Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Identificación y aislamiento de progenitores eritroides de unidades formadoras de ráfagas y unidades formadoras de colonias a partir de tejido de ratón mediante citometría de flujo

Published: November 4, 2022 doi: 10.3791/64373

Summary

Aquí, describimos un nuevo método citométrico de flujo para el aislamiento prospectivo de progenitores eritroides unitarios formadores de ráfagas tempranas (BFU-e) y eritroides unitarios formadores de colonias (UFC-e) directamente de médula ósea y bazo de ratón frescos. Este protocolo, desarrollado en base a datos transcriptómicos unicelulares, es el primero en aislar todos los progenitores eritroides del tejido con alta pureza.

Abstract

Los progenitores eritroides tempranos se definieron originalmente por su potencial de formación de colonias in vitro y se clasificaron en "unidades" formadoras de ráfagas y colonias conocidas como BFU-e y UFC-e. Hasta hace poco, no se disponía de métodos para el aislamiento prospectivo directo y completo de progenitores puros de BFU-e y UFC-e de médula ósea de ratón adulta recién aislada. Para abordar esta brecha, se analizó un conjunto de datos de RNA-seq de una sola célula (scRNAseq) de médula ósea de ratón para la expresión de genes que codifican marcadores de superficie celular. Este análisis se combinó con ensayos de destino celular, lo que permitió el desarrollo de un nuevo enfoque citométrico de flujo que identifica y permite el aislamiento de subconjuntos completos y puros de progenitores BFU-e y CFU-e en médula ósea o bazo de ratón. Este enfoque también identifica otros subconjuntos progenitores, incluidos los subconjuntos enriquecidos para los potenciales basófilos/mastocitos y megacariocíticos. El método consiste en marcar células frescas de médula ósea o bazo con anticuerpos dirigidos a Kit y CD55. Los progenitores que expresan ambos marcadores se subdividen en cinco poblaciones principales. La población 1 (P1 o UFC-e, Kit+ CD55+ CD49f med/bajo CD105 med/alto CD71 med/alto) contiene todos los progenitores CFU-e y puede subdividirse en P1-bajo (CD71 med CD150 alto) y P1-hi (CD71alto CD150 bajo), correspondiente a CFU-e temprano y tardío, respectivamente; La población 2 (P2 o BFU-e, Kit+ CD55+ CD49f med/low CD105 med/high CD71 low CD150high) contiene todos los progenitores BFU-e; La población P3 (P3, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105med/low CD150 low CD41low) está enriquecida para progenitores basófilos/mastocitos; La población 4 (P4, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105med/low CD150high CD41+) está enriquecida para progenitores megacariocíticos; y la población 5 (P5, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105med/low CD150high CD41-) contiene progenitores con eritroides, basófilos/mastocitos y potencial megacariocítico (EBMP) y progenitores multipotenciales eritroses/megacariocíticos/basófilos (MPP). Este nuevo enfoque permite una mayor precisión al analizar progenitores eritroides y otros progenitores hematopoyéticos y también permite hacer referencia a la información del transcriptoma para cada población citométricamente definida por flujo.

Introduction

La eritropoyesis puede dividirse en dos fases principales: eritropoyesis precoz y diferenciación terminal eritroide (Figura 1)1,2,3. En la eritropoyesis temprana, las células madre hematopoyéticas se comprometen con el linaje eritroide y dan lugar a progenitores eritroides tempranos, que se identificaron por primera vez en la década de 1970 en función de su potencial de formación de colonias en medio semisólido 4,5,6,7,8,9 . En términos generales, los progenitores eritroides se dividen en dos categorías: progenitores anteriores que dan lugar a un "estallido" (un gran agregado de grupos de células eritroides más pequeños), llamado "eritroide unitario formador de estallido" o BFU-e 4,5,6; y su progenie, que forman cada uno un único grupo o colonia de células eritroides pequeñas, denominadas "unidad formadora de colonias eritroides" o UFC-e 7,8,9. BFU-e y CFU-e aún no expresan genes eritroides terminales y no son morfológicamente reconocibles. Después de una serie de divisiones celulares de auto-renovación o expansión, la UFC-e experimenta un cambio transcripcional en el que se inducen genes eritroides como globinas, pasando así a la diferenciación terminal eritroide (ETD)1,10. Durante la ETD, los eritroblastos se someten a tres a cinco divisiones celulares madurativas antes de enuclearse para formar reticulocitos, que maduran en glóbulos rojos.

Los eritroblastos durante la diferenciación terminal se clasificaron originalmente en función de su morfología en proeritroblastos, basófilos, policromáticos y ortocromáticos. El advenimiento de la citometría de flujo permitió su clasificación y aislamiento prospectivo basado en el tamaño celular (medido por dispersión directa, FSC) y dos marcadores de superficie celular, CD71 y Ter11911,12,13 (Figura 1). Este y otros enfoques citométricos de flujo similares 14 han revolucionado la investigación de los aspectos moleculares y celulares de la ETD, permitiendo el análisis específico de la etapa de desarrollo de eritroblastos in vivo e in vitro 10,15,16,17,18,19,20. El enfoque CD71/Ter119 ahora se usa rutinariamente en el análisis de precursores eritroides.

