Summary
Aqui, descrevemos um novo método citométrico de fluxo para isolamento prospectivo de progenitores eritróides de unidade formadora de explosão precoce (BFU-e) e eritróides de unidade formadora de colônias (UFC-e) diretamente da medula óssea e do baço frescos de camundongos. Este protocolo, desenvolvido com base em dados transcriptômicos de célula única, é o primeiro a isolar todos os progenitores eritróides do tecido com alta pureza.
Abstract
Os primeiros progenitores eritróides foram originalmente definidos por seu potencial de formação de colônias in vitro e classificados em "unidades" formadoras de explosões e formadoras de colônias conhecidas como BFU-e e UFC-e. Até recentemente, métodos para o isolamento prospectivo direto e completo de progenitores puros de BFU-e e CFU-e da medula óssea adulta recém-isolada não estavam disponíveis. Para resolver essa lacuna, um conjunto de dados de RNA-seq de célula única (scRNAseq) da medula óssea de camundongos foi analisado para a expressão de genes que codificam marcadores de superfície celular. Esta análise foi combinada com ensaios de destino celular, permitindo o desenvolvimento de uma nova abordagem citométrica de fluxo que identifica e permite o isolamento de subconjuntos completos e puros de progenitores BFU-e e CFU-e na medula óssea ou baço de camundongos. Esta abordagem também identifica outros subconjuntos progenitores, incluindo subconjuntos enriquecidos para basófilos/mastócitos e potenciais megacariocíticos. O método consiste em marcar células frescas da medula óssea ou do baço com anticorpos direcionados a Kit e CD55. Os progenitores que expressam ambos os marcadores são então subdivididos em cinco populações principais. A população 1 (P1 ou UFC-e, Kit+ CD55+ CD49f med/baixo CD105 med/alto CD71 med/alto) contém todos os progenitores da UFC-e e pode ser subdividida em P1-low (CD71med CD150 high) e P1-hi (CD71high CD150low), correspondendo a UFC-e precoce e tardia, respectivamente; A população 2 (P2 ou BFU-e, Kit+ CD55+ CD49f med/low CD105 med/high CD71low CD150high) contém todos os progenitores BFU-e; A população P3 (P3, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105 med/low CD150 low CD41low) é enriquecida para progenitores de basófilos/mastócitos; A população 4 (P4, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105med/low CD150high CD41+) é enriquecida para progenitores megacariocíticos; e a População 5 (P5, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105 med/low CD150high CD41-) contém progenitores com eritróides, basófilos/mastócitos e potencial megacariocítico (EBMP) e progenitores multipotenciais (MPPs) eritróides/megacariocíticos/basófilos. Esta nova abordagem permite maior precisão na análise de progenitores eritróides e outros progenitores hematopoiéticos e também permite a referência à informação do transcriptoma para cada população de fluxo citometricamente definida.
Introduction
A eritropoiese pode ser dividida em duas fases principais: eritropoiese precoce e diferenciação terminal eritróide (Figura 1)1,2,3. Na eritropoiese precoce, as células-tronco hematopoiéticas se comprometem com a linhagem eritróide e dão origem a progenitores eritróides precoces, que foram identificados pela primeira vez na década de 1970 com base em seu potencial de formação de colônias em meio semissólido 4,5,6,7,8,9 . Em termos gerais, os progenitores eritróides são divididos em duas categorias: progenitores anteriores que dão origem a uma "explosão" (um grande agregado de aglomerados de células eritróides menores), denominada "unidade formadora de explosão eritróide" ou BFU-e 4,5,6; e sua progênie, que forma um único e pequeno aglomerado ou colônia de células eritróides, denominado "unidade formadora de colônias eritróide" ou UFC-e 7,8,9. BFU-e e UFC-e ainda não expressam genes eritróides terminais e não são morfologicamente reconhecíveis. Após uma série de divisões celulares de auto-renovação ou expansão, a UFC-e sofre uma troca transcricional na qual genes eritróides, como as globinas, são induzidos, fazendo a transição para a diferenciação terminal eritróide (ETD)1,10. Durante a ETD, os eritroblastos sofrem de três a cinco divisões celulares maturacionais antes de se enuclearem para formar reticulócitos, que amadurecem em glóbulos vermelhos.
Os eritroblastos durante a diferenciação terminal foram originalmente classificados com base em sua morfologia em proeritroblastos, basofílicos, policromáticos e ortocromáticos. O advento da citometria de fluxo permitiu sua classificação prospectiva e isolamento com base no tamanho celular (medido por espalhamento para frente, FSC) e dois marcadores de superfície celular, CD71 e Ter119 11,12,13 (Figura 1). Essa e outras abordagens citométricas de fluxo similares 14 revolucionaram a investigação dos aspectos moleculares e celulares da DTE, permitindo a análise específica do estágio de desenvolvimento de eritroblastos in vivo e in vitro 10,15,16,17,18,19,20. A abordagem CD71/Ter119 é agora utilizada rotineiramente na análise de precursores eritróides.
