Summary
Здесь мы описываем новый проточный цитометрический метод перспективной изоляции ранних всплескообразующих единиц эритроидных (BFU-e) и колониеобразующих единиц эритроидных (CFU-e) прародителей непосредственно из свежего костного мозга и селезенки мыши. Этот протокол, разработанный на основе одноклеточных транскриптомных данных, является первым, который выделяет всех эритроидных предшественников ткани с высокой чистотой.
Abstract
Ранние эритроидные прародители были первоначально определены их колониеобразующим потенциалом in vitro и классифицированы на разрывообразующие и колониеобразующие «единицы», известные как BFU-e и CFU-e. До недавнего времени методы прямого проспективного и полного выделения чистых предшественников BFU-e и CFU-e из свежеизолированного костного мозга взрослой мыши были недоступны. Чтобы устранить этот пробел, был проанализирован набор данных одноклеточной РНК-seq (scRNAseq) костного мозга мыши для экспрессии генов, кодирующих маркеры клеточной поверхности. Этот анализ был объединен с анализами судьбы клеток, что позволило разработать новый проточный цитометрический подход, который идентифицирует и позволяет выделять полные и чистые подмножества предшественников BFU-e и CFU-e в костном мозге или селезенке мыши. Этот подход также идентифицирует другие подмножества предшественников, включая подмножества, обогащенные базофильными/тучными клетками и мегакариоцитарными потенциалами. Метод заключается в маркировке свежих клеток костного мозга или селезенки антителами, направленными на Кит и CD55. Прародители, которые экспрессируют оба этих маркера, затем подразделяются на пять основных популяций. Популяция 1 (P1 или CFU-e, Kit+ CD55+ CD49fmed/low CD105med/high CD71med/high) содержит все предшественники КОЕ-e и может быть дополнительно подразделена на P1-low (CD71med CD150high) и P1-hi (CD71high CD150low), соответствующие раннему и позднему CFU-e, соответственно; Популяция 2 (P2 или BFU-e, Kit+ CD55+ CD49fmed/low CD105med/high CD71low CD150high) содержит все предшественники BFU-e; Популяция P3 (P3, Kit+ CD55+ CD49fmed/high CD105med/low CD150low CD41low) обогащена базафильными/тучными клетками-предшественниками; Популяция 4 (P4, Kit+ CD55+ CD49fmed/high CD105med/low CD150high CD41+) обогащена мегакариоцитарными предшественниками; и популяция 5 (P5, Kit+ CD55+ CD49fmed/high CD105med/low CD150high CD41-) содержит предшественники с эритроидами, базофилами/тучными клетками и мегакариоцитарным потенциалом (EBMP) и эритроидными/мегакариоцитарными/базофильными мультипотенциальными предшественниками (MPP). Этот новый подход обеспечивает большую точность при анализе эритроидных и других гемопоэтических предшественников, а также позволяет ссылаться на информацию транскриптома для каждой цитометрически определенной популяции потока.
Introduction
Эритропоэз можно разделить на две основные фазы: ранний эритропоэз и терминальная дифференциация эритроида (рисунок 1)1,2,3. В раннем эритропоэзе гемопоэтические стволовые клетки связываются с эритроидной линией и дают начало ранним эритроидным предшественникам, которые были впервые идентифицированы в 1970-х годах на основе их колониеобразующего потенциала в полутвердой среде 4,5,6,7,8,9 . В целом, эритроидные предшественники делятся на две категории: более ранние прародители, каждый из которых порождает «всплеск» (большая совокупность меньших кластеров эритроидных клеток), называемый «взрывообразующим блоком эритроида» или BFU-e 4,5,6; и их потомство, каждое из которых образует единый небольшой эритроидный клеточный кластер или колонию, названную «колониеобразующей единицей эритроида» или КОЕ-е 7,8,9. BFU-e и CFU-e еще не экспрессируют терминальные эритроидные гены и не являются морфологически узнаваемыми. После ряда делений самообновления или расширения клеток КОЕ-е подвергается транскрипционному переключателю, при котором индуцируются эритроидные гены, такие как глобины, тем самым переходя в эритроидную терминальную дифференцировку (ETD)1,10. Во время ETD эритробласты подвергаются трем-пяти матурационным клеточным делениям, прежде чем энуклеироваться с образованием ретикулоцитов, которые созревают в красные клетки.
Эритробласты во время терминальной дифференцировки были первоначально классифицированы на основе их морфологии на проэритробласты, базофильные, полихроматические и ортохроматические. Появление проточной цитометрии позволило провести их перспективную сортировку и выделение на основе размера ячейки (измеренного прямым рассеянием, FSC) и двух маркеров поверхности клеток, CD71 и Ter119 11,12,13 (рисунок 1). Этот и подобные им проточные цитометрические подходы14 произвели революцию в исследовании молекулярных и клеточных аспектов ETD, позволив проводить специфический для стадии развития эритробластов in vivo и in vitro 10,15,16,17,18,19,20. Подход CD71/Ter119 в настоящее время регулярно используется при анализе предшественников эритроида.
До недавнего времени аналогичный, доступный проточный цитометрический подход для прямой перспективной изоляции КОЕ-е и БФУ-е из ткани мыши ускользал от исследователей. Вместо этого исследователи использовали проточные цитометрические стратегии, которые изолируют только часть этих предшественников, часто в присутствии неэритроидных клеток, которые совместно очищаются в пределах одного и того же проточного цитометрического подмножества21. Следовательно, исследование BFU-e и CFU-e было ограничено системами дифференцировки in vitro, которые получают и амплируют BFU-e и CFU-e от более ранних предшественников костного мозга. Затем можно применить проточные цитометрические стратегии, которые отличают КОЕ-е от БФУ-е в этих эритроидных культурах, обогащенных предшественниками22,23. Альтернативный подход использует фетальные КОЕ-е и БФУ-е, которые высоко обогащены в Ter119-отрицательной фракции печени плода мыши в середине беременности 10,24,25. Ни один из этих подходов, однако, не позволяет исследовать взрослые BFU-e и CFU-e в их физиологическом состоянии in vivo. Величину проблемы можно оценить, если напомнить, что, основываясь на анализах колониеобразования, эти клетки присутствуют во взрослом костном мозге с частотой всего 0,025% и 0,3% соответственно6.
Протокол, описанный здесь, представляет собой новый проточный цитометрический подход, основанный на одноклеточном транскриптомном анализе свежесобранных клеток костного мозга мыши Kit+ (Kit экспрессируется всеми ранними популяциями-предшественниками костного мозга)1. Наш подход содержит некоторые маркеры клеточной поверхности, которые уже использовались Pronk et al.21,26. Одноклеточные транскриптомы использовались для определения комбинаций маркеров клеточной поверхности, которые идентифицируют эритроидные и другие ранние кроветворные предшественники (рисунок 2). В частности, фракция CD55+ линейно-отрицательных (Lin-) клеток Kit+ может быть подразделена на пять популяций, три из которых дают смежные сегменты траектории эритроида (рисунок 2). Транскриптомные идентичности каждой из этих популяций были подтверждены сортировкой, за которой последовал scRNAseq и проекция отсортированных одноклеточных транскриптомов обратно на исходную транскриптомную карту (экспрессия генов в каждой из пяти популяций и весь набор данных костного мозга могут быть изучены в https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)1 . Потенциал судьбы клеток каждой из популяций был подтвержден с использованием традиционных анализов формирования колоний (рисунок 2), а также нового высокопроизводительного анализа судьбы одноклеточныхклеток 1,27. Эти анализы показывают, что новый проточный цитометрический подход приводит к высокочистой изоляции всех предшественников BFU-e и CFU-e свежих взрослых костного мозга и селезенки. В частности, популяция 1 (P1) содержит только КОЕ-е и никаких других кроветворных предшественников, а популяция 2 (Р2) содержит все предшественники BFU-e костного мозга и небольшое количество КОЕ-е, но не содержит других прародителей1. Подробный протокол ниже дополнительно проиллюстрирован примером эксперимента на мышах, которым вводили либо физиологический раствор, либо эритропоэз-стимулирующий гормон эритропоэтин (Эпо).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты проводились в соответствии с протоколами на животных A-1586 и 202200017 одобрены Комитетом по институциональным уходу и использованию животных Медицинской школы Чана Массачусетского университета.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь подробно описаны два протокола: во-первых, проточный цитометрический анализ (раздел 1), за которым следуют корректировки протокола для проточной цитометрической сортировки (раздел 2). Приведенный ниже протокол использует проточный цитометр/сортировщик с 10 каналами. Пример установки приведен в таблице 1, упомянутой на шаге 1.14.5. Также можно запустить этот протокол только с девятью каналами; см. легенду в таблице 2.
1. Проточный цитометрический анализ
- Усыплите взрослых (>6 недель) мышей Balb/C или C57BL6, используя соответствующий метод, одобренный вашим Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (например, вдыхание CO2 с последующим вывихом шейки матки). Для проточного цитометрического анализа будет достаточно костного мозга (БМ) от одной мыши. Для сортировки количество мышей зависит от последующих приложений. Выход клеток для каждой популяции приведен ниже (шаг 2.3.3).
- Сбор ткани:
- Подготовьте 5 мл флуоресцентно-активированных клеточных сортировочных (FACS) пробирок, содержащих 3 мл холодного (4 °C) буфера окрашивания («SB5»: фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS), 0,2% бычьего сывороточного альбумина (BSA), 0,08% глюкозы, 5 мМ ЭДТА) на льду. Используйте это для размещения собранных тканей.
- Подготовьте отдельные трубки для каждой ткани, рассеченной у каждой мыши. Не объединяйте ткани нескольких мышей.
- Заготавливайте обе бедренные кости и обе большеберцовые кости. Удалите все мышцы из костей, прежде чем поместить их в трубку с SB5.
- Рассекните селезенку через разрез с левой стороны живота.
- Извлечение клеток костного мозга:
- Поместите свежерассеченные бедренные и большеберцовые кости непосредственно в буфер холодного окрашивания (SB5) и держите трубки на льду до готовности к извлечению костного мозга (BM). Поместите чистый стерилизованный раствор на лед в ведро. Переложите кости в раствор вместе с SB5 из трубки.
- Отрежьте примерно 1 мм концов каждой кости ножницами для рассечения, чтобы отверстие кости стало просто видимым.
- Используйте иглу 26 г и шприц объемом 3 мл, наполненный SB5, чтобы вымыть костный мозг из костей и собрать его в раствор. Повторяйте процесс 3-5 раз, используя свежий буфер каждый раз, пока кости не появятся бесцветными.
- Отфильтруйте промытый костный мозг через сетчатый фильтр 100 мкм и соберите ячейки в центрифужную трубку объемом 50 мл, помещенную на лед.
- Используйте ступку и пестик, чтобы раздавить покрасневшие кости в 5-10 мл SB5. Фильтруйте смесь измельченных костей и буфер через клеточный сетчатый фильтр 100 мкм и пул с клетками, собранными на этапе 1.3.4.
- Извлечение клеток селезенки:
- Установите сетчатый фильтр 100 мкм на пустой центрифужной трубке объемом 50 мл, помещенной на лед. Поместите одну селезенку на сетчатый фильтр.