Hasta hace poco, un enfoque citométrico de flujo similar y accesible para el aislamiento prospectivo directo y de alta pureza de CFU-e y BFU-e de tejido de ratón ha eludido a los investigadores. En cambio, los investigadores han utilizado estrategias citométricas de flujo que aíslan solo una fracción de estos progenitores, a menudo en presencia de células no eritroides que se purifican conjuntamente dentro de los mismos subconjuntos citométricos de flujo21. En consecuencia, la investigación de BFU-e y CFU-e se limitó a sistemas de diferenciación in vitro que derivan y amplifican BFU-e y CFU-e de progenitores de médula ósea anteriores. Entonces es posible aplicar estrategias citométricas de flujo que distinguan la UFC-e de la BFU-e en estos cultivos enriquecidos con progenitores eritroides22,23. Un enfoque alternativo hace uso de UFC-e fetal y BFU-e, que están altamente enriquecidas en la fracción Ter119-negativa del hígado fetal de ratón a mediados de la gestación 10,24,25. Ninguno de estos enfoques, sin embargo, permite la investigación de BFU-e y UFC-e adultos en su estado fisiológico in vivo. La magnitud del desafío puede apreciarse cuando se recuerda que, según los ensayos de formación de colonias, estas células están presentes en la médula ósea adulta con una frecuencia de solo 0,025% y 0,3%, respectivamente6.

El protocolo descrito aquí es un nuevo enfoque citométrico de flujo basado en el análisis transcriptómico de células transcriptómicas de células de médula ósea de ratón Kit+ recién cosechadas (Kit es expresado por todas las poblaciones progenitoras tempranas de la médula ósea)1. Nuestro enfoque contiene algunos marcadores de superficie celular que ya estaban en uso por Pronk et al.21,26. Se utilizaron transcriptomas unicelulares para determinar combinaciones de marcadores de superficie celular que identifican progenitores eritroides y otros progenitores hematopoyéticos tempranos (Figura 2). Específicamente, la fracción CD55+ de las células Kit+ negativas para linaje (Lin-) puede subdividirse en cinco poblaciones, tres de las cuales producen segmentos contiguos de la trayectoria eritroide (Figura 2). Las identidades transcriptómicas de cada una de estas poblaciones se confirmaron mediante clasificación, seguido de scRNAseq y proyección de los transcriptomas unicelulares ordenados en el mapa transcriptómico original (la expresión génica en cada una de las cinco poblaciones y todo el conjunto de datos de médula ósea se puede explorar en https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)1 . El potencial de destino celular de cada una de las poblaciones se confirmó mediante ensayos tradicionales de formación de colonias (Figura 2), así como un nuevo ensayo de destino unicelular de alto rendimiento 1,27. Estos análisis muestran que el nuevo enfoque citométrico de flujo da como resultado un aislamiento de alta pureza de todos los progenitores BFU-e y CFU-e de la médula ósea y el bazo adultos frescos. Específicamente, la población 1 (P1) contiene solo UFC-e y ningún otro progenitor hematopoyético, y la población 2 (P2) contiene todos los progenitores BFU-e de la médula ósea y un pequeño número de UFC-e pero ningún otro progenitor1. El protocolo detallado a continuación se ilustra con un experimento de ejemplo en ratones que fueron inyectados con solución salina o con la hormona estimulante de la eritropoyesis eritropoyetina (Epo).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos animales A-1586 y 202200017 aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Escuela de Medicina Chan de la Universidad de Massachusetts.

NOTA: Aquí se detallan dos protocolos: primero, análisis citométrico de flujo (sección 1), seguido de ajustes de protocolo para la clasificación por citometría de flujo (sección 2). El siguiente protocolo utiliza un citómetro/clasificador de flujo con 10 canales. En la Tabla 1 se proporciona un ejemplo de configuración, al que se hace referencia en el paso 1.14.5. También es posible ejecutar este protocolo con solo nueve canales; véase la leyenda en el cuadro 2.

