Summary
Här beskriver vi en ny flödescytometrisk metod för prospektiv isolering av tidiga burstbildande enheter erytroid (BFU-e) och kolonibildande enhet erytroid (CFU-e) föregångare direkt från färsk musbenmärg och mjälte. Detta protokoll, utvecklat baserat på encells transkriptomiska data, är det första som isolerar alla vävnadens erytroida förfäder med hög renhet.
Abstract
Tidiga erytroidförfäder definierades ursprungligen av deras kolonibildande potential in vitro och klassificerades i burstbildande och kolonibildande "enheter" som kallas BFU-e och CFU-e. Fram till nyligen fanns det inga metoder för direkt prospektiv och fullständig isolering av rena BFU-e- och CFU-e-förfäder från nyisolerade vuxna benmärg från möss. För att åtgärda detta gap analyserades en encells RNA-seq (scRNAseq) dataset av musbenmärg för uttryck av gener som kodar för cellytmarkörer. Denna analys kombinerades med cellödensanalyser, vilket möjliggjorde utvecklingen av ett nytt flödescytometriskt tillvägagångssätt som identifierar och möjliggör isolering av fullständiga och rena delmängder av BFU-e- och CFU-e-förfäder i musbenmärg eller mjälte. Detta tillvägagångssätt identifierar också andra stamfaderdelmängder, inklusive delmängder berikade för basofil/ mastcell och megakaryocytiska potentialer. Metoden består i att märka färska benmärgs- eller mjältceller med antikroppar riktade mot Kit och CD55. Förfäder som uttrycker båda dessa markörer delas sedan in i fem huvudpopulationer. Population 1 (P1 eller CFU-e, Kit+ CD55+ CD49f med/low CD105 med/high CD71 med/high) innehåller alla CFU-e stamfäder och kan vidare delas in i P1-low (CD71med CD150 high) och P1-hi (CD71 high CD150low), motsvarande tidig respektive sen CFU-e; Population 2 (P2 eller BFU-e, Kit + CD55 + CD49f med / låg CD105 med / hög CD71låg CD150hög) innehåller alla BFU-e-förfäder; Population P3 (P3, Kit + CD55 + CD49f med / hög CD105 med / låg CD150 låg CD41 låg) är berikad för basofil/ mastcellsförfäder; Population 4 (P4, Kit + CD55 + CD49f med / hög CD105med / låg CD150hög CD41 +) är berikad för megakaryocytiska förfäder; och Population 5 (P5, Kit + CD55 + CD49f med / hög CD105 med / låg CD150hög CD41-) innehåller förfädermed erytroid, basofil / mastcell och megakaryocytisk potential (EBMP) och erytroid / megakaryocytisk/ basofil-biased multipotential stamfäder (MPP). Detta nya tillvägagångssätt möjliggör större precision vid analys av erytroid och andra hematopoetiska förfäder och möjliggör också hänvisning till transkriptominformation för varje flöde cytometriskt definierad population.
Introduction
Erytropoies kan delas in i två huvudfaser: tidig erytropoies och erytroid terminal differentiering (figur 1)1,2,3. Vid tidig erytropoies förbinder sig hematopoetiska stamceller till erytroidlinjen och ger upphov till tidiga erytroidförfäder, som först identifierades på 1970-talet baserat på deras kolonibildande potential i halvfast medium 4,5,6,7,8,9 . I stort sett är erytroidförfäder indelade i två kategorier: tidigare förfäder som var och en ger upphov till en "burst" (ett stort aggregat av mindre erytroidcellkluster), namngivna "burst-forming unit erythroid" eller BFU-e 4,5,6; och deras avkomma, som var och en bildar ett enda, litet erytroidcellkluster eller koloni, som heter "kolonibildande enhet erytroid" eller CFU-e 7,8,9. BFU-e och CFU-e uttrycker ännu inte terminala erytroidgener och är inte morfologiskt igenkännliga. Efter ett antal självförnyelse- eller expansionscelldelningar genomgår CFU-e en transkriptionsomkopplare där erytroidgener såsom globiner induceras och därigenom övergår till erytroidterminal differentiering (ETD)1,10. Under ETD genomgår erytroblaster tre till fem mognadscelldelningar innan de enucleated för att bilda retikulocyter, som mognar till röda blodkroppar.
Erytroblaster under terminal differentiering klassificerades ursprungligen baserat på deras morfologi till proerytroblaster, basofila, polykromatiska och ortokromatiska. Tillkomsten av flödescytometri möjliggjorde deras prospektiva sortering och isolering baserat på cellstorlek (mätt med framåtspridning, FSC) och två cellytmarkörer, CD71 och Ter11911,12,13 (figur 1). Detta och liknande flödescytometriska tillvägagångssätt14 har revolutionerat undersökningen av de molekylära och cellulära aspekterna av ETD, vilket möjliggör utvecklingsstegspecifik analys av erytroblaster in vivo och in vitro 10,15,16,17,18,19,20. CD71/Ter119-metoden används nu rutinmässigt vid analys av erytroidprekursorer.