- Добавьте 0,5-1 мл SB5 в селезенку, чтобы она не высохла.
- Используя резиновую сторону шприцевого плунжера объемом 3 мл или 5 мл, размяните селезенку через сетку. Добавьте еще SB5, 5 мл за раз, и продолжайте размять, пока все клетки не будут собраны в трубку.
- С этого момента клетки костного мозга и селезенки обрабатываются таким же образом.
- Раскрутите ячейки вниз при 900 x g, 4 °C в течение 10 мин. Аспирация супернатанта с помощью вакуум-аспирационной установки.
- Чтобы сделать одноэлементную суспензию, повторно суспендируйте ячейки в 2 мл SB5 и пипетируйте вверх и вниз 50 раз, используя P1000 с большим наконечником отверстия (см. Таблицу материалов). Они имеют широкие отверстия наконечника, чтобы помочь предотвратить повреждение хрупких клеток.
- Чтобы подсчитать ячейки, повторно суспендируйте путем пипетирования вверх и вниз 20 раз. Разбавляют клетки в соотношении 1:100 в SB5. Смешайте 10 мкл разбавленных клеток с 10 мкл трипан-синего и рассчитывайте на гемоцитометр и/или счетчик клеток.
- Раскрутите ячейки вниз при 900 x g, 4 °C в течение 10 мин. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать клетки при 33 х 106 живых клетках / мл в SB5.
- Приготовьте коктейль Lin-FITC, смешивая равные объемы каждого антитела в таблице 3.
- Подготовьте ячейки для одноцветных элементов управления и элементов управления "Флуоресценция минус один" (FMO). Осуществляют этапы 1.11-1.12 параллельно с подготовкой и окрашиванием образцов клеток на стадии 1.14 (образцы для проточного цитометрического анализа) и/или стадии 2.1 (проточная цитометрическая сортировка).
- Подготовьте клетки к неиспорченному клеточному контролю, перенеся 50 мкл (1,6 х 106 клеток) клеточной суспензии в трубку FACS на льду. Подготовьте ячейки для каждого отдельного цветового контроля (11 пробирок) путем переноса 50 мкл (1,6 х 106 клеток) клеточной суспензии в трубку FACS на льду.
- Подготовьте элементы управления FMO для следующих цветов (Kit, CD41, CD150, CD49f [четыре трубки]), перенеся 300 мкл (10 x 106 клеток) клеточной суспензии в отдельную трубку FACS на льду.
- Раскрутите клетки при 900 х г, 4 °C в течение 10 мин и аспирируйте супернатант.
- Окрашивание антителами ОМО и одноцветные элементы управления
- Окрашивайте МФО в 33 x 106 клеток/мл (в общем объеме 300 мкл) в пробирках FACS. Для каждого контроля добавьте все антитела, кроме одноименного антитела FMO. Например, для Kit FMO исключите антитела Kit. Для каждого антитела используют разведение и конечную концентрацию, как показано в таблице 2.
- Окрашивание одноцветных регуляторов при 20 х 106 ячеек/мл (в общем объеме 50 мкл) в трубках FACS; для каждой контрольной группы добавляют одно антитело в концентрации, указанной в таблице 2.
- Вихрь каждой контрольной трубки в течение 2-3 с при 3000 об/мин (вращений в минуту), а затем инкубируют при 4 °C, раскачиваясь в течение 2,5 ч в темноте, защищенной от света. Качайте трубы с осью вращения, параллельной длине трубы, между примерно углом 10° и 60° от горизонтали, чтобы содержимое не касалось колпачка.
- Промыть клетки с помощью SB5: Восполнить объем клеточной суспензии до 4 мл с SB5. Раскрутите клетки вниз при 900 x g, 4 °C в течение 10 мин и аспирируйте супернатант.
- Повторное суспендирование клеток:
- Повторно суспендируйте незапятнанные и все одноцветные элементы управления (кроме элемента управления DAPI) в 300 мкл SB5 и фильтруйте через фильтрующую сетку 40 мкм в новую трубку FACS.
- Получают раствор DAPI/SB5 путем разбавления запаса DAPI (1 мг/мл в 100% этаноле) при 1:10 000 в SB5.
- Повторное суспендирование ГМО в 1,8 мл DAPI/SB5 и фильтрация через фильтрующую сетку 40 мкм в новую трубку FACS
- Повторное использование одноцветного элемента управления DAPI в 300 мкл DAPI/SB5 и фильтрация через фильтрующую сетку 40 мкм в новую трубку FACS объемом 4 мл.
- Пробоподготовка: Если клетки готовятся к проточному цитометрическому анализу, перейдите к шагу 1.14. При подготовке ячеек к сортировке перейдите к шагу 2.1.
- Окрашивание образцов проточного цитометрического анализа при 33 х 106 клеток/мл в общем объеме 300 мкл (10 х 106 клеток) в пробирках FACS:
- Приготовьте смесь антител. Определите объем мастер-микса по количеству образцов, с 300 мкл на образец. Производят мастер-микс путем разбавления всех антител, перечисленных в таблице 2 , в указанном разведении в SB5. Rabbit IgG в мастер-миксе служит блоком Fc.
- Вихрь каждой трубки в течение 2-3 с при 3000 об/мин, а затем насиживают при 4 °С, раскачиваясь в течение 2,5 ч в темноте, защищенной от света.
- Промыть клетки с помощью SB5: Восполнить объем клеточной суспензии до 4 мл с SB5. Раскрутите клетки вниз при 900 x g, 4 °C в течение 10 мин и аспирируйте супернатант.
- Повторное суспендирование образцов для проточного цитометрического анализа в 1,8 мл DAPI/SB5, подготовленных на этапе 1.12.5.2, и фильтрация через фильтрующую сетку 40 мкм в трубку FACS.
