Summary
Ici, nous décrivons une nouvelle méthode de cytométrie en flux pour l’isolement prospectif des progéniteurs érythroïdes unitaires formant des éclatements précoces (BFU-e) et érythroïdes formant colonie (CFU-e) directement à partir de moelle osseuse et de rate fraîches de souris. Ce protocole, développé sur la base de données transcriptomiques unicellulaires, est le premier à isoler tous les progéniteurs érythroïdes du tissu avec une grande pureté.
Abstract
Les premiers progéniteurs érythroïdes ont été définis à l’origine par leur potentiel de formation de colonies in vitro et classés en « unités » formant des éclatements et des colonies connues sous le nom de BFU-e et CFU-e. Jusqu’à récemment, il n’existait pas de méthodes pour l’isolement prospectif direct et complet des progéniteurs BFU-e et CFU-e purs de la moelle osseuse de souris adulte fraîchement isolée. Pour combler cette lacune, un ensemble de données monocellulaire RNA-seq (scRNAseq) de moelle osseuse de souris a été analysé pour l’expression de gènes codant pour des marqueurs de surface cellulaire. Cette analyse a été combinée à des essais de devenir cellulaire, ce qui a permis le développement d’une nouvelle approche cytométrique en flux qui identifie et permet l’isolement de sous-ensembles complets et purs de progéniteurs BFU-e et CFU-e dans la moelle osseuse ou la rate de souris. Cette approche identifie également d’autres sous-ensembles de progéniteurs, y compris des sous-ensembles enrichis en potentiels basophiles/mastocytes et mégacaryocytaires. La méthode consiste à marquer des cellules fraîches de la moelle osseuse ou de la rate avec des anticorps dirigés contre Kit et CD55. Les progéniteurs qui expriment ces deux marqueurs sont ensuite subdivisés en cinq populations principales. La population 1 (P1 ou UFC-e, Kit+ CD55+ CD49f med/CD105 faible/CD71 élevé/élevé) contient tous les progéniteurs de l’UFC-e et peut être subdivisée en P1-faible (CD71med CD150 élevé) et P1-hi (CD71 élevé CD150faible), correspondant respectivement au début et à la fin de l’UFC-e; La population 2 (P2 ou BFU-e, Kit+ CD55+ CD49fmed/CD105 faible/CD71élevé faible CD150) contient tous les progéniteurs BFU-e; La population P3 (P3, Kit+ CD55+ CD49f med/CD105élevé/CD150 faibleCD41 faible) est enrichie pour les progéniteurs basophiles/mastocytes; La population 4 (P4, Kit+ CD55+ CD49fmed/CD105 élevé/CD150faible à CD41+) est enrichie en progéniteurs mégacaryocytaires; et la population 5 (P5, Kit+ CD55+ CD49fmed/CD105 élevé/CD150faible CD41-) contient des progéniteurs à potentiel érythroïde, basophile/mastocytes et mégacaryocytaire (EBMP) et érythroïdes/mégacaryocytaires/basophiles. Cette nouvelle approche permet une plus grande précision lors de l’analyse des progéniteurs érythroïdes et autres progéniteurs hématopoïétiques et permet également de faire référence à des informations de transcriptome pour chaque population définie cytométriquement en flux.
Introduction
L’érythropoïèse peut être divisée en deux phases principales : l’érythropoïèse précoce et la différenciation érythroïde terminale (Figure 1)1,2,3. Dans l’érythropoïèse précoce, les cellules souches hématopoïétiques s’engagent dans la lignée érythroïde et donnent naissance à des progéniteurs érythroïdes précoces, qui ont été identifiés pour la première fois dans les années 1970 en fonction de leur potentiel de formation de colonies en milieu semi-solide 4,5,6,7,8,9 . En gros, les progéniteurs érythroïdes sont divisés en deux catégories: les progéniteurs antérieurs qui donnent chacun lieu à un « éclatement » (un grand agrégat de petits amas de cellules érythroïdes), appelé « unité érythroïde formant un éclatement » ou BFU-e 4,5,6; et leur descendance, qui forment chacune un seul petit amas de cellules érythroïdes ou une seule colonie, appelée « unité érythroïde formant colonie » ou UFC-e 7,8,9. BFU-e et CFU-e n’expriment pas encore de gènes érythroïdes terminaux et ne sont pas morphologiquement reconnaissables. Après un certain nombre de divisions cellulaires d’auto-renouvellement ou d’expansion, l’UFC-e subit un commutateur transcriptionnel dans lequel des gènes érythroïdes tels que les globines sont induits, passant ainsi à la différenciation terminale érythroïde (ETD)1,10. Au cours de l’ETD, les érythroblastes subissent trois à cinq divisions cellulaires de maturation avant d’énucléer pour former des réticulocytes qui mûrissent en globules rouges.
Les érythroblastes au cours de la différenciation terminale ont été classés à l’origine en fonction de leur morphologie en proérythroblastes, basophiles, polychromatiques et orthochromatiques. L’avènement de la cytométrie en flux a permis leur tri prospectif et leur isolement en fonction de la taille des cellules (mesurée par diffusion directe, FSC) et de deux marqueurs de surface cellulaire, CD71 et Ter11911,12,13 (Figure 1). Cette approche et des approches similaires de cytométrie en flux 14 ont révolutionné l’étude des aspects moléculaires et cellulaires de l’ETD, permettant une analyse spécifique au stade de développement des érythroblastes in vivo et in vitro 10,15,16,17,18,19,20. L’approche CD71/Ter119 est maintenant couramment utilisée dans l’analyse des précurseurs érythroïdes.