Fram till nyligen har ett liknande, tillgängligt flödescytometriskt tillvägagångssätt för direkt, prospektiv isolering av CFU-e och BFU-e från musvävnad med hög renhet gäckat utredare. Istället har utredare använt flödescytometriska strategier som isolerar endast en bråkdel av dessa förfäder, ofta i närvaro av icke-erytroida celler som samrenar inom samma flödescytometriska delmängder21. Följaktligen begränsades undersökningen av BFU-e och CFU-e till in vitro-differentieringssystem som härleder och förstärker BFU-e och CFU-e från tidigare benmärgsförfäder. Det är sedan möjligt att tillämpa flödescytometriska strategier som skiljer CFU-e från BFU-e i dessa erytroida stamfaderberikade kulturer22,23. Ett alternativt tillvägagångssätt använder sig av fostrets CFU-e och BFU-e, som är mycket berikade i den Ter119-negativa fraktionen av musfostrets lever vid mitten av graviditeten 10,24,25. Inget av dessa tillvägagångssätt tillåter dock undersökning av vuxen BFU-e och CFU-e i deras fysiologiska tillstånd in vivo. Utmaningens storlek kan uppskattas när man påminner om att dessa celler, baserat på kolonibildningsanalyser, finns i den vuxna benmärgen med en frekvens av endast 0,025% respektive 0,3%6.
Protokollet som beskrivs här är ett nytt flödescytometriskt tillvägagångssätt baserat på encells transkriptomisk analys av nyskördade Kit + musbenmärgsceller (Kit uttrycks av alla tidiga stampopulationer i benmärgen)1. Vårt tillvägagångssätt innehåller några cellytmarkörer som redan användes av Pronk et al.21,26. Encelliga transkriptom användes för att bestämma kombinationer av cellytmarkörer som identifierar erytroid och andra tidiga hematopoetiska förfäder (figur 2). Specifikt kan CD55 + -fraktionen av härstamningsnegativa (Lin-) Kit + -celler delas in i fem populationer, varav tre ger sammanhängande segment av erytroidbanan (figur 2). De transkriptomiska identiteterna för var och en av dessa populationer bekräftades genom sortering, följt av scRNAseq och projektion av de sorterade encelliga transkriptomerna tillbaka till den ursprungliga transkriptomiska kartan (genuttrycket i var och en av de fem populationerna och hela benmärgsdatasetet kan utforskas i https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)1 . Cellens ödespotential för var och en av populationerna bekräftades med hjälp av traditionella kolonibildningsanalyser (figur 2), liksom en ny högkapacitetsanalys av encells öde 1,27. Dessa analyser visar att det nya flödescytometriska tillvägagångssättet resulterar i isolering med hög renhet av alla BFU-e- och CFU-e-förfäder av färsk vuxen benmärg och mjälte. Specifikt innehåller population 1 (P1) endast CFU-e och inga andra hematopoetiska stamfäder, och population 2 (P2) innehåller alla benmärgens BFU-e-stamfäder och ett litet antal CFU-e men inga andra föregångare1. Det detaljerade protokollet nedan illustreras ytterligare med ett exempelexperiment på möss som injicerades med antingen saltlösning eller med det erytropoiesstimulerande hormonet erytropoietin (Epo).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment utfördes i enlighet med djurprotokollen A-1586 och 202200017 godkända av University of Massachusetts Chan Medical School Institutional Animal Care and Use Committee.
OBS: Två protokoll beskrivs här: först flödescytometrisk analys (avsnitt 1), följt av protokolljusteringar för flödescytometrisk sortering (avsnitt 2). Protokollet nedan använder en flödescytometer/sorterare med 10 kanaler. Ett exempel på inställningar finns i tabell 1, som det hänvisas till i steg 1.14.5. Det är också möjligt att köra detta protokoll med endast nio kanaler; se förklaringen i tabell 2.
1. Flödescytometrisk analys
- Avliva vuxna (>6 veckor gamla) Balb / C- eller C57BL6-möss med en lämplig metod som godkänts av din institutionella djurvårds- och användningskommitté (t.ex. CO2-inandning följt av cervikal dislokation). För flödescytometrisk analys är benmärg (BM) från en enda mus tillräcklig. För sortering beror antalet möss på nedströmsapplikationerna. Cellutbytet för varje population anges nedan (steg 2.3.3).
- Vävnadsskörd:
- Bered 5 ml fluorescensaktiverade cellsorteringsrör (FACS) som innehåller 3 ml kall (4 °C) färgningsbuffert ("SB5": fosfatbuffrad saltlösning (PBS), 0,2% bovint serumalbumin (BSA), 0,08% glukos, 5 mM EDTA) på is. Använd detta för att placera skördade vävnader.
- Förbered separata rör för varje vävnad som dissekeras från varje mus. Slå inte ihop vävnader från flera möss.
- Skörda både lårben och båda skenben. Ta bort alla muskler från benen innan du placerar dem i röret med SB5.
- Dissekera mjälten genom ett snitt på vänster sida av buken.
- Benmärgscell extraktion:
- Placera de nyligen dissekerade lårbenen och skenbenen direkt i kallfärgningsbufferten (SB5) och håll rören på is tills de är redo att extrahera benmärgen (BM). Placera en ren steriliserad murbruk på is i en hink. Överför benen till murbruk tillsammans med SB5 från röret.
- Klipp av cirka 1 mm av ändarna på varje ben med dissektionssax så att benets öppning blir precis synlig.
- Använd en 26 G nål och en 3 ml spruta fylld med SB5 för att spola märgen ur benen och samla den i murbruk. Upprepa processen 3-5 gånger med ny buffert varje gång tills benen verkar färglösa.
- Filtrera den spolade märgen genom ett 100 μm nätfilter och samla cellerna i ett 50 ml centrifugrör placerat på is.
- Använd morteln och mortelstöten för att krossa de spolade benen i 5-10 ml SB5. Filtrera blandningen av krossade ben och buffra genom 100 μm cellsil och pool med celler som samlats upp i steg 1.3.4.
- Extraktion av mjältceller:
- Sätt upp ett 100 μm nätfilter på ett tomt 50 ml centrifugrör placerat på is. Placera en enda mjälte på nätfiltret.