Até recentemente, uma abordagem citométrica de fluxo semelhante e acessível para o isolamento prospectivo direto e de alta pureza da UFC-e e da BFU-e do tecido do rato tem escapado aos investigadores. Em vez disso, os pesquisadores têm utilizado estratégias citométricas de fluxo que isolam apenas uma fração desses progenitores, muitas vezes na presença de células não eritróides que copurificam dentro dos mesmos subconjuntos citométricos de fluxo21. Consequentemente, a investigação de BFU-e e CFU-e limitou-se a sistemas de diferenciação in vitro que derivam e amplificam BFU-e e CFU-e de progenitores anteriores da medula óssea. É possível, então, aplicar estratégias citométricas de fluxo que distinguem a UFC-e da UFC-e nessas culturas enriquecidas com progenitores eritróides22,23. Uma abordagem alternativa faz uso da UFC-e fetal e da UPB-e, que são altamente enriquecidas na fração Ter119-negativa do fígado fetal do rato no meio da gestação 10,24,25. Nenhuma dessas abordagens, no entanto, permite a investigação de BFU-e e UFC-e adultas em seu estado fisiológico in vivo. A magnitude do desafio pode ser apreciada quando se lembra que, com base em ensaios de formação de colônias, essas células estão presentes na medula óssea adulta em uma frequência de apenas 0,025% e 0,3%, respectivamente6.
O protocolo aqui descrito é uma nova abordagem citométrica de fluxo baseada na análise transcriptômica de células da medula óssea de camundongos Kit+ recém-colhidas (o Kit é expresso por todas as populações progenitoras iniciais da medula óssea)1. Nossa abordagem contém alguns marcadores de superfície celular que já estavam em uso por Pronk et al.21,26. Transcriptomas unicelulares foram utilizados para determinar combinações de marcadores de superfície celular que identificam eritróides e outros progenitores hematopoiéticos precoces (Figura 2). Especificamente, a fração CD55+ de células Kit+ de linhagem negativa (Lin-) pode ser subdividida em cinco populações, três das quais produzem segmentos contíguos da trajetória eritróide (Figura 2). As identidades transcriptômicas de cada uma dessas populações foram confirmadas por classificação, seguida de scRNAseq e projeção dos transcriptomas de célula única classificados de volta ao mapa transcriptômico original (a expressão gênica em cada uma das cinco populações e todo o conjunto de dados da medula óssea podem ser explorados em https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)1 . O potencial de destino celular de cada uma das populações foi confirmado usando ensaios tradicionais de formação de colônias (Figura 2), bem como um novo ensaio de destino unicelular de alto rendimento 1,27. Essas análises mostram que a nova abordagem citométrica de fluxo resulta no isolamento de alta pureza de todos os progenitores de BFU-e e UFC-e da medula óssea adulta fresca e do baço. Especificamente, a população 1 (P1) contém apenas UFC-e e nenhum outro progenitor hematopoiético, e a população 2 (P2) contém todos os progenitores BFU-e da medula óssea e um pequeno número de UFC-e, mas nenhum outro progenitor1. O protocolo detalhado abaixo é ainda ilustrado com um experimento de exemplo em camundongos que foram injetados com solução salina ou com o hormônio eritropoiese-estimulante eritropoietina (Epo).
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Protocol
Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com os protocolos animais A-1586 e 202200017 aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Massachusetts Chan Medical School.
NOTA: Dois protocolos são detalhados aqui: primeiro, análise citométrica de fluxo (seção 1), seguida por ajustes de protocolo para classificação de citometria de fluxo (seção 2). O protocolo abaixo usa um citômetro/classificador de fluxo com 10 canais. Um exemplo de configuração é fornecido na Tabela 1, referida na etapa 1.14.5. Também é possível executar este protocolo com apenas nove canais; veja a legenda na Tabela 2.
1. Análise citométrica de fluxo
- Eutanasie camundongos adultos (>6 semanas de idade) Balb/C ou C57BL6 usando um método apropriado aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (por exemplo, inalação de CO2 seguida de luxação cervical). Para a análise citométrica de fluxo, a medula óssea (BM) de um único camundongo será suficiente. Para a classificação, o número de mouses depende das aplicações a jusante. O rendimento celular para cada população é dado a seguir (etapa 2.3.3).
- Colheita de tecidos:
- Preparar 5 mL de tubos de classificação celular ativada por fluorescência (FACS) contendo 3 mL de tampão de coloração frio (4 °C) ("SB5": solução salina tamponada com fosfato (PBS), albumina sérica bovina a 0,2% (BSA), glicose a 0,08%, EDTA a 5 mM) sobre gelo. Use isso para colocar tecidos colhidos.
- Prepare tubos separados para cada tecido dissecado de cada rato. Não agrupe tecidos de vários camundongos.
- Colha ambos os fêmures e ambas as tíbias. Remova todos os músculos dos ossos antes de colocá-los no tubo com SB5.
- Dissecar o baço através de uma incisão no lado esquerdo do abdômen.