- Анализ образцов на цитометре с 10 каналами для размещения конъюгатов антител в таблице 2 и жизнеспособности красителя DAPI. Пример настройки канала приведен в таблице 1. Также можно использовать только девять каналов; см. условные обозначения таблицы 2 .
- Во время анализа данных проточной цитометрии используйте стандартные подходы спектральной компенсации с помощью одноцветных элементов управления и FMO- элементов управления, как описано в шаге 2.4.
2. Настройка протокола для проточной цитометрической сортировки
- Приготовление Лин-
- Объедините все извлеченные клетки из одной и той же ткани (БМ или селезенки) от 10 мышей в трубку объемом 50 мл. Повторное суспендирование каждого объединенного образца путем пипетирования с использованием P1000 с большим наконечником отверстия.
- Раскрутите клетки при 900 х г, 4 °C в течение 10 мин и аспирируйте супернатант.
- Подготовьте одноцветные элементы управления и элементы управления FMO, как описано в разделе 1, используя необогащенные ячейки.
- Обогащение Lin-ячеек для сортировки с помощью магнитного обогащения шариков Lin-клеток :
- Повторно суспендируйте клетки при 1 х 108 ячейках / мл с SB5 и перенесите их в трубку 15 мл. Добавляют нормальную крысиную сыворотку и биотинилированные антитела, перечисленные в таблице 4 , и инкубируют с раскачиванием при 4 °C в течение 1 ч.
- Раскрутите клетки вниз при 900 x g, 4 °C в течение 10 мин и аспирируйте супернатант. Повторное суспендирование клеток в 15 мл холодного SB5.
- Раскрутите клетки вниз при 900 x g, 4 °C в течение 10 мин и аспирируйте супернатант. Повторно суспендируйте клетки при 1 х 108 клетках / мл в холодном SB5 и держите их на льду.
- Вихрь магнитных наношариков при 3000 об/мин в течение 5-10 с. Возьмите 1 мл магнитных наношарик на каждые 10 мл клеток.
- Вымойте наношарики в трубке FACS объемом 5 мл. Восполнить объем до 4 мл с помощью SB5, открутить при 900 х г, 4 °C в течение 5 мин и аспирировать супернатант.
- Повторно суспендируют наношарики в 500 мкл SB5 и смешивают с клетками, полученными на стадии 2.1.7. Инкубировать при 4 °C с раскачиванием в течение 15 мин.
- Раскрутите клетки вниз при 900 x g, 4 °C в течение 10 мин и аспирируйте супернатант. Повторное суспендирование клеток при 1 х 108 ячейках/мл с помощью SB5.
- Поместите трубку на магнит при 4 °C в течение 5 мин.
- Осторожно перелейте супернатант в новую трубку объемом 15 мл.
- Поместите трубку, содержащую супернатант со стадии 2.1.13, на магнит при 4 °C в течение 5 мин. Осторожно перелейте супернатант в новую трубку объемом 15 мл.
- Раскрутите клетки от супернатанта на стадии 2.1.14 при 900 х г, 4 °C в течение 10 мин и аспирируйте супернатант.
- Повторное суспендирование обогащенных Lin клеток в 1 мл SB5.
- Развести 10 мкл клеток при 1:100 в SB5. Смешайте 10 мкл разбавленных клеток с 10 мкл трипан-синего и рассчитывайте на гемоцитометр и/или счетчик клеток.
- Основываясь на количестве клеток на стадии 2.1.17, повторно суспендируйте обогащенные Lin клетки при 33 x 106 клетках/мл.
- Окрашивание обогащенных клеток:
- Окрашивают образцы обогащенных клеток в 33 x 106 клеток/мл в пробирках FACS путем добавления всех антител, перечисленных в таблице 2. Вихрь каждой трубки в течение 2-3 с при 3000 об/мин, а затем насиживают при 4 °С, раскачиваясь в течение 2,5 ч в темноте, защищенной от света.
- Промывайте ячейки с помощью SB5: Увеличьте объем трубок FACS до 4 мл с ПОМОЩЬЮ SB5. Раскрутите ячейки вниз при 900 x g, 4°C в течение 10 мин и удалите супернатант.
- Повторно суспендировать образцы для проточного цитометрического анализа в 4-6 мл DAPI/SB5, подготовленные на этапе 1.12.5.2, и фильтровать через фильтрующую сетку 40 мкм в новую трубку FACS объемом 4 мл.
- Сортировка образцов:
- Сортируйте образцы с большим соплом и низким давлением, чтобы максимизировать выход КОЕ-е, поскольку клетки КОЕ-е легко повреждаются под высоким давлением. Для проточного цитометра, используемого в этом исследовании, используйте 14 фунтов на квадратный дюйм и сопло 100 мкм или 12 фунтов на квадратный дюйм с соплом 130 мкм. Настройте сортировочные ворота, как описано на шаге 2.4 ниже.
- Подготовьте буфер сбора: Добавьте 20% фетальной бычьей сыворотки в PBS.
- Чтобы проверить чистоту отсортированных популяций, повторно запустите небольшую аликвоту из каждой отсортированной популяции в буфере, содержащем DAPI, как описано в шаге 1.12.5.2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, БМ от в общей сложности 10 мышей (приблизительно 1 х 109 клеток) дает по меньшей мере 50 000-100 000 клеток для каждой из популяций P1-hi, P1-low и P2 с жизнеспособностью приблизительно 70%.
- Используйте стратегию гатинга, показанную на рисунке 3 , для анализа или настройки сортировочных ворот.
- Используйте параметр прямого рассеяния (FSC) для удаления мусора в зависимости от размера. Используйте гистограмму FSC-высоты и FSC-области для исключения агрегатов ячеек и выделения отдельных ячеек; повторить с гистограммой бокового рассеяния (SSC) по сравнению с гистограммой области SSC.
- Исключите мертвые клетки, уничтожив клетки, которые являются положительными для красителя ДНК DAPI, для которого жизнеспособные клетки непроницаемы.
- Выберите ячейки Lin-Ter119-Kit+ и выберите из них подпопуляцию, экспрессирующую CD55.
- Подразделите клетки Lin-Ter119-Kit+CD55+ на две основные популяции, P6 и P7, на основе экспрессии CD49f и CD105.
- Основываясь на экспрессии CD150 и CD41, подразделяют P6 далее на P3 (предшественники базофильных или тучных клеток), P4 (мегакариоцитарные предшественники) и P5 (EBMP и ERTHROID-biased MPP).
- Основываясь на экспрессии CD150 и CD71, подразделяют P7 далее на P2 (BFU-e), ранний CFU-e (P1-низкий) и поздний CFU-e (P1-hi).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол описывает проточный цитометрический подход для идентификации BFU-es и CFU-es в свежесобранных клетках костного мозга и селезенки. Он начинается со сбора свежих БМ и селезенки у мышей и немедленного размещения ткани на льду. Все процедуры проводятся на холоде для сохранения жизнеспособности клеток. Клетки маркируются коктейлем антител «lineage», который позволяет исключить все клетки, экспрессирующие маркеры дифференцированных линий крови (коктейль FITC-Lin, таблица 3, в случае проточного цитометрического анализа; или обогащение магнитного шарика, таблица 4, для lineage-отрицательных клеток). Клетки также помечены антителами против маркеров, которые позволяют нам различать ряд ранних популяций предшественников в пределах линейно-отрицательной клеточной фракции. Маркировка сопровождается либо проточной цитометрической сортировкой, либо анализом. Подход к проточной цитометрической сортировке аналогичен подходу проточного цитометрического анализа, но ему предшествует магнитное обогащение для фракции lin-cell , чтобы сократить время и затраты на сортировку большого количества клеток. При сортировке прародителей BM объединяется из нескольких мышей, число которых зависит от последующего приложения. Как правило, БМ от в общей сложности 10 мышей (приблизительно 1 х 109 клеток) дает по меньшей мере 50 000-100 000 клеток для каждой из популяций P1-hi, P1-low и P2 с жизнеспособностью примерно 70%.
Ключевым различием между популяциями, полученными из селезенки и BM, идентифицированными этим протоколом, является гораздо более низкая частота популяции P6 и ее субпопуляций, P4 / P5 / P3, в клетках, полученных из селезенки.
В качестве примера проточного цитометрического анализа был рассмотрен эффект введения ЭПО у мышей. Epo связывается и активирует рецептор Epo (EpoR), который необходим как для базального, так и для ускоренного эритропоэза в стрессовых условиях, таких как гипоксия. Гипоксия стимулирует повышение уровня ЭПО в крови28,18, в свою очередь способствуя расширению КОЕ-е 1,29 и эритроидных предшественников.
Эпо (0,25 ЕД/г массы тела) или равный объем носителя (физиологический раствор) вводили подкожно мышам один раз в 24 ч в течение 3 дней. БМ и селезенку собирали через 72 ч. Стимуляция ЭПО привела к расширению ранних и поздних популяций КОЕ-е (P1-низкий и P1-hi) как в БМ, так и в селезенке (Рисунок 4 и Рисунок 5).
Рисунок 1: Две основные фазы окончательного эритропоэза. Эритропоэз можно разделить на раннюю фазу, где предшественники определяются на основе их колониеобразующего потенциала, и более позднюю фазу, известную как эритроидная терминальная дифференцировка (ETD), где стадия эритробластов определяется на основе морфологии. Проточные цитометрические методы позволили перспективно выделить специфические для развития стадии эритробластов с использованием FSC, Ter119 и CD71. Напротив, не было эквивалентного метода выделения предшественников BFU-e и CFU-e непосредственно из ткани с высокой чистотой. Обратите внимание, что показана только часть колонии BFU-e. Шкала применяется как к колониям CFU-e, так и к колониям BFU-e. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Новая проточная цитометрическая стратегия выделения КОЕ-е и БФУ-е непосредственно из ткани. В этой рукописи описывается протокол для идентификации пяти новых цитометрических популяций потока, от P1 до P5, на основе анализа данных scRNAseq. (A) Проекция графа с силовой направленностью («Весенний график») свежих одноклеточных транскриптомов костного мозга взрослого человека Balb/C. Цвета указывают на предсказанный потенциал судьбы клеток на основе транскриптомной информации и алгоритма анализа баланса популяций (PBA)1. Указаны области участка, которые соответствуют каждой из цитометрических популяций потока P1 до P5. Очерченные области представляют собой нарисованные от руки приближения исходных данных, которые можно найти в Tusi et al.1. Соответствие было подтверждено проведением scRNAseq каждой из отсортированных популяций P1 до P51. E = эритроид; Ba = базофильные или тучные предшественники; Meg = мегакариоцитарные прародители; Ly = лимфоцитарные предшественники; D = дендритные прародители; M = моноцитарные предшественники; G = гранулоцитарные предшественники. (B) Анализы формирования колоний, взятые из Tusi et al.1. Популяции от P1 до P5 и клетки CD55+ были отсортированы, как описано в этом протоколе, и каждая популяция была покрыта для соответствующих анализов формирования колоний. Колонии эритроидов были забиты в указанные дни. UF = унифокальный; MF = мультифокусный; КОЕ-МК = колониеобразующая единица мегакариоцитарная; КОЕ-ГМ = колониеобразующая единица гранулоцитарная/моноцитарная; КОЕ-GEMM = колониеобразующий блок гранулоцитарный, эритроидный, моноцитарный, мегакариоцитарный. (C) Маркеры клеточной поверхности, которые определяют каждую из пяти популяций, а также их потенциал клеточной судьбы. Потенциал судьбы клеток является результатом как транскриптомной информации, так и анализов клеточной судьбы, как колониеобразования, так и анализа судьбы одноклеточнойклетки 1,27. Следует отметить, что популяция P1 была разделена на основе экспрессии маркера CD71 на P1-hi и P1-low1. На основе данных Tusi et al.1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Стратегия проточного цитометрического гатирования. Полная стратегия определения численности населения P1 -P5. Свежесобранный костный мозг (BM) или селезенка (SP) у мыши Balb/C подкожно введенные 100 мкл 0,9% стерильного физиологического раствора сначала закрываются для основной популяции, отбрасывая мусор; за этим следует выбор синглетов, отбрасывание мертвых клеток и обнаружение клеток, которые являются Ter119-отрицательными, линейно-отрицательными и экспресс-китами. Дальнейшее деление Ter119-Lin-Kit+CD55+ на P6 и P7 сопровождается окончательным делением на популяции P1 -P5 (см. также рисунок 2). Канал Ter119 позволяет анализировать эритробласты на одном образце (с использованием подхода12 Ter119/CD71). Однако отдельный канал Ter119 не является существенным для этого протокола, и антитело Ter119 может быть исключено из основного микса и включено в состав коктейля Lin-FITC. Стадия исключения для положительных клеток Ter119 не показана в этой стратегии гатинга. Числа — это проценты от каждого затвора в показанной гистограмме. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Анализ ранних эритроидных предшественников костного мозга и селезенки после стимуляции ЭПО. Репрезентативные цитометрические участки свежесобранного костного мозга (БМ) или селезенки (СП). Мышам Balb/C вводили подкожно либо с 0,25 Ед/г массы тела ЭПО, либо с эквивалентным объемом физиологического раствора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Реакция предшественников БМ и селезенки на Epo in vivo. Сводные статистические данные, показывающие изменения абсолютного числа клеток в популяциях от P1 до P5 после инъекции Epo в свежесобранные (A) клетки костного мозга и (B) селезенки; *p = 0,02. Эксперимент, как показано на рисунке 4. n = 4 мыши в каждой группе. Чтобы вычислить абсолютное число клеток, частоту клеток в каждой популяции в БМ или селезенке (из рисунка 4) умножали на общее количество клеток БМ или селезенки, собранных у каждой мыши и разделенных на вес мыши в граммах. Следует отметить, что только ранний КОЕ-е в БМ достиг статистической значимости (p = 0,02), вероятно, сочетание относительно низкой дозы ЭПО и небольшого количества мышей в каждой группе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Детекторная решетка | ПМТ | Дихроичное зеркало | Полосовой фильтр | Обнаружен флуорофор |
| Синий лазер (488 нм) | A | 685ЛП | 695/40 | |
| B | 505ЛП | 530/30 | Лин-ФИТЦ (+Ter119-FITC) | |
| C | 488/10 | |||
| Фиолетовый лазер (405 нм) | A | 760ЛП | 800/80 | |
| B | 630ЛП | 660/20 | CD150-BV650 | |
| C | 595ЛП | 605/20 | CD41-BV605 | |
| D | 475ЛП | 525/20 | ||
| E | 450/50 | CD49f-BV421 | ||
| Красный лазер (640 нм) | A | 755ЛП | 785/50 | cKit-APC-Cy7 |
| B | 700 ЛП | 720/30 | ||
| C | 675/14 | CD55-AF 647 | ||
| УФ-лазер (355 нм) | A | 505ЛП | 525/20 | |
| B | 420ЛП | 450/50 | ДАПИ | |
| C | 379/28 | Тер119-БУВ 395 | ||
| YG Лазер (561 нм) | A | 755ЛП | 780/60 | CD71-PE-Cy7 |
| B | 685ЛП | 710/50 | ||
| C | 635ЛП | 660/20 | ||
| D | 600ЛП | 610/20 | ||
| E | 570ЛП | 580/20 | CD105-ПЭ |
Таблица 1: Пример расположения канала в цитометре LSRII. Панель антител, используемых в описанном протоколе, и их расположение в проточном цитометре LSRII для сбора данных.
| Реагент или антитело | Парный | Запас (мг/мл) | Коэффициент разбавления | Окончательный конт. в клеточной суспензии (мкг/мл) | Клон |
| СД71 | PE/Cy7 | 0.2 | 2000 | 0.1 | РИ7217 |
| ТЕР-119 | БУВ395 | 0.2 | 100 | 2 | ТЕР-119 |
| CD55 (DAF) | АФ647 | 0.5 | 50 | 10 | РИКО-3 |
| СД105 | ЧП | 0.2 | 50 | 4 | MJ7/18 |
| CD150 (СЛЭМ) | БВ650 | 0.1 | 50 | 2 | ТК15-12Ф12.2 |
| CD49f | БВ421 | 0.025 | 50 | 0.5 | ГоХ3 |
| СД41 | БВ605 | 0.2 | 100 | 2 | МВРег30 |
| CD117 (cKit) | БТР/Cy7 | 0.2 | 200 | 1 | 2Б8 |
| Линь коктейль | ФИТК | 0,08 (за каждое антитело в коктейле) | 83 | 1 (для каждого антитела в коктейле) | |
| Кролик IgG | 10 | 50 | 200 |
Таблица 2: Компоненты мастер-микса антител. Состав мастер-микса антител. Канал Ter119 позволяет анализировать эритробласты на одном образце (с использованием подхода12 Ter119/CD71). Однако отдельный канал Ter119 не является существенным для этого протокола, и антитело Ter119 может быть исключено из основного микса и включено в состав коктейля Lin-FITC.
| Реагент или антитело | Парный | Запас (мг/мл) | Клон |
| Ly-6G и Ly-6C | ФИТК | 0.5 | РБ6-8С5 |
| СД11б | ФИТК | 0.5 | М1/70 |
| СД19 | ФИТК | 0.5 | 1Д3 |
| СД4 | ФИТК | 0.5 | РМ4-5 |
| СД8а | ФИТК | 0.5 | 53-6.7 |
| Ф4/80 | ФИТК | 0.5 | БМ8 |
Таблица 3: Компоненты линь-коктейля. Состав коктейля Лин используется в составе мастер-микса антител (подробности мастер-микса см. в таблице 2).
| Реагент или антитело | Парный | Запас (мг/мл) | Коэффициент разбавления | Окончательный конт. в клеточной суспензии (мкг/мл) | Клон |
| Ly-6G и Ly-6C | Биотин | 0.5 | 200 | 2.5 | РБ6-8С5 |
| СД11б | Биотин | 0.5 | 200 | 2.5 | М1/70 |
| СД19 | Биотин | 0.5 | 200 | 2.5 | 1Д3 |
| СД4 | Биотин | 0.5 | 200 | 2.5 | РМ4-5 |
| СД8а | Биотин | 0.5 | 200 | 2.5 | 53-6.7 |
| Ф4/80 | Биотин | 0.5 | 200 | 2.5 | БМ8 |
| ТЕР-119 | Биотин | 0.5 | 200 | 2.5 | ТЕР-119 |
| Нормальная крысиная сыворотка | 50 |
Таблица 4: Антитела для обогащения магнитным шариком. Антитела, используемые для обогащения Lin-фракции BM или селезенки перед сортировкой клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Способность перспективно изолировать предшественников BFU-e и CFU-e непосредственно из свежих тканей с высокой чистотой ранее ускользала от исследователей. Наш новый подход, проверенный с использованием scRNAseq и анализов судьбы клеток 1,27, теперь предлагает инструменты для этого.
Существует ряд ключевых моментов для успешного выполнения как сортировки, так и аналитических протоколов. Во-первых, клетки должны быть раскручены при 900 х г , чтобы предотвратить потерю клеток низкой плотности. Многие клетки на стадии КОЕ-е являются большими клетками низкой плотности, которые в противном случае могут быть потеряны. Во-вторых, необходимо использовать большие наконечники отверстий при пипетке вверх и вниз, чтобы помочь сломать клеточные агрегаты и предотвратить потерю хрупких клеток P1 и P2. Этот шаг важен, поскольку многие прародители КОЕ-е связаны с макрофагами эритробластных островов (EBI) и будут потеряны, если не будут успешно диссоциированы. В-третьих, клетки инкубируются с эдта-содержащим буфером («SB5») перед окрашиванием, что помогает диссоциировать EBI. В-четвертых, при сборе проточных цитометрических данных скорость сбора не должна превышать 7000 событий/с или рекомендуемой скорости для используемого прибора проточного цитометра.
Популяции P1 и P2 содержат все предшественники КОЕ-e и BFU-e в костном мозге соответственно и не содержат других типов клеток-предшественников1. Популяция P1 далее делится на раннюю КОЕ-e (P1-низкая) и позднюю CFU-e (P1-hi) на основе экспрессии CD711. Эти высокочистые цитометрические популяции потока дают полную картину популяций-прародителей BFU-e и CFU-e in vivo.
Одним из недостатков является то, что популяция P2 содержит небольшую долю ранних прародителей КОЕ-е. Однако он содержит все клетки BFU-e в BM и никаких других типов клеток. Популяция P1 содержит всю КОЕ-e в BM, за исключением небольшой фракции, которая присутствует в P2. В отличие от популяций P1 и P2, от P3 до P5 являются высокообогащенными, но не чистыми популяциями-прародителями.
Применение этого проточного цитометрического инструмента к мышиным моделям эритропоэза теперь позволит определять клеточные и молекулярные реакции во время физиологических и патологических возмущений эритропоэза. В показанном примере мышам вводили гормон Эпо. Этот подход может быть использован у генетически модифицированных мышей, например, в мышиных моделях гемоглобинопатий, для более точного молекулярного анализа их измененных эритроидных предшественников in vivo.