1. Análisis citométrico de flujo

  1. Eutanasia a ratones adultos (>6 semanas de edad) Balb/C o C57BL6 utilizando un método apropiado aprobado por su Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (por ejemplo, inhalación deCO2 seguida de dislocación cervical). Para el análisis citométrico de flujo, la médula ósea (BM) de un solo ratón será suficiente. Para la clasificación, el número de ratones depende de las aplicaciones posteriores. El rendimiento celular para cada población se indica a continuación (paso 2.3.3).
  2. Recolección de tejidos:
    1. Preparar tubos de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) de 5 ml que contengan 3 ml de tampón de tinción en frío (4 °C) ("SB5": solución salina tamponada con fosfato (PBS), 0,2% de albúmina sérica bovina (BSA), 0,08% de glucosa, 5 mM EDTA) en hielo. Use esto para colocar los tejidos cosechados.
    2. Prepare tubos separados para cada tejido diseccionado de cada ratón. No agrupe tejidos de varios ratones.
    3. Cosecha ambos fémures y ambas tibias. Retire todos los músculos de los huesos antes de colocarlos en el tubo con SB5.
    4. Diseccionar el bazo a través de una incisión en el lado izquierdo del abdomen.
  3. Extracción de células de médula ósea:
    1. Coloque los fémures y tibias recién disecados directamente en el tampón de tinción en frío (SB5) y mantenga los tubos en hielo hasta que estén listos para extraer la médula ósea (BM). Coloque un mortero esterilizado limpio sobre hielo en un balde. Transfiera los huesos al mortero junto con el SB5 del tubo.
    2. Corte aproximadamente 1 mm de los extremos de cada hueso con tijeras de disección para que el orificio del hueso se vuelva apenas visible.
    3. Use una aguja de 26 G y una jeringa de 3 ml llena de SB5 para eliminar la médula de los huesos y recogerla en el mortero. Repita el proceso 3-5 veces usando tampón nuevo cada vez hasta que los huesos parezcan incoloros.
    4. Filtre la médula enjuagada a través de un filtro de malla de 100 μm y recoja las células en un tubo de centrífuga de 50 ml colocado sobre hielo.
    5. Use el mortero para aplastar los huesos enjuagados en 5-10 ml de SB5. Filtrar la mezcla de huesos triturados y tampón a través del filtro de células de 100 μm y agrupar con las células recogidas en el paso 1.3.4.
  4. Extracción de células del bazo:
    1. Coloque un filtro de malla de 100 μm en un tubo centrífugo vacío de 50 ml colocado sobre hielo. Coloque un solo bazo en el filtro de malla.
    2. Agregue 0.5-1 ml de SB5 al bazo para asegurarse de que no se seque.
    3. Usando el lado de goma de un émbolo de jeringa de 3 ml o 5 ml, triture el bazo a través de la malla. Agregue más SB5, 5 ml a la vez, y continúe triturando hasta que todas las células se hayan recogido en el tubo.
  5. A partir de este momento, la médula ósea y las células esplénicas se tratan de la misma manera.
  6. Girar las células hacia abajo a 900 x g, 4 °C durante 10 min. Aspire el sobrenadante usando una configuración de aspiración endouterina.
  7. Para hacer una suspensión de una sola célula, resuspenda las celdas en 2 ml de SB5 y pipete hacia arriba y hacia abajo 50 veces usando un P1000 con una punta de orificio grande (consulte la Tabla de materiales). Estos tienen aberturas anchas en las puntas para ayudar a prevenir el daño a las células frágiles.
  8. Para contar las celdas, resuspenda pipeteando hacia arriba y hacia abajo 20 veces. Diluir las células en una proporción de 1:100 en SB5. Mezclar 10 μL de las células diluidas con 10 μL de azul de tripano y contar con un hemocitómetro y/o contador celular.
  9. Girar las células hacia abajo a 900 x g, 4 °C durante 10 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células a 33 x 106 células vivas/ml en SB5.
  10. Prepare el cóctel Lin-FITC mezclando volúmenes iguales de cada anticuerpo en la Tabla 3.
  11. Prepare las celdas para controles de un solo color y controles de "fluorescencia menos uno" (FMO). Realizar los pasos 1.11-1.12 en paralelo con la preparación y tinción de las células de muestra en el paso 1.14 (muestras para análisis citométrico de flujo) y/o en el paso 2.1 (clasificación por citometría de flujo).
    1. Preparar las células para un control celular no teñido transfiriendo 50 μL (1,6 x 106 células) de la suspensión celular a un tubo FACS sobre hielo. Prepare las celdas para cada control de color único (11 tubos) transfiriendo 50 μL (1,6 x 106 celdas) de la suspensión celular a un tubo FACS sobre hielo.
    2. Prepare los controles FMO para los siguientes colores (Kit, CD41, CD150, CD49f [cuatro tubos]) transfiriendo 300 μL (10 x 106 celdas) de la suspensión celular a un tubo FACS separado sobre hielo.
    3. Girar las células a 900 x g, 4 °C durante 10 min y aspirar el sobrenadante.
  12. Tinción de anticuerpos de FMO y controles de un solo color
    1. Tinción de los FMO a 33 x 106 células/ml (en un volumen total de 300 μL) en tubos FACS. Para cada control, agregue todos los anticuerpos excepto el anticuerpo homónimo del FMO. Por ejemplo, para el Kit FMO, omita el anticuerpo Kit. Para cada anticuerpo, use la dilución y la concentración final como en la Tabla 2.
    2. Teñir los controles de color único a 20 x 106 células/ml (en un volumen total de 50 μL) en tubos FACS; para cada control, añadir un único anticuerpo a la concentración indicada en la Tabla 2.
    3. Vortex cada tubo de control durante 2-3 s a 3.000 rpm (rotaciones por minuto), y luego incubar a 4 °C, balanceándose durante 2,5 h en la oscuridad, protegido de la luz. Balancee los tubos con un eje de rotación paralelo a la longitud del tubo, entre aproximadamente un ángulo de 10° y 60° desde la horizontal, de modo que el contenido no toque la tapa.
    4. Lave las celdas con SB5: Enrasar el volumen de la suspensión celular a 4 mL con SB5. Girar las células hacia abajo a 900 x g, 4 °C durante 10 min, y aspirar el sobrenadante.
  13. Resuspensión celular:
    1. Resuspenda los controles sin teñir y todos los controles de un solo color (excepto el control DAPI) en 300 μL de SB5 y filtre a través de una malla de filtro de 40 μm en un nuevo tubo FACS.
    2. Haga una solución DAPI/SB5 diluyendo el stock de DAPI (1 mg/ml en etanol al 100%) a 1:10.000 en SB5.
    3. Resuspender los FMO en 1,8 ml de DAPI/SB5 y filtrar a través de una malla filtrante de 40 μm en un nuevo tubo FACS
    4. Vuelva a suspender el control de color único DAPI en 300 μL de DAPI/SB5 y filtre a través de una malla de filtro de 40 μm en un nuevo tubo FACS de 4 ml.
  14. Preparación de la muestra: Si las células se están preparando para el análisis citométrico de flujo, vaya al paso 1.14. Si prepara las celdas para la ordenación, vaya al paso 2.1.
  15. Tinción de las muestras de análisis citométrico de flujo a 33 x 106 células/ml en un volumen total de 300 μL (10 x 106 células) en tubos FACS:
    1. Prepare la mezcla maestra de anticuerpos. Determinar el volumen de la mezcla maestra por el número de muestras, con 300 μL por muestra. Haga la mezcla maestra diluyendo todos los anticuerpos enumerados en la Tabla 2 en la dilución indicada en SB5. El Rabbit IgG en la mezcla maestra sirve como un bloque Fc.
    2. Vortex cada tubo durante 2-3 s a 3.000 rpm, y luego incubar a 4 °C, balanceando durante 2,5 h en la oscuridad, protegido de la luz.
    3. Lave las celdas con SB5: Enrasar el volumen de la suspensión celular a 4 mL con SB5. Girar las células hacia abajo a 900 x g, 4 °C durante 10 min, y aspirar el sobrenadante.
    4. Resuspender las muestras para el análisis citométrico de flujo en 1,8 ml de DAPI/SB5 preparado en el paso 1.12.5.2 y filtrar a través de una malla filtrante de 40 μm en un tubo FACS.
    5. Analizar las muestras en un citómetro con 10 canales para acomodar los conjugados de anticuerpos en la Tabla 2 y el colorante de viabilidad DAPI. En la Tabla 1 se proporciona un ejemplo de configuración de canal. También es posible utilizar sólo nueve canales; véase la leyenda de la Tabla 2 .
    6. Durante el análisis de los datos de citometría de flujo, utilice enfoques de compensación espectral estándar con la ayuda de los controles de un solo color y los controles FMO como se detalla en el paso 2.4.

