Summary
Burada, floresan ile aktive olmuş çekirdekler (FAN) sıralama yoluyla çoğu nöronu dışlayan fare dentat girusundan izole edilen tek çekirdekleri sıralamak için bir yöntem sunulmaktadır. Bu yaklaşım, yüksek kaliteli ekspresyon profilleri oluşturur ve nöral kök hücreler gibi kıt popülasyonlar da dahil olmak üzere niş içinde temsil edilen diğer hücre tiplerinin çoğunun incelenmesini kolaylaştırır.
Abstract
Dentat girusun (DG) alt granüler bölgesi (SGZ) içindeki proliferatif ve sessiz nöral kök hücrelerin (NSC'ler) ömür boyu sürdürülmesinden ve yeni doğan nöronlardan granül hücre tabakasındaki granül hücrelere farklılaşmasından oluşan Erişkin Hipokampal Nörogenez (AHN), çok sayıda çalışmada iyi bir şekilde doğrulanmıştır. Genetiği değiştirilmiş hayvanların, özellikle de kemirgenlerin kullanılması, AHN'yi düzenleyen sinyal yollarını araştırmak ve hipokampal nörojenik nişi oluşturan her hücre tipinin rolünü incelemek için değerli bir araçtır. İkincisini ele almak için, tek çekirdek izolasyonunu yeni nesil dizileme ile birleştiren yöntemler, her hücre popülasyonu için gen imzalarını tanımlamak için AHN alanında önemli bir etkiye sahip olmuştur. Bununla birlikte, DG içindeki daha nadir hücre popülasyonlarının fenotipik profilini çıkarmak için bu tekniklerin daha da iyileştirilmesi gerekmektedir. Burada, NeuN antijeni için lekesiz çekirdekleri seçerek, yeni disseke edilmiş DG'den izole edilmiş tek bir çekirdek süspansiyonundan çoğu nöronal popülasyonu dışlamak için Floresan Aktif Çekirdek Sıralama (FANS) kullanan bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, AHN'nin hücreler arası düzenlemesini daha fazla araştırmak ve türler arasında yeni hücresel belirteçleri ve mekanizmaları ortaya çıkarmak için potansiyel bir basamak taşıdır.
Introduction
Yetişkin Hipokampal Nörogenezi (AHN) olarak da bilinen yetişkinlikte hipokampal nöronların sürekli üretimi, öğrenme, hafıza edinimi / klirensi ve örüntü ayrımı gibi bilişsel işlevlerle ilişkilidir ve bilişsel eksiklikleri önlemek için yaşlanma ve nörodejeneratif hastalıklarda önemli bir esneklik mekanizması gibi görünmektedir 1,2,3 . Kemirgenler, immünositokimya ve yeni nesil dizileme (NGS) yöntemleri de dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanarak AHN'yi incelemek için tercih edilen model olmuştur. Bu sonuçların diğer türlere çevirisi tartışmalı olmaya devam etmektedir. Gerçekten de, AHN çoğu türde gözlenmiştir, ancak yaşam boyunca, özellikle de insanlarda 4,5,6,7,8 oranında devam ettiği düzenli olarak tartışılmaktadır.
Bugüne kadar, AHN1'i modüle etmek için çeşitli içsel ve dışsal sinyal yolları doğrulanmıştır. Bununla birlikte, hücreler arası iletişimin AHN üzerindeki etkisi sadece9. Bu ilk olarak, genetiği değiştirilmiş hayvanlarla in vivo analiz yapmak için şu anda bilinen hücre belirteçlerinin yetersiz özgüllüğüne bağlanabilir. Gerçekten de, birçok çalışma, çoklu hücre tipleri1'de eksprese edilen doublecortin veya glial fibriler asidik protein (GFAP) gibi belirteçlere dayanmaktadır. İkincisi, yetişkin hipokampal niş10'daki karmaşıklık ve yüksek derecede hücre çeşitliliği, her hücre tipinin profilini çıkarmak için teknik zorluklar getirmektedir. Bu, özellikle NSC'ler veya glial hücreler gibi farklı popülasyonlar için analitik boru hatlarında kullanılan örtüşen hücresel belirteçlerle biyoinformatik analiz için geçerlidir ve AHN 7,11'i değerlendirirken tartışmalı sonuçlara yol açmaktadır. Üçüncüsü, çok sayıda nöron, astrositler, oligodendrositler veya ependimal hücreler gibi daha az miktarda hücre popülasyonunun araştırılmasını baltalamaktadır, ancak AHN'nin ince ayar düzenlemesindeki rolleri öne çıkmaktadır9. Birlikte, bu sınırlamalar sonuçları kemirgenlerden diğer türlere çevirme yeteneğini etkiler. Bu, özellikle hipokampal nörojenik niş gibi karmaşık bir dokuyu in vitro olarak özetlemenin zorluğu ve insan dokularını içeren çalışmalarda doku işleme için standartlaştırılmış protokollerin eksikliği ile birlikte yüksek kaliteli dokuya erişmenin önündeki birçok engel ile daha da artmaktadır12,13. Bu nedenle, hücre popülasyonlarının profilini çıkarmak için yeni yaklaşımlar geliştirmek ve dentat girus (DG) içindeki yeni hücresel belirteçleri tanımlamak kritik öneme sahiptir ve sonuçta her hücre tipinin AHN regülasyonuna farklı katkılarının daha iyi anlaşılmasına yol açacaktır.
Bunu başarmak için, RNA dizilimi ile birlikte tek hücreli (sc) ve tek çekirdekli (sn) izolasyon, DG14 gibi karmaşık dokuları araştırmak için etkili hale gelmiştir. Bu nedenle, tek hücreleri fare yetişkin hipokampal nişinden izole etmek için hücresel zenginleştirme stratejileri çoğunlukla NSC'leri incelemek için gerçekleştirilmiştir15,16. Nöronal olmayan hücreleri DG'den zenginleştirmek için ilginç bir strateji, GluR1 / Cd24 çift negatif tek hücrelerin dizilenmesiyle uygulandı ve biyoinformatik analizden sonra astrositler ve NSC'ler arasında belirgin kümeler olmadan 1.408 hücrenin dizilenmesiyle sonuçlandı17. Bunun nedeni, hücre bütünlüğüne ve RNA'ya zarar veren tek hücre hazırlığı için gereken sert enzimatik sindirim olabilir. Bu teknik sorunu atlamak için, bunun yerine tek çekirdek izolasyonunu kullanan çeşitli yöntemler geliştirilmiştir ve özellikle karmaşık dokular için uygundur11,18. Bununla birlikte, DG içindeki nöronların baskınlığı veya daha geniş anlamda hipokampal-entorinal sistem içinde, bu beyin bölgelerinde bulunan hücre popülasyonlarının tamamını incelemek için bir örnekleme önyargısı oluşturur. Ek olarak, tek hücre kütüphanelerinin hazırlanması için yüklenecek sınırlı sayıda hücre, sıralanmış tek çekirdeklerin analitik boru hatlarında ana hücre popülasyonunun varlığını vurgulamaktadır. Gerçekten de, büyük nöronal kümeler genellikle açıklama eklenir ve analiz edilirken, diğer hücre popülasyonları yeterince temsil edilmez veya kaçırılır 5,11.
