale populasjoner. Flytskjema som beskriver hovedtrinnene i protokollen som inkluderer disseksjon av mus DG, fremstilling av suspensjon av enkeltkjerner, NeuN-immunostaining og negativ NeuN-FANS-sortering før du fortsetter med snRNA-seq. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
1. Disseksjon av DG (Timing: 15 min)
- Klargjør kjerneisolasjonsmedier 1 og 2 (NIM1 og NIM2), homogeniseringsbuffer (HB) og vaskemedier (WM) (supplerende tabell 1). Legg alle buffere, medier, reagenser og verktøy på is til det er nødvendig. Sett Dounce homogenisatoren (se materialtabell) på is under tilberedning (minimum 1 time før homogeniseringstrinnet).
MERK: NIM1 kan tilberedes og oppbevares ved 4 °C i opptil 6 måneder. NIM2, HB og WM bør være nyforberedt.
FORSIKTIG: Manipuler DTT, proteasehemmeren og Triton X-100 med forsiktighet. Disse forbindelsene er hud- og øyeirriterende, akutt giftige og farlige for vannmiljøet. Mens du bruker disse kjemikaliene, bruk vernehansker, klær, øye- og ansiktsbeskyttelse, vask hendene grundig etter håndtering, og unngå utslipp til miljøet. - Avliv en 22 måneder gammel mannlig C57Bl/6J-mus ved cervikal dislokasjon etter Home Office Schedule 1-prosedyren20.
MERK: Se diskusjon for begrunnelse for bruk av 22 måneder gammel mus i denne studien. Denne protokollen kan imidlertid utføres i alle aldre over hele levetiden. - Disseker hjernen ut fra en avlivet mus og overfør den til en 10 cm petriskål fylt med iskald 1x PBS (figur 1). Legg petriskålen på is. Fjern lillehjernen ved hjelp av en skalpell og kutt hjernen i to mellom begge halvkule (langs sagittalaksen).
- Fyll på en ny 10 cm petriskål med iskald PBS og legg den på is. Overfør den ene halvdelen av hjernen til den nye petriskålen. Bruk kikkert, disseker ut DG og gjenta dette trinnet for å oppnå den andre DG fra andre halvdel av hjernen.
MERK: Disse trinnene (trinn 1.2-1.4) ble tilpasset fra en tidligere beskrevet prosedyre21. Det er viktig å fortsette så raskt som mulig på dette stadiet for å bevare cellens integritet. - Overfør de to DG-ene til den forkjølte Dunce-homogenisatoren og tilsett 1 ml kald HB.
2. Vevsdissosiasjon, enkeltkjerneisolasjon og anti-NeuN-immunostaining (Timing: 2 timer)
- Homogeniser vevet med 10 slag av den løse "A" -pestlen, etterfulgt av 15 slag av den stramme "B" -pestlen.
MERK: Dounce homogenisering bør utføres med mørtel på is med milde slag for å redusere varme forårsaket av friksjon og skumdannelse. Alle buffere og utstyr skal forkjøles og holdes på is under prosedyren. - Overfør homogenatet til et forkjølt 15 ml rør; skyll Dounce homogenisatoren med 1 ml kald HB og kombiner til samme rør. Tilsett 3 ml HB i 15 ml røret og inkubert 5 minutter på is. Bland 2x ved å snu røret forsiktig.
- Forvåt en 70 μm silhette med 0,5 ml HB over et 50 ml reagensrør. Sil kjernesuspensjonen fra trinn 2.2 ved å tippe forsiktig over 15 ml røret inn i cellesilen. Vask cellesilen med 0,5 ml HB.
- Fjern cellesilen og sentrifuger reagensrøret ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C, ved hjelp av en svingbøttesentrifuge. Kast supernatanten.
MERK: Å belaste homogenatet vil bidra til å redusere rusk, noe som er kritisk for flowcytometrien og snRNA-seq nedstrømstrinnene. - Resuspend pelleten forsiktig i 4 ml HB ved hjelp av en P1000 pipette. Inkuber på is i 5 min. Spinn ved 500 x g i 10 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten og resuspend pelleten i 3 ml WM.
- Forvåt en 35 μm silhette over et 15 ml reagensrør med 0,5 ml WM. Sil kjernesuspensjonen fra trinn 2.5 gjennom cellesilen, og pipet forsiktig 0,5 ml om gangen ved hjelp av en P1000-pipette.
- Vask silhetten med 0,5 ml WM og legg slangen på is. Overfør filtratet til et nytt 15 ml rør og sentrifuge i 5 minutter og 4 °C ved 500 x g. Kast supernatanten og resuspend pelleten i 3 ml WM.
- Spinn ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten og resuspend pelleten i 1 ml WM med musens anti-NeuN, Alexa Fluor 488-konjugerte antistoff (anti-NeuN-AF488, 1: 32,000) og 1 μg / ml DAPI. Inkuber i 45 minutter på is i mørket.
MERK: For å optimalisere immunostaining av isolerte kjerner, anbefales det å titrere antistoffet for å bestemme optimal fortynning for flowcytometrianalyse og sortering. Kjør deretter tilstrekkelige kontroller for å bekrefte at fargeforholdene er optimale. For eksempel, med det konjugerte anti-NeuN-AF488-antistoffet, ble det kjørt en negativ kontroll (dvs. ingen tillegg av antistoffet, supplerende figur 1A) og en positiv kontroll (dvs. farging med antistoffet, supplerende figur 1B) for å vurdere segregering av ikke-fargede og fargede populasjoner. Når du begynner å arbeide med et AF488-konjugert antistoff, anbefales det å kjøre en AF488-konjugert isotypekontroll for å vurdere spesifisiteten. Hvis et ikke-konjugert antistoff brukes, kan det være nødvendig med ytterligere kontroll som å legge til et sekundært antistoff bare til et kjernepreparat for å vurdere uspesifikk binding av det sekundære antistoffet.
3. Fluorescens aktivert kjernesortering (FANS) for å utelukke nevronpopulasjoner (Timing: 45 min)
- Overfør den immunfargede kjernesuspensjonen til et 5 ml reagensrør og hold den på is til starten av flowcytometriprosedyren.
MERK: Hvis du arbeider med større biter av vev enn to mus DG, kan det være nødvendig med ytterligere fortynning med WM-buffer for å unngå tilstopping av FACS hvis kjernetettheten i løsningen blir høy. - Vortex prøvene i 3 s ved lav hastighet før du plasserer rørene i FACS-instrumentet (se materialtabell).
MERK: (FACS-oppsett) Sorteringsmaskiner må justeres ved starten av prosedyren med kalibreringspartikler i henhold til produsentens anbefalinger. Fallforsinkelsen ble kalibrert med perler eller mikrosfærer (se materialtabell) i henhold til FACS-modellen. Prøvene ble sortert ved 4 °C i renhetsmodus. For å redusere oppsamlingsvolumet ble kjernene sortert gjennom en 70 μm dyse ved anbefalt trykk for flowcytometeret. Kjerner ble sortert i 1,5 ml lavbindingsrør (se materialtabell) som inneholdt 50 μL WM. Alle oppsamlingsrørene ble belagt i PBS + 5% BSA ved 4 °C over natten for å redusere risikoen for at kjerner fester seg til rørets vegger. - For å skaffe dataene fra en prøve av den fargede kjernesuspensjonen, sett portene i DAPI-høyde og DAPI-området for å utelukke celleavfall og de aggregerte kjernene (figur 2A). Videre separerer du enkeltkjerner fra eventuelle gjenværende DAPI-fargede aggregater eller cellerester ved å sette portene i log Side scatter (SSC)-området og log Forward scatter (FCS)-området (figur 2B).
- Sett portene for anti-NeuN-AF488 og FSC-området, for å isolere den NeuN-AF488-negative populasjonen, som vist i figur 2C.
- Etter analyse, ved hjelp av gating-strategien beskrevet ovenfor, sorterer du NeuN-AF488-negativ populasjon i et 1,5 ml oppsamlingsrør fylt med 50 μL WM.
MERK: Etter gating-strategien beskrevet ovenfor og disseksjonsprosedyren for å isolere DG fra hjernen til en voksen mus, forventes den NeuN-AF488-negative populasjonen å representere ~ 14% av enkeltkjernene.