2. Ajustes del protocolo para la clasificación por citometría de flujo

  1. Preparación de Lin-
    1. Agrupe todas las células extraídas del mismo tejido (ya sea BM o bazo) de 10 ratones en un tubo de 50 ml. Resuspenda cada muestra agrupada pipeteando con un P1000 con una punta de orificio grande.
    2. Girar las células a 900 x g, 4 °C durante 10 min y aspirar el sobrenadante.
    3. Prepare controles de un solo color y FMO como se describe en la sección 1 utilizando células no enriquecidas.
    4. Enriquecer las células de Lin para su clasificación mediante el enriquecimiento magnético de las células de lin:
    5. Resuspender las células a 1 x 108 células/ml con SB5 y transferirlas a un tubo de 15 ml. Añadir suero normal de rata y los anticuerpos biotinilados enumerados en la Tabla 4 e incubar con balanceo a 4 °C durante 1 h.
    6. Girar las células hacia abajo a 900 x g, 4 °C durante 10 min y aspirar el sobrenadante. Resuspender las células en 15 mL de SB5 frío.
    7. Girar las células hacia abajo a 900 x g, 4 °C durante 10 min y aspirar el sobrenadante. Resuspender las células a 1 x 108 células/ml en SB5 frío y mantenerlas en hielo.
    8. Vortex las nanoperlas magnéticas a 3.000 rpm durante 5-10 s. Tome 1 ml de nanoperlas magnéticas por cada 10 ml de células.
    9. Lave las nanoperlas en un tubo FACS de 5 ml. Enrasar el volumen a 4 ml con SB5, girar a 900 x g, 4 °C durante 5 min, y aspirar el sobrenadante.
    10. Resuspender las nanoperlas en 500 μL de SB5 y mezclar con las células preparadas en el paso 2.1.7. Incubar a 4 °C con balanceo durante 15 min.
    11. Girar las células hacia abajo a 900 x g, 4 °C durante 10 min y aspirar el sobrenadante. Resuspender las células a 1 x 108 células/ml con SB5.
    12. Colocar el tubo sobre un imán a 4 °C durante 5 min.
    13. Vierta con cuidado el sobrenadante en un nuevo tubo de 15 ml.
    14. Colocar el tubo que contiene el sobrenadante del paso 2.1.13 en un imán a 4 °C durante 5 min. Vierta con cuidado el sobrenadante en un nuevo tubo de 15 ml.
    15. Girar las células del sobrenadante en el paso 2.1.14 a 900 x g, 4 °C durante 10 min, y aspirar el sobrenadante.
    16. Resuspender las células enriquecidas con Lin en 1 ml de SB5.
    17. Diluir 10 μL de las células a 1:100 en SB5. Mezclar 10 μL de las células diluidas con 10 μL de azul de tripano y contar con un hemocitómetro y/o contador celular.
    18. Según el recuento de células en el paso 2.1.17, resuspender las células enriquecidas con Lin a 33 x 106 células/ml.
  2. Tinción de células enriquecidas:
    1. Teñir las muestras de células enriquecidas a 33 x 106 células/ml en tubos FACS añadiendo todos los anticuerpos enumerados en la Tabla 2. Vortex cada tubo durante 2-3 s a 3.000 rpm, y luego incubar a 4 °C, balanceando durante 2,5 h en la oscuridad, protegido de la luz.
    2. Lavar las celdas con SB5: Enrasar el volumen de los tubos FACS a 4 mL con SB5. Girar las células hacia abajo a 900 x g, 4 °C durante 10 min, y retirar el sobrenadante.
    3. Resuspender las muestras para el análisis citométrico de flujo en 4-6 ml de DAPI/SB5 como se preparó en el paso 1.12.5.2 y filtrar a través de una malla filtrante de 40 μm en un nuevo tubo FACS de 4 ml.
  3. Clasificación de muestras:
    1. Clasifique las muestras con una boquilla grande y baja presión para maximizar el rendimiento de CFU-e, ya que las células CFU-e se dañan fácilmente a alta presión. Para el citómetro de flujo utilizado en este estudio, use 14 psi y una boquilla de 100 μm o 12 psi con una boquilla de 130 μm. Configure las puertas de clasificación como se describe en el paso 2.4 a continuación.
    2. Prepare el tampón de recolección: agregue un 20% de suero bovino fetal al PBS.
    3. Para comprobar la pureza de las poblaciones ordenadas, vuelva a ejecutar una pequeña alícuota de cada población ordenada en un búfer que contenga DAPI, como se describe en el paso 1.12.5.2.
      NOTA: Típicamente, BM de un total de 10 ratones (aproximadamente 1 x 109 células) produce al menos 50,000-100,000 células para cada una de las poblaciones P1-hi, P1-low y P2 con una viabilidad de aproximadamente 70%.
  4. Utilice la estrategia de acceso que se muestra en la figura 3 para analizar o configurar las puertas de clasificación.
    1. Utilice el parámetro de dispersión directa (FSC) para eliminar los residuos en función del tamaño. Utilice el histograma FSC-altura versus FSC-área para excluir agregados de celdas y seleccionar celdas individuales; repita con el histograma de altura de dispersión lateral (SSC) versus área de SSC.
    2. Excluya las células muertas eliminando las células que son positivas para el colorante de ADN DAPI, al que las células viables son impermeables.
    3. Seleccione las células Lin-Ter119-Kit+ y, de estas, seleccione una subpoblación que exprese CD55.
    4. Subdivida las células Lin-Ter119-Kit+CD55+ en dos poblaciones principales, P6 y P7, basándose en la expresión de CD49f y CD105.
    5. Según la expresión de CD150 y CD41, subdivida P6 en P3 (progenitores basófilos o mastocitos), P4 (progenitores megacariocíticos) y P5 (EBMP y MPP con sesgo eritroide).
    6. Según la expresión de CD150 y CD71, subdivida P7 en P2 (BFU-e), UFC-e temprana (P1-baja) y UFC-e tardía (P1-hi).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