Bu önyargıların üstesinden gelmek ve fare DG'sinde bulunan nöronlar dışındaki hücre tiplerinin profilini çıkarabilmek amacıyla, bu çalışmada, nöronal nükleer antijenli boyalı tek çekirdeklerin negatif seçimi ile çoğu nöronal popülasyonu dışlayan Floresan Aktif Çekirdek Sıralama (FANS)18 ilkesini kullanan bir yöntem geliştirilmiştir (NeuN, Rbfox3 olarak da bilinir). Bu antijen seçimi, NeuN'yi güvenilir bir nöronal belirteç19 olarak tanımlayan literatür ve bu yaklaşım için nükleer bir protein kullanma gerekliliği tarafından yönlendirilmiştir. NeuN-negatif FACS-sıralanmış hücreler daha sonra 10x Genomik platformunda RNA dizilimi için hazırlandı. Sonuçlar, NeuN eksprese eden hücrelerin dışlanmasının, glial ve nadir hücre popülasyonlarının hücre tipine özgü, yüksek kaliteli transkriptomik profillemesine izin verdiğini göstermektedir.
Protocol
Hayvan bakımı ve deneysel prosedürler, Francis Crick Enstitüsü'nün yönergelerinin yanı sıra İngiltere İçişleri Bakanlığı yönergeleri ve yasalarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
Şekil 1: Nöronal olmayan popülasyonların snRNA-sekleri için yetişkin farelerin disseke edilmiş DG'sinden tek bir çekirdek süspansiyonunun hazırlanması. snRNA-seq ile devam etmeden önce fare DG'sinin diseksiyonu, tek çekirdeklerin süspansiyonunun hazırlanması, NeuN immün boyama ve negatif NeuN-FANS-sıralamayı içeren protokolün ana adımlarını açıklayan akış diyagramı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
1. Genel Müdürlük diseksiyonu (Zamanlama: 15 dk.)
- Çekirdek izolasyon ortamı 1 ve 2'yi (NIM1 ve NIM2), homojenizasyon tamponunu (HB) ve Yıkama ortamını (WM) hazırlayın (Ek Tablo 1). Tüm tamponları, ortamları, reaktifleri ve aletleri ihtiyaç duyulana kadar buzun üzerine yerleştirin. Sıçrama homojenizatörünü ( bakınız Malzeme Tablosu) hazırlama sırasında (homojenizasyon adımından en az 1 saat önce) buzun üzerine koyun.
NOT: NIM1, 4 °C'de 6 aya kadar hazırlanabilir ve saklanabilir. NIM2, HB ve WM taze hazırlanmalıdır.
DİKKAT: DTT, proteaz inhibitörü ve Triton X-100'ü dikkatli bir şekilde manipüle edin. Bu bileşikler cildi ve gözü tahriş edici, akut toksik ve su ortamı için tehlikelidir. Bu kimyasalları kullanırken koruyucu eldiven, giysi, göz ve yüz koruyucu kullanın, kullandıktan sonra ellerinizi iyice yıkayın ve çevreye salınımdan kaçının. - 22 aylık bir erkek C57Bl / 6J fareyi, Ev Ofisi Program 1 prosedürü20'yi takiben servikal çıkık ile ötenazileştirin.
NOT: Bu çalışmada 22 aylık fare kullanımı ile ilgili gerekçeler için tartışmaya bakınız. Bununla birlikte, bu protokol yaşam süresi boyunca herhangi bir yaşta gerçekleştirilebilir. - Beyni ötenazi yapılmış bir fareden çıkarın ve buz gibi soğuk 1x PBS ile dolu 10 cm'lik bir Petri kabına aktarın (Şekil 1). Petri kabını buzun üzerine yerleştirin. Bir neşter kullanarak beyinciğini çıkarın ve beyni her iki yarımküre arasında (sagital eksen boyunca) ikiye bölün.
- 10 cm'lik yeni bir Petri kabını buz gibi PBS ile doldurun ve buzun üzerine yerleştirin. Beynin yarısını yeni Petri kabına aktarın. Dürbün kullanarak, DG'yi disseke edin ve beynin ikinci yarısından ikinci DG'yi elde etmek için bu adımı tekrarlayın.
NOT: Bu adımlar (adım 1.2-1.4) daha önce açıklanan yordam21'den uyarlanmıştır. Hücrelerin bütünlüğünü korumak için bu aşamada mümkün olduğunca hızlı ilerlemek önemlidir. - İki DG'yi önceden soğutulmuş Dounce homojenizatörüne aktarın ve 1 mL soğuk HB ekleyin.
2. Doku ayrışması, tek çekirdek izolasyonu ve anti-NeuN immün boyama (Zamanlama: 2 saat)
- Dokuyu gevşek "A" havanesinin 10 vuruşuyla, ardından sıkı "B" havanesinin 15 vuruşuyla homojenize edin.
NOT: Sürtünme ve köpüklenmenin neden olduğu ısıyı azaltmak için sıçrama homojenizasyonu buz üzerindeki harçla yumuşak vuruşlarla yapılmalıdır. İşlem sırasında tüm tamponlar ve ekipmanlar önceden soğutulmalı ve buz üzerinde tutulmalıdır. - Homojenatı önceden soğutulmuş 15 mL'lik bir tüpe aktarın; Dounce homojenizatörünü 1 mL soğuk HB ile durulayın ve aynı tüpte birleştirin. 15 mL tüpe 3 mL HB ekleyin ve buz üzerinde 5 dakika kuluçkaya yatırın. Tüpü yavaşça ters çevirerek 2x karıştırın.
