Summary
Her beskriver vi en ny flowcytometrisk metode for prospektiv isolering av tidlig burst-forming unit erythroid (BFU-e) og kolonidannende enhet erythroid (CFU-e) forfedre direkte fra fersk mus benmarg og milt. Denne protokollen, utviklet basert på enkeltcellede transkriptomiske data, er den første som isolerer alle vevets erytroidprogenitorer med høy renhet.
Abstract
Tidlige erytroid-forfedre ble opprinnelig definert av deres kolonidannende potensial in vitro og klassifisert i burst-forming og kolonidannende "enheter" kjent som BFU-e og CFU-e. Inntil nylig var metoder for direkte prospektiv og fullstendig isolering av rene BFU-e og CFU-e forfedre fra nyisolert voksen mus benmarg tilgjengelig. For å løse dette gapet ble et enkeltcellet RNA-seq (scRNAseq) datasett av musebenmarg analysert for ekspresjon av gener som koder for celleoverflatemarkører. Denne analysen ble kombinert med celleskjebneanalyser, noe som gjorde det mulig å utvikle en ny flowcytometrisk tilnærming som identifiserer og tillater isolering av komplette og rene undergrupper av BFU-e og CFU-e forfedre i musebenmarg eller milt. Denne tilnærmingen identifiserer også andre stamcelleundergrupper, inkludert delmengder beriket for basofil / mastcelle og megakaryocytiske potensialer. Metoden består av merking av ferske benmargs- eller miltceller med antistoffer rettet mot Kit og CD55. Forfedre som uttrykker begge disse markørene blir deretter delt inn i fem hovedpopulasjoner. Populasjon 1 (P1 eller CFU-e, Kit+ CD55+ CD49f med/low CD105 med/high CD71 med/high) inneholder alle CFU-e forfedrene og kan videre deles inn i henholdsvis P1-low (CD71med CD150 high) og P1-hi (CD71 high CD150 low), tilsvarende henholdsvis tidlig og sen CFU-e; Populasjon 2 (P2 eller BFU-e, Kit + CD55+ CD49f med/lav CD105med/høy CD71lav CD150høy) inneholder alle BFU-e forfedrene; Populasjon P3 (P3, Kit + CD55+ CD49f med/høy CD105med/lav CD150 lav CD41lav) er beriket for basofile/ mastcelleprogenitorer; Populasjon 4 (P4, Kit + CD55+ CD49f med/høy CD105med/lav CD150høy CD41+) er beriket for megakaryocytiske forfedre; og populasjon 5 (P5, Kit + CD55+ CD49f med/høy CD105 med/lav CD150høy CD41-) inneholder stamcellermed erytroid, basofil/mastcelle og megakaryocytisk potensiale (EBMP) og erytroide/megakaryocyttiske/basofil-forutinntatte multipotensielle stamceller (MPP). Denne nye tilnærmingen gir større presisjon ved analyse av erytroid og andre hematopoietiske forfedre og gir også mulighet for referanse til transkriptominformasjon for hver flowcytometrisk definert populasjon.
Introduction
Erytropoiesen kan deles inn i to hovedfaser: tidlig erytropoiese og erytroid terminal differensiering (figur 1)1,2,3. I tidlig erytropoiese forplikter hematopoietiske stamceller seg til erytroidlinjen og gir opphav til tidlige erytroidprogenitorer, som først ble identifisert på 1970-tallet basert på deres kolonidannende potensial i halvfast medium 4,5,6,7,8,9 . I stor grad er erytroide forfedre delt inn i to kategorier: tidligere forfedre som hver gir opphav til en "burst" (et stort aggregat av mindre erytroidcelleklynger), kalt "burst-forming unit erythroid" eller BFU-e 4,5,6; og deres avkom, som hver danner en enkelt, liten erytroidcelleklynge eller koloni, kalt "kolonidannende enhet erytroid" eller CFU-e 7,8,9. BFU-e og CFU-e uttrykker ennå ikke terminale erytroidgener og er ikke morfologisk gjenkjennelige. Etter en rekke selvfornyelses- eller ekspansjonscelledelinger gjennomgår CFU-e en transkripsjonsbryter der erytroidgener som globiner induseres, og går dermed over til erytroid terminal differensiering (ETD)1,10. Under ETD gjennomgår erytroblaster tre til fem modningscelledelinger før de enukleerer for å danne retikulocytter, som modnes til røde blodlegemer.
Erytroblaster under terminal differensiering ble opprinnelig klassifisert basert på deres morfologi i proerythroblaster, basofile, polykromatiske og ortokromatiske. Ankomsten av flowcytometri tillot deres prospektive sortering og isolasjon basert på cellestørrelse (målt ved fremoverspredning, FSC) og to celleoverflatemarkører, CD71 og Ter11911,12,13 (figur 1). Denne og lignende flowcytometriske tilnærminger14 har revolusjonert undersøkelsen av de molekylære og cellulære aspektene ved ETD, noe som tillater utviklingsstadiespesifikk analyse av erytroblaster in vivo og in vitro 10,15,16,17,18,19,20. CD71/Ter119-tilnærmingen brukes nå rutinemessig i analysen av erytroide forløpere.