- Tillsätt 0,5-1 ml SB5 i mjälten för att säkerställa att den inte torkar.
- Använd gummisidan på en 3 ml eller 5 ml sprutkolv och mosa mjälten genom nätet. Tillsätt mer SB5, 5 ml åt gången och fortsätt att mosa tills alla celler har samlats i röret.
- Från och med denna tidpunkt behandlas benmärgen och mjältcellerna på samma sätt.
- Snurra ner cellerna vid 900 x g, 4 °C i 10 min. Aspirera supernatanten med hjälp av en vakuumaspirationsinställning.
- För att göra en encellssuspension, återsuspendera cellerna i 2 ml SB5 och pipett upp och ner 50 gånger med en P1000 med en stor öppningsspets (se Materialförteckning). Dessa har breda spetsöppningar för att förhindra skador på bräckliga celler.
- För att räkna cellerna, återsuspendera genom att pipettera upp och ner 20 gånger. Späd cellerna i ett förhållande av 1:100 i SB5. Blanda 10 μl av de utspädda cellerna med 10 μl trypanblått och räkna med en hemocytometer och/eller cellräknare.
- Snurra ner cellerna vid 900 x g, 4 °C i 10 min. Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna vid 33 x 106 levande celler / ml i SB5.
- Förbered Lin-FITC-cocktailen genom att blanda lika stora volymer av varje antikropp i tabell 3.
- Förbered cellerna för enfärgskontroller och "Fluorescens minus en" (FMO) kontroller. Utför steg 1.11–1.12 parallellt med beredningen och färgningen av provcellerna i steg 1.14 (prover för flödescytometrisk analys) och/eller steg 2.1 (flödescytometrisk sortering).
- Förbered cellerna för en ostoppad cellkontroll genom att överföra 50 μL (1,6 x 106 celler) av cellsuspensionen till ett FACS-rör på is. Förbered cellerna för varje enskild färgkontroll (11 rör) genom att överföra 50 μL (1,6 x 106 celler) av cellsuspensionen till ett FACS-rör på is.
- Förbered FMO-kontrollerna för följande färger (Kit, CD41, CD150, CD49f [fyra rör]) genom att överföra 300 μL (10 x 106 celler) av cellsuspensionen till ett separat FACS-rör på is.
- Snurra ner cellerna vid 900 x g, 4 °C i 10 min och aspirera supernatanten.
- Antikroppsfärgning av FMO och enfärgskontroller
- Färga finansmarknadsoperatörerna vid 33 x 106 celler/ml (i en total volym på 300 μl) i FACS-rör. För varje kontroll, lägg till alla antikroppar utom FMO: s namne-antikropp. Till exempel, för Kit FMO, utelämna Kit-antikroppen. Använd spädningen och den slutliga koncentrationen för varje antikropp enligt tabell 2.
- Fläcka enfärgskontrollerna vid 20 x 106 celler / ml (i en total volym på 50 μL) i FACS-rör; För varje kontroll, tillsätt en enda antikropp vid den koncentration som anges i tabell 2.
- Vörda varje kontrollrör i 2-3 s vid 3 000 rpm (rotationer per minut) och inkubera sedan vid 4 °C, gunga i 2,5 timmar i mörkret, skyddat från ljus. Gunga rören med en rotationsaxel parallell med rörets längd, mellan ungefär 10° och 60° vinkel från horisontalplanet, så att innehållet inte vidrör locket.
- Tvätta cellerna med SB5: Fyll på cellsuspensionens volym till 4 ml med SB5. Snurra ner cellerna vid 900 x g, 4 °C i 10 minuter och aspirera supernatanten.
- Återsuspension av celler:
- Återsuspendera de ofärgade och alla enfärgskontroller (utom DAPI-kontrollen) i 300 μL SB5 och filtrera genom ett 40 μm filternät till ett nytt FACS-rör.
- Gör en DAPI/SB5-lösning genom att späda ut DAPI-stamberedningen (1 mg/ml i 100 % etanol) vid 1:10 000 i SB5.
- Återsuspendera finansmarknadsoperatörerna i 1,8 ml DAPI/SB5 och filtrera genom ett 40 μm filternät till ett nytt FACS-rör
- Återupphäng DAPI-enfärgskontrollen i 300 μl DAPI/SB5 och filtrera genom ett 40 μm filternät till ett nytt 4 ml FACS-rör.
- Provberedning: Om cellerna förbereds för flödescytometrisk analys, gå till steg 1.14. Om du förbereder cellerna för sortering går du vidare till steg 2.1.
- Färga de cytometriska analysproverna vid 33 x 10 6 celler/ml i en total volym på 300 μl (10 x 106 celler) i FACS-rör:
- Förbered antikroppsmästarblandningen. Bestäm volymen av huvudblandningen med antalet prover, med 300 μL per prov. Gör masterblandningen genom att späda ut alla antikroppar som anges i tabell 2 vid den angivna utspädningen i SB5. Kaninen IgG i mastermixen fungerar som ett Fc-block.
- Virvla varje rör i 2-3 s vid 3 000 rpm och inkubera sedan vid 4 °C, gunga i 2,5 timmar i mörkret, skyddat från ljus.
- Tvätta cellerna med SB5: Fyll på cellsuspensionens volym till 4 ml med SB5. Snurra ner cellerna vid 900 x g, 4 °C i 10 minuter och aspirera supernatanten.
- Återsuspendera proverna för flödescytometrisk analys i 1,8 ml DAPI/SB5 enligt beredningen i steg 1.12.5.2 och filtrera genom ett 40 μm filternät till ett FACS-rör.