- 50 mL'lik bir test tüpü üzerinde 0,5 mL HB içeren 70 μm'lik bir süzgeç kapağını önceden ıslatın. 15 mL tüpün üzerinden yavaşça hücre süzgecine devrilerek çekirdek süspansiyonunu adım 2.2'den süzün. Hücre süzgecini 0,5 mL HB ile yıkayın.
- Hücre süzgecini çıkarın ve bir salıncak kovası santrifüjü kullanarak test tüpünü 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın. Süper natantı atın.
NOT: Homojenatın zorlanması, akış sitometrisi ve snRNA-seq aşağı akış adımları için kritik olan kalıntıların azaltılmasına yardımcı olacaktır. - Bir P1000 pipet kullanarak peleti 4 mL HB içinde nazikçe yeniden askıya alın. 5 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. 4 °C'de 10 dakika boyunca 500 x g'de döndürün. Süpernatantı atın ve peleti 3 mL WM içinde yeniden askıya alın.
- 0,5 mL WM içeren 15 mL'lik bir test tüpü üzerinde 35 μm'lik bir süzgeç kapağını önceden ıslatın. çekirdek süspansiyonunu 2.5. adımdan hücre süzgecinden süzün, bir P1000 pipet kullanarak bir seferde 0,5 mL'yi hafifçe pipetleyin.
- Süzgeç kapağını 0,5 mL WM ile yıkayın ve tüpü buzun üzerine yerleştirin. Filtratın yeni bir 15 mL tüpe aktarın ve 500 x g'de 5 dakika ve 4 ° C için santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve peleti 3 mL WM içinde yeniden askıya alın.
- 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de döndürün. Süpernatantı atın ve fare anti-NeuN, Alexa Fluor 488-konjuge antikor (anti-NeuN-AF488, 1:32.000) ve 1 μg / mL DAPI ile peleti 1 mL WM içinde yeniden askıya alın. Karanlıkta buz üzerinde 45 dakika kuluçkaya yatırın.
NOT: İzole çekirdeklerin immün boyamasını optimize etmek için, akış sitometrisi analizi ve sıralama için en uygun seyreltmeyi belirlemek üzere antikorun titre edilmesi önerilir. Ardından, boyama koşullarının optimal olduğunu doğrulamak için yeterli kontrolleri çalıştırın. Örneğin, konjuge anti-NeuN-AF488 antikoru ile, lekesiz ve lekeli popülasyonların ayrışmasını değerlendirmek için negatif bir kontrol (yani, antikorun eklenmemesi, Ek Şekil 1A) ve pozitif bir kontrol (yani, antikor ile boyanma, Ek Şekil 1B) çalıştırılmıştır. AF488 konjuge bir antikor ile çalışmaya başlarken, özgüllüğü değerlendirmek için AF488 konjuge izotip kontrolünün çalıştırılması önerilir. Konjuge olmayan bir antikor kullanılıyorsa, sekonder antikorun spesifik olmayan bağlanmasını değerlendirmek için sadece bir çekirdek preparatına ikincil bir antikor eklemek gibi ek kontrol gerekli olabilir.
3. Nöronal popülasyonları dışlamak için floresan aktif çekirdek sıralama (FANS) (Zamanlama: 45 dakika)
- İmmün boyalı çekirdek süspansiyonunu 5 mL'lik bir test tüpüne aktarın ve akış sitometrisi prosedürünün başlangıcına kadar buz üzerinde tutun.
NOT: İki fare DG'sinden daha büyük doku parçalarıyla çalışıyorsanız, çözeltideki çekirdek yoğunluğu yükselirse FACS'ın tıkanmasını önlemek için WM tamponu ile daha fazla seyreltme gerekebilir. - Tüpleri FACS cihazına yerleştirmeden önce numuneleri düşük hızda 3 sn'lik vorteksle yapın (bkz.
NOT: (FACS kurulumu) Ayıklama makinelerinin, prosedürün başlangıcında üreticinin tavsiyelerine uygun olarak kalibrasyon parçacıklarıyla hizalanması gerekir. Düşme gecikmesi, FACS modeline göre boncuklar veya mikrosferlerle kalibre edildi (bkz. Numuneler saflık modunda 4 °C'de sıralandı. Toplama hacmini azaltmak için, çekirdekler akış sitometresi için önerilen basınçta 70 μm'lik bir nozuldan ayrıldı. Çekirdekler, 50 μL WM içeren 1.5 mL düşük bağlayıcı tüplere (bakınız Malzeme Tablosu) ayrıldı. Tüm toplama tüpleri, çekirdeğin tüpün duvarlarına yapışma riskini azaltmak için gece boyunca 4 ° C'de PBS +% 5 BSA ile kaplanmıştır. - Verileri lekeli çekirdek süspansiyonunun bir örneğinden elde etmek için, hücre kalıntılarını ve toplanmış çekirdekleri dışlamak için kapıları DAPI yüksekliğinde ve DAPI alanında ayarlayın (Şekil 2A). Ayrıca, kapıları log Side scatter (SSC)-area ve log Forward scatter (FCS)-area (Şekil 2B) olarak ayarlayarak kalan DAPI lekeli agregalardan veya hücre kalıntılarından tek çekirdekleri ayırın.
- Şekil 2C'de gösterildiği gibi, NeuN-AF488-negatif popülasyonu izole etmek için anti-NeuN-AF488 ve FSC alanı için kapıları ayarlayın.
- Analizden sonra, yukarıda açıklanan geçit stratejisini kullanarak, NeuN-AF488-negatif popülasyonu, 50 μL WM ile doldurulmuş 1,5 mL'lik bir toplama tüpünde sıralayın.
NOT: Yukarıda açıklanan geçit stratejisini ve DG'yi yetişkin bir farenin beyninden izole etmek için diseksiyon prosedürünü takiben, NeuN-AF488-negatif popülasyonun tek çekirdeğin ~% 14'ünü temsil etmesi beklenmektedir.