El protocolo describe un enfoque citométrico de flujo para identificar BFU-es y UFC-es en células de médula ósea y bazo recién cosechadas. Comienza con la recolección de BM fresco y bazo de ratones e inmediatamente la colocación del tejido en hielo. Todos los procedimientos se realizan en el frío para preservar la viabilidad celular. Las células se marcan con un cóctel de anticuerpos de "linaje" que permite la exclusión de todas las células que expresan marcadores de linajes sanguíneos diferenciados (el cóctel FITC-Lin, Tabla 3, en el caso del análisis citométrico de flujo; o el enriquecimiento magnético de perlas, Tabla 4, para células negativas para linaje). Las células también están marcadas con anticuerpos contra marcadores que nos permiten distinguir un número de poblaciones progenitoras tempranas dentro de la fracción celular negativa del linaje. El etiquetado es seguido por la clasificación citométrica de flujo o el análisis. El enfoque de la clasificación por citometría de flujo es similar al del análisis citométrico de flujo, pero está precedido por el enriquecimiento de perlas magnéticas para la fracción de células de Lin para reducir el tiempo y el gasto de clasificar un gran número de células. Al clasificar progenitores, BM se agrupa a partir de múltiples ratones, el número depende de la aplicación posterior. Típicamente, BM de un total de 10 ratones (aproximadamente 1 x 109 células) produce al menos 50,000-100,000 células para cada una de las poblaciones P1-hi, P1-low y P2 con una viabilidad de aproximadamente 70%.

La diferencia clave entre las poblaciones derivadas del bazo y BM identificadas por este protocolo es la frecuencia mucho menor de la población P6 y sus subpoblaciones, P4/P5/P3, en las células derivadas del bazo.

Como ejemplo de análisis citométrico de flujo, se examinó el efecto de la administración de Epo en ratones. Epo se une y activa el receptor de Epo (EpoR), que es esencial para la eritropoyesis basal y acelerada en condiciones de estrés como la hipoxia. La hipoxia estimula un aumento en los niveles sanguíneos de Epo 28,18, promoviendo a su vez la expansión de CFU-e 1,29 y precursores eritroides.

Epo (0,25 U/g de peso corporal) o un volumen igual de vehículo (solución salina) se inyectó por vía subcutánea en ratones una vez cada 24 h durante 3 días. El BM y el bazo se cosecharon a las 72 h. La estimulación con epo condujo a la expansión de las poblaciones tempranas y tardías de UFC-e (P1-bajo y P1-hi) tanto en el BM como en el bazo (Figura 4 y Figura 5).