Jusqu’à récemment, une approche cytométrique en flux similaire et accessible pour l’isolement prospectif direct et de haute pureté de CFU-e et BFU-e à partir de tissus de souris a échappé aux chercheurs. Au lieu de cela, les chercheurs ont utilisé des stratégies de cytométrie en flux qui n’isolent qu’une fraction de ces progéniteurs, souvent en présence de cellules non érythroïdes qui co-purifient dans les mêmes sous-ensembles cytométriquesen flux 21. Par conséquent, l’étude de BFU-e et CFU-e s’est limitée aux systèmes de différenciation in vitro qui dérivent et amplifient BFU-e et CFU-e à partir de progéniteurs antérieurs de la moelle osseuse. Il est alors possible d’appliquer des stratégies de cytométrie en flux qui distinguent CFU-e de BFU-e dans ces cultures enrichies en progéniteurs érythroïdes22,23. Une autre approche utilise l’UFC-e et l’UFB-e fœtales, qui sont hautement enrichies en la fraction Ter119-négative du foie fœtal de souris au milieu de la gestation 10,24,25. Cependant, aucune de ces approches ne permet d’étudier l’état physiologique in vivo de l’UFC-e et de l’UFC-e chez l’adulte. L’ampleur du défi peut être appréciée si l’on se souvient que, sur la base des essais de formation de colonies, ces cellules sont présentes dans la moelle osseuse adulte à une fréquence de seulement 0,025% et 0,3%, respectivement6.
Le protocole décrit ici est une nouvelle approche de cytométrie en flux basée sur l’analyse transcriptomique unicellulaire de cellules de moelle osseuse de souris Kit+ fraîchement récoltées (Kit est exprimé par toutes les premières populations progénitrices de la moelle osseuse)1. Notre approche contient certains marqueurs de surface cellulaire qui étaient déjà utilisés par Pronk et al.21,26. Des transcriptomes unicellulaires ont été utilisés pour déterminer des combinaisons de marqueurs de surface cellulaire qui identifient les progéniteurs érythroïdes et autres progéniteurs hématopoïétiques précoces (Figure 2). Plus précisément, la fraction CD55+ des cellules Kit+ de lignée négative peut être subdivisée en cinq populations, dont trois produisent des segments contigus de la trajectoire érythroïde (figure 2). Les identités transcriptomiques de chacune de ces populations ont été confirmées par tri, suivi d’un scRNAseq et d’une projection des transcriptomes unicellulaires triés sur la carte transcriptomique originale (l’expression génique dans chacune des cinq populations et l’ensemble des données sur la moelle osseuse peuvent être explorés dans https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)1 . Le potentiel de devenir cellulaire de chacune des populations a été confirmé à l’aide d’essais traditionnels de formation de colonies (figure 2), ainsi que d’un nouveau test de devenir unicellulaire à haut débit 1,27. Ces analyses montrent que la nouvelle approche de cytométrie en flux permet d’isoler de haute pureté tous les progéniteurs BFU-e et CFU-e de la moelle osseuse et de la rate adultes fraîches. Plus précisément, la population 1 (P1) ne contient que l’UFC-e et aucun autre progéniteur hématopoïétique, et la population 2 (P2) contient tous les progéniteurs BFU-e de la moelle osseuse et un petit nombre d’UFC-e mais aucun autre progéniteur1. Le protocole détaillé ci-dessous est illustré par un exemple d’expérience chez des souris qui ont reçu une injection de solution saline ou de l’hormone stimulant l’érythropoïèse érythropoïétine (Epo).
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Protocol
Toutes les expériences ont été menées conformément aux protocoles animaux A-1586 et 202200017 approuvés par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’école de médecine Chan de l’Université du Massachusetts.
REMARQUE: Deux protocoles sont détaillés ici: premièrement, l’analyse cytométrique en flux (section 1), suivie des ajustements de protocole pour le tri cytométrique en flux (section 2). Le protocole ci-dessous utilise un cytomètre/trieur en flux à 10 canaux. Un exemple de configuration est fourni dans le tableau 1, référencé à l’étape 1.14.5. Il est également possible d’exécuter ce protocole avec seulement neuf canaux; voir la légende du tableau 2.
1. Analyse cytométrique en flux
- Euthanasier les souris adultes (âgées de >6 semaines) Balb/C ou C57BL6 en utilisant une méthode appropriée approuvée par votre comité de soin et d’utilisation des animaux en établissement (p. ex. inhalation de CO2 suivie d’une luxation cervicale). Pour l’analyse cytométrique en flux, la moelle osseuse (BM) d’une seule souris sera suffisante. Pour le tri, le nombre de souris dépend des applications en aval. Le rendement cellulaire pour chaque population est donné ci-dessous (étape 2.3.3).
- Prélèvement de tissus:
- Préparer 5 mL de tubes de tri cellulaire activés par fluorescence (FACS) contenant 3 mL de tampon de coloration à froid (4 °C) (« SB5 » : solution saline tamponnée au phosphate (PBS), 0,2 % d’albumine sérique bovine (BSA), 0,08 % de glucose, 5 mM d’EDTA) sur de la glace. Utilisez-le pour placer les tissus récoltés.
- Préparez des tubes séparés pour chaque tissu disséqué de chaque souris. Ne mettez pas en commun les tissus de plusieurs souris.
- Récoltez les deux fémurs et les deux tibias. Retirez tous les muscles des os avant de les placer dans le tube avec SB5.
- Disséquer la rate à travers une incision sur le côté gauche de l’abdomen.
- Extraction de cellules de la moelle osseuse :
- Placez les fémurs et les tibias fraîchement disséqués directement dans un tampon de coloration à froid (SB5) et gardez les tubes sur la glace jusqu’à ce qu’ils soient prêts à extraire la moelle osseuse (BM). Placez un mortier stérilisé propre sur de la glace dans un seau. Transférer les os dans le mortier avec le SB5 du tube.
- Couper environ 1 mm des extrémités de chaque os avec des ciseaux à dissection afin que l’orifice de l’os devienne juste visible.
- Utilisez une aiguille de 26 g et une seringue de 3 ml remplie de SB5 pour rincer la moelle osseuse et la recueillir dans le mortier. Répétez le processus 3 à 5 fois en utilisant un tampon frais à chaque fois jusqu’à ce que les os apparaissent incolores.
- Filtrer la moelle rincée à travers un filtre à mailles de 100 μm et recueillir les cellules dans un tube à centrifuger de 50 ml placé sur de la glace.
- Utilisez le mortier et le pilon pour écraser les os rincés dans 5 à 10 ml de SB5. Filtrer le mélange d’os broyés et de tampon à travers la crépine cellulaire de 100 μm et mettre en pool avec les cellules collectées à l’étape 1.3.4.
- Extraction des cellules de la rate :
- Installez un filtre à mailles de 100 μm sur un tube centrifuge vide de 50 ml placé sur de la glace. Placez une seule rate sur le filtre à mailles.
- Ajouter 0,5-1 mL de SB5 à la rate pour s’assurer qu’elle ne sèche pas.
- À l’aide du côté en caoutchouc d’un piston de seringue de 3 ml ou 5 ml, écraser la rate à travers le filet. Ajouter plus de SB5, 5 ml à la fois, et continuer à écraser jusqu’à ce que toutes les cellules aient été recueillies dans le tube.
- À partir de ce moment, la moelle osseuse et les cellules spléniques sont traitées de la même manière.
- Faites tourner les cellules vers le bas à 900 x g, 4 °C pendant 10 min. Aspirer le surnageant à l’aide d’une configuration d’aspiration intra-utérine.
- Pour fabriquer une suspension unicellulaire, remettre les cellules en suspension dans 2 mL de SB5 et pipeter 50 fois de haut en bas à l’aide d’un P1000 avec une grande pointe d’orifice (voir le tableau des matériaux). Ceux-ci ont de larges ouvertures d’extrémité pour aider à prévenir les dommages aux cellules fragiles.
- Pour compter les cellules, remettez en suspension en tuytant de haut en bas 20 fois. Diluer les cellules dans un rapport de 1:100 dans SB5. Mélanger 10 μL de cellules diluées avec 10 μL de bleu de trypan et compter sur un hémocytomètre et/ou un compteur cellulaire.
- Faites tourner les cellules vers le bas à 900 x g, 4 °C pendant 10 min. Aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension à 33 x 106 cellules vivantes/ml dans SB5.
- Préparer le cocktail Lin-FITC en mélangeant des volumes égaux de chaque anticorps dans le tableau 3.
- Préparez les cellules pour les contrôles monochromes et les contrôles « Fluorescence moins un » (FMO). Effectuer les étapes 1.11-1.12 en parallèle de la préparation et de la coloration des cellules de l’échantillon à l’étape 1.14 (échantillons pour analyse cytométrique en flux) et/ou à l’étape 2.1 (tri cytométrique en flux).
- Préparer les cellules pour un contrôle cellulaire non coloré en transférant 50 μL (1,6 x 106 cellules) de la suspension cellulaire dans un tube FACS sur glace. Préparez les cellules pour chaque contrôle de couleur (11 tubes) en transférant 50 μL (1,6 x 106 cellules) de la suspension cellulaire dans un tube FACS sur glace.
- Préparer les commandes FMO pour les couleurs suivantes (trousse, CD41, CD150, CD49f [quatre tubes]) en transférant 300 μL (10 x 106 cellules) de la suspension cellulaire dans un tube FACS séparé sur glace.
- Faites tourner les cellules à 900 x g, 4 °C pendant 10 min et aspirez le surnageant.
- Coloration par anticorps des FMO et des contrôles monocolores
- Colorer les FMO à 33 x 106 cellules/mL (dans un volume total de 300 μL) dans des tubes FACS. Pour chaque contrôle, ajoutez tous les anticorps à l’exception de l’anticorps homonyme du FMO. Par exemple, pour le Kit FMO, omettez l’anticorps Kit. Pour chaque anticorps, utiliser la dilution et la concentration finale comme indiqué dans le tableau 2.
- Colorer les témoins unicolores à 20 x 106 cellules/ml (dans un volume total de 50 μL) dans des tubes FACS; pour chaque témoin, ajouter un seul anticorps à la concentration indiquée dans le tableau 2.
- Vortex chaque tube de commande pendant 2-3 s à 3 000 tr/min (rotations par minute), puis incuber à 4 °C, en se balançant pendant 2,5 h dans l’obscurité, à l’abri de la lumière. Balancer les tubes avec un axe de rotation parallèle à la longueur du tube, entre environ un angle de 10° et 60° par rapport à l’horizontale, de sorte que le contenu ne touche pas le bouchon.
- Laver les cellules avec SB5: Compléter le volume de la suspension cellulaire à 4 mL avec SB5. Faites tourner les cellules à 900 x g, 4 °C pendant 10 min, et aspirez le surnageant.
- Suspension cellulaire :
- Remettez en suspension les commandes non colorées et toutes les commandes monochromes (à l’exception de la commande DAPI) dans 300 μL de SB5 et filtrez à travers un treillis filtrant de 40 μm dans un nouveau tube FACS.
- Fabriquer une solution DAPI/SB5 en diluant le stock de DAPI (1 mg/mL dans de l’éthanol à 100 %) à 1:10 000 dans du SB5.
- Resuspendre les FMO dans 1,8 mL de DAPI/SB5 et filtrer à travers un filtrage de 40 μm dans un nouveau tube FACS
- Remettez en suspension le contrôle monocolore DAPI dans 300 μL de DAPI/SB5 et filtrez à travers un treillis filtrant de 40 μm dans un nouveau tube FACS de 4 mL.
- Préparation de l’échantillon : Si les cellules sont préparées pour l’analyse cytométrique en flux, passez à l’étape 1.14. Si vous préparez les cellules pour le tri, passez à l’étape 2.1.
- Colorer les échantillons d’analyse cytométrique en flux à 33 x 10 6 cellules/mL dans un volume total de 300 μL (10 x 106 cellules) dans des tubes FACS:
- Préparez le mélange principal d’anticorps. Déterminer le volume du mélange maître par le nombre d’échantillons, avec 300 μL par échantillon. Préparer le mélange maître en diluant tous les anticorps énumérés dans le tableau 2 à la dilution indiquée dans SB5. Le Rabbit IgG dans le mélange principal sert de bloc Fc.
- Tourbillonner chaque tube pendant 2-3 s à 3 000 tr/min, puis incuber à 4 °C, en se balançant pendant 2,5 h dans l’obscurité, à l’abri de la lumière.
- Laver les cellules avec SB5: Compléter le volume de la suspension cellulaire à 4 mL avec SB5. Faites tourner les cellules à 900 x g, 4 °C pendant 10 min, et aspirez le surnageant.
- Resuspendre les échantillons pour analyse cytométrique en flux dans 1,8 mL de DAPI/SB5 tel que préparé à l’étape 1.12.5.2 et filtrer à travers un treillis filtrant de 40 μm dans un tube FACS.
- Analyser les échantillons sur un cytomètre à 10 canaux pour accueillir les conjugués d’anticorps du tableau 2 et le colorant de viabilité DAPI. Un exemple de configuration de canal est fourni dans le Tableau 1. Il est également possible de n’utiliser que neuf canaux; voir la légende du tableau 2 .
- Au cours de l’analyse des données de cytométrie en flux, utilisez des approches de compensation spectrale standard à l’aide des contrôles monocolores et des contrôles FMO, comme détaillé à l’étape 2.4.
2. Ajustements de protocole pour le tri cytométrique en flux
- Préparation de Lin-
- Regrouper toutes les cellules extraites du même tissu (BM ou rate) de 10 souris dans un tube de 50 mL. Remettez en suspension chaque échantillon groupé en pipetant à l’aide d’un P1000 avec une grande pointe d’orifice.
- Faites tourner les cellules à 900 x g, 4 °C pendant 10 min et aspirez le surnageant.
- Préparer des contrôles monochromes et FMO comme décrit à la section 1 à l’aide de cellules non enrichies.
- Enrichir les cellules Lin- pour le tri par enrichissement magnétique des cellules Lin:
- Remettez les cellules en suspension à 1 x 108 cellules/mL avec SB5 et transférez-les dans un tube de 15 mL. Ajouter le sérum normal pour rats et les anticorps biotinylés énumérés dans le tableau 4 et incuber à 4 °C pendant 1 h.
- Faites tourner les cellules vers le bas à 900 x g, 4 °C pendant 10 min et aspirez le surnageant. Remettez les cellules en suspension dans 15 mL de SB5 froid.
- Faites tourner les cellules vers le bas à 900 x g, 4 °C pendant 10 min et aspirez le surnageant. Remettez les cellules en suspension à 1 x 108 cellules/mL dans du SB5 froid et gardez-les sur de la glace.
- Vortex les nanobilles magnétiques à 3 000 tr/min pendant 5-10 s. Prendre 1 mL de nanobilles magnétiques pour 10 mL de cellules.
- Lavez les nanobilles dans un tube FACS de 5 mL. Porter le volume à 4 mL avec SB5, faire tourner à 900 x g, 4 °C pendant 5 min, et aspirer le surnageant.
- Resuspendre les nanobilles dans 500 μL de SB5 et mélanger avec les cellules préparées à l’étape 2.1.7. Incuber à 4 °C en berçant pendant 15 min.
- Faites tourner les cellules vers le bas à 900 x g, 4 °C pendant 10 min et aspirez le surnageant. Remettez les cellules en suspension à 1 x 108 cellules/ml avec SB5.
- Placez le tube sur un aimant à 4 °C pendant 5 min.
- Verser délicatement le surnageant dans un nouveau tube de 15 mL.
- Placer le tube contenant le surnageant de l’étape 2.1.13 sur un aimant à 4 °C pendant 5 min. Verser délicatement le surnageant dans un nouveau tube de 15 mL.
- Faire tourner les cellules du surnageant à l’étape 2.1.14 à 900 x g, 4 °C pendant 10 min, et aspirer le surnageant.
- Remettez en suspension les cellules enrichies en Lin dans 1 mL de SB5.
- Diluer 10 μL des cellules à 1:100 dans SB5. Mélanger 10 μL de cellules diluées avec 10 μL de bleu de trypan et compter sur un hémocytomètre et/ou un compteur cellulaire.
- D’après le nombre de cellules de l’étape 2.1.17, remettre en suspension les cellules enrichies en Lin à 33 x 106 cellules/mL.
- Coloration des cellules enrichies :
- Colorer les échantillons de cellules enrichies à 33 x 106 cellules/ml dans des tubes FACS en ajoutant tous les anticorps énumérés dans le tableau 2. Tourbillonner chaque tube pendant 2-3 s à 3 000 tr/min, puis incuber à 4 °C, en se balançant pendant 2,5 h dans l’obscurité, à l’abri de la lumière.
- Laver les cellules avec SB5: Compléter le volume des tubes FACS à 4 mL avec SB5. Faites tourner les cellules vers le bas à 900 x g, 4°C pendant 10 min, et retirez le surnageant.
- Resuspendre les échantillons pour analyse cytométrique en flux dans 4 à 6 mL de DAPI/SB5 tel que préparé à l’étape 1.12.5.2 et filtrer à travers un treillis filtrant de 40 μm dans un nouveau tube FACS de 4 mL.
- Tri des échantillons :
- Triez les échantillons avec une grande buse et une basse pression pour maximiser le rendement en UFC-e puisque les cellules CFU-e sont facilement endommagées sous haute pression. Pour le cytomètre en flux utilisé dans cette étude, utilisez 14 psi et une buse de 100 μm ou 12 psi avec une buse de 130 μm. Configurez les portes de tri comme décrit à l’étape 2.4 ci-dessous.
- Préparer le tampon de collecte : Ajouter 20 % de sérum fœtal bovin au PBS.
- Pour vérifier la pureté des populations triées, réexécutez une petite partie aliquote de chaque population triée dans une zone tampon contenant du DAPI, comme décrit à l’étape 1.12.5.2.
REMARQUE : En règle générale, la BM provenant d’un total de 10 souris (environ 1 x 109 cellules) donne au moins 50 000 à 100 000 cellules pour chacune des populations P1-hi, P1-faible et P2 avec une viabilité d’environ 70%.
- Utilisez la stratégie de contrôle illustrée à la figure 3 pour l’analyse ou la configuration des portes de tri.
- Utilisez le paramètre de diffusion directe (FSC) pour enlever les débris en fonction de leur taille. Utilisez l’histogramme de la hauteur FSC par rapport à la zone FSC pour exclure les agrégats de cellules et sélectionner des cellules individuelles; répétez l’opération avec l’histogramme de la hauteur de diffusion latérale (SSC) par rapport à l’histogramme de la zone SSC.
- Exclure les cellules mortes en excluant les cellules positives pour le colorant à ADN DAPI, auquel les cellules viables sont imperméables.
- Sélectionnez les cellules Lin-Ter119-Kit+ et, parmi celles-ci, sélectionnez une sous-population qui exprime CD55.
- Subdiviser les cellules Lin- Ter119-Kit+CD55+ en deux populations principales, P6 et P7, en fonction de l’expression de CD49f et CD105.
- Sur la base de l’expression de CD150 et CD41, subdiviser P6 en P3 (progéniteurs basophiles ou mastocytes), P4 (progéniteurs mégacaryocytaires) et P5 (EBMP et MPP érythroïde).
- Sur la base de l’expression de CD150 et CD71, subdiviser P7 en P2 (BFU-e), CFU-e précoce (P1-faible) et CFU-e tardif (P1-hi).
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Representative Results
Le protocole décrit une approche cytométrique en flux pour identifier les UFC-es et les UFC-es dans les cellules de moelle osseuse et de rate fraîchement récoltées. Cela commence par la récolte de BM fraîche et de rate de souris et la mise immédiatement du tissu sur la glace. Toutes les procédures sont effectuées dans le froid pour préserver la viabilité cellulaire. Les cellules sont marquées avec un cocktail d’anticorps « lignée » qui permet l’exclusion de toutes les cellules exprimant des marqueurs de lignées sanguines différenciées (le cocktail FITC-Lin, tableau 3, dans le cas de l’analyse cytométrique en flux ; ou l’enrichissement en billes magnétiques, tableau 4, pour les cellules de lignée négative). Les cellules sont également marquées avec des anticorps contre des marqueurs qui nous permettent de distinguer un certain nombre de populations progénitrices précoces au sein de la fraction cellulaire négative de la lignée. Le marquage est suivi d’un tri ou d’une analyse cytométrique en flux. L’approche du tri cytométrique en flux est similaire à celle de l’analyse cytométrique en flux, mais elle est précédée d’un enrichissement en billes magnétiques pour la fraction des cellules de Lin afin de réduire le temps et les dépenses liés au tri d’un grand nombre de cellules. Lors du tri des progéniteurs, BM est mis en commun à partir de plusieurs souris, le nombre dépendant de l’application en aval. En règle générale, la BM d’un total de 10 souris (environ 1 x 109 cellules) donne au moins 50 000-100 000 cellules pour chacune des populations P1-hi, P1-faible et P2 avec une viabilité d’environ 70%.
La principale différence entre les populations dérivées de la rate et de la BM identifiées par ce protocole est la fréquence beaucoup plus faible de la population P6 et de ses sous-populations, P4/P5/P3, dans les cellules dérivées de la rate.
À titre d’exemple d’analyse cytométrique en flux, l’effet de l’administration d’Epo chez la souris a été examiné. Epo se lie et active le récepteur Epo (EpoR), ce qui est essentiel pour l’érythropoïèse basale et accélérée dans des conditions de stress comme l’hypoxie. L’hypoxie stimule une augmentation des taux sanguins d’Epo 28,18, favorisant à son tour l’expansion de CFU-e 1,29 et des précurseurs érythroïdes.
De l’Epo (0,25 U/g de poids corporel) ou un volume égal de véhicule (solution saline) ont été injectés par voie sous-cutanée à des souris une fois toutes les 24 heures pendant 3 jours. Le BM et la rate ont été récoltés à 72 h. La stimulation de l’Epo a conduit à l’expansion des populations d’UFC-e précoces et tardives (P1-faible et P1-hi) dans le BM et la rate (Figure 4 et Figure 5).
Figure 1 : Deux phases principales de l’érythropoïèse définitive. L’érythropoïèse peut être divisée en une phase précoce, où les progéniteurs sont définis en fonction de leur potentiel de formation de colonies, et une phase ultérieure connue sous le nom de différenciation terminale érythroïde (ETD), où le stade érythroblastique est défini en fonction de la morphologie. Les techniques de cytométrie en flux ont permis l’isolement prospectif de stades érythroblastiques spécifiques au développement en utilisant FSC, Ter119 et CD71. En revanche, il n’existe pas de méthode équivalente pour isoler les progéniteurs BFU-e et CFU-e directement à partir de tissus de haute pureté. Notez que seule une fraction de la colonie BFU-e est montrée. La barre d’échelle s’applique à la fois aux colonies CFU-e et BFU-e. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Une nouvelle stratégie de cytométrie en flux pour isoler CFU-e et BFU-e directement des tissus. Ce manuscrit décrit un protocole pour identifier cinq nouvelles populations cytométriques en flux, P1 à P5, sur la base d’une analyse des données scRNAseq. (A) Projection graphique dirigée par force (« Spring plot ») de transcriptomes unicellulaires de moelle osseuse adulte Balb/C frais. Les couleurs indiquent le potentiel de devenir cellulaire prédit en fonction des informations transcriptomiques et de l’algorithme d’analyse de l’équilibre de population (PBA)1. Les régions du graphique qui correspondent à chacune des populations cytométriques en flux P1 à P5 sont indiquées. Les régions délimitées sont des approximations dessinées à la main des données originales, que l’on peut trouver dans Tusi et al.1. La correspondance a été confirmée en entreprenant scRNAseq de chacune des populations P1 à P5 triées1. E = érythroïde; Ba = progéniteurs basophiles ou mastocytes; Meg = progéniteurs mégacaryocytaires; Ly = Progéniteurs lymphocytaires; D = progéniteurs dendritiques; M = progéniteurs monocytaires; G = progéniteurs granulocytaires. (B) Essais de formation de colonies, retracés à partir de Tusi et al.1. Les populations P1 à P5 et les cellules CD55+ ont été triées comme décrit dans ce protocole, et chaque population a été plaquée pour les tests de formation de colonies pertinents. Les colonies érythroïdes ont été notées les jours indiqués. UF = unifocal; MF = multifocal; UFC-MK = unité formant colonie mégacaryocytaire; UFC-GM = unité granulocytaire/monocytaire formant des colonies; UFC-GEMM = unité formant colonie granulocytaire, érythroïde, monocytaire, mégacaryocytaire. (C) Marqueurs de surface cellulaire qui définissent chacune des cinq populations, ainsi que leur potentiel de devenir cellulaire. Le potentiel de devenir cellulaire est à la fois le résultat de l’information transcriptomique et des essais de devenir cellulaire, à la fois la formation de colonies et les essais de devenir unicellulaire 1,27. Il convient de noter que la population P1 a été divisée en fonction de l’expression du marqueur CD71 en P1-hi et P1-low1. D’après les données de Tusi et al.1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Stratégie de contrôle cytométrique en flux. La stratégie complète de points de contrôle pour les populations P1 à P5. La moelle osseuse (BM) ou la rate (SP) fraîchement récoltée d’une souris Balb/C injectée par voie sous-cutanée avec 100 μL de solution saline stérile à 0,9 % est d’abord fermée pour la population principale, en jetant les débris; ceci est suivi par la sélection de singulets, l’élimination des cellules mortes et le gating sur les cellules qui sont Ter119-négatif, lignée négative et express Kit. La subdivision ultérieure de Ter119-Lin-Kit+CD55+ en P6 et P7 est suivie par la subdivision finale en populations P1 à P5 (voir également la figure 2). Le canal Ter119 permet l’analyse des érythroblastes sur un même échantillon (en utilisant l’approche Ter119/CD7112). Cependant, un canal Ter119 séparé n’est pas essentiel pour ce protocole, et l’anticorps Ter119 peut être omis du mélange principal et inclus dans le cocktail Lin-FITC à la place. L’étape d’exclusion des cellules Ter119 positives n’est pas indiquée dans cette stratégie de gating. Les nombres sont des pourcentages de chaque porte dans l’histogramme affiché. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Analyse des progéniteurs érythroïdes précoces de la moelle osseuse et de la rate après stimulation Epo. Tracés cytométriques en flux représentatifs de moelle osseuse (BM) ou de rate (SP) fraîchement récoltée. Des souris Balb/C ont été injectées par voie sous-cutanée avec 0,25 U/g de poids corporel d’Epo ou avec un volume équivalent de solution saline. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Réponse des progéniteurs BM et rate à l’Epo in vivo. Statistiques sommaires montrant les changements dans le nombre absolu de cellules dans les populations P1 à P5 après injection d’Epo dans des cellules fraîchement récoltées (A) de moelle osseuse et (B) de rate ; *p = 0,02. Expérimentez comme décrit à la figure 4. n = 4 souris dans chaque groupe. Pour calculer le nombre absolu de cellules, la fréquence des cellules dans chaque population de BM ou de rate (à partir de la figure 4) a été multipliée par le nombre total de cellules BM ou rate prélevées sur chaque souris et divisée par le poids de la souris en grammes. Il convient de noter que seule l’UFC-e précoce dans le BM a atteint une signification statistique (p = 0,02), probablement une combinaison d’une dose relativement faible d’Epo et d’un petit nombre de souris dans chaque groupe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Réseau de détecteurs | PMT | Miroir dichroïque | Filtre passe-bande | Fluorophore détecté |
| Laser bleu (488 nm) | Un | 685LP | 695/40 | |
| B | 505LP | 530/30 | Lin-FITC (+Ter119-FITC) | |
| C | 488/10 | |||
| Laser violet (405 nm) | Un | 760LP | 800/80 | |
| B | 630LP | 660/20 | CD150-BV650 | |
| C | 595LP | 605/20 | CD41-BV605 | |
| D | 475LP | 525/20 | ||
| E | 450/50 | CD49f-BV421 | ||
| Laser rouge (640 nm) | Un | 755LP | 785/50 | cKit-APC-Cy7 |
| B | 700 LP | 720/30 | ||
| C | 675/14 | CD55-AF 647 | ||
| Laser UV (355 nm) | Un | 505LP | 525/20 | |
| B | 420LP | 450/50 | Le | |
| C | 379/28 | Ter119-BUV 395 | ||
| YG Laser (561 nm) | Un | 755LP | 780/60 | CD71-PE-Cy7 |
| B | 685LP | 710/50 | ||
| C | 635LP | 660/20 | ||
| D | 600LP | 610/20 | ||
| E | 570LP | 580/20 | CD105-PE |
Tableau 1 : Exemple de disposition des canaux dans un cytomètre LSRII. Le panel d’anticorps utilisés dans le protocole décrit et leur disposition dans le cytomètre en flux LSRII pour collecter les données.
| Réactif ou anticorps | Conjuguer | Conc. mère (mg/mL) | Facteur de dilution | Conc. final en suspension cellulaire (μg/mL) | Clone |
| DC71 | PE/Cy7 | 0.2 | 2000 | 0.1 | RI7217 |
| TER-119 | BUV395 | 0.2 | 100 | 2 | TER-119 |
| CD55 (DAF) | AF647 | 0.5 | 50 | 10 | RIKO-3 |
| CD105 | PE | 0.2 | 50 | 4 | MJ7/18 |
| CD150 (SLAM) | BV650 | 0.1 | 50 | 2 | TC15-12F12.2 |
| CD49f | BV421 | 0.025 | 50 | 0.5 | GoH3 |
| DC41 | BV605 | 0.2 | 100 | 2 | MWReg30 |
| CD117 (cKit) | APC/Cy7 | 0.2 | 200 | 1 | 2B8 |
| Cocktail Lin | FITC | 0,08 (pour chaque anticorps du cocktail) | 83 | 1 (pour chaque anticorps du cocktail) | |
| IgG de lapin | 10 | 50 | 200 |
Tableau 2 : Composants du mélange maître d’anticorps. Composition du mélange maître d’anticorps. Le canal Ter119 permet l’analyse des érythroblastes sur un même échantillon (en utilisant l’approche Ter119/CD7112). Cependant, un canal Ter119 séparé n’est pas essentiel pour ce protocole, et l’anticorps Ter119 peut être omis du mélange principal et inclus dans le cocktail Lin-FITC à la place.
| Réactif ou anticorps | Conjuguer | Conc. mère (mg/mL) | Clone |
| Ly-6G et Ly-6C | FITC | 0.5 | RB6-8C5 |
| CD11b | FITC | 0.5 | M1/70 |
| CD19 | FITC | 0.5 | 1D3 |
| CD4 | FITC | 0.5 | RM4-5 |
| CD8a | FITC | 0.5 | 53-6.7 |
| F4/80 | FITC | 0.5 | BM8 |
Tableau 3 : Composants du cocktail Lin. Composition du cocktail Lin utilisé dans le cadre du mélange maître d’anticorps (voir les détails du mélange maître dans le tableau 2).
| Réactif ou anticorps | Conjuguer | Conc. mère (mg/mL) | Facteur de dilution | Conc. final en suspension cellulaire (μg/mL) | Clone |
| Ly-6G et Ly-6C | Biotine | 0.5 | 200 | 2.5 | RB6-8C5 |
| CD11b | Biotine | 0.5 | 200 | 2.5 | M1/70 |
| CD19 | Biotine | 0.5 | 200 | 2.5 | 1D3 |
| CD4 | Biotine | 0.5 | 200 | 2.5 | RM4-5 |
| CD8a | Biotine | 0.5 | 200 | 2.5 | 53-6.7 |
| F4/80 | Biotine | 0.5 | 200 | 2.5 | BM8 |
| TER-119 | Biotine | 0.5 | 200 | 2.5 | TER-119 |
| Sérum de rat normal | 50 |
Tableau 4 : Anticorps pour l’enrichissement des billes magnétiques. Anticorps utilisés pour enrichir la fraction Lin- du BM ou de la rate avant le tri cellulaire.
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Discussion
La capacité d’isoler prospectivement les progéniteurs BFU-e et CFU-e directement à partir de tissus frais de haute pureté avait auparavant échappé aux chercheurs. Notre nouvelle approche, validée à l’aide de scRNAseq et des essais de destin cellulaire 1,27, offre maintenant les outils pour y parvenir.
Il existe un certain nombre de points clés pour exécuter avec succès les protocoles de tri et d’analyse. Tout d’abord, les cellules doivent être filées à 900 x g pour éviter la perte de cellules de faible densité. De nombreuses cellules au stade UFC-e sont de grandes cellules de faible densité qui pourraient autrement être perdues. Deuxièmement, il est nécessaire d’utiliser de grandes pointes d’orifice lors du pipetage de haut en bas pour aider à briser les agrégats cellulaires et prévenir la perte de cellules P1 et P2 fragiles. Cette étape est importante car de nombreux progéniteurs de l’UFC-e sont associés aux macrophages des îles érythroblastiques (EBI) et seraient perdus s’ils ne réussissaient pas à se dissocier. Troisièmement, les cellules sont incubées avec un tampon contenant de l’EDTA (« SB5 ») avant la coloration, ce qui aide à dissocier les EBI. Quatrièmement, lors de l’acquisition des données cytométriques en flux, le taux d’acquisition ne doit pas dépasser 7 000 événements/s ou le taux recommandé pour l’instrument de cytomètre en flux utilisé.
Les populations P1 et P2 contiennent tous les progéniteurs CFU-e et BFU-e dans la moelle osseuse, respectivement, et ne contiennent aucun autre type de cellules progénitrices1. La population de P1 est subdivisée en UFC-e précoce (P1-faible) et UFC-e tardive (P1-hi) en fonction de l’expression de CD711. Ces populations cytométriques en flux très pures fournissent une image complète des populations de progéniteurs BFU-e et CFU-e in vivo.
Un inconvénient est que la population P2 contient une petite fraction des premiers progéniteurs CFU-e. Il contient cependant toutes les cellules BFU-e du BM et aucun autre type de cellule. La population P1 contient toute l’UFC-e dans le BM, à l’exception de la petite fraction présente dans P2. Contrairement aux populations P1 et P2, les populations P3 à P5 sont des populations progénitrices fortement enrichies, mais non pures.
L’application de cet outil de cytométrie en flux à des modèles murins d’érythropoïèse permettrait désormais de déterminer les réponses cellulaires et moléculaires lors de perturbations physiologiques et pathologiques de l’érythropoïèse. Dans l’exemple montré, des souris ont été injectées avec l’hormone Epo. Cette approche peut être utilisée chez des souris génétiquement modifiées, par exemple dans des modèles murins d’hémoglobinopathies, pour une analyse moléculaire plus précise de leurs progéniteurs érythroïdes altérés in vivo.
DISPONIBILITÉ DES DONNÉES :
Des données supplémentaires associées aux expériences de la figure 4 et de la figure 5 sont disponibles sur demande.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu par les subventions NIH R01DK130498, R01DK120639 et R01HL141402
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575020 | |
| 1000 µL large orifice tips | USA sceintific | 1011-9000 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD55 (DAF) Antibody | BioLegend | 131806 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) Antibody | BioLegend | 105826 | |
| Biotin-CD11b | BD Biosciences | 557395 | M1/70 (clone) |
| Biotin-CD19 | BD Biosciences | 553784 | 1D3 (clone) |
| Biotin-CD4 | BD Biosciences | BDB553045 | RM4-5 (clone) |
| Biotin-CD8a | BD Biosciences | BDB553029 | 53-6.7 (clone) |
| Biotin-F4/80 | Biolegend | 123106 | BM8 (clone) |
| Biotin-Ly-6G and Ly-6C | BD Biosciences | 553125 | RB6-8C5 (clone) |
| Biotin-TER-119 | BD Biosciences | 553672 | TER-119 (clone) |
| Bovine Serum Albumin | Sigma aldritch | A1470 | |
| Brilliant Violet 421 anti-human/mouse CD49f Antibody | BioLegend | 313624 | |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD41 Antibody | BioLegend | 133921 | |
| Brilliant Violet 650 anti-mouse CD150 (SLAM) Antibody | BioLegend | 115931 | |
| BUV395 Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells | BD Biosciences | 563827 | |
| ChromPure Rabbit IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 011-000-003 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306 | |
| Digital DIVA hardware and software for LSR II | BD Biosciences | ||
| FITC anti-mouse F4/80 Antibody | BioLegend | 123108 | |
| FITC Rat Anti-CD11b | BD Biosciences | 557396 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD19 | BD Biosciences | 553785 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD4 | BD Biosciences | 553047 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 553031 | |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and LY-6C | BD Biosciences | 553127 | |
| FlowJo software | FlowJo | version 10 | Flow cytometer analysis software |
| LSR II digital multiparameter flow cytometer analyzer | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| NewlineNY Stainless Steel Hand Masher & Bowl, Mortar and Pestle Set | Amazon | ||
| Normal rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| PE anti-mouse CD105 Antibody | BioLegend | 120408 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD71 Antibody | BioLegend | 113812 | |
| Phosphate Buffered Saline, 10x Solution | Fisher scientific | BP3994 | |
| Streptavidin Nanobeads | BioLegend | 480016 | Magnetic beads |
References
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