Şekil 2: NeuN-AF488 negatif tek çekirdeği izole etmek ve hücre kalıntılarını dışlamak için DG. (A-C) Geçit stratejisinden nöronal olmayan hücre popülasyonlarının izolasyonu ve transkriptomik profillemesi. (A) FANLAR, DAPI+ çekirdeklerinin seçimi ve hücre kalıntılarının ve agregalarının dışlanması için kapı ayarını gösteren, izole edilmiş çekirdeklerin temsili bir örneğinin nokta grafiği. (B) FSC alanı ve SSC alanı kullanılarak ilgili tek çekirdeklerin daha fazla seçimi. (C) NeuN-AF488'in pozitif popülasyonu dışlaması ve negatif tek çekirdekleri sıralaması için kapılar. (D) Kötü kaliteli çekirdeklere (beyaz ok) kıyasla minimum miktarda enkaz ve daha yüksek oranda kaliteli çekirdeklere (yuvarlak şekil, siyah ok) sahip iyi bir tek çekirdek süspansiyonunun mikrografisi. Ölçek çubukları = 50 μm, 10 μm (giriş). (E,F) snRNA-seq verilerinin analizi ve 22 aylık C57BL/6J erkek farelerin DG'sinden izole edilen farklı hücre popülasyonlarının profillenmesi. Boyut Azaltma için Tekdüze Manifold Yaklaşımı ve Projeksiyonu (UMAP), (E) FACS-sıralanmamış hücrelerden ve (F) NeuN-negatif FACS-sıralanmış hücrelerden, hücre tipine göre renklendirilmiş tek çekirdek profillerinin grafikleri. (G) Her iki örnekte tanımlanan hücre tiplerinin frekanslarını karşılaştıran pasta grafikler. (H) Sıralanan örnekler için ilgili metrikler: çekirdek sayısı, medyan gen sayısı ve çekirdek başına transkript. (I) Her iki örnekte de her hücre tipi için tespit edilen gen sayısının ve transkriptlerin dağılımını gösteren keman grafikleri. Astr. = astrositler, Olig. = oligodendrositler, Vasc. = vasküler hücreler, CRC'ler = Cajal-Retzius hücreleri, Neur. = nöronlar, Imm. = bağışıklık hücreleri, OPC'ler = oligodendrositler öncü hücreler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
4. Tek çekirdekli RNA dizilimini gerçekleştirmek için tek çekirdek süspansiyonunun hazırlanması (Zamanlama: 30 dakika)
- Sıralamadan sonra, tüpün duvarındaki damlacıkları toplamak için toplama tüpüne %1 BSA içeren 1 mL PBS ekleyin ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de döndürün. 50 μL bırakarak süpernatanı atın.
NOT: Santrifüjlü çekirdekleri dikkatli bir şekilde kullanın, çünkü tüpün dibinde herhangi bir pelet gözlemlemek zor olabilir. Bir salıncak kovası santrifüjü kullanmak, peleti bozmadan süpernatantın atılmasına yardımcı olacaktır. - Pipet, santrifüjlü çekirdekleri yeniden askıya almak için nazikçe kullanılır. 0.5 mL'lik bir mikrotüp içinde 5 μL Tripan mavisine 5 μL çekirdek süspansiyonu ekleyin.
DİKKAT: Tripan mavisini sağlık için tehlikeli olduğu, kansere neden olabileceği ve doğurganlığa veya doğmamış çocuğa zarar verdiğinden şüphelenildiği için dikkatli kullanın. Koruyucu eldiven, kıyafet, göz ve yüz koruyucu kullanın. Tüm güvenlik önlemleri okunup anlaşılana kadar elleçlemeyin. - Bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak konsantrasyonu ölçün ve tek hücreli süspansiyonun yaşayabilirliğini değerlendirin (bkz. Adım 5'te ayrıntılı olarak açıklandığı gibi kütüphane hazırlığını ve çekirdeklerin sıralanmasını gerçekleştirin.
NOT: Dizileme için iyi kalitede olduğu düşünülen örnekler, mikroskop altında hücre kalıntıları olmadan yuvarlak ve düzenli çekirdek şekli göstermiştir (Şekil 2D). Nükleer membranın etrafında bir halenin varlığı veya çoklu çekirdeğin bir araya toplanması, hasarlı çekirdeklerin belirtileridir ve bu tür hücre süspansiyonları snRNA-seq için dikkate alınmamalıdır (Şekil 2D). Ölçülen çekirdek konsantrasyonu 300-700 çekirdek / μL aralığındaydı.
5. Kütüphane hazırlama ve sıralama
NOT: Aşağıdaki adımların tanımı, bu çalışmada kullanılan kurum içi sıralama platformuna dayanmaktadır (bkz. Bu nedenle, farklı bir platform kullanırken bazı ayarlar farklı olabilir. Burada, yalnızca önemli adımlar açıklanmaktadır ve her parametre, ilk kullanımdan önce optimizasyonla da olsa, seçilen üreticinin rehberliği ve protokolleri izlenerek belirlenmelidir. RNA bozulmasını önlemek ve dizilemenin optimum kalitesini sağlamak için sıralanmış çekirdek süspansiyonları konsantre edildikten sonra kütüphanelerin hazırlanmasının mümkün olduğunca çabuk yapılmasını sağlamak çok önemlidir.
- 7.000 ila 10.000 çekirdeği mikroakışkan Tek Hücreli Çipe yükleyin.
- Sağlanan kontrolörü ve seçilen tedarikçiden gelen reaktifleri kullanarak nanolitre ölçekli damlacıklarda yüklü çekirdekleri bölümleyin. Her damlacık içindeki liz çekirdekleri ve ters transkripsiyon RNA.
NOT: Bir damlacık içinde ortaya çıkan tüm cDNA'lar aynı hücre barkodunu paylaştı. - Seçilen tedarikçinin yönergelerini izleyerek ve sıralama platformuyla uyumluluğu sağlayarak snRNA-seq için kütüphaneler hazırlayın. Elektroforez, florometri veya qPCR tabanlı yöntemler kullanarak nihai kütüphanelerin kalitesini ve konsantrasyonunu kontrol edin ve varsa, sıralamadan önce bunları eşit olarak bir araya getirin.
- Denatüre 3ʹ gen ekspresyon kütüphanelerini bir araya getirdi ve üreticinin tavsiyesine göre seyreltin.
- Hücre başına 50.000 okuma çifti sıralama derinliğine sahip yeni nesil bir sıralama platformunda çift uçlu, tek veya çift indeksleme dizilimi gerçekleştirin.