Figure 1
Figura 1: Dos fases principales de la eritropoyesis definitiva. La eritropoyesis se puede dividir en una fase temprana, donde los progenitores se definen en función de su potencial de formación de colonias, y una fase posterior conocida como diferenciación terminal eritroide (ETD), donde la etapa de eritroblastos se define en función de la morfología. Las técnicas de citometría de flujo han permitido el aislamiento prospectivo de etapas de eritroblastos específicas del desarrollo utilizando FSC, Ter119 y CD71. Por el contrario, no ha habido un método equivalente para aislar progenitores BFU-e y CFU-e directamente de tejido con alta pureza. Tenga en cuenta que solo se muestra una fracción de la colonia BFU-e. La barra de escala se aplica tanto a las colonias CFU-e como BFU-e. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Una nueva estrategia de citometría de flujo para aislar CFU-e y BFU-e directamente del tejido. Este manuscrito describe un protocolo para identificar cinco nuevas poblaciones de citometría de flujo, P1 a P5, basado en un análisis de los datos de scRNAseq. (A) Proyección gráfica dirigida por fuerza ("diagrama de primavera") de transcriptomas unicelulares frescos de médula ósea adulta Balb/C. Los colores indican el potencial de destino celular previsto basado en información transcriptómica y el algoritmo de análisis de balance poblacional (PBA)1. Se indican las regiones de la gráfica que corresponden a cada una de las poblaciones citométricas de flujo P1 a P5. Las regiones delineadas son aproximaciones dibujadas a mano de los datos originales, que se pueden encontrar en Tusi et al.1. La correspondencia se confirmó mediante la realización de scRNAseq de cada una de las poblaciones clasificadas de P1 a P51. E = eritroide; Ba = progenitores basófilos o mastocitos; Meg = progenitores megacariocíticos; Ly = Progenitores linfocíticos; D = progenitores dendríticos; M = progenitores monocíticos; G = progenitores granulocíticos. (B) Ensayos de formación de colonias, retrazados de Tusi et al.1. Las poblaciones P1 a P5 y las células CD55+ se clasificaron como se describe en este protocolo, y cada población se clasificó para los ensayos de formación de colonias relevantes. Las colonias eritroides se puntuaron en los días indicados. UF = unifocal; MF = multifocal; CFU-MK = unidad formadora de colonias megacariocítica; UFC-GM = unidad formadora de colonias granulocítica/monocítica; CFU-GEMM = unidad formadora de colonias granulocítica, eritroide, monocítica, megacariocítica. (C) Marcadores de superficie celular que definen cada una de las cinco poblaciones, así como su potencial de destino celular. El potencial de destino celular es tanto el resultado de la información transcriptómica como de los ensayos de destino celular, tanto de la formación de colonias como de los ensayos de destino unicelular 1,27. Cabe destacar que la población P1 se dividió en función de la expresión del marcador CD71 en P1-hi y P1-low1. Basado en datos de Tusi et al.1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Estrategia de gating por citometría de flujo. La estrategia completa de compuerta para las poblaciones P1 a P5. La médula ósea (BM) o el bazo (SP) recién cosechados de un ratón Balb/C inyectado por vía subcutánea con 100 μL de solución salina estéril al 0,9% se cierran primero para la población principal, descartando desechos; esto es seguido por la selección de singletes, el descarte de células muertas y la activación de las celdas que son Ter119-negativas, linaje negativo y Express Kit. La subdivisión adicional de Ter119-Lin-Kit+CD55+ en P6 y P7 es seguida por la subdivisión final en poblaciones P1 a P5 (ver también Figura 2). El canal Ter119 permite el análisis de eritroblastos en la misma muestra (utilizando el enfoque Ter119/CD7112). Sin embargo, un canal Ter119 separado no es esencial para este protocolo, y el anticuerpo Ter119 puede omitirse de la mezcla maestra e incluirse como parte del cóctel Lin-FITC en su lugar. El paso de exclusión para las células positivas de Ter119 no se muestra en esta estrategia de compuerta. Los números son porcentajes de cada puerta dentro del histograma mostrado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Análisis de progenitores eritroides tempranos de médula ósea y bazo tras estimulación con Epo. Gráficos citométricos de flujo representativos de médula ósea (BM) o bazo (SP) recién cosechados. Los ratones Balb/C fueron inyectados por vía subcutánea con 0,25 U/g de peso corporal de Epo o con un volumen equivalente de solución salina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: La respuesta de los progenitores de BM y bazo a Epo in vivo. Estadísticas resumidas que muestran cambios en el número absoluto de células en las poblaciones P1 a P5 después de la inyección de Epo en células de (A) médula ósea recién cosechadas y (B) de bazo; *p = 0,02. Experimente como se describe en la figura 4. n = 4 ratones en cada grupo. Para calcular el número absoluto de células, la frecuencia de células en cada población en el BM o el bazo (de la Figura 4) se multiplicó por el número total de células BM o bazo recolectadas de cada ratón y se dividió por el peso del ratón en gramos. Cabe destacar que solo la UFC-e temprana en el BM alcanzó significación estadística (p = 0,02), probablemente una combinación de una dosis relativamente baja de Epo y un pequeño número de ratones en cada grupo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Matriz de detectores PMT Espejo dicroico Filtro de paso de banda Fluoróforo detectado
Láser azul (488 nm) Un 685LP 695/40
B 505LP 530/30 Lin-FITC (+Ter119-FITC)
C 488/10
Láser violeta (405 nm) Un 760LP 800/80
B 630LP 660/20 CD150-BV650
C 595LP 605/20 CD41-BV605
D 475LP 525/20
E 450/50 CD49f-BV421
Láser rojo (640 nm) Un 755LP 785/50 cKit-APC-Cy7
B 700 LP 720/30
C 675/14 CD55-AF 647
Láser UV (355 nm) Un 505LP 525/20
B 420LP 450/50 DAPI
C 379/28 Ter119-BUV 395
Láser YG (561 nm) Un 755LP 780/60 CD71-PE-Cy7
B 685LP 710/50
C 635LP 660/20
D 600LP 610/20
E 570LP 580/20 CD105-PE

Tabla 1: Ejemplo del diseño del canal en un citómetro LSRII. El panel de anticuerpos utilizado en el protocolo descrito y su disposición en el citómetro de flujo LSRII para recopilar los datos.

Reactivo o anticuerpo Conjugar Concentración de existencias (mg/ml) Factor de dilución Conc. final en suspensión celular (μg/mL) Clon
CD71 PE/Cy7 0.2 2000 0.1 RI7217
TER-119 BUV395 0.2 100 2 TER-119
CD55 (DAF) AF647 0.5 50 10 RIKO-3
CD105 PEI 0.2 50 4 MJ7/18
CD150 (SLAM) BV650 0.1 50 2 TC15-12F12.2
CD49f BV421 0.025 50 0.5 GoH3
CD41 BV605 0.2 100 2 MWReg30
CD117 (cKit) APC/Cy7 0.2 200 1 2B8
Cóctel Lin FITC 0.08 (por cada anticuerpo en el cóctel) 83 1 (para cada anticuerpo en el cóctel)
Conejo IgG 10 50 200

Tabla 2: Componentes de la mezcla maestra de anticuerpos. Composición de la mezcla maestra de anticuerpos. El canal Ter119 permite el análisis de eritroblastos en la misma muestra (utilizando el enfoque Ter119/CD7112). Sin embargo, un canal Ter119 separado no es esencial para este protocolo, y el anticuerpo Ter119 puede omitirse de la mezcla maestra e incluirse como parte del cóctel Lin-FITC en su lugar.