- Analysera proverna på en cytometer med 10 kanaler för att rymma antikroppskonjugaten i tabell 2 och viabilitetsfärgen DAPI. Ett exempel på kanalinställningar finns i tabell 1. Det är också möjligt att bara använda nio kanaler; se förklaring till tabell 2 .
- Under analysen av flödescytometridata använder du standardmetoder för spektralkompensation med hjälp av enfärgskontrollerna och FMO-kontrollerna som beskrivs i steg 2.4.
2. Protokolljusteringar för flödescytometrisk sortering
- Beredning av lin-
- Samla alla extraherade celler från samma vävnad (antingen BM eller mjälte) från 10 möss till ett 50 ml rör. Återsuspendera varje poolat prov genom pipettering med hjälp av en P1000 med en stor öppningsspets.
- Snurra ner cellerna vid 900 x g, 4 °C i 10 min och aspirera supernatanten.
- Förbered enfärgs- och FMO-kontroller enligt beskrivningen i avsnitt 1 med hjälp av oberikade celler.
- Berika lin- celler för sortering med magnetisk pärlberikning av linceller :
- Återsuspendera cellerna vid 1 x 108 celler / ml med SB5 och överför dem till ett 15 ml rör. Tillsätt normalt råttserum och de biotinylerade antikroppar som anges i tabell 4 och inkubera med gungning vid 4 °C i 1 timme.
- Snurra ner cellerna vid 900 x g, 4 °C i 10 minuter och aspirera supernatanten. Återsuspendera cellerna i 15 ml kall SB5.
- Snurra ner cellerna vid 900 x g, 4 °C i 10 minuter och aspirera supernatanten. Återsuspendera cellerna vid 1 x 108 celler / ml i kall SB5 och håll dem på is.
- Vortex de magnetiska nanopärlorna vid 3 000 rpm i 5-10 s. Ta 1 ml magnetiska nanopärlor för varje 10 ml celler.
- Tvätta nanopärlorna i ett 5 ml FACS-rör. Fyll på volymen till 4 ml med SB5, snurra vid 900 x g, 4 °C i 5 minuter och aspirera supernatanten.
- Återsuspendera nanopärlorna i 500 μl SB5 och blanda med cellerna som beretts i steg 2.1.7. Inkubera vid 4 °C med gungning i 15 min.
- Snurra ner cellerna vid 900 x g, 4 °C i 10 minuter och aspirera supernatanten. Återsuspendera cellerna vid 1 x 108 celler / ml med SB5.
- Placera röret på en magnet vid 4 °C i 5 minuter.
- Häll försiktigt supernatanten i ett nytt 15 ml rör.
- Placera röret som innehåller supernatanten från steg 2.1.13 på en magnet vid 4 °C i 5 minuter. Häll försiktigt supernatanten i ett nytt 15 ml rör.
- Snurra cellerna från supernatanten i steg 2.1.14 vid 900 x g, 4 °C i 10 minuter och aspirera supernatanten.
- Återsuspendera de Lin-berikade cellerna i 1 ml SB5.
- Späd 10 μl av cellerna vid 1:100 i SB5. Blanda 10 μl av de utspädda cellerna med 10 μl trypanblått och räkna med en hemocytometer och/eller cellräknare.
- Baserat på cellantalet i steg 2.1.17, återsuspendera de Lin-berikade cellerna vid 33 x 106 celler / ml.
- Färgning av berikade celler:
- Färga de anrikade cellproverna vid 33 x 106 celler/ml i FACS-rör genom att tillsätta alla antikroppar som anges i tabell 2. Virvla varje rör i 2-3 s vid 3 000 rpm och inkubera sedan vid 4 °C, gunga i 2,5 timmar i mörkret, skyddat från ljus.
- Tvätta cellerna med SB5: Fyll volymen på FACS-rören till 4 ml med SB5. Snurra ner cellerna vid 900 x g, 4 ° C i 10 minuter och ta bort supernatanten.
- Återsuspendera proverna för flödescytometrisk analys i 4-6 ml DAPI/SB5 enligt beredningen i steg 1.12.5.2 och filtrera genom ett 40 μm filternät till ett nytt 4 ml FACS-rör.
- Provsortering:
- Sortera proverna med ett stort munstycke och lågt tryck för att maximera CFU-e-utbytet eftersom CFU-e-celler lätt skadas under högt tryck. För flödescytometern som används i denna studie, använd 14 psi och ett 100 μm munstycke eller 12 psi med ett 130 μm munstycke. Ställ in sorteringsgrindarna enligt beskrivningen i steg 2.4 nedan.
- Förbered uppsamlingsbufferten: Tillsätt 20% fetalt nötkreaturserum till PBS.
- För att kontrollera renheten hos de sorterade populationerna, kör om en liten alikvot från varje sorterad population i en buffert som innehåller DAPI, enligt beskrivningen i steg 1.12.5.2.
OBS: Vanligtvis ger BM från totalt 10 möss (cirka 1 x 109 celler) minst 50 000-100 000 celler för var och en av P1-hi-, P1-låg- och P2-populationerna med en livskraft på cirka 70%.
- Använd grindstrategin som visas i figur 3 för analys eller inställning av sorteringsgrindarna.
- Använd parametern forward-scatter (FSC) för att ta bort skräpet baserat på storlek. Använd histogrammet FSC-höjd kontra FSC-område för att utesluta cellaggregat och markera enskilda celler; upprepa med histogrammet side-scatter (SSC)-höjd jämfört med SSC-området.
- Uteslut de döda cellerna genom att stänga av de celler som är positiva för DNA-färgämnet DAPI, för vilka livskraftiga celler är ogenomträngliga.