- Extração de células da medula óssea:
- Coloque os fêmures e tíbias recém-dissecados diretamente no tampão de coloração a frio (SB5) e mantenha os tubos no gelo até que estejam prontos para extrair a medula óssea (BM). Coloque uma argamassa esterilizada limpa no gelo em um balde. Transfira os ossos para a argamassa juntamente com o SB5 do tubo.
- Recorte aproximadamente 1 mm das extremidades de cada osso com uma tesoura de dissecação para que o orifício do osso se torne apenas visível.
- Use uma agulha de 26 G e uma seringa de 3 mL cheia de SB5 para liberar a medula dos ossos e coletá-la na argamassa. Repita o processo 3-5 vezes usando buffer fresco de cada vez até que os ossos pareçam incolores.
- Filtre a medula lavada através de um filtro de malha de 100μm e colete as células em um tubo de centrífuga de 50 mL colocado no gelo.
- Use a argamassa e o pilão para esmagar os ossos lavados em 5-10 mL de SB5. Filtrar a mistura de ossos triturados e tampão através do filtro celular de 100 μm e agrupar com células recolhidas no passo 1.3.4.
- Extração de células do baço:
- Configure um filtro de malha de 100 μm em um tubo de centrífuga vazio de 50 mL colocado no gelo. Coloque um único baço no filtro de malha.
- Adicione 0,5-1 mL de SB5 ao baço para garantir que ele não seque.
- Usando o lado de borracha de um êmbolo de seringa de 3 mL ou 5 mL, amasse o baço através da malha. Adicione mais SB5, 5 mL de cada vez, e continue a amassar até que todas as células tenham sido coletadas no tubo.
- A partir deste ponto, a medula óssea e as células esplênicas são tratadas da mesma maneira.
- Gire as células para baixo a 900 x g, 4 °C durante 10 min. Aspirar o sobrenadante usando uma configuração de aspiração a vácuo.
- Para fazer uma suspensão de célula única, ressuspeite as células em 2 mL de SB5 e pipete para cima e para baixo 50 vezes usando um P1000 com uma grande ponta de orifício (ver Tabela de Materiais). Estes têm amplas aberturas de ponta para ajudar a evitar danos às células frágeis.
- Para contar as células, ressuspenda pipetando para cima e para baixo 20 vezes. Diluir as células na proporção de 1:100 em SB5. Misture 10 μL das células diluídas com 10 μL de azul de tripano e conte com um hemocitômetro e/ou contador celular.
- Gire as células para baixo a 900 x g, 4 °C durante 10 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células a 33 x 106 células vivas/ml em SB5.
- Preparar o cocktail Lin-FITC misturando volumes iguais de cada anticorpo na Tabela 3.
- Prepare as células para controles de cor única e controles de "Fluorescência menos um" (FMO). Realizar as etapas 1.11-1.12 em paralelo com a preparação e coloração das células da amostra na etapa 1.14 (amostras para análise citométrica de fluxo) e/ou na etapa 2.1 (classificação citométrica de fluxo).
- Preparar as células para um controlo celular não corado transferindo 50 μL (1,6 x 106 células) da suspensão celular para um tubo FACS no gelo. Prepare as células para cada controle de cor única (11 tubos) transferindo 50 μL (1,6 x 106 células) da suspensão celular para um tubo FACS no gelo.
- Prepare os controles FMO para as seguintes cores (Kit, CD41, CD150, CD49f [quatro tubos]) transferindo 300 μL (10 x 106 células) da suspensão celular para um tubo FACS separado no gelo.
- Girar as células a 900 x g, 4 °C durante 10 min e aspirar o sobrenadante.
- Coloração de anticorpos de FMOs e controles de cor única
- Coloração dos FMOs a 33 x 106 células/mL (em um volume total de 300 μL) em tubos FACS. Para cada controle, adicione todos os anticorpos, exceto o anticorpo homônimo do FMO. Por exemplo, para o Kit FMO, deixe de fora o anticorpo do Kit. Para cada anticorpo, utilizar a diluição e a concentração final como indicado no quadro 2.
- Coloração dos controles de cor única a 20 x 106 células/mL (em um volume total de 50 μL) em tubos FACS; para cada controlo, adicionar um único anticorpo à concentração indicada no quadro 2.
- Vórtice cada tubo de controle por 2-3 s a 3.000 rpm (rotações por minuto) e, em seguida, incubar a 4 °C, balançando por 2,5 h no escuro, protegido da luz. Agite os tubos com um eixo de rotação paralelo ao comprimento do tubo, entre aproximadamente um ângulo de 10° e um ângulo de 60° da horizontal, de modo que o conteúdo não toque na tampa.
- Lave as células com SB5: Completar o volume da suspensão celular para 4 ml com SB5. Gire as células para baixo a 900 x g, 4 °C durante 10 minutos e aspirar o sobrenadante.
- Ressuspensão:
- Ressuspeite os controles não corados e todos os controles de cor única (exceto o controle DAPI) em 300 μL de SB5 e filtre através de uma malha de filtro de 40 μm em um novo tubo FACS.
- Fazer uma solução de DAPI/SB5 diluindo o estoque de DAPI (1 mg/mL em etanol a 100%) a 1:10.000 em SB5.