Figur 2: Isolering og transkriptomisk profilering av ikke-nevronale cellepopulasjoner fra DG. (A-C) Gating strategi for å isolere NeuN-AF488 negative enkeltkjerner og ekskludere celleavfall. (A) FANS prikkplott av et representativt utvalg av isolerte kjerner, som viser portinnstillingen for valg av DAPI+-kjerner og utelukkelse av cellerester og aggregater. (B) Videre seleksjon av relevante enkeltkjerner ved bruk av FSC-området og SSC-området. (C) Portene for NeuN-AF488 for å ekskludere den positive populasjonen og sortere for de negative enkeltkjernene. (D) Mikrografi av en god enkeltkjernesuspensjon med minimal mengde rusk og høyere andel kjerner av god kvalitet (rund form, svart pil) sammenlignet med kjerner av dårlig kvalitet (hvit pil). Skalastenger = 50 μm, 10 μm (innfelt). (E,F) Analyse av snRNA-seq-data og profilering av de distinkte cellepopulasjonene isolert fra DG hos 22 måneder gamle C57BL/6J hannmus. UMAP-plott (Uniform Manifold Approximation and Projection for Dimension Reduction) av enkeltkjerneprofiler fra (E) ikke-FACS-sorterte celler og (F) NeuN-negative FACS-sorterte celler, farget av celletype. (G) Kakediagrammer som sammenligner frekvensene til identifiserte celletyper i begge prøvene. (H) Respektive beregninger for de sekvenserte prøvene: antall kjerner, median antall gener og transkripsjoner per kjerne. (I) Fiolinplott som viser fordelingen av antall gener og transkripsjoner oppdaget for hver celletype i begge prøvene. Astr. = astrocytter, Olig. = oligodendrocytter, Vasc. = vaskulære celler, CRC = Cajal-Retzius celler, Neur. = nevroner, Imm. = immunceller, OPC = oligodendrocytter forløperceller. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
4. Fremstilling av enkeltkjernesuspensjonen for å utføre RNA-sekvensering av enkeltkjerner (Timing: 30 min)
- Etter sortering, tilsett 1 ml PBS som inneholder 1% BSA til oppsamlingsrøret for å samle dråper på rørets vegg og spinne ved 500 x g i 5 minutter ved 4 ° C. Kast supernatanten, og la 50 μL.
MERK: Håndter de sentrifugerte kjernene med forsiktighet, da det kan være vanskelig å observere pellet i bunnen av røret. Å bruke en svingbøtte sentrifuge vil bidra til å kaste bort supernatanten uten å forstyrre pelleten. - Pipet forsiktig for å resuspendere sentrifugerte kjerner. Tilsett 5 μL av kjernesuspensjonen til 5 μL Trypan blå i et 0,5 ml mikrorør.
FORSIKTIG: Håndter Trypan blue med forsiktighet, da det er helsefarlig, kan forårsake kreft og mistenkes for å skade fruktbarheten eller det ufødte barnet. Bruk vernehansker, klær og øye- og ansiktsbeskyttelse. Ikke håndter før alle sikkerhetsforanstaltninger er lest og forstått. - Mål konsentrasjonen og vurder levedyktigheten til enkeltcellesuspensjonen ved hjelp av et hemocytometer eller en automatisert celleteller (se materialtabell). Utfør bibliotekforberedelse og sekvensering av kjernene som beskrevet i trinn 5.
MERK: Prøver som ble vurdert å være av god kvalitet for sekvensering viste runde og regelmessige kjerneformer under mikroskopet uten celleavfall (figur 2D). Tilstedeværelsen av en halo rundt kjernemembranen eller aggregering av flere kjerner sammen er tegn på skadede kjerner, og slike cellesuspensjoner bør ikke vurderes for snRNA-seq (figur 2D). Den målte konsentrasjonen av kjerner var innenfor området 300-700 kjerner / μL.
5. Bibliotekforberedelse og sekvensering
MERK: Beskrivelsen av følgende trinn er basert på den interne sekvenseringsplattformen som ble brukt i denne studien (se Materialtabell). Derfor kan noen innstillinger variere når du bruker en annen plattform. Her er bare de viktigste trinnene beskrevet, og hver parameter bør bestemmes etter veiledning og protokoller fra den valgte produsenten, om enn med optimalisering før første gangs bruk. Det er avgjørende å sikre at klargjøring av biblioteker utføres så raskt som mulig etter å ha konsentrert sorterte kjernesuspensjoner for å unngå RNA-nedbrytning og sikre optimal kvalitet på sekvenseringen.
- Last mellom 7.000 og 10.000 kjerner inn i en microfluidics Single Cell Chip.
- Partisjonsbelastede kjerner i nanoliterskala dråper ved hjelp av kontrolleren som følger med og reagensene fra den valgte leverandøren. Lyse kjerner i hver dråpe og omvendt transkribert RNA.
MERK: I en dråpe delte alle de resulterende cDNA den samme cellestrekkoden. - Klargjør biblioteker for snRNA-seq etter retningslinjer fra den valgte leverandøren og sikre kompatibilitet med sekvenseringsplattform. Kontroller kvaliteten og konsentrasjonen av endelige biblioteker ved hjelp av elektroforese, fluorometri eller qPCR-baserte metoder, og eventuelt samle dem like mye før sekvensering.
- Denature samlet 3ʹ genuttrykksbiblioteker og fortynnet i henhold til produsentens anbefaling.
- Utfør parret, enkel eller dobbel indekseringssekvensering på en neste generasjons sekvenseringsplattform med sekvenseringsdybde på 50 000 lesepar per celle.
Representative Results
Protokollen som presenteres her beskriver en metode for å forberede en suspensjon av ikke-nevronale enkeltkjerner isolert fra DG for å utføre snRNA-seq. Med eller uten FANS avslørte bioinformatisk clustering godt separerte grupper av kjerner som tilsvarer kjente celletyper innenfor DG (Figur 2E,F). Innenfor den ikke-FACS-sorterte prøven besto flertallet av kjernene av høy kvalitet som ble sekvensert av tre grupper av nevroner (84,9% av totale kjerner for denne prøven, figur 2E, G, H). Slike resultater forventes, med tanke på at de mest representerte cellepopulasjonene i DG er granulatneuroner, andre eksitatoriske nevroner (merket eksitatoriske nevroner) og hemmende nevroner10. De ikke-nevronale klyngene som ble identifisert, var hovedsakelig laget av gliacelletyper (11,1%), inkludert astrocytter, oligodendrocytter og oligodendrocytterceller (OPCs), immunceller (3,3%) og Cajal-Retzius-celler (0,6%). Når du utfører FANS for å ekskludere NeuN-positive populasjoner (NeuN-negativ FACS-sortert prøve; Figur 2F, G, H), klynger av gliaceller ble dominerende (81, 3%). Isoleringen av et større antall glialkjerner tillater en bedre segmentering av forskjellige populasjoner som ville klynge seg sammen uten FANS. Faktisk, på re-clustering og analysere spesifikke gener enten uttrykt i NSC eller i astrocytter, fire sub-klynger skilt ut (Supplemental Figur 2A, B). Ved å se på mer spesifikke cellulære markører og vurdere genuttrykksnivåer på tvers av celletypene, ble det oppdaget en liten klynge av NSC som segregerte separat fra de viktigste astrocytiske populasjonene med høyere uttrykk for Hopx og Notch2 og nesten ingen uttrykk for Aldh1a1 eller Aqp4 (supplerende figur 2C). På grunn av overlappingen i genuttrykk mellom astrocytter og NSC, vil det imidlertid være nødvendig med ytterligere analyse for å spesifikt profilere og identifisere forskjellige undertyper av celler. Videre hadde den NeuN-negative FANS-prøven flere klynger merket som vaskulære celler (2,3%) som omfatter endotelceller, pericytter og vaskulære leptomeningeale celler når de kryssrefereres for ekspresjon av cellespesifikke markører (data ikke vist).
Etter veiledningen for den valgte protokollen for å generere biblioteker for sekvensering, ble uttrykksprofiler av høy kvalitet oppnådd med eller uten FANS. For prøver sekvensert ved 50 000 avlesninger / kjerne ble 2 510 gener detektert i gjennomsnitt per kjerne for den ikke-FACS-sorterte prøven (5 578 transkripsjoner, figur 2H) og 1 665,5 gener (3 508 transkripsjoner) for NeuN-negativ FANS-prøve, etter filtrering av kjerner av lav kvalitet (figur 2H, I). Disse beregningene bekrefter at denne protokollen genererer høykvalitets transkriptomisk profilering av enkeltkjerner som er sammenlignbare med studier ved bruk av forskjellige tilnærminger22,23, og at prosessen med FACS-sortering ikke skader kjerner for påfølgende snRNA-seq. Spesielt er forskjellen i antall gener og transkripsjoner per kjerner mellom de to prøvene ikke på grunn av lavere datakvalitet, men til den høye andelen nevroner i den ikke-FACS-sorterte prøven (84,9% sammenlignet med 1,7% i NeuN-negativ FANS-prøve), som har en høyere transkripsjonsaktivitet (2,660 gener / kjerne og 6,170 transkripsjoner / kjerne i ikke-FACS-sortert prøve) enn den gjennomsnittlige transkripsjonsaktiviteten til alle ikke-nevronale celletyper (1,090 gener / kjerne og 1,785 transkripsjoner/kjerne, figur 2I).
Sammen viser disse representative resultatene at utvalget av NeuN-negative kjerner ved hjelp av FANS er et kraftig verktøy for å isolere celletyper med lav overflod fra nydissekert hjernevev og utføre høykvalitets enkeltkjerner transkriptomisk profilering av disse forskjellige cellepopulasjonene via snRNA-seq-metoder.
Supplerende figur 1: Validering av immunostaining for FANS. Nuclei-suspensjonen ble inkubert (A) uten anti-NeuN-AF 488-antistoffet som en negativ kontroll eller (B) med antistoffet og kjørt gjennom FACS-sorteringsmaskinen for å validere immunfargingsforhold. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 2: Genuttrykksanalyse og re-clustering av astrocytklyngen. (A) Uniform Manifold Approximation and Projection for Dimension Reduction (UMAP) plott som viser klyngen av 4968 kjerner basert på genom-brede uttrykksprofiler fra figur 2F. Celle-type samtaler ble gjort basert på celle-type markører. (B) Astrocytklyngen består av 2579 kjerner valgt fra (A) for ytterligere undersetting for å undersøke potensielle cellulære undertyper. Fire undertyper ble oppdaget av Seurat (0-3) clustering, vist av forskjellige farger. (C) Genuttrykksnivåer av spesifikke cellulære markører på tvers av de fire celletypene. Alle tomter ble oppnådd ved hjelp av Seurat R-pakken24. Kort fortalt ble RNA-seq-tellinger normalisert for hver celle med det totale uttrykket og multiplisert med skalafaktoren (10 000). Dette resultatet ble deretter loggtransformert. De transformerte verdiene ble skalert (varians skalert til én) og sentrert (gjennomsnitt satt til null) i hver celle før UMAP ble brukt til å beregne innebyggingen, som ble brukt som verdier på x- og y-akser. Grafer representerer utgangen av en dimensjonal reduksjonsteknikk på et 2D-spredningsplott der hvert punkt representerer en celle med respektive x- og y-koordinater basert på celleinnbyggingene bestemt av reduksjonsteknikken. Celler med lignende gensignaturer er plassert nær hverandre ved innebygging. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 3: Genuttrykksanalyse av NeuN i nevrogen avstamning. (A) UMAP-plott som viser klynger av nevrogen avstamning fra offentlig tilgjengelig datasett15. UMAPs ble generert som i supplerende figur 2. (B) Genuttrykksnivåer av spesifikke cellulære markører over den nevrogene linjen som viser astrocytt (Aquaporin 4 = Aqp4), NSC (Homeodomain-only protein = Hopx), NeuN / Rbfox3 (NSC og mellomliggende stamceller [IPCs]) og syklusceller (Cyklinavhengig kinase 6 = Cdk6). Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende tabell 1: Sammensetninger av medier og buffere brukt i studien. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
For å kunne utføre denne protokollen, er disseksjonen av DG det første kritiske trinnet, noe som krever litt øvelse for å holde den uskadet og for å begrense forurensning fra det omkringliggende vevet. Av erfaring kan separasjon av DG fra hippocampus oppnås veldig raskt av en dyktig forsker som deretter kunne jobbe med å raffinere teknikken for å øke hastigheten på disseksjon og dermed forbedre friskheten i vevet for å generere data av høy kvalitet. På samme måte krever forberedelse og resuspendering av enkeltkjerner konsistens på tvers av de forskjellige forholdene som brukes i et enkelt eksperiment, men også unngåelse av overdreven pipettering som kan forstyrre kjernemembran som frigjør omgivende RNA som vil forstyrre sekvenseringsresultatene. I tillegg til tidligere nevnte anbefalinger for å fremstille kjerner av høy kvalitet, skal konsentrasjonen av enkeltkjernesuspensjonen også vurderes før sekvensering fortsetter. Faktisk, i henhold til produsentens retningslinjer, bør et preparat med en konsentrasjon høyere enn 1,200 nuc / μL fortynnes, da dette nivået av kjernekonsentrasjon vil ha høyere risiko for å danne multipleter som påvirker nedstrøms bioinformatiske analyser. Merk at sekvenseringsprøver med kjernekonsentrasjoner under 500 nuc / μL kanskje ikke er verdt på grunn av kostnadene som er involvert. Det anbefales også å følge rådene fra en avansert FACS-bruker for å sette opp all gating og å forbli konsistent med innstillingene på tvers av prøver og biologiske replikasjoner. På samme måte innebærer klargjøring av biblioteker for RNA-sekvensering noe trening for å oppnå resultater av høy kvalitet, og de fleste leverandører har utmerket støtte for å oppnå dette effektivt. Denne metoden ble bare testet med friskt vev i denne studien; FANS har imidlertid også blitt utført med frosset vev25. Det er derfor rimelig å anta at denne protokollen kan utføres med frosset vev, om enn med mindre optimalisering.
Denne protokollen er utviklet med tanke på en bestemt nedstrøms applikasjon, som er å undersøke andre cellepopulasjoner enn nevroner innenfor hippocampal nevrogen nisje. Faktisk indikerer økende bevislinjer at nedsatt AHN i aldring kan tilskrives de omkringliggende cellene innenfor nisje 1,2,3,9. Spesielt fremstår astrocytter og oligodendrocytter som sentrale regulatorer av AHN; Imidlertid har deres isolasjon fra DG kombinert med RNA-sekvensering generert blandede resultater, noe som gjør denne hypotesen utfordrende å vurdere med denne teknikken 1,17. Denne tilnærmingen til FACS-sortering NeuN-negative kjerner tillot isolering av flere astrocytter og oligodendrocytter sammenlignet med prøver som ikke var FACS-sortert, noe som muliggjør bedre bioinformatisk analyse. Denne protokollen gjelder i alle aldre over hele levetiden, og de representative dataene som presenteres her med vev fra gamle dyr, gir et bevis på at denne metoden er robust for å undersøke den aldrende hippocampale nevrogene nisjen. For å utvide bruken av denne metoden og tilpasse den til forskjellige biologiske spørsmål, er det viktig å vurdere at andre nevronale kjernemembranantigener kan testes sammen med en grundig titrering av de best validerte antistoffene for disse markørene. For eksempel, når man studerer prosessen med nevrondifferensiering fra NSC i DG, begynner noen celletyper som type 2-celler eller neuroblaster å uttrykke NeuN (supplerende figur 3). Derfor vil det være behov for et annet antigen for å spesifikt undersøke disse celletypene. Omvendt ble noen nevroner fortsatt identifisert i denne studien etter NeuN-negativ FACS-sortering, muligens på grunn av lavt eller ingen uttrykk for NeuN i disse populasjonene (f.eks. Kortikal Cajal-Retzius-nevroner19). I tillegg har NeuN blitt rapportert å bli uttrykt i underpopulasjoner av oligodendrocytter26, noe som kan gi partiske resultater hvis disse underpopulasjonene var av interesse. Valg av antigen ved bruk av FANS bør derfor vurderes nøye for å unngå inklusjon eller eksklusjon av cellepopulasjoner som vil utelukke et nøyaktig svar på et bestemt biologisk spørsmål. I samsvar med dette anbefales det også at hvert sekvenseringsresultat valideres ytterligere ved ortogonale analyser (f.eks. immunhistokjemi eller RNA-omfang) før man validerer eller tilbakeviser den testede hypotesen med denne protokollen. Endelig kan trinnet som involverer FANS videreutvikles til å inkludere mer enn ett antistoff med en mer utarbeidet sorteringsstrategi for å ekskludere og / eller inkludere ønskede cellepopulasjoner.
Til syvende og sist kan teknologier beskrevet i denne protokollen ha noen begrensninger når de brukes med andre arter. For eksempel er nisjen veldig godt definert hos gnagere med tilstedeværelse av proliferative og hvilende NSC eller nyfødte nevroner begrenset innenfor bestemte underregioner av DG, men det er fortsatt ikke klart hvordan hippocampal neurogen nisje skal avgrenses i andre arter. Faktisk er proliferative celler ikke justert innenfor en kontinuerlig sone av DG hos ikke-menneskelige primater og mennesker, men er heller spredt rundt det og kan også være tilstede i amygdala7. Derfor vil dissekering og isolering av bredere områder enn DG i andre arter potensielt påvirke bruken av denne protokollen. Spesielt må dissosiasjons- og triturasjonstrinnene for fremstilling av vev optimaliseres mens du arbeider med større vevsstykker27,28. Når det gjelder bioinformatisk analyse, mens inbreed-plasserte gnagere har et veldig homogent og veldig godt kommentert genom, krever den genetiske variabiliteten til det menneskelige genomet kombinert med utilstrekkelig antall cellulære markører for å tydelig skille forskjellige cellepopulasjoner (f.eks. NSC og astrocytter) mye normalisering for analyse som kan føre til forskjellige konklusjoner når en liten klynge av celler er identifisert7, 11. I slike situasjoner kan celleberikelse fortsatt være et foretrukket alternativ eller bør brukes sammen med andre strategier for å øke analytisk kraft.
Ikke desto mindre kan den nåværende tilnærmingen muliggjøre undersøkelse av rollen som understuderte, om enn potensielt viktige cellepopulasjoner i reguleringen av AHN. Dette kan spesielt være tilfelle for populasjoner av astrocytter, som spiller en sentral rolle i utbruddet og progresjonen av nevrodegenerative sykdommer29,30. Denne studien viste at astrocytter og andre sjeldne cellepopulasjoner kan identifiseres og profileres ganske enkelt ved å ekskludere de aller fleste nevroner som er tilstede i DG. Andre studier ved hjelp av forskjellige tilnærminger har ikke vært i stand til å oppnå lignende utvinning av kjerner fra samme utvalg av cellepopulasjoner 5,11,17. Videre viser resultatene fra denne studien at det er mulig å bruke denne tilnærmingen til å isolere en NSC-klynge uten spesifikk anrikning av denne cellepopulasjonen15.
Avslutningsvis vil følgende og forbedring av denne metoden være et skritt fremover for å løse utestående spørsmål knyttet til den kontekstuelle rollen til hippocampal neurogen nisje for modulering av AHN. Spesielt kan det gi ny innsikt i genuttrykksnivåer i eldre og syke hjerner i cellepopulasjoner assosiert med reguleringen av AHN9, støtte identifiseringen av en potensiell heterogenitet av NSCs1 eller adressere rollen som vaskulaturen i AHN. Til syvende og sist kan denne metoden tilpasses andre voksne stamcellenisjer med lignende spørsmål og problemer.
Disclosures
SG, TL og SK er ansatte i Merck Sharp & Dohme LLC, et datterselskap av Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, USA kjent som MSD utenfor USA og Canada. SG er aksjonær i Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, USA.
Acknowledgments
Forfatterne takker Lachlan Harris og Piero Rigo for teknisk støtte og Jason M. Uslaner og Ditte Lovatt for tilbakemelding på manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av tilskuddsstøtte fra MRC og et pre-konkurransedyktig forskningssamarbeid med MSD, Francis Crick Institute, som mottar finansiering fra Cancer Research UK (FC0010089), UK Medical Research Council (FC0010089), Wellcome Trust (FC0010089) og av en Wellcome Trust Investigator Award til FG (106187 / Z / 14 / Z). Vi beklager til de mange forfatterne hvis arbeid vi ikke kunne diskutere og sitere på grunn av plassmangel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5ml microtube | Eppendorf | 30124537 | |
| 10.00µm Flouresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 15700-10 | |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 2 pairs of sterile Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma Aldrich | D9564-10MG | |
| 4150 TapeStation System | Agilent | N/A | |
| 5 mL round bottom high clarity polypropylene test tube with snap cap | Falcon | 352063 | |
| 5 mL round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | Falcon | 352235 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430829 | |
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 8 peak SPHERO Rainbow Calibration Particles | BD Biosciences | RCP-30-5A | |
| Accudrop Beads | BD Biosciences | N/A | |
| Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | N/A | |
| Anti-NeuN antibody, clone A60, Alexa Fluor 488 conjugated | Millipore | MAB377X | |
| BD FACSAria Fusion Flow Cytometer | BD Biosciences | N/A | |
| Beckman Coulter MoFlo XDP | Beckman Coulter | N/A | |
| Chromium Controller | 10x Genomics | N/A | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 | 10x Genomics | PN-1000121; PN-1000120; PN-1000213 | |
| BSA 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0861 | |
| Dounce tissue grinder set: mortar, loose pestle (A) and tight pestle (B) | KIMBLE | D8938-1SET | |
| Eppendorf Tubes Protein LoBind 1.5ml | Eppendorf | 30108116 | |
| Halt, 100x Protease inhibitor | ThermoFisher | 78429 | |
| HiSeq 4000 Sequencing System | Illumina | N/A | Sequencing configuration: 28-8-0-91 |
| KCl | Any chemical supplier | Laboratory made | |
| LUNA-FX7 Automated Cell counter | Logos Biosystems | N/A | |
| MgCl2 | Any chemical supplier | Laboratory made | |
| N°10 guarded sterile disposable scalpels | Swann-Morton | 6601 | |
| Nuclease-free water | Sigma Aldrich | W4502-1L | |
| Pair of sterile student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-12 | |
| PBS | Any chemical supplier | Laboratory made | |
| RNase Inhibitor 40 U µl-1 | Ambion | AM2684 | |
| RNasin 40 U µl-1 | Promega | N211A | |
| Sterile Petri dish | Corning | 430167 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 59378-500G | |
| Tris buffer, pH 8.0 | Any chemical supplier | Laboratory made | |
| Triton X-100 10% (v/v) | Sigma Aldrich | T8787-250ML | |
| Trypan blue | Invitrogen | T10282 |
References
- Gillotin, S. Targeting impaired adult hippocampal neurogenesis in ageing leveraging intrinsic mechanisms regulating neural stem cell activity. Ageing Research Reviews. 71, 101447 (2021).
- Urban, N., Blomfield, I. M., Guillemot, F. Quiescence of adult mammalian neural stem cells: A highly regulated rest. Neuron. 104 (5), 834-848 (2019).
- Hanspal, M. A., Gillotin, S. A new age in understanding adult hippocampal neurogenesis in Alzheimer's disease. Neural Regeneration Research. 17 (12), 2615-2618 (2022).
- Zhang, H., et al. Single-nucleus transcriptomic landscape of primate hippocampal aging. Protein & Cell. 12 (9), 695-716 (2021).
- Franjic, D., et al. Transcriptomic taxonomy and neurogenic trajectories of adult human, macaque, and pig hippocampal and entorhinal cells. Neuron. 110 (3), 452-469 (2022).
- Moreno-Jimenez, E. P., Terreros-Roncal, J., Flor-Garcia, M., Rabano, A., Llorens-Martin, M. Evidences for adult hippocampal neurogenesis in humans. Journal of Neuroscience. 41 (12), 2541-2553 (2021).
- Sorrells, S. F., et al. Positive controls in adults and children support that very few, if any, new neurons are born in the adult human hippocampus. Journal of Neuroscience. 41 (12), 2554-2565 (2021).
- Zhou, Y., et al. Molecular landscapes of human hippocampal immature neurons across lifespan. Nature. 607, 527-533 (2022).
- Bonafina, A., Paratcha, G., Ledda, F. Deciphering new players in the neurogenic adult hippocampal niche. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 548 (2020).
- Amaral, D. G., Scharfman, H. E., Lavenex, P. The dentate gyrus: fundamental neuroanatomical organization (dentate gyrus for dummies). Progress in Brain Research. 163, 3-22 (2007).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- Flor-Garcia, M., et al. Unraveling human adult hippocampal neurogenesis. Nature Protocols. 15 (2), 668-693 (2020).
- Moreno-Jimenez, E. P., et al. Adult hippocampal neurogenesis is abundant in neurologically healthy subjects and drops sharply in patients with Alzheimer's disease. Nature Medicine. 25 (4), 554-560 (2019).
- Kalinina, A., Lagace, D. Single-cell and single-nucleus RNAseq analysis of adult neurogenesis. Cells. 11 (10), 1633 (2022).
- Harris, L., et al. Coordinated changes in cellular behavior ensure the lifelong maintenance of the hippocampal stem cell population. Cell Stem Cell. 28 (5), 863-876 (2021).
- Shin, J., et al. Single-cell RNA-seq with Waterfall reveals molecular cascades underlying adult neurogenesis. Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).
- Artegiani, B., et al. A single-cell RNA sequencing study reveals cellular and molecular dynamics of the hippocampal neurogenic niche. Cell Reports. 21 (11), 3271-3284 (2017).
- Nott, A., Schlachetzki, J. C. M., Fixsen, B. R., Glass, C. K. Nuclei isolation of multiple brain cell types for omics interrogation. Nature Protocols. 16 (3), 1629-1646 (2021).
- Sarnat, H. B., Nochlin, D., Born, D. E. Neuronal nuclear antigen (NeuN): a marker of neuronal maturation in early human fetal nervous system. Brain Development. 20 (2), 88-94 (1998).
- Guidance on the Operation of ASPA. , Available from: https://assets.publishing.service.gov.uk/government/uploads/system/uploads/attachment_dat/file/662364/Guidance_on_the_Operation_of_ASPA.pdf (2022).
- Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (33), e1543 (2009).
- Habib, N., et al. Disease-associated astrocytes in Alzheimer's disease and aging. Nature Neuroscience. 23 (6), 701-706 (2020).
- Ding, J., et al. Systematic comparison of single-cell and single-nucleus RNA-sequencing methods. Nature Biotechnology. 38 (6), 737-746 (2020).
- Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
- Mussa, Z., Tome-Garcia, J., Jiang, Y., Akbarian, S., Tsankova, N. M. Isolation of adult human astrocyte populations from fresh-frozen cortex using fluorescence-activated nuclei sorting. Journal of Visualized Experiments. (170), e62405 (2021).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Marti-Mengual, U., Varea, E., Crespo, C., Blasco-Ibanez, J. M., Nacher, J. Cells expressing markers of immature neurons in the amygdala of adult humans. European Journal of Neuroscience. 37 (1), 10-22 (2013).
- Zhang, X. M., et al. Doublecortin-expressing cells persist in the associative cerebral cortex and amygdala in aged nonhuman primates. Frontiers in Neuroanatomy. 3, 17 (2009).
- Ding, Z. B., et al. Astrocytes: a double-edged sword in neurodegenerative diseases. Neural Regeneration Research. 16 (9), 1702-1710 (2021).
- Phatnani, H., Maniatis, T. Astrocytes in neurodegenerative disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (6), 020628 (2015).