- Välj Lin-Ter119-Kit+-celler och välj en delpopulation som uttrycker CD55 bland dessa.
- Dela upp Lin- Ter119-Kit + CD55 + -cellerna i två huvudpopulationer, P6 och P7, baserat på uttrycket av CD49f och CD105.
- Baserat på uttrycket av CD150 och CD41, dela upp P6 ytterligare i P3 (basofil- eller mastcellsförfäder), P4 (megakaryocytiska förfäder) och P5 (EBMP och erytroid-biased MPP).
- Baserat på uttrycket av CD150 och CD71, dela upp P7 ytterligare i P2 (BFU-e), tidig CFU-e (P1-låg) och sen CFU-e (P1-hi).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet beskriver ett flödescytometriskt tillvägagångssätt för att identifiera BFU-er och CFU-er i nyskördade benmärgs- och mjälteceller. Det börjar med att skörda färsk BM och mjälte från möss och omedelbart placera vävnaden på is. Alla procedurer utförs i kylan för att bevara cellviabiliteten. Celler är märkta med en "härstamning" antikroppscocktail som möjliggör uteslutning av alla celler som uttrycker markörer för differentierade blodlinjer (FITC-Lin-cocktail, tabell 3, vid flödescytometrisk analys; eller magnetisk pärlberikning, tabell 4, för härstamningsnegativa celler). Celler är också märkta med antikroppar mot markörer som gör att vi kan skilja ett antal tidiga stampopulationer inom den härstamningsnegativa cellfraktionen. Märkning följs av antingen flödescytometrisk sortering eller analys. Tillvägagångssättet för flödescytometrisk sortering liknar det för flödescytometrisk analys men föregås av magnetisk pärlberikning för lincellfraktionen för att minska tiden och kostnaden för att sortera ett stort antal celler. Vid sortering av förfäder poolas BM från flera möss, antalet beroende på nedströmsapplikationen. Vanligtvis ger BM från totalt 10 möss (cirka 1 x 109 celler) minst 50 000-100 000 celler för var och en av P1-hi-, P1-låg- och P2-populationerna med en livskraft på cirka 70%.
Huvudskillnaden mellan mjälte- och BM-härledda populationer som identifieras av detta protokoll är den mycket lägre frekvensen av P6-populationen och dess delpopulationer, P4 / P5 / P3, i mjälte-härledda celler.
Som ett exempel på flödescytometrisk analys undersöktes effekten av Epo-administrering hos möss. Epo binder till och aktiverar Epo-receptorn (EpoR), som är avgörande för både basal och accelererad erytropoes under stressförhållanden som hypoxi. Hypoxi stimulerar en ökning av Epo-nivåerna i blodet 28,18, vilket i sin tur främjar expansionen av CFU-e 1,29 och erytroidprekursorer.
Epo (0,25 U/g kroppsvikt) eller en lika stor volym vehikel (saltlösning) injicerades subkutant i möss en gång var 24:e timme i 3 dagar. BM och mjälte skördades vid 72 timmar. Epo-stimulering ledde till expansion av de tidiga och sena CFU-e-populationerna (P1-low och P1-hi) i både BM och mjälte (figur 4 och figur 5).
Figur 1: Två huvudfaser av definitiv erytropoies. Erytropoies kan delas in i en tidig fas, där förfäder definieras baserat på deras kolonibildande potential, och en senare fas som kallas erytroid terminal differentiering (ETD), där erytroblaststadiet definieras baserat på morfologi. Flödescytometriska tekniker har möjliggjort prospektiv isolering av utvecklingsspecifika erytroblaststadier med FSC, Ter119 och CD71. Däremot har det inte funnits någon likvärdig metod för att isolera BFU-e- och CFU-e-förfäder direkt från vävnad med hög renhet. Observera att endast en bråkdel av BFU-e-kolonin visas. Skalstrecket gäller för både CFU-e- och BFU-e-kolonierna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: En ny flödescytometrisk strategi för att isolera CFU-e och BFU-e direkt från vävnad. Detta manuskript beskriver ett protokoll för att identifiera fem nya flödescytometriska populationer, P1 till P5, baserat på en analys av scRNAseq-data. (A) Kraftstyrd grafprojektion ("Vårdiagram") av färska Balb/C vuxna benmärgstranskriptom. Färgerna indikerar den förutsagda cellens ödespotential baserat på transkriptomisk information och algoritmen för populationsbalansanalys (PBA)1. De regioner i diagrammet som motsvarar var och en av flödescytometriska populationerna P1 till P5 indikeras. De avgränsade regionerna är handritade approximationer av de ursprungliga uppgifterna, som finns i Tusi et al.1. Korrespondensen bekräftades genom att genomföra scRNAseq för var och en av de sorterade P1 till P5-populationerna1. E = erytroid; Ba = basofila eller mastcellsförfäder; Meg = megakaryocytiska förfäder; Ly = Lymfocytiska förfäder; D = dendritiska förfäder; M = monocytiska förfäder; G = granulocytiska förfäder. (B) Kolonibildningsanalyser, replotterade från Tusi et al.1. P1 till P5-populationerna och CD55 + -cellerna sorterades enligt beskrivningen i detta protokoll, och varje population pläterades för relevanta kolonibildningsanalyser. Erytroidkolonier gjordes på de angivna dagarna. UF = unifokal; MF = multi-fokal; CFU-MK = kolonibildande enhet megakaryocytisk; CFU-GM = kolonibildande enhet granulocytisk/monocytisk; CFU-GEMM = kolonibildande enhet granulocytisk, erytroid, monocytisk, megakaryocytisk. (C) Cellytmarkörer som definierar var och en av de fem populationerna, liksom deras cellödepotential. Cellödets potential är både resultatet av transkriptomisk information och av cellödesanalyserna, både kolonibildning och encelliga ödeanalyser 1,27. Observera att P1-populationen delades upp baserat på uttrycket av CD71-markören i P1-hi och P1-low1. Baserat på data från Tusi et al.1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Flödescytometrisk gatingstrategi. Den kompletta grindstrategin för populationerna P1 till P5. Nyskördad benmärg (BM) eller mjälte (SP) från en balb/c-mus som subkutant injicerats med 100 μl 0,9 % steril saltlösning stängs först för huvudpopulationen och skräp kasseras. detta följs av att välja singlets, kassera döda celler och gating på celler som är Ter119-negativa, härstamningsnegativa och express Kit. Ytterligare indelning av Ter119-Lin-Kit + CD55 + i P6 och P7 följs av den slutliga indelningen i populationerna P1 till P5 (se även figur 2). Ter119-kanalen möjliggör analys av erytroblaster på samma prov (med Ter119 / CD71-metoden12). En separat Ter119-kanal är dock inte nödvändig för detta protokoll, och Ter119-antikroppen kan utelämnas från mastermixen och inkluderas som en del av Lin-FITC-cocktailen istället. Exkluderingssteget för Ter119-positiva celler visas inte i den här grindstrategin. Siffror är procentandelar av varje grind inom det visade histogrammet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Analys av tidiga erytroida stamfäder av benmärg och mjälte efter Epo-stimulering. Representativa flödescytometriska diagram av nyskördad benmärg (BM) eller mjälte (SP). Balb/C-möss injicerades subkutant med antingen 0,25 U/g kroppsvikt av Epo eller med motsvarande volym saltlösning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Svaret från BM och mjälteförfäder på Epo in vivo. Sammanfattande statistik som visar förändringar i det absoluta cellantalet i populationerna P1 till P5 efter epoinjektion i nyskördade (A) benmärgs- och (B) mjältceller; *p = 0,02. Experimentera enligt beskrivningen i figur 4. n = 4 möss i varje grupp. För att beräkna det absoluta cellantalet multiplicerades frekvensen av celler i varje population i antingen BM eller mjälte (från figur 4) med det totala antalet BM- eller mjältceller som skördats från varje mus och dividerats med musens vikt i gram. Observera att endast tidig CFU-e i BM nådde statistisk signifikans (p = 0,02), sannolikt en kombination av en relativt låg Epo-dos och ett litet antal möss i varje grupp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Detektor Array | BETALNING | Dichroic spegel | Bandpass-filter | Fluorofor detekterad |
| Blå laser (488 nm) | A | 685LP | 695/40 | |
| B | 505LP | 530/30 | Lin-FITC (+Ter119-FITC) | |
| C | 488/10 | |||
| Violett laser (405 nm) | A | 760LP | 800/80 | |
| B | 630LP | 660/20 | CD150-BV650 | |
| C | 595LP | 605/20 | CD41-BV605 | |
| D | 475LP | 525/20 | ||
| E | 450/50 | CD49f-BV421 | ||
| Röd laser (640 nm) | A | 755LP | 785/50 | cKit-APC-Cy7 |
| B | 700 LP-skivor | 720/30 | ||
| C | 675/14 | CD55-AF 647 | ||
| UV-laser (355 nm) | A | 505LP | 525/20 | |
| B | 420LP | 450/50 | DAPI | |
| C | 379/28 | Ter119-BUV 395 | ||
| YG Laser (561 nm) | A | 755LP | 780/60 | CD71-PE-CY7 |
| B | 685LP | 710/50 | ||
| C | 635LP | 660/20 | ||
| D | 600LP | 610/20 | ||
| E | 570LP | 580/20 | CD105-PE |
Tabell 1: Exempel på kanallayouten i en LSRII-cytometer. Panelen av antikroppar som används i det beskrivna protokollet och deras arrangemang i LSRII-flödescytometern för att samla in data.
| Reagens eller antikropp | Böja | (mg/ml) | Utspädningsfaktorn | Slutlig sammansättning i cellsuspension (μg/ml) | Klon |
| CD71 | PE/CY7 | 0.2 | 2000 | 0.1 | RI7217 |
| TER-119 | BUV395 | 0.2 | 100 | 2 | TER-119 |
| CD55 (DAF) | AF647 | 0.5 | 50 | 10 | RIKO-3 |
| CD105 | PE | 0.2 | 50 | 4 | MJ7/18 |
| CD150 (SLAM) | BV650 | 0.1 | 50 | 2 | TC15-12F12.2 |
| CD49f | BV421 | 0.025 | 50 | 0.5 | GoH3 |
| CD41 | BV605 | 0.2 | 100 | 2 | MWReg30 |
| CD117 (cKit) | APC/CY7 | 0.2 | 200 | 1 | 2B8 |
| Lin cocktail | FITC | 0,08 (för varje antikropp i cocktailen) | 83 | 1 (för varje antikropp i cocktailen) | |
| Kanin IgG | 10 | 50 | 200 |
Tabell 2: Antikroppshuvudblandningskomponenter. Sammansättning av antikroppsmästarblandningen. Ter119-kanalen möjliggör analys av erytroblaster på samma prov (med Ter119 / CD71-metoden12). En separat Ter119-kanal är dock inte nödvändig för detta protokoll, och Ter119-antikroppen kan utelämnas från mastermixen och inkluderas som en del av Lin-FITC-cocktailen istället.