Inntil nylig har en lignende, tilgjengelig flowcytometrisk tilnærming for direkte, høy renhet prospektiv isolering av CFU-e og BFU-e fra musevev unnsluppet etterforskere. I stedet har forskere brukt flowcytometriske strategier som isolerer bare en brøkdel av disse forfedrene, ofte i nærvær av ikke-erytroidceller som samrenser innenfor de samme flowcytometriske delmengdene21. Undersøkelsen av BFU-e og CFU-e var derfor begrenset til in vitro differensieringssystemer som utleder og forsterker BFU-e og CFU-e fra tidligere benmargsprogenitorer. Det er da mulig å anvende flowcytometriske strategier som skiller CFU-e fra BFU-e i disse erytroide forfedreberikede kulturene22,23. En alternativ tilnærming benytter seg av føtal CFU-e og BFU-e, som er svært beriket i Ter119-negativ fraksjon av musens fosterlever ved midten av svangerskapet 10,24,25. Ingen av disse tilnærmingene tillater imidlertid undersøkelse av voksen BFU-e og CFU-e i deres fysiologiske tilstand in vivo. Størrelsen på utfordringen kan bli verdsatt når man husker at disse cellene, basert på kolonidannelsesanalyser, er tilstede i den voksne benmargen med en frekvens på henholdsvis bare 0,025% og 0,3%, henholdsvis6.
Protokollen beskrevet her er en ny flowcytometrisk tilnærming basert på encellet transkriptomisk analyse av nyhøstede Kit + musebenmargceller (Kit uttrykkes av alle de tidlige stamcellepopulasjonene i benmargen)1. Vår tilnærming inneholder noen celleoverflatemarkører som allerede var i bruk av Pronk et al.21,26. Enkeltcelletranskriptomer ble brukt til å bestemme kombinasjoner av celleoverflatemarkører som identifiserer erytroide og andre tidlige hematopoietiske forfedre (figur 2). Nærmere bestemt kan CD55+-fraksjonen av avstamningsnegative (Lin-) Kit+-celler deles inn i fem populasjoner, hvorav tre gir sammenhengende segmenter av erytroidbanen (figur 2). De transkriptomiske identitetene til hver av disse populasjonene ble bekreftet ved sortering, etterfulgt av scRNAseq og projeksjon av de sorterte enkeltcellede transkriptomene tilbake på det opprinnelige transkriptomiske kartet (genuttrykket i hver av de fem populasjonene og hele benmargsdatasettet kan utforskes i https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)1 . Celleskjebnepotensialet til hver av populasjonene ble bekreftet ved hjelp av tradisjonelle kolonidannelsesanalyser (figur 2), samt en ny høykapasitets enkeltcellet skjebneanalyse 1,27. Disse analysene viser at den nye flowcytometriske tilnærmingen resulterer i isolasjon med høy renhet av alle BFU-e- og CFU-e-forfedrene til ferske voksne benmarg og milt. Nærmere bestemt inneholder populasjon 1 (P1) bare CFU-e og ingen andre hematopoietiske forfedre, og populasjon 2 (P2) inneholder alle benmargens BFU-e forfedre og et lite antall CFU-e, men ingen andre forfedre1. Den detaljerte protokollen nedenfor er ytterligere illustrert med et eksempeleksperiment hos mus som ble injisert med enten saltvann eller med det erytropoiesestimulerende hormonet erytropoietin (Epo).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter ble utført i samsvar med dyreprotokoller A-1586 og 202200017 godkjent av University of Massachusetts Chan Medical School Institutional Animal Care and Use Committee.
MERK: To protokoller er beskrevet her: først flowcytometrisk analyse (avsnitt 1), etterfulgt av protokolljusteringer for flowcytometrisk sortering (avsnitt 2). Protokollen nedenfor bruker et flowcytometer/sorteringsmaskin med 10 kanaler. Et eksempeloppsett finnes i tabell 1, som det refereres til i trinn 1.14.5. Det er også mulig å kjøre denne protokollen med bare ni kanaler; se forklaringen i tabell 2.
1. Flowcytometrisk analyse
- Avliv voksne (>6 uker gamle) Balb/C- eller C57BL6-mus ved hjelp av en egnet metode godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (f.eks. CO 2-innånding etterfulgt av cervikal dislokasjon). For flowcytometrisk analyse vil benmarg (BM) fra en enkelt mus være tilstrekkelig. For sortering avhenger antall mus av nedstrøms applikasjoner. Celleutbyttet for hver populasjon er gitt nedenfor (trinn 2.3.3).
- Vevshøsting:
- Klargjør 5 ml fluorescensaktiverte cellesorteringsrør (FACS) som inneholder 3 ml kald (4 °C) fargebuffer ("SB5": fosfatbufret saltvann (PBS), 0,2 % bovint serumalbumin (BSA), 0,08 % glukose, 5 mM EDTA) på is. Bruk dette til å plassere høstet vev.
- Forbered separate rør for hvert vev dissekert fra hver mus. Ikke basseng vev fra flere mus.
- Høst både lårben og begge tibias. Fjern alle musklene fra beinene før du plasserer dem i røret med SB5.
- Disseker milten gjennom et snitt på venstre side av magen.
- Benmarg celle ekstraksjon:
- Plasser de nydissekerte lårbenene og tibias direkte i kaldfargingsbufferen (SB5) og hold rørene på is til de er klare til å trekke ut benmargen (BM). Legg en ren sterilisert mørtel på is i en bøtte. Overfør beinene til mørtelen sammen med SB5 fra røret.
- Klipp av ca. 1 mm av endene av hvert bein med disseksjonssaks slik at beinåpningen blir bare synlig.
- Bruk en 26 G kanyle og en 3 ml sprøyte fylt med SB5 til å skylle margen ut av skjelettet og samle den opp i morteren. Gjenta prosessen 3-5 ganger med ny buffer hver gang til beinene virker fargeløse.
- Filtrer den spylte margen gjennom et 100μm maskefilter og samle cellene i et 50 ml sentrifugerør plassert på is.
- Bruk mørtel og pistill til å knuse de spylte beinene i 5-10 ml SB5. Filtrer blandingen av knuste bein og buffer gjennom 100 μm cellesil og basseng med celler samlet i trinn 1.3.4.