- Ressuspeite os FMOs em 1,8 mL de DAPI/SB5 e filtre através de uma malha de filtro de 40 μm em um novo tubo FACS
- Ressuscite o controle de cor única DAPI em 300 μL de DAPI/SB5 e filtre através de uma malha de filtro de 40 μm em um novo tubo FACS de 4 mL.
- Preparação da amostra: Se as células estiverem a ser preparadas para a análise citométrica de fluxo, avance para o passo 1.14. Se preparar as células para classificação, avance para o passo 2.1.
- Coloração das amostras de análise citométrica de fluxo a 33 x 10 6 células/mL em um volume total de 300 μL (10 x 106 células) em tubos FACS:
- Prepare a mistura mestre de anticorpos. Determinar o volume da mistura principal pelo número de amostras, com 300 μL por amostra. Efectuar a mistura principal diluindo todos os anticorpos enumerados na Tabela 2 à diluição indicada em SB5. O Rabbit IgG no master mix serve como um bloco Fc.
- Vórtice cada tubo por 2-3 s a 3.000 rpm e, em seguida, incubar a 4 °C, balançando por 2,5 h no escuro, protegido da luz.
- Lave as células com SB5: Completar o volume da suspensão celular para 4 ml com SB5. Gire as células para baixo a 900 x g, 4 °C durante 10 minutos e aspirar o sobrenadante.
- Ressuspender as amostras para análise citométrica de fluxo em 1,8 mL de DAPI/SB5, conforme preparado na etapa 1.12.5.2, e filtrar através de uma malha filtrante de 40 μm para um tubo FACS.
- Analisar as amostras em um citômetro com 10 canais para acomodar os conjugados de anticorpos na Tabela 2 e o corante de viabilidade DAPI. Um exemplo de configuração de canal é fornecido na Tabela 1. Também é possível usar apenas nove canais; veja a legenda da Tabela 2 .
- Durante a análise dos dados de citometria de fluxo, use abordagens de compensação espectral padrão com a ajuda dos controles de cor única e controles FMO, conforme detalhado na etapa 2.4.
2. Ajustes de protocolo para classificação citométrica de fluxo
- Preparação de Lin-
- Agrupe todas as células extraídas do mesmo tecido (BM ou baço) de 10 camundongos em um tubo de 50 mL. Ressuspenda cada amostra agrupada por pipetagem usando um P1000 com uma grande ponta de orifício.
- Girar as células a 900 x g, 4 °C durante 10 min e aspirar o sobrenadante.
- Preparar controles de cor única e FMO, conforme descrito na seção 1, usando células não enriquecidas.
- Enriqueça células Lin para classificação usando enriquecimento de grânulos magnéticos de células Lin:
- Ressuspeite as células em 1 x 108 células/mL com SB5 e transfira-as para um tubo de 15 mL. Adicionar soro normal de rato e os anticorpos biotinilados enumerados no quadro 4 e incubar com balanço a 4 °C durante 1 h.
- Girar as células para baixo a 900 x g, 4 °C durante 10 min e aspirar o sobrenadante. Ressuspender as células em 15 mL de SB5 frio.
- Girar as células para baixo a 900 x g, 4 °C durante 10 min e aspirar o sobrenadante. Ressuspeite as células em 1 x 108 células/mL no SB5 frio e mantenha-as no gelo.
- Vórtice as nanoesferas magnéticas a 3.000 rpm por 5-10 s. Tome 1 mL de nanoesferas magnéticas para cada 10 mL de células.
- Lave as nanoesferas em um tubo FACS de 5 mL. Perfazer o volume até 4 mL com SB5, girar a 900 x g, 4 °C por 5 min e aspirar o sobrenadante.
- Ressuspender as nanoesferas em 500 μL de SB5 e misturar com as células preparadas na etapa 2.1.7. Incubar a 4 °C com balanço durante 15 min.
- Girar as células para baixo a 900 x g, 4 °C durante 10 min e aspirar o sobrenadante. Ressuspenda as células em 1 x 108 células/mL com SB5.
- Coloque o tubo num íman a 4 °C durante 5 minutos.
- Despeje cuidadosamente o sobrenadante em um novo tubo de 15 mL.
- Colocar o tubo que contém o sobrenadante da etapa 2.1.13 num íman a 4 °C durante 5 minutos. Despeje cuidadosamente o sobrenadante em um novo tubo de 15 mL.
- Girar as células do sobrenadante na etapa 2.1.14 a 900 x g, 4 °C durante 10 minutos e aspirar o sobrenadante.
- Ressuspender as células enriquecidas com Lin em 1 mL de SB5.
- Diluir 10 μL das células a 1:100 em SB5. Misture 10 μL das células diluídas com 10 μL de azul de tripano e conte com um hemocitômetro e/ou contador celular.
- Com base na contagem de células na etapa 2.1.17, ressuspeite as células enriquecidas com Lin em 33 x 106 células/mL.
- Coloração de células enriquecidas:
- Coloração das amostras de células enriquecidas a 33 x 106 células/mL em tubos FACS adicionando todos os anticorpos listados na Tabela 2. Vórtice cada tubo por 2-3 s a 3.000 rpm e, em seguida, incubar a 4 °C, balançando por 2,5 h no escuro, protegido da luz.
- Lave as células com SB5: Completar o volume dos tubos FACS para 4 mL com SB5. Gire as células para baixo a 900 x g, 4 °C por 10 minutos e remova o sobrenadante.
- Ressuspender as amostras para análise citométrica de fluxo em 4-6 mL de DAPI/SB5 conforme preparado na etapa 1.12.5.2 e filtrar através de uma malha filtrante de 40 μm em um novo tubo FACS de 4 mL.
- Classificação de amostras:
- Separe as amostras com um bocal grande e baixa pressão para maximizar o rendimento de UFC-e, uma vez que as células de UFC-e são facilmente danificadas sob alta pressão. Para o citômetro de fluxo utilizado neste estudo, utilizar 14 psi e um bocal de 100 μm ou 12 psi com bico de 130 μm. Configure as portas de classificação conforme descrito na etapa 2.4 abaixo.
- Prepare o tampão de coleta: Adicione 20% de soro fetal bovino ao PBS.
- Para verificar as purezas das populações classificadas, execute novamente uma pequena alíquota de cada população classificada em um buffer que contenha DAPI, conforme descrito na etapa 1.12.5.2.
NOTA: Normalmente, o BM de um total de 10 camundongos (aproximadamente 1 x 109 células) produz pelo menos 50.000-100.000 células para cada uma das populações P1-hi, P1-low e P2 com uma viabilidade de aproximadamente 70%.
- Use a estratégia de bloqueio mostrada na Figura 3 para análise ou configuração das portas de classificação.
- Use o parâmetro FSC (forward-scatter) para remover os detritos com base no tamanho. Use o histograma FSC-height versus FSC-area para excluir agregados de células e selecionar células únicas; repetir com o histograma de altura de dispersão lateral (SSC) versus área de SSC.
- Exclua as células mortas eliminando as células que são positivas para o corante de DNA DAPI, ao qual as células viáveis são impermeáveis.
- Selecione células Lin-Ter119-Kit+ e, a partir delas, selecione uma subpopulação que expresse CD55.
- Subdivida as células Lin-Ter119-Kit+CD55+ em duas populações principais, P6 e P7, com base na expressão de CD49f e CD105.
- Com base na expressão de CD150 e CD41, subdivida P6 ainda mais em P3 (progenitores basófilos ou mastócitos), P4 (progenitores megacariocíticos) e P5 (EBMP e MPP com viés eritróide).
- Com base na expressão de CD150 e CD71, subdivida P7 ainda mais em P2 (BFU-e), UFC-e precoce (P1-baixo) e UFC-e tardia (P1-hi).
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Representative Results
O protocolo descreve uma abordagem citométrica de fluxo para identificar BFU-es e UFC-es em células recém-colhidas da medula óssea e do baço. Começa com a colheita de BM fresco e baço de ratos e imediatamente colocando o tecido no gelo. Todos os procedimentos são realizados a frio para preservar a viabilidade celular. As células são marcadas com um coquetel de anticorpos de "linhagem" que permite a exclusão de todas as células que expressam marcadores de linhagens sanguíneas diferenciadas (o coquetel FITC-Lin, Tabela 3, no caso da análise citométrica de fluxo; ou enriquecimento de esferas magnéticas, Tabela 4, para células negativas para linhagem). As células também são marcadas com anticorpos contra marcadores que nos permitem distinguir um número de populações progenitoras precoces dentro da fração celular negativa para linhagem. A marcação é seguida por classificação ou análise citométrica de fluxo. A abordagem para a classificação citométrica de fluxo é semelhante à da análise citométrica de fluxo, mas é precedida pelo enriquecimento de esferas magnéticas para a fração de células Lin para reduzir o tempo e a despesa de classificar um grande número de células . Ao classificar progenitores, o BM é agrupado a partir de vários mouses, o número depende do aplicativo a jusante. Normalmente, o BM de um total de 10 camundongos (aproximadamente 1 x 109 células) produz pelo menos 50.000-100.000 células para cada uma das populações P1-hi, P1-low e P2 com uma viabilidade de aproximadamente 70%.
A principal diferença entre as populações derivadas do baço e da BM identificadas por este protocolo é a frequência muito menor da população P6 e suas subpopulações, P4/P5/P3, em células derivadas do baço.
Como exemplo de análise citométrica de fluxo, o efeito da administração de Epo em ratinhos foi examinado. O Epo se liga e ativa o receptor Epo (EpoR), que é essencial para a eritropoiese basal e acelerada sob condições de estresse como hipóxia. A hipóxia estimula o aumento dos níveis sanguíneos de Epo 28,18, promovendo por sua vez a expansão da UFC-e 1,29 e dos precursores eritróides.
Epo (0,25 U/g de peso corporal) ou um volume igual de veículo (solução salina) foram injetados por via subcutânea em camundongos uma vez a cada 24 horas por 3 dias. O BM e o baço foram colhidos às 72 h. A estimulação de Epo levou à expansão das populações precoce e tardia de UFC-e (P1-baixa e P1-hi) tanto no BM quanto no baço (Figura 4 e Figura 5).
Figura 1: Duas fases principais da eritropoiese definitiva. A eritropoiese pode ser dividida em uma fase inicial, onde os progenitores são definidos com base em seu potencial de formação de colônias, e uma fase posterior conhecida como diferenciação terminal eritróide (ETD), onde o estágio eritroblasto é definido com base na morfologia. As técnicas de citometria de fluxo têm permitido o isolamento prospectivo de estádios eritroblastos específicos do desenvolvimento utilizando FSC, Ter119 e CD71. Por outro lado, não houve um método equivalente para isolar progenitores BFU-e e CFU-e diretamente de tecidos com alta pureza. Note que apenas uma fração da colônia BFU-e é mostrada. A barra de escala aplica-se às colônias CFU-e e BFU-e. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Uma nova estratégia citométrica de fluxo para isolar UFC-e e BFU-e diretamente do tecido. Este manuscrito descreve um protocolo para identificação de cinco novas populações de citometria de fluxo, P1 a P5, com base em uma análise dos dados de scRNAseq. (A) Projeção gráfica dirigida por força ("Gráfico de mola") de transcriptomas unicelulares de medula óssea adulta Balb/C frescos. As cores indicam o potencial de destino celular previsto com base em informações transcriptômicas e no algoritmo de análise de balanço populacional (PBA)1. São indicadas as regiões do gráfico que correspondem a cada uma das populações de citometria de fluxo de P1 a P5. As regiões delineadas são aproximações desenhadas à mão dos dados originais, que podem ser encontradas em Tusi et al.1. A correspondência foi confirmada pela realização de scRNAseq de cada uma das populações classificadas de P1 a P51. E = eritróide; Ba = progenitores basofílicos ou mastócitos; Meg = progenitores megacariocíticos; Ly = Progenitores linfocíticos; D = progenitores dendríticos; M = progenitores monocíticos; G = progenitores granulocíticos. (B) Ensaios de formação de colônias, replotados a partir de Tusi et al.1. As populações de P1 a P5 e as células CD55+ foram classificadas conforme descrito neste protocolo, e cada população foi chapeada para os ensaios relevantes de formação de colônias. As colônias eritróides foram pontuadas nos dias indicados. UF = unifocal; MF = multifocal; UFC-MK = unidade formadora de colônias megacariocítica; UFC-GM = unidade formadora de colônias granulocítica/monocítica; UFC-GEMM = unidade formadora de colônias granulocítica, eritróide, monocítica, megacariocítica. (C) Marcadores de superfície celular que definem cada uma das cinco populações, bem como seu potencial de destino celular. O potencial de destino celular é tanto o resultado da informação transcriptômica quanto dos ensaios de destino celular, tanto da formação de colônias quanto dos ensaios de destino unicelular 1,27. Digno de nota, a população P1 foi dividida com base na expressão do marcador CD71 em P1-hi e P1-low1. Com base em dados de Tusi et al.1. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Estratégia de bloqueio citométrico de fluxo. A estratégia completa de gating para populações P1 a P5. Medula óssea (BM) ou baço (SP) recém-colhidos de um camundongo Balb/C injetado por via subcutânea com 100 μL de solução salina estéril a 0,9% são primeiro fechados para a população principal, descartando detritos; isso é seguido pela seleção de singletos, descartando células mortas e congelando células que são Ter119-negativas, linhagen-negativas e Express Kit. A subdivisão adicional de Ter119-Lin-Kit+CD55+ em P6 e P7 é seguida pela subdivisão final em populações P1 a P5 (ver também a Figura 2). O canal Ter119 permite a análise de eritroblastos em uma mesma amostra (utilizando a abordagem Ter119/CD7112). No entanto, um canal Ter119 separado não é essencial para este protocolo, e o anticorpo Ter119 pode ser omitido da mistura principal e incluído como parte do coquetel Lin-FITC. A etapa de exclusão para células positivas Ter119 não é mostrada nesta estratégia de bloqueio. Os números são porcentagens de cada porta dentro do histograma mostrado. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise dos progenitores eritróides precoces da medula óssea e do baço após estimulação de Epo. Gráficos citométricos de fluxo representativos da medula óssea (BM) ou do baço (SP) recém-colhidos. Os camundongos Balb/C foram injetados por via subcutânea com peso corporal de Epo de 0,25 U/g ou com um volume equivalente de solução salina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: A resposta dos progenitores BM e baço ao Epo in vivo. Estatísticas sumárias que mostram alterações no número absoluto de células nas populações P1 a P5 após a injeção de Epo em células da medula óssea e (B) do baço recém-colhidas (A); *p = 0,02. Experimento conforme descrito na Figura 4. n = 4 camundongos em cada grupo. Para o cálculo do número absoluto de células, a frequência de células em cada população no BM ou no baço (a partir da Figura 4) foi multiplicada pelo número total de células BM ou baço colhidas de cada camundongo e dividida pelo peso do camundongo em gramas. É importante notar que apenas a UFC-e precoce no BM atingiu significância estatística (p = 0,02), provavelmente uma combinação de uma dose relativamente baixa de Epo e um pequeno número de camundongos em cada grupo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Matriz de detectores | PGTO | Espelho dicroico | Filtro passa-banda | Fluoróforo detectado |
| Laser azul (488 nm) | Um | 685LP | 695/40 | |
| B | 505LP | 530/30 | Lin-FITC (+Ter119-FITC) | |
| C | 488/10 | |||
| Laser violeta (405 nm) | Um | 760LP | 800/80 | |
| B | 630LP | 660/20 | CD150-BV650 | |
| C | 595LP | 605/20 | CD41-BV605 | |
| D | 475LP | 525/20 | ||
| E | 450/50 | CD49f-BV421 | ||
| Laser vermelho (640 nm) | Um | 755LP | 785/50 | cKit-APC-Cy7 |
| B | 700 LP | 720/30 | ||
| C | 675/14 | CD55-AF 647 | ||
| Laser UV (355 nm) | Um | 505LP | 525/20 | |
| B | 420LP | 450/50 | DAPI | |
| C | 379/28 | Ter119-BUV 395 | ||
| YG Laser (561 nm) | Um | 755LP | 780/60 | CD71-PE-Cy7 |
| B | 685LP | 710/50 | ||
| C | 635LP | 660/20 | ||
| D | 600LP | 610/20 | ||
| E | 570LP | 580/20 | CD105-PE |
Tabela 1: Exemplo do layout do canal em um citômetro LSRII. O painel de anticorpos utilizado no protocolo descrito e sua disposição no citômetro de fluxo LSRII para coleta de dados.
| Reagente ou Anticorpo | Conjugado | Estoque conc. (mg/mL) | Fator de diluição | Concentração final em suspensão celular (μg/mL) | Clone |
| CD71 | PE/Cy7 | 0.2 | 2000 | 0.1 | RI7217 |
| TER-119 | BUV395 | 0.2 | 100 | 2 | TER-119 |
| CD55 (DAF) | AF647 | 0.5 | 50 | 10 | RIKO-3 |
| CD105 | PE | 0.2 | 50 | 4 | MJ7/18 |
| CD150 (SLAM) | BV650 | 0.1 | 50 | 2 | TC15-12F12.2 |
| CD49f | BV421 | 0.025 | 50 | 0.5 | GoH3 |
| CD41 | BV605 | 0.2 | 100 | 2 | MWReg30 |
| CD117 (cKit) | APC/Cy7 | 0.2 | 200 | 1 | 2B8 |
| Coquetel Lin | FITC | 0,08 (para cada anticorpo no cocktail) | 83 | 1 (para cada anticorpo no cocktail) | |
| Coelho IgG | 10 | 50 | 200 |
Tabela 2: Componentes master-mix de anticorpos. Composição da mistura mestre de anticorpos. O canal Ter119 permite a análise de eritroblastos em uma mesma amostra (utilizando a abordagem Ter119/CD7112). No entanto, um canal Ter119 separado não é essencial para este protocolo, e o anticorpo Ter119 pode ser omitido da mistura principal e incluído como parte do coquetel Lin-FITC.
| Reagente ou Anticorpo | Conjugado | Estoque conc. (mg/mL) | Clone |
| Ly-6G e Ly-6C | FITC | 0.5 | RB6-8C5 |
| CD11b | FITC | 0.5 | M1/70 |
| CD19 | FITC | 0.5 | 1D3 |
| CD4 | FITC | 0.5 | RM4-5 |
| CD8a | FITC | 0.5 | 53-6.7 |
| F4/80 | FITC | 0.5 | BM8 |
Tabela 3: Componentes do coquetel Lin. Composição do cocktail Lin utilizado como parte da mistura de anticorpos master (ver detalhes da mistura master no Quadro 2).
| Reagente ou Anticorpo | Conjugado | Estoque conc. (mg/mL) | Fator de diluição | Concentração final em suspensão celular (μg/mL) | Clone |
| Ly-6G e Ly-6C | Biotina | 0.5 | 200 | 2.5 | RB6-8C5 |
| CD11b | Biotina | 0.5 | 200 | 2.5 | M1/70 |
| CD19 | Biotina | 0.5 | 200 | 2.5 | 1D3 |
| CD4 | Biotina | 0.5 | 200 | 2.5 | RM4-5 |
| CD8a | Biotina | 0.5 | 200 | 2.5 | 53-6.7 |
| F4/80 | Biotina | 0.5 | 200 | 2.5 | BM8 |
| TER-119 | Biotina | 0.5 | 200 | 2.5 | TER-119 |
| Soro normal de ratos | 50 |
Tabela 4: Anticorpos para enriquecimento de esferas magnéticas. Anticorpos usados para enriquecer a fração de Lin do BM ou do baço antes da classificação celular.
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Discussion
A capacidade de isolar prospectivamente progenitores BFU-e e CFU-e diretamente de tecido fresco com alta pureza já havia escapado aos pesquisadores. Nossa nova abordagem, validada usando scRNAseq e ensaios de destino celular 1,27, agora oferece as ferramentas para fazer isso.
Há uma série de pontos-chave para executar com sucesso os protocolos de classificação e analíticos. Primeiro, as células precisam ser giradas a 900 x g para evitar a perda de células de baixa densidade. Muitas células no estágio CFU-e são células grandes e de baixa densidade que, de outra forma, poderiam ser perdidas. Em segundo lugar, é necessário usar grandes pontas de orifício ao pipetar para cima e para baixo para ajudar a quebrar os agregados celulares e evitar a perda de células P1 e P2 frágeis. Esta etapa é importante, uma vez que muitos progenitores de UFC-e estão associados a macrófagos de ilha eritroblástica (EBIs) e seriam perdidos se não fossem dissociados com sucesso. Em terceiro lugar, as células são incubadas com um tampão contendo EDTA ("SB5") antes da coloração, o que ajuda a dissociar as EBIs. Em quarto lugar, durante a aquisição de dados citométricos de fluxo, a taxa de aquisição não deve exceder 7.000 eventos/s ou a taxa recomendada para o instrumento de citômetro de fluxo que está sendo usado.
As populações P1 e P2 contêm todos os progenitores UFC-e e BFU-e na medula óssea, respectivamente, e não contêm outros tipos de células progenitoras1. A população P1 é dividida em UFC-e precoce (P1-baixa) e UFC-e tardia (P1-hi) com base na expressão de CD711. Essas populações citométricas de fluxo altamente puras fornecem uma imagem completa das populações progenitoras de BFU-e e CFU-e in vivo.
Uma desvantagem é que a população P2 contém uma pequena fração dos primeiros progenitores da UFC-e. No entanto, contém todas as células BFU-e no BM e nenhum outro tipo de célula. A população P1 contém toda a UFC-e no BM, exceto a pequena fração que está presente em P2. Ao contrário das populações P1 e P2, P3 a P5 são populações progenitoras altamente enriquecidas, mas não puras.
A aplicação desta ferramenta citométrica de fluxo a modelos de eritropoiese em camundongos permitiria agora a determinação de respostas celulares e moleculares durante perturbações fisiológicas e patológicas à eritropoiese. No exemplo mostrado, os ratos foram injetados com o hormônio Epo. Esta abordagem pode ser usada em camundongos geneticamente modificados, por exemplo, em modelos de hemoglobinopatias em camundongos, para uma análise molecular mais precisa de seus progenitores eritróides alterados in vivo.
DISPONIBILIDADE DE DADOS:
Dados adicionais associados aos experimentos da Figura 4 e da Figura 5 estão disponíveis mediante solicitação.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado pelos subsídios do NIH R01DK130498, R01DK120639 e R01HL141402
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575020 | |
| 1000 µL large orifice tips | USA sceintific | 1011-9000 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD55 (DAF) Antibody | BioLegend | 131806 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) Antibody | BioLegend | 105826 | |
| Biotin-CD11b | BD Biosciences | 557395 | M1/70 (clone) |
| Biotin-CD19 | BD Biosciences | 553784 | 1D3 (clone) |
| Biotin-CD4 | BD Biosciences | BDB553045 | RM4-5 (clone) |
| Biotin-CD8a | BD Biosciences | BDB553029 | 53-6.7 (clone) |
| Biotin-F4/80 | Biolegend | 123106 | BM8 (clone) |
| Biotin-Ly-6G and Ly-6C | BD Biosciences | 553125 | RB6-8C5 (clone) |
| Biotin-TER-119 | BD Biosciences | 553672 | TER-119 (clone) |
| Bovine Serum Albumin | Sigma aldritch | A1470 | |
| Brilliant Violet 421 anti-human/mouse CD49f Antibody | BioLegend | 313624 | |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD41 Antibody | BioLegend | 133921 | |
| Brilliant Violet 650 anti-mouse CD150 (SLAM) Antibody | BioLegend | 115931 | |
| BUV395 Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells | BD Biosciences | 563827 | |
| ChromPure Rabbit IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 011-000-003 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306 | |
| Digital DIVA hardware and software for LSR II | BD Biosciences | ||
| FITC anti-mouse F4/80 Antibody | BioLegend | 123108 | |
| FITC Rat Anti-CD11b | BD Biosciences | 557396 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD19 | BD Biosciences | 553785 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD4 | BD Biosciences | 553047 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 553031 | |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and LY-6C | BD Biosciences | 553127 | |
| FlowJo software | FlowJo | version 10 | Flow cytometer analysis software |
| LSR II digital multiparameter flow cytometer analyzer | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| NewlineNY Stainless Steel Hand Masher & Bowl, Mortar and Pestle Set | Amazon | ||
| Normal rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| PE anti-mouse CD105 Antibody | BioLegend | 120408 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD71 Antibody | BioLegend | 113812 | |
| Phosphate Buffered Saline, 10x Solution | Fisher scientific | BP3994 | |
| Streptavidin Nanobeads | BioLegend | 480016 | Magnetic beads |
References
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