| Reagens eller antikropp | Böja | (mg/ml) | Klon |
| Ly-6G och Ly-6C | FITC | 0.5 | RB6-8C5 |
| CD11b | FITC | 0.5 | M1/70 |
| CD19 | FITC | 0.5 | 1D3 |
| CD4 | FITC | 0.5 | RM4-5 |
| CD8a | FITC | 0.5 | 53-6.7 |
| F4/80 | FITC | 0.5 | BM8 |
Tabell 3: Lin-cocktailkomponenter. Sammansättningen av Lin-cocktailen som används som en del av antikroppsmästarmixen (se detaljer om mastermixen i tabell 2).
| Reagens eller antikropp | Böja | (mg/ml) | Utspädningsfaktorn | Slutlig sammansättning i cellsuspension (μg/ml) | Klon |
| Ly-6G och Ly-6C | Biotin | 0.5 | 200 | 2.5 | RB6-8C5 |
| CD11b | Biotin | 0.5 | 200 | 2.5 | M1/70 |
| CD19 | Biotin | 0.5 | 200 | 2.5 | 1D3 |
| CD4 | Biotin | 0.5 | 200 | 2.5 | RM4-5 |
| CD8a | Biotin | 0.5 | 200 | 2.5 | 53-6.7 |
| F4/80 | Biotin | 0.5 | 200 | 2.5 | BM8 |
| TER-119 | Biotin | 0.5 | 200 | 2.5 | TER-119 |
| Normalt råttserum | 50 |
Tabell 4: Antikroppar för anrikning med magnetpärlor. Antikroppar som används för att berika Lin- fraktionen av antingen BM eller mjälte före cellsortering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förmågan att prospektivt isolera BFU-e och CFU-e stamfäder direkt från färsk vävnad med hög renhet hade tidigare gäckat utredare. Vårt nya tillvägagångssätt, validerat med hjälp av scRNAseq och cellödeanalyser 1,27, erbjuder nu verktygen för att göra detta.
Det finns ett antal viktiga punkter för att framgångsrikt genomföra både sorterings- och analysprotokollen. Först måste cellerna snurras vid 900 x g för att förhindra förlust av celler med låg densitet. Många celler vid CFU-e-stadiet är stora celler med låg densitet som annars kan gå förlorade. För det andra är det nödvändigt att använda stora öppningsspetsar vid pipettering upp och ner för att hjälpa till att bryta cellaggregaten och förhindra förlust av bräckliga P1- och P2-celler. Detta steg är viktigt eftersom många CFU-e förfäder är associerade med erytroblastic-island makrofager (EBI) och skulle gå vilse om de inte framgångsrikt dissocierades. För det tredje inkuberas cellerna med en EDTA-innehållande buffert ("SB5") före färgning, vilket hjälper till att dissociera EBI: erna. För det fjärde, under insamling av flödescytometriska data, bör förvärvshastigheten inte överstiga 7 000 händelser / s eller den rekommenderade hastigheten för det flödescytometerinstrument som används.
P1- och P2-populationerna innehåller alla CFU-e- respektive BFU-e-förfäder i benmärgen och innehåller inga andra stamcellstyper1. P1-populationen är vidare uppdelad i tidig CFU-e (P1-låg) och sen CFU-e (P1-hi) baserat på uttrycket av CD711. Dessa mycket rena flödescytometriska populationer ger en fullständig bild av BFU-e- och CFU-e-stampopulationerna in vivo.
En nackdel är att P2-populationen innehåller en liten bråkdel av tidiga CFU-e stamfäder. Den innehåller dock alla BFU-e-celler i BM och inga andra celltyper. P1-populationen innehåller alla CFU-e i BM, förutom den lilla fraktionen som finns i P2. Till skillnad från P1- och P2-populationerna är P3 till P5 mycket berikade, men inte rena, stampopulationer.
Att tillämpa detta flödescytometriska verktyg på musmodeller av erytropoies skulle nu möjliggöra bestämning av cellulära och molekylära svar under fysiologiska och patologiska störningar till erytropoies. I det visade exemplet injicerades möss med hormonet Epo. Detta tillvägagångssätt kan användas i genetiskt modifierade möss, till exempel i musmodeller av hemoglobinopatier, för en mer exakt molekylär analys av deras förändrade erytroida förfäder in vivo.
DATA TILLGÄNGLIGHET:
Ytterligare data som är associerade med experimenten i figur 4 och figur 5 finns tillgängliga på begäran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av NIH-bidrag R01DK130498, R01DK120639 och R01HL141402
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575020 | |
| 1000 µL large orifice tips | USA sceintific | 1011-9000 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD55 (DAF) Antibody | BioLegend | 131806 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) Antibody | BioLegend | 105826 | |
| Biotin-CD11b | BD Biosciences | 557395 | M1/70 (clone) |
| Biotin-CD19 | BD Biosciences | 553784 | 1D3 (clone) |
| Biotin-CD4 | BD Biosciences | BDB553045 | RM4-5 (clone) |
| Biotin-CD8a | BD Biosciences | BDB553029 | 53-6.7 (clone) |
| Biotin-F4/80 | Biolegend | 123106 | BM8 (clone) |
| Biotin-Ly-6G and Ly-6C | BD Biosciences | 553125 | RB6-8C5 (clone) |
| Biotin-TER-119 | BD Biosciences | 553672 | TER-119 (clone) |
| Bovine Serum Albumin | Sigma aldritch | A1470 | |
| Brilliant Violet 421 anti-human/mouse CD49f Antibody | BioLegend | 313624 | |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD41 Antibody | BioLegend | 133921 | |
| Brilliant Violet 650 anti-mouse CD150 (SLAM) Antibody | BioLegend | 115931 | |
| BUV395 Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells | BD Biosciences | 563827 | |
| ChromPure Rabbit IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 011-000-003 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306 | |
| Digital DIVA hardware and software for LSR II | BD Biosciences | ||
| FITC anti-mouse F4/80 Antibody | BioLegend | 123108 | |
| FITC Rat Anti-CD11b | BD Biosciences | 557396 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD19 | BD Biosciences | 553785 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD4 | BD Biosciences | 553047 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 553031 | |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and LY-6C | BD Biosciences | 553127 | |
| FlowJo software | FlowJo | version 10 | Flow cytometer analysis software |
| LSR II digital multiparameter flow cytometer analyzer | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| NewlineNY Stainless Steel Hand Masher & Bowl, Mortar and Pestle Set | Amazon | ||
| Normal rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| PE anti-mouse CD105 Antibody | BioLegend | 120408 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD71 Antibody | BioLegend | 113812 | |
| Phosphate Buffered Saline, 10x Solution | Fisher scientific | BP3994 | |
| Streptavidin Nanobeads | BioLegend | 480016 | Magnetic beads |
References
- Tusi, B. K., et al. Population snapshots predict early haematopoietic and erythroid hierarchies. Nature. 555 (7694), 54-60 (2018).
- Socolovsky, M. The role of specialized cell cycles during erythroid lineage development: Insights from single-cell RNA sequencing. International Journal of Hematology. 116 (2), 163-173 (2022).
- Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development. WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504 (2021).
- Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M., Heath, D. S. Properties of Cells that Produce Erythrocytic Colonies In Vitro. Hemopoiesis in Culture. Robinson, W. A. , National Institutes of Health, US Government Printing Office. (1974).
- Heath, D. S., Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M. Separation of the erythropoietin-responsive progenitors BFU-E and CFU-E in mouse bone marrow by unit gravity sedimentation. Blood. 47 (5), 777-792 (1976).
- Iscove, N. N., Sieber, F. Erythroid progenitors in mouse bone marrow detected by macroscopic colony formation in culture. Experimental Hematology. 3 (1), 32-43 (1975).
- Gregory, C. J., McCulloch, E. A., Till, J. E. Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: State of differentiation. Journal of Cell Physiology. 81 (3), 411-420 (1973).
- Gregory, C. J., Tepperman, A. D., McCulloch, E. A., Till, J. E. Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: Response of normal and genetically anemic W-W-V mice to manipulations of the erythron. Journal of Cell Physiology. 84 (1), 1-12 (1974).
- Gregory, C. J. Erythropoietin sensitivity as a differentiation marker in the hemopoietic system: studies of three erythropoietic colony responses in culture. Journal of Cell Physiology. 89 (2), 289-301 (1976).
- Pop, R., et al. A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression. PLoS Biology. 8 (9), 1000484 (2010).
- Koulnis, M., et al. Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay. Journal of Visualized Experiments. (54), e2809 (2011).
- Liu, Y., et al. Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in vivo. Blood. 108 (1), 123-133 (2006).
- Socolovsky, M., et al. Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts. Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).
- Chen, K., et al. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17413-17418 (2009).
- Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development. WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504 (2020).
- Hidalgo, D., et al. EpoR stimulates rapid cycling and larger red cells during mouse and human erythropoiesis. Nature Communications. 12 (1), 7334 (2021).
- Porpiglia, E., Hidalgo, D., Koulnis, M., Tzafriri, A. R., Socolovsky, M. Stat5 signaling specifies basal versus stress erythropoietic responses through distinct binary and graded dynamic modalities. PLoS Biology. 10 (8), 1001383 (2012).
- Koulnis, M., et al. Contrasting dynamic responses in vivo of the Bcl-xL and Bim erythropoietic survival pathways. Blood. 119 (5), 1228-1239 (2012).
- Shearstone, J. R., et al. Global DNA demethylation during mouse erythropoiesis in vivo. Science. 334 (6057), 799-802 (2011).
- Koulnis, M., Liu, Y., Hallstrom, K., Socolovsky, M. Negative autoregulation by Fas stabilizes adult erythropoiesis and accelerates its stress response. PLoS One. 6 (7), 21192 (2011).
- Pronk, C. J., et al. Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy. Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).
- Dolznig, H., et al. Expansion and differentiation of immature mouse and human hematopoietic progenitors. Methods in Molecular Medicine. 105, 323-344 (2005).
- Li, J., et al. Isolation and transcriptome analyses of human erythroid progenitors: BFU-E and CFU-E. Blood. 124 (24), 3636-3645 (2014).
- Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: Functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system. Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).
- Flygare, J., Rayon Estrada, V., Shin, C., Gupta, S., Lodish, H. F. HIF1alpha synergizes with glucocorticoids to promote BFU-E progenitor self-renewal. Blood. 117 (12), 3435-3444 (2011).
- Pronk, C. J., Attema, J., Rossi, D. J., Sigvardsson, M., Bryder, D. Deciphering developmental stages of adult myelopoiesis. Cell Cycle. 7 (6), 706-713 (2008).
- Khoramian Tusi, B., Socolovsky, M. High-throughput single-cell fate potential assay of murine hematopoietic progenitors in vitro. Experimental Hematology. 60, 21-29 (2018).
- Erslev, A. J., Caro, J. Erythropoietin titers in response to anemia or hypoxia. Blood Cells. 13 (1-2), 207-216 (1987).
- Koury, M. J., Bondurant, M. C. The molecular mechanism of erythropoietin action. European Journal of Biochemistry. 210 (3), 649-663 (1992).