- Miltcelleutvinning:
- Sett opp et 100 μm maskefilter på et tomt 50 ml sentrifugerør plassert på is. Plasser en enkelt milt på maskefilteret.
- Tilsett 0,5-1 ml SB5 i milten for å sikre at den ikke tørker.
- Bruk gummisiden av et sprøytestempel på 3 ml eller 5 ml til å mose milten gjennom nettet. Tilsett mer SB5, 5 ml om gangen, og fortsett å mose til alle cellene er samlet i røret.
- Fra dette tidspunktet behandles benmarg og miltceller på samme måte.
- Spinn cellene ned ved 900 x g, 4 °C i 10 minutter. Aspirer supernatanten ved hjelp av et vakuum aspirasjonsoppsett.
- For å lage en enkeltcellet suspensjon, resuspend cellene i 2 ml SB5 og pipet opp og ned 50 ganger ved hjelp av en P1000 med en stor åpningsspiss (se Materialtabell). Disse har brede spissåpninger for å forhindre skade på skjøre celler.
- For å telle cellene, resuspend ved pipettering opp og ned 20 ganger. Fortynn cellene i forholdet 1:100 i SB5. Bland 10 μL av de fortynnede cellene med 10 μL trypanblå og tell på et hemocytometer og / eller celleteller.
- Spinn cellene ned ved 900 x g, 4 °C i 10 minutter. Aspirer supernatanten og resuspendere cellene ved 33 x 106 levende celler / ml i SB5.
- Tilbered Lin-FITC-cocktailen ved å blande like store mengder av hvert antistoff i tabell 3.
- Klargjør cellene for kontroller med én farge og FMO-kontroller (Fluorescens minus én). Utfør trinn 1.11-1.12 parallelt med preparering og farging av prøvecellene i trinn 1.14 (prøver for flowcytometrisk analyse) og/eller trinn 2.1 (flowcytometrisk sortering).
- Forbered cellene for en ufarget cellekontroll ved å overføre 50 μL (1,6 x 106 celler) av cellesuspensjonen til et FACS-rør på is. Forbered cellene for hver enkelt fargekontroll (11 rør) ved å overføre 50 μL (1,6 x 106 celler) av cellesuspensjonen til et FACS-rør på is.
- Forbered FMO-kontroller for følgende farger (Kit, CD41, CD150, CD49f [fire rør]) ved å overføre 300 μL (10 x 106 celler) av cellesuspensjonen til et separat FACS-rør på is.
- Spinn ned cellene ved 900 x g, 4 °C i 10 minutter og aspirer supernatanten.
- Antistofffarging av FMOer og enkeltfargekontroller
- Flekk FMOene ved 33 x 106 celler / ml (i et totalt volum på 300 μL) i FACS-rør. For hver kontroll, legg til alle antistoffene unntatt FMOs navnebror antistoff. For eksempel, for Kit FMO, la ut Kit antistoff. For hvert antistoff benyttes fortynning og endelig konsentrasjon som i tabell 2.
- Flekk enkeltfargekontrollene ved 20 x 106 celler/ml (i et totalt volum på 50 μL) i FACS-rør; for hver kontroll, legg til ett enkelt antistoff ved konsentrasjonen oppført i tabell 2.
- Vortex hvert kontrollrør i 2-3 s ved 3000 o / min (rotasjoner per minutt), og inkuber deretter ved 4 ° C, gynger i 2,5 timer i mørket, beskyttet mot lys. Rock rørene med en rotasjonsakse parallelt med rørets lengde, mellom omtrent 10 ° og en 60 ° vinkel fra horisontalen, slik at innholdet ikke berører hetten.
- Vask cellene med SB5: Gjør opp volumet av cellesuspensjonen til 4 ml med SB5. Spinn cellene ned ved 900 x g, 4 °C i 10 minutter, og aspirer supernatanten.
- Celle resuspendering:
- Resuspend de ufargede og alle enkeltfargekontrollene (unntatt DAPI-kontrollen) i 300 μL SB5 og filtrer gjennom et 40 μm filternett inn i et nytt FACS-rør.
- Lag en DAPI/SB5-løsning ved å fortynne DAPI-stammen (1 mg/ml i 100 % etanol) ved 1:10 000 i SB5.
- Resuspend FMOene i 1,8 ml DAPI/SB5 og filtrer gjennom et 40 μm filternett inn i et nytt FACS-rør
- Resuspend DAPI enkeltfargekontroll i 300 μL DAPI / SB5 og filtrer gjennom et 40 μm filternett til et nytt 4 ml FACS-rør.
- Prøvepreparering: Hvis cellene klargjøres for flowcytometrisk analyse, gå til trinn 1.14. Hvis du klargjør cellene for sortering, går du til trinn 2.1.
- Flekk de cytometriske strømningsanalyseprøvene ved 33 x 10 6 celler/ml i et totalvolum på 300 μL (10 x 106 celler) i FACS-rør:
- Forbered antistoffmesterblandingen. Bestem volumet av masterblandingen med antall prøver, med 300 μL per prøve. Lag masterblandingen ved å fortynne alle antistoffene oppført i tabell 2 ved den angitte fortynningen i SB5. Rabbit IgG i mastermiksen fungerer som en Fc-blokk.
- Vortex hvert rør i 2-3 s ved 3000 o / min, og inkuber deretter ved 4 ° C, gynger i 2,5 timer i mørket, beskyttet mot lys.
- Vask cellene med SB5: Gjør opp volumet av cellesuspensjonen til 4 ml med SB5. Spinn cellene ned ved 900 x g, 4 °C i 10 minutter, og aspirer supernatanten.
- Resuspend prøvene for flowcytometrisk analyse i 1,8 ml DAPI/SB5 som fremstilt i trinn 1.12.5.2 og filtrer gjennom et 40 μm filternett inn i et FACS-rør.
- Analyser prøvene på et cytometer med 10 kanaler for å imøtekomme antistoffkonjugatene i tabell 2 og levedyktighetsfargen DAPI. Et eksempel på kanaloppsett finnes i tabell 1. Det er også mulig å bare bruke ni kanaler; se tabell 2-forklaringen .
- Under analysen av flowcytometridataene bruker du standard spektralkompensasjonsmetoder ved hjelp av enkeltfargekontroller og FMO-kontroller som beskrevet i trinn 2.4.
2. Protokolljusteringer for flowcytometrisk sortering
- Tilberedning av Lin-
- Samle alle de ekstraherte cellene fra samme vev (enten BM eller milt) fra 10 mus til et 50 ml rør. Resuspend hver samlet prøve ved pipettering ved hjelp av en P1000 med en stor åpningsspiss.
- Spinn ned cellene ved 900 x g, 4 °C i 10 minutter og aspirer supernatanten.
- Klargjør enkeltfarge- og FMO-kontroller som beskrevet i avsnitt 1 ved hjelp av celler som ikke er beriket.
- Berik Lin-celler for sortering ved hjelp av magnetisk perleberikelse av Lin-celler:
- Resuspend cellene ved 1 x 108 celler / ml med SB5 og overfør dem til et 15 ml rør. Tilsett normalt rotteserum og de biotinylerte antistoffene oppført i tabell 4 og inkuber med gynging ved 4 °C i 1 time.
- Spinn cellene ned ved 900 x g, 4 °C i 10 minutter og aspirer supernatanten. Resuspend cellene i 15 ml kald SB5.
- Spinn cellene ned ved 900 x g, 4 °C i 10 minutter og aspirer supernatanten. Resuspend cellene ved 1 x 108 celler / ml i kald SB5 og hold dem på is.
- Vortex de magnetiske nanoperlene ved 3000 o / min i 5-10 s. Ta 1 ml magnetiske nanoperler for hver 10 ml celler.
- Vask nanoperlene i et 5 ml FACS-rør. Gjør opp volumet til 4 ml med SB5, spinn ved 900 x g, 4 °C i 5 minutter, og aspirer supernatanten.
- Resuspend nanobeads i 500 μL SB5 og bland med cellene fremstilt i trinn 2.1.7. Inkuber ved 4 °C med gynging i 15 min.
- Spinn cellene ned ved 900 x g, 4 °C i 10 minutter og aspirer supernatanten. Resuspend cellene ved 1 x 108 celler / ml med SB5.
- Plasser røret på en magnet ved 4 °C i 5 minutter.
- Hell supernatanten forsiktig i et nytt 15 ml rør.
- Plasser slangen som inneholder supernatanten fra trinn 2.1.13 på en magnet ved 4 °C i 5 minutter. Hell supernatanten forsiktig i et nytt 15 ml rør.
- Spinn cellene fra supernatanten i trinn 2.1.14 ved 900 x g, 4 °C i 10 minutter, og aspirer supernatanten.
- Resuspend de Lin-berikede cellene i 1 ml SB5.
- Fortynn 10 μL av cellene ved 1:100 i SB5. Bland 10 μL av de fortynnede cellene med 10 μL trypanblå og tell på et hemocytometer og / eller celleteller.
- Basert på celletallet i trinn 2.1.17, resuspenderer de Lin-berikede cellene ved 33 x 106 celler/ml.
- Farging av berikede celler:
- Flekk de berikede celleprøvene ved 33 x 106 celler / ml i FACS-rør ved å legge til alle antistoffene som er oppført i tabell 2. Vortex hvert rør i 2-3 s ved 3000 o / min, og inkuber deretter ved 4 ° C, gynger i 2,5 timer i mørket, beskyttet mot lys.
- Vask cellene med SB5: Gjør opp volumet av FACS-rørene til 4 ml med SB5. Spinn cellene ned ved 900 x g, 4 °C i 10 minutter, og fjern supernatanten.
- Resuspendere prøvene for flowcytometrisk analyse i 4-6 ml DAPI/SB5 som fremstilt i trinn 1.12.5.2 og filtrer gjennom et 40 μm filternett inn i et nytt 4 ml FACS-rør.
- Eksempel sortering:
- Sorter prøvene med en stor dyse og lavt trykk for å maksimere CFU-e-utbyttet siden CFU-e-celler lett blir skadet under høyt trykk. For flowcytometeret som ble brukt i denne studien, bruk 14 psi og en 100 μm dyse eller 12 psi med en 130 μm dyse. Sett opp sorteringsportene som beskrevet under trinn 2.4 nedenfor.
- Forbered innsamlingsbufferen: Tilsett 20% føtalt bovint serum til PBS.
- For å kontrollere renhetene til de sorterte populasjonene, kjør en liten aliquot fra hver sortert populasjon i en buffer som inneholder DAPI, som beskrevet i trinn 1.12.5.2.
MERK: Vanligvis gir BM fra totalt 10 mus (ca. 1 x 109 celler) minst 50 000-100 000 celler for hver av P1-hi-, P1-low- og P2-populasjonene med en levedyktighet på omtrent 70%.
- Bruk gating-strategien vist i figur 3 for analyse eller oppsett av sorteringsportene.
- Bruk parameteren forward-scatter (FSC) for å fjerne rusk basert på størrelse. Bruk FSC-høyden versus FSC-området histogrammet for å ekskludere celleaggregater og velge enkeltceller; Gjenta med sidespredningshøyden (SSC)-høyden versus SSC-områdets histogram.
- Ekskluder de døde cellene ved å gating ut cellene som er positive for DNA-fargestoffet DAPI, som levedyktige celler er ugjennomtrengelige.
- Velg Lin-Ter119-Kit+-celler, og velg en delpopulasjon som uttrykker CD55 fra disse.
- Del opp Lin- Ter119-Kit+CD55+-cellene i to hovedpopulasjoner, P6 og P7, basert på uttrykket av CD49f og CD105.
- Basert på uttrykket av CD150 og CD41, del P6 videre inn i P3 (basofile eller mastcelle-forfedre), P4 (megakaryocytiske forfedre) og P5 (EBMP og erytroid-biased MPP).
- Basert på uttrykket av CD150 og CD71, del P7 videre inn i P2 (BFU-e), tidlig CFU-e (P1-lav) og sen CFU-e (P1-hi).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen beskriver en flowcytometrisk tilnærming for å identifisere BFU-er og CFU-er i nyhøstede benmargs- og miltceller. Det starter med å høste fersk BM og milt fra mus og umiddelbart plassere vevet på is. Alle prosedyrer utføres i kulde for å bevare cellens levedyktighet. Celler er merket med en "avstamning" antistoffcocktail som tillater utelukkelse av alle celler som uttrykker markører for differensierte blodlinjer (FITC-Lin-cocktailen, tabell 3, ved flowcytometrisk analyse; eller magnetisk perleberikelse, tabell 4, for avstamningsnegative celler). Celler er også merket med antistoffer mot markører som gjør at vi kan skille en rekke tidlige stamcellepopulasjoner innenfor den avstamningsnegative cellefraksjonen. Merking etterfølges av enten flowcytometrisk sortering eller analyse. Tilnærmingen til flowcytometrisk sortering ligner på flowcytometrisk analyse, men innledes med magnetisk perleberikelse for Lin-cellefraksjonen for å redusere tid og kostnader ved sortering av et stort antall celler. Ved sortering av forfedre samles BM fra flere mus, antallet avhengig av nedstrømsapplikasjonen. Vanligvis gir BM fra totalt 10 mus (ca. 1 x 109 celler) minst 50 000-100 000 celler for hver av P1-hi-, P1-low- og P2-populasjonene med en levedyktighet på omtrent 70%.
Hovedforskjellen mellom milt- og BM-avledede populasjoner identifisert av denne protokollen er den mye lavere frekvensen av P6-populasjonen og dens underpopulasjoner, P4 / P5 / P3, i miltavledede celler.
Som et eksempel på flowcytometrisk analyse ble effekten av epo-administrasjon hos mus undersøkt. Epo binder seg til og aktiverer epo-reseptoren (EpoR), noe som er viktig for både basal og akselerert erytropoiesis under stressforhold som hypoksi. Hypoksi stimulerer en økning i blod Epo nivåer 28,18, i sin tur fremme utvidelsen av CFU-e 1,29 og erytroid forløpere.
Epo (0,25 U/g kroppsvekt) eller et likt volum kjøretøy (saltvann) ble injisert subkutant i mus en gang hver 24. time i 3 dager. BM og milt ble høstet ved 72 timer. Epo-stimulering førte til utvidelse av de tidlige og sene CFU-e-populasjonene (P1-lav og P1-hi) i både BM og milt (figur 4 og figur 5).
Figur 1: To hovedfaser av definitiv erytropoiese. Erytropoiesen kan deles inn i en tidlig fase, hvor forfedre defineres ut fra deres kolonidannende potensial, og en senere fase kjent som erytroid terminal differensiering (ETD), hvor erytroblaststadiet er definert basert på morfologi. Flowcytometriske teknikker har tillatt prospektiv isolering av utviklingsspesifikke erytroblaststadier ved bruk av FSC, Ter119 og CD71. Derimot har det ikke vært en tilsvarende metode for å isolere BFU-e og CFU-e forfedre direkte fra vev med høy renhet. Merk at bare en brøkdel av BFU-e-kolonien vises. Skalalinjen gjelder for både CFU-e- og BFU-e-koloniene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: En ny flowcytometrisk strategi for isolering av CFU-e og BFU-e direkte fra vev. Dette manuskriptet beskriver en protokoll for å identifisere fem nye flowcytometriske populasjoner, P1 til P5, basert på en analyse av scRNAseq-dataene. (A) Kraftstyrt grafprojeksjon ("Vårplott") av ferske Balb / C voksne benmarg enkeltcellede transkriptomer. Fargene indikerer det forutsagte celleskjebnepotensialet basert på transkriptomisk informasjon og populasjonsbalanseanalysen (PBA) algoritme1. Områdene i plottet som tilsvarer hver av de flowcytometriske populasjonene P1 til P5 er angitt. Regionene som er avgrenset er håndtegnede tilnærminger av de opprinnelige dataene, som finnes i Tusi et al.1. Korrespondansen ble bekreftet ved å foreta scRNAseq av hver av de sorterte P1 til P5 populasjoner1. E = erytroid; Ba = basofile eller mastcelle forfedre; Meg = megakaryocytiske forfedre; Ly = Lymfocytiske forfedre; D = dendritiske forfedre; M = monocytiske forfedre; G = granulocytiske forfedre. (B) Koloniformasjonsanalyser, replotted fra Tusi et al.1. P1- til P5-populasjonene og CD55+-cellene ble sortert som beskrevet i denne protokollen, og hver populasjon ble belagt for de relevante kolonidannelsesanalysene. Erytroidkolonier ble skåret på de angitte dagene. UF = unifocal; MF = multi-fokal; CFU-MK = kolonidannende enhet megakaryocytisk; CFU-GM = kolonidannende enhet granulocytisk/monocytisk; CFU-GEMM = kolonidannende enhet granulocytisk, erytroid, monocytisk, megakaryocytisk. (C) Celleoverflatemarkører som definerer hver av de fem populasjonene, samt deres celleskjebnepotensial. Celleskjebnepotensialet er både et resultat av transkriptomisk informasjon og av celleskjebneanalysene, både kolonidannelse og encellede skjebneanalyser 1,27. Merk at P1-populasjonen ble delt basert på uttrykket av CD71-markøren i P1-hi og P1-lav1. Basert på data fra Tusi et al.1. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Flowcytometrisk gatingstrategi. Den komplette gatingstrategien for populasjoner P1 til P5. Nyhøstet benmarg (BM) eller milt (SP) fra en Balb / C-mus subkutant injisert med 100 μL 0,9% steril saltvann er først inngjerdet for hovedpopulasjonen, og kaster rusk; Dette etterfølges av å velge singleter, forkaste døde celler og gating på celler som er Ter119-negative, Lineage-negative og Express Kit. Videre inndeling av Ter119-Lin-Kit+CD55+ i P6 og P7 etterfølges av den endelige inndelingen i populasjoner P1 til P5 (se også figur 2). Ter119-kanalen tillater analyse av erytroblaster på samme prøve (ved bruk av Ter119/CD71 tilnærming12). En separat Ter119-kanal er imidlertid ikke avgjørende for denne protokollen, og Ter119-antistoffet kan utelates fra masterblandingen og inkluderes som en del av Lin-FITC-cocktailen i stedet. Eksklusjonstrinnet for Ter119 positive celler er ikke vist i denne gating-strategien. Tall er prosentandeler av hver port i det viste histogrammet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Analyse av tidlig erytroide stamceller med benmarg og milt etter Epo-stimulering. Representative flowcytometriske plott av nyhøstet benmarg (BM) eller milt (SP). Balb/C mus ble injisert subkutant med enten 0,25 U/g kroppsvekt av Epo eller med tilsvarende volum saltvann. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Responsen fra BM og miltforfedre til Epo in vivo. Sammendragsstatistikk som viser endringer i det absolutte celletallet i populasjonene P1 til P5 etter Epo injeksjon i nyhøstede (A) benmarg og (B) miltceller; *p = 0,02. Eksperiment som beskrevet i figur 4. n = 4 mus i hver gruppe. For å beregne det absolutte celletallet ble frekvensen av celler i hver populasjon i enten BM eller milt (fra figur 4) multiplisert med det totale antall BM- eller miltceller høstet fra hver mus og delt på musevekten i gram. Det er verdt å merke seg at bare tidlig CFU-e i BM nådde statistisk signifikans (p = 0,02), sannsynligvis en kombinasjon av en relativt lav epodose og et lite antall mus i hver gruppe. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Detektor Array | AVDRAG | Dichroic speil | Bandpass-filter | Fluorophore oppdaget |
| Blå laser (488 nm) | En | 685LP | 695/40 | |
| B | 505LP | 530/30 | Lin-FITC (+Ter119-FITC) | |
| C | 488/10 | |||
| Fiolett laser (405 nm) | En | 760LP | 800/80 | |
| B | 630LP | 660/20 | CD150-BV650 | |
| C | 595LP | 605/20 | CD41-BV605 | |
| D | 475LP | 525/20 | ||
| E | 450/50 | CD49f-BV421 | ||
| Rød laser (640 nm) | En | 755LP | 785/50 | cKit-APC-Cy7 |
| B | 700 LP | 720/30 | ||
| C | 675/14 | CD55-AF 647 | ||
| UV-laser (355 nm) | En | 505LP | 525/20 | |
| B | 420LP | 450/50 | DAPI | |
| C | 379/28 | Ter119-BUV 395 | ||
| YG Laser (561 nm) | En | 755LP | 780/60 | CD71-PE-Cy7 |
| B | 685LP | 710/50 | ||
| C | 635LP | 660/20 | ||
| D | 600LP | 610/20 | ||
| E | 570LP | 580/20 | CD105-PE |
Tabell 1: Eksempel på kanaloppsettet i et LSRII-cytometer. Panelet av antistoffer som brukes i den beskrevne protokollen og deres arrangement i LSRII flowcytometer for å samle inn dataene.
| Reagens eller antistoff | Konjugat | Lager conc. (mg/ml) | Fortynningsfaktor | Endelig konk. i cellesuspensjon (μg/ml) | Klon |
| CD71 | PE/Cy7 | 0.2 | 2000 | 0.1 | RI7217 |
| TER-119 | BUV395 | 0.2 | 100 | 2 | TER-119 |
| CD55 (DAF) | AF647 | 0.5 | 50 | 10 | RIKO-3 |
| CD105 | PE | 0.2 | 50 | 4 | MJ7/18 |
| CD150 (SLAM) | BV650 | 0.1 | 50 | 2 | TC15-12F12.2 |
| CD49f | BV421 | 0.025 | 50 | 0.5 | GoH3 |
| CD41 | BV605 | 0.2 | 100 | 2 | MWReg30 |
| CD117 (cKit) | APC/Cy7 | 0.2 | 200 | 1 | 2B8 |
| Lin cocktail | FITC | 0,08 (for hvert antistoff i cocktailen) | 83 | 1 (for hvert antistoff i cocktailen) | |
| Kanin IgG | 10 | 50 | 200 |
Tabell 2: Antistoff master-mix komponenter. Sammensetning av antistoffmasterblandingen. Ter119-kanalen tillater analyse av erytroblaster på samme prøve (ved bruk av Ter119/CD71 tilnærming12). En separat Ter119-kanal er imidlertid ikke avgjørende for denne protokollen, og Ter119-antistoffet kan utelates fra masterblandingen og inkluderes som en del av Lin-FITC-cocktailen i stedet.