Representative Results
Burada sunulan protokol, snRNA-seq gerçekleştirmek için DG'den izole edilen nöronal olmayan tek çekirdeklerin süspansiyonunu hazırlamak için bir yöntemi açıklamaktadır. FANS'lı veya fanssız, biyoinformatik kümeleme, DG içindeki bilinen hücre tiplerine karşılık gelen iyi ayrılmış çekirdek gruplarını ortaya çıkardı (Şekil 2E, F). FACS-sıralanmamış örnekte, dizilenen yüksek kaliteli çekirdeklerin çoğunluğu üç nöron grubundan oluşuyordu (bu örnek için toplam çekirdeğin% 84.9'u, Şekil 2E, G, H). DG'de en çok temsil edilen hücre popülasyonlarının granül nöronlar, diğer uyarıcı nöronlar (uyarıcı nöronlar olarak etiketlenmiş) ve inhibitör nöronlar10 olduğu göz önüne alındığında, bu tür sonuçlar beklenmektedir. Tanımlanan nöronal olmayan kümeler çoğunlukla astrositler, oligodendrositler ve oligodendrosit öncü hücreleri (OPC'ler), bağışıklık hücreleri (% 3.3) ve Cajal-Retzius hücreleri (% 0.6) dahil olmak üzere glial hücre tiplerinden (% 11.1) yapılmıştır. NeuN pozitif popülasyonlarını dışlamak için FANS uygularken (NeuN-negatif FACS-sıralanmış örneklem; Şekil 2F,G,H), glial hücre kümeleri baskın hale geldi (%81.3). Daha fazla sayıda glial çekirdeğin izolasyonu, FANS olmadan bir araya gelecek farklı popülasyonların daha iyi bir segmentasyonuna izin verir. Gerçekten de, NSC'lerde veya astrositlerde eksprese edilen spesifik genlerin yeniden kümelenmesi ve analiz edilmesinde, dört alt küme ayrıldı (Ek Şekil 2A, B). Daha spesifik hücresel belirteçlere bakıldığında ve hücre tipleri boyunca gen ekspresyon seviyelerini değerlendirerek, Hopx ve Notch2'nin daha yüksek ekspresyonuna sahip ana astrositik popülasyonlardan ayrı olarak ayrılan ve neredeyse hiç Aldh1a1 veya Aqp4 ekspresyonu olmayan küçük bir NSC kümesi tespit edildi (Ek Şekil 2C). Bununla birlikte, astrositler ve NSC'ler arasındaki gen ekspresyonundaki örtüşme nedeniyle, farklı alt hücre tiplerini spesifik olarak profillemek ve tanımlamak için daha fazla analiz yapılması gerekecektir. Ayrıca, NeuN-negatif FANS örneği, hücreye özgü belirteçlerin ekspresyonu için çapraz referans alındığında endotel hücrelerini, perisitleri ve vasküler leptomeningeal hücreleri kapsayan vasküler hücreler (% 2.3) olarak etiketlenmiş ek kümelere sahipti (veriler gösterilmemiştir).
Sıralama için kitaplıklar oluşturmak üzere seçilen protokole yönelik kılavuzun ardından, FANS'lı veya FANS'sız yüksek kaliteli ifade profilleri elde edildi. 50.000 okuma / çekirdekte sıralanan örnekler için, düşük kaliteli çekirdekleri filtreledikten sonra, FACS-sıralanmamış örnek (5.578 transkript, Şekil 2H) için çekirdek başına ortalama 2.510 gen ve NeuN-negatif FANS örneği için 1.665.5 gen (3.508 transkript) tespit edildi (Şekil 2H, I). Bu metrikler, bu protokolün farklı yaklaşımlar kullanan çalışmalarla karşılaştırılabilir tek çekirdeklerin yüksek kaliteli transkriptomik profilini oluşturduğunu 22,23 ve FACS sıralama işleminin sonraki snRNA-seq için çekirdeklere zarar vermediğini doğrulamaktadır. Özellikle, iki örnek arasındaki çekirdek başına gen ve transkript sayısındaki fark, düşük veri kalitesinden değil, FACS-sıralanmamış numunedeki nöronların yüksek oranından (NeuN-negatif FANS örneğinde% 1.7'ye kıyasla% 84.9), daha yüksek bir transkripsiyonel aktiviteye (FACS-sıralanmamış örnekte 2.660 gen / çekirdek ve 6.170 transkript / çekirdek) sahip olan nöronların yüksek oranından kaynaklanmaktadır. transkriptler/çekirdek, Şekil 2I).
Birlikte, bu temsili sonuçlar, FANS kullanarak NeuN negatif çekirdeklerinin seçiminin, düşük bolluktaki hücre tiplerini yeni disseke edilmiş beyin dokusundan izole etmek ve snRNA-seq yöntemleri aracılığıyla bu farklı hücre popülasyonlarının yüksek kaliteli tek çekirdekli transkriptomik profillemesini gerçekleştirmek için güçlü bir araç olduğunu göstermektedir.