ДОСТУПНОСТЬ ДАННЫХ:
Дополнительные данные, связанные с экспериментами на рисунках 4 и 5 , доступны по запросу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается грантами NIH R01DK130498, R01DK120639 и R01HL141402
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575020 | |
| 1000 µL large orifice tips | USA sceintific | 1011-9000 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD55 (DAF) Antibody | BioLegend | 131806 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) Antibody | BioLegend | 105826 | |
| Biotin-CD11b | BD Biosciences | 557395 | M1/70 (clone) |
| Biotin-CD19 | BD Biosciences | 553784 | 1D3 (clone) |
| Biotin-CD4 | BD Biosciences | BDB553045 | RM4-5 (clone) |
| Biotin-CD8a | BD Biosciences | BDB553029 | 53-6.7 (clone) |
| Biotin-F4/80 | Biolegend | 123106 | BM8 (clone) |
| Biotin-Ly-6G and Ly-6C | BD Biosciences | 553125 | RB6-8C5 (clone) |
| Biotin-TER-119 | BD Biosciences | 553672 | TER-119 (clone) |
| Bovine Serum Albumin | Sigma aldritch | A1470 | |
| Brilliant Violet 421 anti-human/mouse CD49f Antibody | BioLegend | 313624 | |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD41 Antibody | BioLegend | 133921 | |
| Brilliant Violet 650 anti-mouse CD150 (SLAM) Antibody | BioLegend | 115931 | |
| BUV395 Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells | BD Biosciences | 563827 | |
| ChromPure Rabbit IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 011-000-003 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306 | |
| Digital DIVA hardware and software for LSR II | BD Biosciences | ||
| FITC anti-mouse F4/80 Antibody | BioLegend | 123108 | |
| FITC Rat Anti-CD11b | BD Biosciences | 557396 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD19 | BD Biosciences | 553785 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD4 | BD Biosciences | 553047 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 553031 | |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and LY-6C | BD Biosciences | 553127 | |
| FlowJo software | FlowJo | version 10 | Flow cytometer analysis software |
| LSR II digital multiparameter flow cytometer analyzer | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| NewlineNY Stainless Steel Hand Masher & Bowl, Mortar and Pestle Set | Amazon | ||
| Normal rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| PE anti-mouse CD105 Antibody | BioLegend | 120408 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD71 Antibody | BioLegend | 113812 | |
| Phosphate Buffered Saline, 10x Solution | Fisher scientific | BP3994 | |
| Streptavidin Nanobeads | BioLegend | 480016 | Magnetic beads |
References
- Tusi, B. K., et al. Population snapshots predict early haematopoietic and erythroid hierarchies. Nature. 555 (7694), 54-60 (2018).
- Socolovsky, M. The role of specialized cell cycles during erythroid lineage development: Insights from single-cell RNA sequencing. International Journal of Hematology. 116 (2), 163-173 (2022).
- Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development. WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504 (2021).
- Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M., Heath, D. S. Properties of Cells that Produce Erythrocytic Colonies In Vitro. Hemopoiesis in Culture. Robinson, W. A. , National Institutes of Health, US Government Printing Office. (1974).
- Heath, D. S., Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M. Separation of the erythropoietin-responsive progenitors BFU-E and CFU-E in mouse bone marrow by unit gravity sedimentation. Blood. 47 (5), 777-792 (1976).
- Iscove, N. N., Sieber, F. Erythroid progenitors in mouse bone marrow detected by macroscopic colony formation in culture. Experimental Hematology. 3 (1), 32-43 (1975).
- Gregory, C. J., McCulloch, E. A., Till, J. E. Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: State of differentiation. Journal of Cell Physiology. 81 (3), 411-420 (1973).
- Gregory, C. J., Tepperman, A. D., McCulloch, E. A., Till, J. E. Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: Response of normal and genetically anemic W-W-V mice to manipulations of the erythron. Journal of Cell Physiology. 84 (1), 1-12 (1974).
- Gregory, C. J. Erythropoietin sensitivity as a differentiation marker in the hemopoietic system: studies of three erythropoietic colony responses in culture. Journal of Cell Physiology. 89 (2), 289-301 (1976).
- Pop, R., et al. A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression. PLoS Biology. 8 (9), 1000484 (2010).
- Koulnis, M., et al. Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay. Journal of Visualized Experiments. (54), e2809 (2011).
- Liu, Y., et al. Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in vivo. Blood. 108 (1), 123-133 (2006).
- Socolovsky, M., et al. Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts. Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).
- Chen, K., et al. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17413-17418 (2009).
- Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development. WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504 (2020).
- Hidalgo, D., et al. EpoR stimulates rapid cycling and larger red cells during mouse and human erythropoiesis. Nature Communications. 12 (1), 7334 (2021).
- Porpiglia, E., Hidalgo, D., Koulnis, M., Tzafriri, A. R., Socolovsky, M. Stat5 signaling specifies basal versus stress erythropoietic responses through distinct binary and graded dynamic modalities. PLoS Biology. 10 (8), 1001383 (2012).
- Koulnis, M., et al. Contrasting dynamic responses in vivo of the Bcl-xL and Bim erythropoietic survival pathways. Blood. 119 (5), 1228-1239 (2012).
- Shearstone, J. R., et al. Global DNA demethylation during mouse erythropoiesis in vivo. Science. 334 (6057), 799-802 (2011).
- Koulnis, M., Liu, Y., Hallstrom, K., Socolovsky, M. Negative autoregulation by Fas stabilizes adult erythropoiesis and accelerates its stress response. PLoS One. 6 (7), 21192 (2011).
- Pronk, C. J., et al. Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy. Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).
- Dolznig, H., et al. Expansion and differentiation of immature mouse and human hematopoietic progenitors. Methods in Molecular Medicine. 105, 323-344 (2005).
- Li, J., et al. Isolation and transcriptome analyses of human erythroid progenitors: BFU-E and CFU-E. Blood. 124 (24), 3636-3645 (2014).
- Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: Functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system. Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).
- Flygare, J., Rayon Estrada, V., Shin, C., Gupta, S., Lodish, H. F. HIF1alpha synergizes with glucocorticoids to promote BFU-E progenitor self-renewal. Blood. 117 (12), 3435-3444 (2011).
- Pronk, C. J., Attema, J., Rossi, D. J., Sigvardsson, M., Bryder, D. Deciphering developmental stages of adult myelopoiesis. Cell Cycle. 7 (6), 706-713 (2008).
- Khoramian Tusi, B., Socolovsky, M. High-throughput single-cell fate potential assay of murine hematopoietic progenitors in vitro. Experimental Hematology. 60, 21-29 (2018).
- Erslev, A. J., Caro, J. Erythropoietin titers in response to anemia or hypoxia. Blood Cells. 13 (1-2), 207-216 (1987).
- Koury, M. J., Bondurant, M. C. The molecular mechanism of erythropoietin action. European Journal of Biochemistry. 210 (3), 649-663 (1992).