Reactivo o anticuerpo Conjugar Concentración de existencias (mg/ml) Clon
Ly-6G y Ly-6C FITC 0.5 RB6-8C5
CD11b FITC 0.5 M1/70
CD19 FITC 0.5 1D3
CD4 FITC 0.5 RM4-5
CD8a FITC 0.5 53-6.7
F4/80 FITC 0.5 BM8

Tabla 3: Componentes del cóctel Lin. Composición del cóctel Lin utilizado como parte de la mezcla maestra de anticuerpos (ver detalles de la mezcla maestra en la Tabla 2).

Reactivo o anticuerpo Conjugar Concentración de existencias (mg/ml) Factor de dilución Conc. final en suspensión celular (μg/mL) Clon
Ly-6G y Ly-6C Biotina 0.5 200 2.5 RB6-8C5
CD11b Biotina 0.5 200 2.5 M1/70
CD19 Biotina 0.5 200 2.5 1D3
CD4 Biotina 0.5 200 2.5 RM4-5
CD8a Biotina 0.5 200 2.5 53-6.7
F4/80 Biotina 0.5 200 2.5 BM8
TER-119 Biotina 0.5 200 2.5 TER-119
Suero normal para ratas 50

Tabla 4: Anticuerpos para el enriquecimiento de perlas magnéticas. Anticuerpos utilizados para enriquecer la fracción Lin- de la BM o del bazo antes de la clasificación celular.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

La capacidad de aislar prospectivamente progenitores de BFU-e y CFU-e directamente de tejido fresco con alta pureza había eludido previamente a los investigadores. Nuestro nuevo enfoque, validado utilizando scRNAseq y ensayos de destino celular 1,27, ahora ofrece las herramientas para hacer esto.

Hay una serie de puntos clave para ejecutar con éxito tanto la clasificación como los protocolos analíticos. Primero, las células deben hilarse a 900 x g para evitar la pérdida de células de baja densidad. Muchas células en la etapa CFU-e son células grandes y de baja densidad que de otro modo podrían perderse. En segundo lugar, es necesario utilizar puntas de orificio grandes al pipetear hacia arriba y hacia abajo para ayudar a romper los agregados celulares y evitar la pérdida de células P1 y P2 frágiles. Este paso es importante ya que muchos progenitores de UFC-e están asociados con macrófagos de islas eritroblásticas, y se perderían si no se disociaran con éxito. En tercer lugar, las células se incuban con un tampón que contiene EDTA ("SB5") antes de la tinción, lo que ayuda a disociar las EBI. En cuarto lugar, durante la adquisición de datos citométricos de flujo, la tasa de adquisición no debe exceder los 7.000 eventos/s o la tasa recomendada para el instrumento del citómetro de flujo que se está utilizando.

Las poblaciones P1 y P2 contienen todos los progenitores CFU-e y BFU-e en la médula ósea, respectivamente, y no contienen otros tipos de células progenitoras1. La población P1 se divide además en UFC-e temprana (P1-baja) y UFC-e tardía (P1-hi) basada en la expresión de CD711. Estas poblaciones citométricas de flujo altamente puras proporcionan una imagen completa de las poblaciones progenitoras de BFU-e y UFC-e in vivo.

Un inconveniente es que la población P2 contiene una pequeña fracción de progenitores CFU-e tempranos. Sin embargo, contiene todas las células BFU-e en el BM y ningún otro tipo de células. La población P1 contiene toda la UFC-e en el BM, excepto la pequeña fracción que está presente en P2. A diferencia de las poblaciones P1 y P2, P3 a P5 son poblaciones progenitoras altamente enriquecidas, pero no puras.

La aplicación de esta herramienta de citometría de flujo a modelos de eritropoyesis en ratones permitiría ahora la determinación de las respuestas celulares y moleculares durante las perturbaciones fisiológicas y patológicas de la eritropoyesis. En el ejemplo mostrado, a los ratones se les inyectó la hormona Epo. Este enfoque se puede utilizar en ratones modificados genéticamente, por ejemplo, en modelos de ratón de hemoglobinopatías, para un análisis molecular más preciso de sus progenitores eritroides alterados in vivo.

DISPONIBILIDAD DE DATOS:
Los datos adicionales asociados con los experimentos en la Figura 4 y la Figura 5 están disponibles bajo petición.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Acknowledgments

Este trabajo es apoyado por las subvenciones de los NIH R01DK130498, R01DK120639 y R01HL141402

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575020
1000 µL large orifice tips USA sceintific 1011-9000
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD55 (DAF) Antibody BioLegend 131806
APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) Antibody BioLegend 105826
Biotin-CD11b BD Biosciences 557395 M1/70 (clone)
Biotin-CD19 BD Biosciences 553784 1D3 (clone)
Biotin-CD4 BD Biosciences BDB553045 RM4-5 (clone)
Biotin-CD8a BD Biosciences BDB553029 53-6.7 (clone)
Biotin-F4/80 Biolegend 123106 BM8 (clone)
Biotin-Ly-6G and Ly-6C BD Biosciences 553125 RB6-8C5 (clone)
Biotin-TER-119 BD Biosciences 553672 TER-119 (clone)
Bovine Serum Albumin Sigma aldritch A1470
Brilliant Violet 421 anti-human/mouse CD49f Antibody BioLegend 313624
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD41 Antibody BioLegend 133921
Brilliant Violet 650 anti-mouse CD150 (SLAM) Antibody BioLegend 115931
BUV395 Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells BD Biosciences 563827
ChromPure Rabbit IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch Laboratories 011-000-003
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Life Technologies D1306
Digital DIVA hardware and software for LSR II BD Biosciences
FITC anti-mouse F4/80 Antibody BioLegend 123108
FITC Rat Anti-CD11b BD Biosciences 557396
FITC Rat Anti-Mouse CD19 BD Biosciences 553785
FITC Rat Anti-Mouse CD4 BD Biosciences 553047
FITC Rat Anti-Mouse CD8a BD Biosciences 553031
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and LY-6C BD Biosciences 553127
FlowJo software  FlowJo version 10 Flow cytometer analysis software
LSR II digital multiparameter flow cytometer analyzer BD Biosciences Flow cytometer 
NewlineNY Stainless Steel Hand Masher & Bowl, Mortar and Pestle Set Amazon
Normal rat serum Stem Cell Technologies 13551
PE anti-mouse CD105 Antibody BioLegend 120408
PE/Cyanine7 anti-mouse CD71 Antibody BioLegend 113812
Phosphate Buffered Saline, 10x Solution Fisher scientific BP3994
Streptavidin Nanobeads BioLegend 480016 Magnetic beads