Ek Şekil 1: FANS için immün boyamanın doğrulanması. Çekirdek süspansiyonu (A) negatif kontrol olarak anti-NeuN-AF 488 antikoru olmadan veya (B) antikor ile inkübe edildi ve immün boyama koşullarını doğrulamak için FACS sıralayıcısından geçirildi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 2: Gen ekspresyon analizi ve astrosit kümesinin yeniden kümelenmesi. (A) Boyut Azaltma için Tekdüze Manifold Yaklaşımı ve Projeksiyonu (UMAP) grafiği, Şekil 2F'deki genom çapında ekspresyon profillerine dayanarak 4968 çekirdeğin kümelenmesini göstermektedir. Hücre tipi çağrılar, hücre tipi belirteçlere göre yapıldı. (B) Astrosit kümesi, potansiyel hücresel alt tipleri araştırmak için daha fazla alt ayar için (A) 'dan seçilen 2579 çekirdekten oluşur. Farklı renklerle gösterilen Seurat (0-3) kümelemesi ile dört alt tip tespit edildi. (C) Dört hücre tipi boyunca spesifik hücresel belirteçlerin gen ekspresyon seviyeleri. Tüm arsalar Seurat R paketi24 kullanılarak elde edildi. Kısaca, RNA-seq sayıları her hücre için toplam ekspresyon ile normalleştirildi ve ölçek faktörü (10.000) ile çarpıldı. Bu sonuç daha sonra log dönüştürüldü. Dönüştürülen değerler, x ve y eksenlerinde değer olarak kullanılan gömmeleri hesaplamak için UMAP uygulanmadan önce her hücre içinde ölçeklendirildi (varyans bire ölçeklendirildi) ve ortalandı (ortalama sıfıra ayarlandı). Grafikler, her noktanın, indirgeme tekniği tarafından belirlenen hücre gömmelerine dayanan ilgili x ve y koordinatlarına sahip bir hücreyi temsil ettiği bir 2B dağılım grafiği üzerindeki boyutsal indirgeme tekniğinin çıktısını temsil eder. Benzer gen imzalarına sahip hücreler, gömmeler tarafından birbirine yakın konumlandırılır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 3: Nörojenik soyda NeuN'nin gen ekspresyon analizi. (A) Nörojenik soyun kümelenmesini halka açık veri kümesi15'ten gösteren UMAP grafiği. UMAP'ler Ek Şekil 2'de olduğu gibi oluşturulmuştur. (B) Astrosit (Aquaporin 4 = Aqp4), NSC'ler (yalnızca Homeodomain proteini = Hopx), NeuN / Rbfox3 (NSC'ler ve ara progenitör hücreler [IPC'ler]) ve döngü hücrelerini (Siklin bağımlı kinaz 6 = Cdk6) gösteren nörojenik soy boyunca spesifik hücresel belirteçlerin gen ekspresyon seviyeleri. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Tablo 1: Çalışmada kullanılan ortam ve tampon bileşimleri. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Discussion
Bu protokolü başarılı bir şekilde uygulamak için, DG'nin diseksiyonu, hasar görmemesini sağlamak ve çevre dokulardan kontaminasyonu sınırlamak için bazı uygulamalar gerektiren ilk kritik adımdır. Deneyimlere göre, DG'nin hipokampustan ayrılması, daha sonra diseksiyonun hızını artırmak ve dolayısıyla yüksek kaliteli veriler üretmek için dokunun tazeliğini artırmak için tekniklerini rafine etmek için çalışabilecek yetenekli bir araştırmacı tarafından çok hızlı bir şekilde elde edilebilir. Benzer şekilde, tek çekirdeklerin hazırlanması ve yeniden askıya alınması, tek bir deneyde kullanılan farklı koşullar arasında tutarlılık gerektirir, ancak aynı zamanda dizileme sonuçlarını önyargılı hale getirecek ortam RNA'larını serbest bırakan nükleer zarı bozabilecek aşırı pipetlemeden kaçınılmasını gerektirir. Yüksek kaliteli çekirdekler hazırlamak için daha önce bahsedilen önerilere ek olarak, dizilemeye devam etmeden önce tek çekirdekli süspansiyonun konsantrasyonu da dikkate alınmalıdır. Gerçekten de, üreticinin yönergelerine göre, 1.200 nuc / μL'den daha yüksek bir konsantrasyona sahip bir preparat seyreltilmelidir, çünkü bu çekirdek konsantrasyonu seviyesi, aşağı akış biyoinformatik analizlerini etkileyen çarpanlar oluşturma riski daha yüksek olacaktır. Not olarak, 500 nuc / μL'nin altındaki çekirdek konsantrasyonlarına sahip numunelerin dizilenmesi, ilgili maliyet nedeniyle faydalı olmayabilir. Ayrıca, tüm geçitleri ayarlamak ve numuneler ve biyolojik kopyalar arasındaki ayarlarla tutarlı kalmak için gelişmiş bir FACS kullanıcısının tavsiyelerine uymanız önerilir. Benzer şekilde, RNA dizilimi için kütüphanelerin hazırlanması, yüksek kaliteli sonuçlar elde etmek için bazı eğitimler gerektirir ve çoğu satıcı bunu verimli bir şekilde elde etmek için mükemmel desteğe sahiptir. Bu çalışmada bu yöntem sadece taze doku ile test edilmiştir; Bununla birlikte, FANS dondurulmuş doku25 ile de gerçekleştirilmiştir. Bu nedenle, bu protokolün küçük bir optimizasyonla da olsa dondurulmuş doku ile gerçekleştirilebileceğini varsaymak mantıklıdır.
Bu protokol, hipokampal nörojenik niş içindeki nöronlar dışındaki hücre popülasyonlarını araştırmak için belirli bir aşağı akış uygulaması göz önünde bulundurularak geliştirilmiştir. Gerçekten de, artan kanıt çizgileri, yaşlanmada AHN'nin bozulmasının,niş 1,2,3,9 içindeki çevre hücrelere atfedilebileceğini göstermektedir. Özellikle, astrositler ve oligodendrositler AHN'nin kilit düzenleyicileri olarak ortaya çıkmaktadır; Bununla birlikte, RNA dizilimi ile birleştiğinde DG'den izole edilmeleri karışık sonuçlar üretmiş ve bu hipotezin bu teknikle değerlendirilmesini zorlaştırmıştır 1,17. FACS'ın NeuN-negatif çekirdekleri sıralama yaklaşımı, FACS-sıralanmamış örneklere kıyasla daha fazla astrosit ve oligodendrositin izolasyonuna izin verdi ve bu da daha iyi biyoinformatik analiz sağladı. Bu protokol yaşam boyu her yaşta uygulanabilir ve burada yaşlı hayvanlardan elde edilen dokularla sunulan temsili veriler, bu yöntemin yaşlanan hipokampal nörojenik nişi araştırmak için sağlam olduğuna dair bir kavram kanıtı sağlar. Bu yöntemin kullanımını genişletmek ve farklı biyolojik sorulara uyarlamak için, diğer nöronal nükleer membran antijenlerinin, bu belirteçler için en iyi doğrulanmış antikorların kapsamlı bir titrasyonuyla birlikte test edilebileceğini düşünmek önemlidir. Örneğin, DG'deki NSC'lerden nöronal farklılaşma sürecini incelerken, tip 2 hücreler veya nöroblastlar gibi bazı hücre tipleri NeuN'yi eksprese etmeye başlar (Ek Şekil 3). Bu nedenle, bu hücre tiplerini spesifik olarak araştırmak için başka bir antijene ihtiyaç duyulacaktır. Tersine, bu çalışmada, muhtemelen bu popülasyonlarda NeuN'un düşük ekspresyonuna veya hiç ekspresyonuna bağlı olarak NeuN-negatif FACS-sıralamasından sonra bazı nöronlar hala tanımlanmıştır (örneğin, Kortikal Cajal-Retzius nöronları19). Ek olarak, NeuN'nin oligodendrositler26'nın alt popülasyonlarında eksprese edildiği bildirilmiştir, bu da bu alt popülasyonların ilgi çekici olması durumunda önyargılı sonuçlar verebilir. Bu nedenle, FAN'ları kullanmaya başlarken antijen seçimi, belirli bir biyolojik soruya doğru bir cevabı engelleyecek hücre popülasyonlarının dahil edilmesini veya dışlanmasını önlemek için dikkatlice düşünülmelidir. Bununla aynı fikirde, test edilen hipotezi bu protokolle doğrulamadan veya çürütmeden önce, her bir dizileme sonucunun ortogonal tahlillerle (örneğin, immünohistokimya veya RNA kapsamı) daha da doğrulanması önerilir. Son olarak, FAN'ları içeren adım, istenen hücre popülasyonlarını dışlamak ve / veya dahil etmek için daha ayrıntılı bir sıralama stratejisine sahip birden fazla antikor içerecek şekilde daha da geliştirilebilir.
Nihayetinde, bu protokolde açıklanan teknolojilerin diğer türlerle birlikte kullanıldığında bazı sınırlamaları olabilir. Örneğin, niş, proliferatif ve sessiz NSC'lerin veya DG'nin belirli alt bölgelerinde kısıtlanmış yeni doğmuş nöronların varlığı ile kemirgenlerde çok iyi tanımlanmıştır, ancak hipokampal nörojenik nişin diğer türlerde nasıl tanımlanması gerektiği hala açık değildir. Gerçekten de, proliferatif hücreler, insan olmayan primatlarda ve insanlarda DG'nin sürekli bir bölgesi içinde hizalanmaz, aksine etrafına dağılmıştır ve amigdala7'de de bulunabilir. Bu nedenle, diğer türlerde DG'den daha geniş alanların parçalara ayrılması ve izole edilmesi, bu protokolün kullanımını potansiyel olarak etkileyecektir. Özellikle, dokunun hazırlanması için ayrışma ve tritürasyon adımlarının, daha büyük doku parçalarıyla çalışırken optimize edilmesi gerekecektir27,28. Biyoinformatik analizle ilgili olarak, inbreed barındırılan kemirgenler çok homojen ve çok iyi açıklamalı bir genoma sahipken, insan genomunun genetik değişkenliği, farklı hücre popülasyonlarını (örneğin, NSC'ler ve astrositler) açıkça ayırt etmek için yetersiz sayıda hücresel belirteçle birleştiğinde, küçük bir hücre kümesi tanımlandığında farklı sonuçlara yol açabilecek analiz için çok fazla normalizasyon gerektirir7, 11. Bu gibi durumlarda, hücre zenginleştirme hala tercih edilen bir seçenek olabilir veya analitik gücü artırmak için diğer stratejilerle birlikte kullanılmalıdır.
Bununla birlikte, mevcut yaklaşım, AHN'nin düzenlenmesinde potansiyel olarak önemli hücre popülasyonlarının az çalışılmış olmasına rağmen rolünün araştırılmasını sağlayabilir. Bu, özellikle nörodejeneratif hastalıkların başlangıcında ve ilerlemesinde merkezi bir rol oynayan astrosit popülasyonları için geçerli olabilir29,30. Bu çalışma, astrositlerin ve diğer nadir hücre popülasyonlarının, DG içinde bulunan nöronların büyük çoğunluğunu dışlayarak tanımlanabileceğini ve profillenebileceğini göstermiştir. Farklı yaklaşımlar kullanan diğer çalışmalar, aynı hücre popülasyonuaralığından çekirdeklerin benzer şekilde geri kazanılmasını sağlayamamıştır 5,11,17. Dahası, bu çalışmanın sonuçları, bu hücre popülasyonunun spesifik olarak zenginleştirilmeden bir NSC kümesini izole etmek için bu yaklaşımı kullanmanın mümkün olduğunu göstermektedir15.
Sonuç olarak, bu yöntemi takip etmek ve geliştirmek, AHN'nin modülasyonu için hipokampal nörojenik nişin bağlamsal rolü ile ilgili olağanüstü soruları ele almak için ileriye doğru atılmış bir adım olacaktır. Özellikle, AHN9'un düzenlenmesiyle ilişkili hücre popülasyonlarındaki yaşlı ve hastalıklı beyinlerdeki gen ekspresyon seviyelerine yeni bakış açıları getirebilir, NSC'lerin1'in potansiyel bir heterojenliğinin tanımlanmasını destekleyebilir veya AHN'deki vaskülatürün rolünü ele alabilir. Sonuçta, bu yöntem benzer soru ve sorunları olan diğer yetişkin kök hücre nişleri için uyarlanabilir.
Disclosures
SG, TL ve SK, ABD ve Kanada dışında MSD olarak bilinen Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, ABD'nin bir yan kuruluşu olan Merck Sharp & Dohme LLC'nin çalışanlarıdır. SG, Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, ABD'nin hissedarıdır.
Acknowledgments
Yazarlar, teknik destek için Lachlan Harris ve Piero Rigo'ya ve makale hakkında geri bildirim sağlayan Jason M. Uslaner ve Ditte Lovatt'a teşekkür eder. Bu çalışma, MRC'den hibe desteği ve MSD, Francis Crick Enstitüsü ile rekabet öncesi araştırma işbirliği ile desteklendi ve finansmanını Cancer Research UK (FC0010089), İngiltere Tıbbi Araştırma Konseyi (FC0010089), Wellcome Trust (FC0010089) ve FG'ye Wellcome Trust Araştırmacı Ödülü (106187 / Z / 14 / Z) tarafından alındı. Yer darlığı nedeniyle çalışmalarını tartışamadığımız ve alıntı yapamadığımız birçok yazardan özür dileriz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5ml microtube | Eppendorf | 30124537 | |
| 10.00µm Flouresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 15700-10 | |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 2 pairs of sterile Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma Aldrich | D9564-10MG | |
| 4150 TapeStation System | Agilent | N/A | |
| 5 mL round bottom high clarity polypropylene test tube with snap cap | Falcon | 352063 | |
| 5 mL round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | Falcon | 352235 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430829 | |
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 8 peak SPHERO Rainbow Calibration Particles | BD Biosciences | RCP-30-5A | |
| Accudrop Beads | BD Biosciences | N/A | |
| Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | N/A | |
| Anti-NeuN antibody, clone A60, Alexa Fluor 488 conjugated | Millipore | MAB377X | |
| BD FACSAria Fusion Flow Cytometer | BD Biosciences | N/A | |
| Beckman Coulter MoFlo XDP | Beckman Coulter | N/A | |
| Chromium Controller | 10x Genomics | N/A | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 | 10x Genomics | PN-1000121; PN-1000120; PN-1000213 | |
| BSA 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0861 | |
| Dounce tissue grinder set: mortar, loose pestle (A) and tight pestle (B) | KIMBLE | D8938-1SET | |
| Eppendorf Tubes Protein LoBind 1.5ml | Eppendorf | 30108116 | |
| Halt, 100x Protease inhibitor | ThermoFisher | 78429 | |
| HiSeq 4000 Sequencing System | Illumina | N/A | Sequencing configuration: 28-8-0-91 |
| KCl | Any chemical supplier | Laboratory made | |
| LUNA-FX7 Automated Cell counter | Logos Biosystems | N/A | |
| MgCl2 | Any chemical supplier | Laboratory made | |
| N°10 guarded sterile disposable scalpels | Swann-Morton | 6601 | |
| Nuclease-free water | Sigma Aldrich | W4502-1L | |
| Pair of sterile student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-12 | |
| PBS | Any chemical supplier | Laboratory made | |
| RNase Inhibitor 40 U µl-1 | Ambion | AM2684 | |
| RNasin 40 U µl-1 | Promega | N211A | |
| Sterile Petri dish | Corning | 430167 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 59378-500G | |
| Tris buffer, pH 8.0 | Any chemical supplier | Laboratory made | |
| Triton X-100 10% (v/v) | Sigma Aldrich | T8787-250ML | |
| Trypan blue | Invitrogen | T10282 |
References
- Gillotin, S. Targeting impaired adult hippocampal neurogenesis in ageing leveraging intrinsic mechanisms regulating neural stem cell activity. Ageing Research Reviews. 71, 101447 (2021).
- Urban, N., Blomfield, I. M., Guillemot, F. Quiescence of adult mammalian neural stem cells: A highly regulated rest. Neuron. 104 (5), 834-848 (2019).
- Hanspal, M. A., Gillotin, S. A new age in understanding adult hippocampal neurogenesis in Alzheimer's disease. Neural Regeneration Research. 17 (12), 2615-2618 (2022).
- Zhang, H., et al. Single-nucleus transcriptomic landscape of primate hippocampal aging. Protein & Cell. 12 (9), 695-716 (2021).
- Franjic, D., et al. Transcriptomic taxonomy and neurogenic trajectories of adult human, macaque, and pig hippocampal and entorhinal cells. Neuron. 110 (3), 452-469 (2022).
- Moreno-Jimenez, E. P., Terreros-Roncal, J., Flor-Garcia, M., Rabano, A., Llorens-Martin, M. Evidences for adult hippocampal neurogenesis in humans. Journal of Neuroscience. 41 (12), 2541-2553 (2021).
- Sorrells, S. F., et al. Positive controls in adults and children support that very few, if any, new neurons are born in the adult human hippocampus. Journal of Neuroscience. 41 (12), 2554-2565 (2021).
- Zhou, Y., et al. Molecular landscapes of human hippocampal immature neurons across lifespan. Nature. 607, 527-533 (2022).
- Bonafina, A., Paratcha, G., Ledda, F. Deciphering new players in the neurogenic adult hippocampal niche. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 548 (2020).
- Amaral, D. G., Scharfman, H. E., Lavenex, P. The dentate gyrus: fundamental neuroanatomical organization (dentate gyrus for dummies). Progress in Brain Research. 163, 3-22 (2007).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- Flor-Garcia, M., et al. Unraveling human adult hippocampal neurogenesis. Nature Protocols. 15 (2), 668-693 (2020).
- Moreno-Jimenez, E. P., et al. Adult hippocampal neurogenesis is abundant in neurologically healthy subjects and drops sharply in patients with Alzheimer's disease. Nature Medicine. 25 (4), 554-560 (2019).
- Kalinina, A., Lagace, D. Single-cell and single-nucleus RNAseq analysis of adult neurogenesis. Cells. 11 (10), 1633 (2022).
- Harris, L., et al. Coordinated changes in cellular behavior ensure the lifelong maintenance of the hippocampal stem cell population. Cell Stem Cell. 28 (5), 863-876 (2021).
- Shin, J., et al. Single-cell RNA-seq with Waterfall reveals molecular cascades underlying adult neurogenesis. Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).
- Artegiani, B., et al. A single-cell RNA sequencing study reveals cellular and molecular dynamics of the hippocampal neurogenic niche. Cell Reports. 21 (11), 3271-3284 (2017).
- Nott, A., Schlachetzki, J. C. M., Fixsen, B. R., Glass, C. K. Nuclei isolation of multiple brain cell types for omics interrogation. Nature Protocols. 16 (3), 1629-1646 (2021).
- Sarnat, H. B., Nochlin, D., Born, D. E. Neuronal nuclear antigen (NeuN): a marker of neuronal maturation in early human fetal nervous system. Brain Development. 20 (2), 88-94 (1998).
- Guidance on the Operation of ASPA. , Available from: https://assets.publishing.service.gov.uk/government/uploads/system/uploads/attachment_dat/file/662364/Guidance_on_the_Operation_of_ASPA.pdf (2022).
- Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (33), e1543 (2009).
- Habib, N., et al. Disease-associated astrocytes in Alzheimer's disease and aging. Nature Neuroscience. 23 (6), 701-706 (2020).
- Ding, J., et al. Systematic comparison of single-cell and single-nucleus RNA-sequencing methods. Nature Biotechnology. 38 (6), 737-746 (2020).
- Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
- Mussa, Z., Tome-Garcia, J., Jiang, Y., Akbarian, S., Tsankova, N. M. Isolation of adult human astrocyte populations from fresh-frozen cortex using fluorescence-activated nuclei sorting. Journal of Visualized Experiments. (170), e62405 (2021).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Marti-Mengual, U., Varea, E., Crespo, C., Blasco-Ibanez, J. M., Nacher, J. Cells expressing markers of immature neurons in the amygdala of adult humans. European Journal of Neuroscience. 37 (1), 10-22 (2013).
- Zhang, X. M., et al. Doublecortin-expressing cells persist in the associative cerebral cortex and amygdala in aged nonhuman primates. Frontiers in Neuroanatomy. 3, 17 (2009).
- Ding, Z. B., et al. Astrocytes: a double-edged sword in neurodegenerative diseases. Neural Regeneration Research. 16 (9), 1702-1710 (2021).
- Phatnani, H., Maniatis, T. Astrocytes in neurodegenerative disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (6), 020628 (2015).