| Reagens eller antistoff | Konjugat | Lager conc. (mg/ml) | Klon |
| Ly-6G og Ly-6C | FITC | 0.5 | RB6-8C5 |
| CD11b | FITC | 0.5 | M1/70 |
| CD19 | FITC | 0.5 | 1D3 |
| CD4 | FITC | 0.5 | RM4-5 |
| CD8a | FITC | 0.5 | 53-6.7 |
| F4/80 | FITC | 0.5 | BM8 |
Tabell 3: Lin cocktail komponenter. Sammensetning av Lin-cocktailen som brukes som en del av antistoffmasterblandingen (se detaljer om mastermiksen i tabell 2).
| Reagens eller antistoff | Konjugat | Lager conc. (mg/ml) | Fortynningsfaktor | Endelig konk. i cellesuspensjon (μg/ml) | Klon |
| Ly-6G og Ly-6C | Biotin | 0.5 | 200 | 2.5 | RB6-8C5 |
| CD11b | Biotin | 0.5 | 200 | 2.5 | M1/70 |
| CD19 | Biotin | 0.5 | 200 | 2.5 | 1D3 |
| CD4 | Biotin | 0.5 | 200 | 2.5 | RM4-5 |
| CD8a | Biotin | 0.5 | 200 | 2.5 | 53-6.7 |
| F4/80 | Biotin | 0.5 | 200 | 2.5 | BM8 |
| TER-119 | Biotin | 0.5 | 200 | 2.5 | TER-119 |
| Normalt rotteserum | 50 |
Tabell 4: Antistoffer for magnetisk perleberikelse. Antistoffer som brukes til å berike Lin-fraksjonen av enten BM eller milten før cellesortering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Evnen til prospektivt å isolere BFU-e og CFU-e forfedre direkte fra friskt vev med høy renhet hadde tidligere unnsluppet etterforskere. Vår nye tilnærming, validert ved hjelp av scRNAseq og celleskjebneanalyser 1,27, tilbyr nå verktøyene for å gjøre dette.
Det finnes en rekke viktige punkter for vellykket gjennomføring av både sorterings- og analyseprotokollene. Først må cellene spinnes ved 900 x g for å forhindre tap av celler med lav tetthet. Mange celler på CFU-e-stadiet er store celler med lav tetthet som ellers kan gå tapt. For det andre er det nødvendig å bruke store åpningsspisser når du pipetterer opp og ned for å bidra til å bryte celleaggregatene og forhindre tap av skjøre P1- og P2-celler. Dette trinnet er viktig siden mange CFU-e forfedre er assosiert med erytroblastiske øymakrofager (EBI) og vil gå tapt hvis de ikke lykkes med å dissosieres. For det tredje inkuberes cellene med en EDTA-holdig buffer ("SB5") før farging, noe som bidrar til å dissosiere EBIene. For det fjerde, under innsamling av cytometriske strømningsdata bør innsamlingshastigheten ikke overstige 7 000 hendelser/s eller den anbefalte hastigheten for flowcytometerinstrumentet som brukes.
P1- og P2-populasjonene inneholder alle CFU-e- og BFU-e-forfedrene i henholdsvis benmargen, og inneholder ingen andre stamcelletyper1. P1-populasjonen deles videre inn i tidlig CFU-e (P1-lav) og sen CFU-e (P1-hi) basert på uttrykket av CD711. Disse svært rene flowcytometriske populasjonene gir et komplett bilde av BFU-e- og CFU-e-stamfarpopulasjonene in vivo.
En ulempe er at P2-populasjonen inneholder en liten brøkdel av tidlige CFU-e-forfedre. Det inneholder imidlertid alle BFU-e-cellene i BM og ingen andre celletyper. P1-populasjonen inneholder hele CFU-e i BM, bortsett fra den lille brøkdelen som er tilstede i P2. I motsetning til P1- og P2-populasjonene er P3 til P5 svært berikede, men ikke rene, stamfarpopulasjoner.
Bruk av dette flowcytometriske verktøyet til musemodeller av erytropoiesis vil nå tillate bestemmelse av cellulære og molekylære responser under fysiologiske og patologiske forstyrrelser til erytropoiesis. I det viste eksemplet ble mus injisert med hormonet Epo. Denne tilnærmingen kan brukes i genmodifiserte mus, for eksempel i musemodeller av hemoglobinopatier, for en mer nøyaktig molekylær analyse av deres endrede erytroidprogenitorer in vivo.
DATATILGJENGELIGHET:
Ytterligere data knyttet til eksperimentene i figur 4 og figur 5 er tilgjengelig på forespørsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
Dette arbeidet er støttet av NIH-stipendene R01DK130498, R01DK120639 og R01HL141402
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575020 | |
| 1000 µL large orifice tips | USA sceintific | 1011-9000 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD55 (DAF) Antibody | BioLegend | 131806 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) Antibody | BioLegend | 105826 | |
| Biotin-CD11b | BD Biosciences | 557395 | M1/70 (clone) |
| Biotin-CD19 | BD Biosciences | 553784 | 1D3 (clone) |
| Biotin-CD4 | BD Biosciences | BDB553045 | RM4-5 (clone) |
| Biotin-CD8a | BD Biosciences | BDB553029 | 53-6.7 (clone) |
| Biotin-F4/80 | Biolegend | 123106 | BM8 (clone) |
| Biotin-Ly-6G and Ly-6C | BD Biosciences | 553125 | RB6-8C5 (clone) |
| Biotin-TER-119 | BD Biosciences | 553672 | TER-119 (clone) |
| Bovine Serum Albumin | Sigma aldritch | A1470 | |
| Brilliant Violet 421 anti-human/mouse CD49f Antibody | BioLegend | 313624 | |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD41 Antibody | BioLegend | 133921 | |
| Brilliant Violet 650 anti-mouse CD150 (SLAM) Antibody | BioLegend | 115931 | |
| BUV395 Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells | BD Biosciences | 563827 | |
| ChromPure Rabbit IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 011-000-003 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306 | |
| Digital DIVA hardware and software for LSR II | BD Biosciences | ||
| FITC anti-mouse F4/80 Antibody | BioLegend | 123108 | |
| FITC Rat Anti-CD11b | BD Biosciences | 557396 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD19 | BD Biosciences | 553785 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD4 | BD Biosciences | 553047 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 553031 | |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and LY-6C | BD Biosciences | 553127 | |
| FlowJo software | FlowJo | version 10 | Flow cytometer analysis software |
| LSR II digital multiparameter flow cytometer analyzer | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| NewlineNY Stainless Steel Hand Masher & Bowl, Mortar and Pestle Set | Amazon | ||
| Normal rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| PE anti-mouse CD105 Antibody | BioLegend | 120408 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD71 Antibody | BioLegend | 113812 | |
| Phosphate Buffered Saline, 10x Solution | Fisher scientific | BP3994 | |
| Streptavidin Nanobeads | BioLegend | 480016 | Magnetic beads |
References
- Tusi, B. K., et al. Population snapshots predict early haematopoietic and erythroid hierarchies. Nature. 555 (7694), 54-60 (2018).
- Socolovsky, M. The role of specialized cell cycles during erythroid lineage development: Insights from single-cell RNA sequencing. International Journal of Hematology. 116 (2), 163-173 (2022).
- Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development. WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504 (2021).
- Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M., Heath, D. S. Properties of Cells that Produce Erythrocytic Colonies In Vitro. Hemopoiesis in Culture. Robinson, W. A. , National Institutes of Health, US Government Printing Office. (1974).
- Heath, D. S., Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M. Separation of the erythropoietin-responsive progenitors BFU-E and CFU-E in mouse bone marrow by unit gravity sedimentation. Blood. 47 (5), 777-792 (1976).
- Iscove, N. N., Sieber, F. Erythroid progenitors in mouse bone marrow detected by macroscopic colony formation in culture. Experimental Hematology. 3 (1), 32-43 (1975).
- Gregory, C. J., McCulloch, E. A., Till, J. E. Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: State of differentiation. Journal of Cell Physiology. 81 (3), 411-420 (1973).
- Gregory, C. J., Tepperman, A. D., McCulloch, E. A., Till, J. E. Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: Response of normal and genetically anemic W-W-V mice to manipulations of the erythron. Journal of Cell Physiology. 84 (1), 1-12 (1974).
- Gregory, C. J. Erythropoietin sensitivity as a differentiation marker in the hemopoietic system: studies of three erythropoietic colony responses in culture. Journal of Cell Physiology. 89 (2), 289-301 (1976).
- Pop, R., et al. A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression. PLoS Biology. 8 (9), 1000484 (2010).
- Koulnis, M., et al. Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay. Journal of Visualized Experiments. (54), e2809 (2011).
- Liu, Y., et al. Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in vivo. Blood. 108 (1), 123-133 (2006).
- Socolovsky, M., et al. Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts. Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).
- Chen, K., et al. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17413-17418 (2009).
- Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development. WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504 (2020).
- Hidalgo, D., et al. EpoR stimulates rapid cycling and larger red cells during mouse and human erythropoiesis. Nature Communications. 12 (1), 7334 (2021).
- Porpiglia, E., Hidalgo, D., Koulnis, M., Tzafriri, A. R., Socolovsky, M. Stat5 signaling specifies basal versus stress erythropoietic responses through distinct binary and graded dynamic modalities. PLoS Biology. 10 (8), 1001383 (2012).
- Koulnis, M., et al. Contrasting dynamic responses in vivo of the Bcl-xL and Bim erythropoietic survival pathways. Blood. 119 (5), 1228-1239 (2012).
- Shearstone, J. R., et al. Global DNA demethylation during mouse erythropoiesis in vivo. Science. 334 (6057), 799-802 (2011).
- Koulnis, M., Liu, Y., Hallstrom, K., Socolovsky, M. Negative autoregulation by Fas stabilizes adult erythropoiesis and accelerates its stress response. PLoS One. 6 (7), 21192 (2011).
- Pronk, C. J., et al. Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy. Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).
- Dolznig, H., et al. Expansion and differentiation of immature mouse and human hematopoietic progenitors. Methods in Molecular Medicine. 105, 323-344 (2005).
- Li, J., et al. Isolation and transcriptome analyses of human erythroid progenitors: BFU-E and CFU-E. Blood. 124 (24), 3636-3645 (2014).
- Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: Functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system. Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).
- Flygare, J., Rayon Estrada, V., Shin, C., Gupta, S., Lodish, H. F. HIF1alpha synergizes with glucocorticoids to promote BFU-E progenitor self-renewal. Blood. 117 (12), 3435-3444 (2011).
- Pronk, C. J., Attema, J., Rossi, D. J., Sigvardsson, M., Bryder, D. Deciphering developmental stages of adult myelopoiesis. Cell Cycle. 7 (6), 706-713 (2008).
- Khoramian Tusi, B., Socolovsky, M. High-throughput single-cell fate potential assay of murine hematopoietic progenitors in vitro. Experimental Hematology. 60, 21-29 (2018).
- Erslev, A. J., Caro, J. Erythropoietin titers in response to anemia or hypoxia. Blood Cells. 13 (1-2), 207-216 (1987).
- Koury, M. J., Bondurant, M. C. The molecular mechanism of erythropoietin action. European Journal of Biochemistry. 210 (3), 649-663 (1992).