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tusi, B. K., et al. Population snapshots predict early haematopoietic and erythroid hierarchies. Nature. 555 (7694), 54-60 (2018).
  2. Socolovsky, M. The role of specialized cell cycles during erythroid lineage development: Insights from single-cell RNA sequencing. International Journal of Hematology. 116 (2), 163-173 (2022).
  3. Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development. WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504 (2021).
  4. Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M., Heath, D. S. Properties of Cells that Produce Erythrocytic Colonies In Vitro. Hemopoiesis in Culture. Robinson, W. A. , National Institutes of Health, US Government Printing Office. (1974).
  5. Heath, D. S., Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M. Separation of the erythropoietin-responsive progenitors BFU-E and CFU-E in mouse bone marrow by unit gravity sedimentation. Blood. 47 (5), 777-792 (1976).
  6. Iscove, N. N., Sieber, F. Erythroid progenitors in mouse bone marrow detected by macroscopic colony formation in culture. Experimental Hematology. 3 (1), 32-43 (1975).
  7. Gregory, C. J., McCulloch, E. A., Till, J. E. Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: State of differentiation. Journal of Cell Physiology. 81 (3), 411-420 (1973).
  8. Gregory, C. J., Tepperman, A. D., McCulloch, E. A., Till, J. E. Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: Response of normal and genetically anemic W-W-V mice to manipulations of the erythron. Journal of Cell Physiology. 84 (1), 1-12 (1974).
  9. Gregory, C. J. Erythropoietin sensitivity as a differentiation marker in the hemopoietic system: studies of three erythropoietic colony responses in culture. Journal of Cell Physiology. 89 (2), 289-301 (1976).
  10. Pop, R., et al. A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression. PLoS Biology. 8 (9), 1000484 (2010).
  11. Koulnis, M., et al. Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay. Journal of Visualized Experiments. (54), e2809 (2011).
  12. Liu, Y., et al. Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in vivo. Blood. 108 (1), 123-133 (2006).
  13. Socolovsky, M., et al. Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts. Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).
  14. Chen, K., et al. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17413-17418 (2009).
  15. Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development. WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504 (2020).
  16. Hidalgo, D., et al. EpoR stimulates rapid cycling and larger red cells during mouse and human erythropoiesis. Nature Communications. 12 (1), 7334 (2021).
  17. Porpiglia, E., Hidalgo, D., Koulnis, M., Tzafriri, A. R., Socolovsky, M. Stat5 signaling specifies basal versus stress erythropoietic responses through distinct binary and graded dynamic modalities. PLoS Biology. 10 (8), 1001383 (2012).
  18. Koulnis, M., et al. Contrasting dynamic responses in vivo of the Bcl-xL and Bim erythropoietic survival pathways. Blood. 119 (5), 1228-1239 (2012).
  19. Shearstone, J. R., et al. Global DNA demethylation during mouse erythropoiesis in vivo. Science. 334 (6057), 799-802 (2011).
  20. Koulnis, M., Liu, Y., Hallstrom, K., Socolovsky, M. Negative autoregulation by Fas stabilizes adult erythropoiesis and accelerates its stress response. PLoS One. 6 (7), 21192 (2011).
  21. Pronk, C. J., et al. Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy. Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).
  22. Dolznig, H., et al. Expansion and differentiation of immature mouse and human hematopoietic progenitors. Methods in Molecular Medicine. 105, 323-344 (2005).
  23. Li, J., et al. Isolation and transcriptome analyses of human erythroid progenitors: BFU-E and CFU-E. Blood. 124 (24), 3636-3645 (2014).
  24. Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: Functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system. Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).
  25. Flygare, J., Rayon Estrada, V., Shin, C., Gupta, S., Lodish, H. F. HIF1alpha synergizes with glucocorticoids to promote BFU-E progenitor self-renewal. Blood. 117 (12), 3435-3444 (2011).
  26. Pronk, C. J., Attema, J., Rossi, D. J., Sigvardsson, M., Bryder, D. Deciphering developmental stages of adult myelopoiesis. Cell Cycle. 7 (6), 706-713 (2008).
  27. Khoramian Tusi, B., Socolovsky, M. High-throughput single-cell fate potential assay of murine hematopoietic progenitors in vitro. Experimental Hematology. 60, 21-29 (2018).
  28. Erslev, A. J., Caro, J. Erythropoietin titers in response to anemia or hypoxia. Blood Cells. 13 (1-2), 207-216 (1987).
  29. Koury, M. J., Bondurant, M. C. The molecular mechanism of erythropoietin action. European Journal of Biochemistry. 210 (3), 649-663 (1992).

Tags

Developmental Biology Número 189 Eritropoyesis citometría de flujo FACS UFC-e BFU-e progenitores eritroides
Identificación y aislamiento de progenitores eritroides de unidades formadoras de ráfagas y unidades formadoras de colonias a partir de tejido de ratón mediante citometría de flujo
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Swaminathan, A., Hwang, Y., Winward, More

Swaminathan, A., Hwang, Y., Winward, A., Socolovsky, M. Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (189), e64373, doi:10.3791/64373 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter