Summary
En musekirurgisk model til at skabe venstre lungeiskæmireperfusion (IR) skade, samtidig med at ventilationen opretholdes og hypoxi undgås.
Abstract
Iskæmi reperfusion (IR) skade skyldes ofte processer, der involverer en forbigående periode med afbrudt blodgennemstrømning. I lungen tillader isoleret IR eksperimentel undersøgelse af denne specifikke proces med fortsat alveolær ventilation og derved undgår de sammensatte skadelige processer af hypoxi og atelektase. I klinisk sammenhæng er lungeiskæmireperfusionsskade (også kendt som lunge IRI eller LIRI) forårsaget af adskillige processer, herunder men ikke begrænset til lungeemboli, genoplivet hæmoragisk traume og lungetransplantation. Der er i øjeblikket begrænsede effektive behandlingsmuligheder for LIRI. Her præsenterer vi en reversibel kirurgisk model af lunge-IR, der involverer første orotracheal intubation efterfulgt af ensidig venstre lungeiskæmi og reperfusion med bevaret alveolær ventilation eller gasudveksling. Mus gennemgår en venstre thoracotomi, hvorigennem den venstre lungearterie udsættes, visualiseres, isoleres og komprimeres ved hjælp af en reversibel slipknot. Det kirurgiske snit lukkes derefter i den iskæmiske periode, og dyret vækkes og ekstuberes. Når musen spontant trækker vejret, etableres reperfusion ved at frigive slipknuden omkring lungearterien. Denne klinisk relevante overlevelsesmodel tillader evaluering af lunge-IR-skade, opløsningsfasen, nedstrømseffekter på lungefunktionen samt to-hit-modeller, der involverer eksperimentel lungebetændelse. Selvom det er teknisk udfordrende, kan denne model mestres i løbet af et par uger til måneder med en eventuel overlevelses- eller succesrate på 80% -90%.
Introduction
Iskæmi reperfusion (IR) skade kan opstå, når blodgennemstrømningen genoprettes til et organ eller væv seng efter en periode med afbrydelse. I lungen kan IR forekomme isoleret eller i forbindelse med andre skadelige processer såsom infektion, hypoxi, atelektase, volutrauma (fra høje tidevandsvolumener under mekanisk ventilation), barotrauma (højt peak eller vedvarende tryk under mekanisk ventilation) eller stump (ikke-penetrerende) lungekontusionsskade 1,2,3 . Der er stadig flere huller i vores viden om LIRI's mekanismer og virkningen af samtidige processer (f.eks. infektion) på LIRI-resultaterne, og også behandlingsmulighederne for LIRI er begrænsede. En in vivo-model af ren LIRI er nødvendig for at identificere patofysiologien af lunge IR-skade isoleret og for at studere dens bidrag til enhver multi-hit-proces, hvor lungeskade er en komponent.
Murine lunge IR-modeller kan bruges til at studere den lungespecifikke patofysiologi af flere processer, herunder lungetransplantation3, lungeemboli4 og lungeskade efter hæmoragisk traume med genoplivning5. Aktuelt anvendte modeller omfatter kirurgisk lungetransplantation6, hilar fastspænding7, ex vivo lungeperfusion8 og ventileret lunge IR9. Her giver vi en detaljeret protokol for en murinventileret lunge-IR-model af steril lungeskade. Der er flere fordele ved denne tilgang (figur 2), herunder at den inducerer minimal hypoxi og minimal atelektase, og det er en overlevelseskirurgisk model, der giver mulighed for langsigtede undersøgelser.
Grunde til at vælge denne model af LIRI frem for andre modeller såsom hilar fastspænding og ex vivo perfusion modeller er følgende: denne model minimerer de inflammatoriske bidrag fra atelektase, mekanisk ventilation og hypoxi; det bevarer cyklisk ventilation; det opretholder et intakt in vivo kredsløbsimmunsystem, der kan reagere på IR-skaden; og endelig tillader den som en overlevelsesprocedure en langsigtet analyse af mekanismerne for sekundær skadesgenerering (2-hit-modeller) og skadeopløsning. Samlet set mener vi, at denne ventilerede lunge IR-model giver den "reneste" form for IR-skade, der kan studeres eksperimentelt.
Andre publikationer har beskrevet brugen af orotracheal intubation af mus til at udføre IT-injektioner eller installationer10,11, men ikke som udgangspunkt for en overlevelsesoperation, som det er i denne model. Placeringen af et orotrachealrør tillader udførelse af lungekirurgi ved at tillade sammenbrud af den operative lunge. Det giver også mulighed for genopblussen af lungen i slutningen af proceduren, hvilket er kritisk for pneumothorax og for musens evne til at vende tilbage til spontan ventilation ved afslutningen af procedurerne. Endelig er fjernelsen af det sikrede orotrachealrør en simpel procedure, der i modsætning til en invasiv trakeotomi er kompatibel med en overlevelsesoperation. Dette giver mulighed for langsigtede forskningsundersøgelser med fokus på at forstå progression og opløsning af LIRI og tilhørende lidelser samt oprettelse af kroniske skademodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer og trin beskrevet nedenfor blev godkendt af den institutionelle dyrepleje- og brugskomité (IACUC) ved University of California San Francisco. Enhver musestamme kan bruges, selvom nogle stammer har en mere robust lunge IR-inflammatorisk respons sammenlignet med andre12. Mus, der er ca. 12-15 uger gamle (30-40 g) eller ældre, tolererer og overlever lunge-IR-operationen bedre end yngre mus. Både han- og hunmus kan bruges til disse operationer.
1. Protokol til intubation af mus
- Anæstesi og forberedelse til intubation
- Tør musens mave af med en ethanolpind. Anæstetiser musen med en intraperitoneal injektion af tribromoethanol (250-400 mg/kg). Vurder den passende dybde af anæstesi ved manglen på pedaludtagningsrefleks. Øjensmørende salve anbringes nu eller senere (trin 2.1.4).
BEMÆRK: Til denne procedure giver tribromoethanol (og etomidat som en alternativ mulighed) et stabilt bedøvelsesplan uden at påvirke de hæmodynamiske tilstande, der kræves til denne operation. Denne bedøvelse bruges kun én gang for at undgå risikoen for peritoneale adhæsioner. Isofluran kunne også bruges, men vi bruger det ikke her. Udøveren er fri til at bruge den bedøvelsesopskrift, de finder passende. - Placer den bedøvede mus på et intubationsstativ eller plaststøtte i liggende stilling, ophængt af dens øvre fortænder på loopede 4-0 suturer (silke eller andet) over to støtteankre.
- For at holde musen immobiliseret under intubationsproceduren skal du løse tape den nederste del af brystet (eller begge øvre lemmer) til platformen.
- Placer det fiberoptiske fleksible lys forsigtigt på musens luftrør, lidt under stemmebåndene. Juster belysningsniveauet, så kun et mørkt felt er synligt, når du ser ind i musens oropharynx bortset fra rødt lys, der stammer fra under stemmebåndene, hvilket viser målet for den endelige placering af endotrachealrøret. Bemærk, at stemmebåndsbevægelser skal være synlige med det blotte øje eller om nødvendigt under forstørrelse.
- Tør musens mave af med en ethanolpind. Anæstetiser musen med en intraperitoneal injektion af tribromoethanol (250-400 mg/kg). Vurder den passende dybde af anæstesi ved manglen på pedaludtagningsrefleks. Øjensmørende salve anbringes nu eller senere (trin 2.1.4).
- Intubation procedure
- Hold pincetten med den dominerende hånd og brug dem til forsigtigt at gribe og trække tungen ud af mundhulen.
- Åbn underkæben ved hjælp af tang, der holdes af den ikke-dominerende hånd, og skub derefter tangen ind i strubehovedet for forsigtigt at løfte epiglottis. På dette tidspunkt skal du slippe tungen fra pincetten.
- Kig efter stemmebåndene. De skal åbne og lukke i henhold til hvert åndedrag. Hold kanylen med styretråden forudindlæst, indsæt spidsen af ledningen gennem stemmebåndene.
- Vær meget forsigtig med ikke at flytte ledningen ved at holde en del af den, der er uden for kanylen, men lige over stemmebåndene, træk kanylen tilbage og lad kun ledningen være på plads med sin distale ende i luftrøret.
- På dette tidspunkt skal du udføre en anden visualisering af stemmebåndene for at bekræfte, at trådens distale spids forbliver passeret gennem de oplyste stemmebånd og ind i luftrøret og ikke er i den uoplyste spiserør.
- Hold ledningen uden for munden med den buede tang i venstre hånd, stabiliseret mod en hård overflade, og skub forsigtigt 20G-kateteret med tapevinger over ledningen.
- Når den distale ende af ledningen kommer ud af bagenden af 20G-kateteret eller endotrachealrøret, skal du holde den ende med de buede tang og glide 20G-kateteret ind i luftrøret.
- Fjern forsigtigt ledningen fra den distale ende af 20G-kateteret med de buede tang uden at løsne kateterets placering.
- Tilslut kateteret kort til ventilatoren, før du sikrer det for at bekræfte korrekt placering i luftrøret og ikke spiserøret. Bekræft trakeal placering ved observation af mekanisk ventilationsafhængig bilateral brystvægsbevægelser og fraværet af inflation i maven.
- Efter intubation
- Frakobl kateteret fra ventilatoren. Fastgør båndvingerne (fastgjort til kateteret) gennem musens underlæbe ved hjælp af en 4-0 vicrylsutur for at fastgøre endotrachealrøret (ETT) til musen under alle efterfølgende procedurer / manipulationer.
BEMÆRK: Alternativt kan silketape eller andet tape bruges til at sikre ETT, men man skal sørge for at undgå at løsne ETT under bevægelse af dyret fra intubationsslæden til den kirurgiske overflade. - Fjern forsigtigt musen fra intubationsslæden. Tilslut kateteret kort til ventilatoren, der er indstillet til et tidevandsvolumen 0,2-0,225 ml og en respirationsfrekvens på 120-150 vejrtrækninger pr. Minut for at bekræfte korrekt trakealplacering af orotrachealrøret, og afbryd derefter forbindelsen med musen, der trækker vejret spontant gennem orotrachealrøret.
- Efterlad ikke dyret uden opsyn fra dette tidspunkt og fremefter, før det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde sternal recumbency ved afslutningen af proceduren.
- Frakobl kateteret fra ventilatoren. Fastgør båndvingerne (fastgjort til kateteret) gennem musens underlæbe ved hjælp af en 4-0 vicrylsutur for at fastgøre endotrachealrøret (ETT) til musen under alle efterfølgende procedurer / manipulationer.
2. Lungeiskæmi og reperfusion (IR) kirurgi protokol
- Analgesi og forberedelse af det kirurgiske sted
- Tør musens mave af med en ethanolpind, og injicer buprenorphin (0,05-0,1 mg/kg) intraperitonealt.
- Barber håret over venstre brystkasseområde op til venstre skulderblad. Fjern overskydende barberet hår ved hjælp af alkoholpinde.
BEMÆRK: Trin 2.1.1 og 2.1.2 kan også udføres før intubation, hvis der er bekymring for løsrivelse af ETT, når den er fastgjort med silketape. - Placer musen på en varmepude i en venstre lateral eller 3/4 drejet position og tilslut trakealrøret på ventilatoren med et tidevandsvolumen på 0,2-0,225 ml (~ 8 mg / kg) og en respirationsfrekvens på 120-150 vejrtrækninger pr. Minut. Brug ikke supplerende ilt til denne procedure.
- Påfør øjensmøremiddel med en steril vatpind i bomuldsspidsen. Drej musen til 3/4 venstre side opad og immobiliser alle fire lemmer og halen med laboratorietape.
- Desinficer det barberede hudområde og den omgivende pels med povidon-jod og vent på, at opløsningen tørrer. Dæk derefter det kirurgiske felt med en steril drapering eller klar plastfilm og skab en rektangulær åbning i draperingen eller plastfilmen til det kirurgiske felt.
- Kirurgisk procedure
- Bekræft det passende niveau af anæstesi (tilvejebragt ved administration af tribromethanol og buprenorphin som beskrevet tidligere) ved at teste respons på tåspids.
- Brug en par skarpe sakse og et par større tang (smalle mønstertang eller lignende) til at lave et 2 cm tværgående hudsnit under den nedre vinkel af scapulaen i venstre laterale thorax. Brug saksen og et finere par tang (ekstra fin graefe tang eller lignende) til at skære i det muskuløse lag og dissekere ned til ribbenene.
- Identificer det andet interkostale rum, og hold det andet ribben med de ekstra fine tang. Træk ribben opad, brug et sterilt #11 eller #12 (buet) skalpelblad (intet håndtag nødvendigt) til at komme ind i pleuralrummet ved at adskille og skære på tværs af 2.-3. rummets interkostale muskler. Overvej at sætte ventilationen på pause for at reducere skaden på venstre lungespids.
- Indsæt tre steriliserede retraktorer. Brug den mindste / smalleste retraktor cephalad langs ribbenenes orientering, den mellemstore retraktor til venstre langs 2. ribben og den største retraktor til højre langs overfladen af 3. ribben.
- Åbn brystet med langsom og progressiv tilbagetrækning ved hjælp af de elastiske retraktorsnore. Udsæt og identificer den venstre lungearterie (PA) ved at flytte venstre lungespids væk med en steril vatpind i bomuldsspidsen.
- Brug mikrotangen, ultrafine tang i højre hånd og PA eller kar dilaterende tang i venstre hånd, til forsigtigt at udsætte og skabe det felt, hvor venstre PA og bronchus begge er synlige.
- Brug PA-tangen til at samle den venstre PA op og trække forsigtigt, men fast opad og cephalad for at visualisere de gennemsigtige bronchus nedenfor. Forøg forstørrelsen på dissektionsmikroskopet (se udstyrslisten for flere detaljer) på dette tidspunkt til maksimum (2x).
BEMÆRK: Steriliser alt udstyr før brug. For at opretholde sterilitet bør kun spidserne af kirurgiske instrumenter desuden komme ind i det sterile kirurgiske felt. - Mens PA trækkes væk fra bronchus, skal du forsigtigt passere de lukkede ultrafine tang gennem rummet mellem venstre PA og bronchus. Brug derefter disse tang til at holde og trække en 7-0 eller 8-0 prolensutur gennem rummet mellem venstre lungearterie (ovenfor) og bronchus (nedenfor).
- Omslut den venstre PA ved at binde en slipknot for at skabe en okklusion i PA. Afbrydelse af blodgennemstrømningen visualiseres let under mikroskopet. Dette markerer indledningen af den iskæmiske periode.
- Eksternaliser den frie ende af knuden gennem et andet indgangspunkt i den forreste venstre brystkasse ved hjælp af en 24G-28G nål og fastgør enden af suturen med et lille stykke tape for lettere identifikation senere.
- Pust lungen op igen for at udvise så meget luft ud af brysthulen som muligt ved hjælp af en PEEP-ventil/slange på gnaverventilatoren. Luk derefter brystkassen med to afbrudte 4-0 nylonsuturer.
- Luk musklen og det subkutane lag med en løbende 4-0 nylonsutur. Påfør derefter to eller tre dråber topisk bupivacain (0,5%) på snittet. Brug en 4-0 nylonsutur til at lukke hudlaget med en løbende sutur.
- Postoperativ pleje
- Når spontan ventilation er genoptaget, skal du afbryde endotrachealrøret fra ventilatoren og ekstubere musen.
- Placer musen på varmepuden for at opretholde kropstemperaturen under tidlig genopretning efter anæstesi.
- Overvåg musen omhyggeligt, mens du kommer dig efter generel anæstesi. Træk forsigtigt i den eksternaliserede slipknude i slutningen af den iskæmiske periode (30 min eller 1 time).
- Flyt musen fra varmepuden til et bur, når den har udvist tegn på bedring: selvkorrigerende og/eller bevægelse.
- Efter reperfusionsperioden (1 time eller 3 timer) aflives dyret og samler blod ved hjertepunktur og lungevæv til yderligere analyse. I 1 time reperfusion indsamles plasma til ELISA, væv til RNA og proteinanalyse; I 3 timers reperfusion samles desuden væv til histologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Inflammation genereret af ensidig ventileret steril lungeiskæmireperfusion (IR) skade: Efter 1 time iskæmi observerede vi øgede niveauer af cytokiner i serumet og i lungevævet ved både ELISA og qRT-PCR, der toppede ved 1 time efter reperfusion og hurtigt vendte tilbage til baseline inden for 12-24 timer efter reperfusion13. For prøver indsamlet efter 3 timer efter reperfusion observerede vi intens neutrofilinfiltration i venstre lungevæv og bemærkede, at intensiteten af betændelsen var afhængig af den anvendte musestamme (figur 1). Især opløsninger den inflammation, der genereres i mangel af en sameksisterende eller efterfølgende infektiøs proces, gradvist, og lungerne vender tilbage til deres normale lungearkitektur (ved histopatologi) med efferocytose eller udgang af neutrofiler fra de skadede lunger inden for 12-24 timer efter reperfusion13. Bemærk, at vi observerede mild, men påviselig betændelse, som stort set var neutrofil og også blev observeret i den ikke-operative højre lunge, som vi antager skyldes hyperperfusionsskade14.
Vævsprøveindsamling for denne lunge-IR-model er ikke anderledes end for andre lunge-IR-modeller: blod kan indsamles til plasmapræparation via hjertepunktur eller IVC-kannulation; lungevæv kan høstes til protein- eller RNA-forberedelse og derefter til yderligere analyse ved western blot, ELISA eller qPCR.
Figur 1: Histologi af lungesektioner i vildtypemus af to forskellige stammer. (A) C3H og (B) C57BL/6 mus. Begge stammer af mus modtog 1 h iskæmi og 3 timers reperfusion, og vævet er vist ved 10x forstørrelse. 40x forstørrelse er vist i indsatsen. Neutrofil infiltration blev observeret i begge stammer, hvor C3H-stammen viste markant større niveauer af inflammation sammenlignet med C57BL/6 som rapporteret tidligere12. Skalabjælken er 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Sammenligning af fordele (blå tekst) og ulemper (rød tekst) af de tre mest almindeligt anvendte museeksperimentelle lunge IR-skademodeller (LIRI). Denne sammenligning fremhæver valget af ventileret lunge IR (beskrevet i dette manuskript) som den ideelle model til at studere ren lunge IR. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette manuskript beskriver de trin, der er involveret i udførelsen af den ventilerede lunge IR-model udviklet af Dodd-o et al.9. Denne model har hjulpet med at identificere molekylære veje involveret i generering og opløsning af inflammation fra lunge IR isoleret 14,15,16,17, lunge IR i kombination med sameksisterende infektion 18 og lunge IR i forhold til tarm-lungeaksen og bidraget fra tarmmikrobiomet13,18,19 . Selvom den nuværende model teknisk set er mere udfordrende, giver den mulighed for evaluering af lunge-IR uden de sammensatte virkninger af afbrudt cyklisk lungeinflation og hypoxi. Det minimerer også perioden med mekanisk ventilatoreksponering, i modsætning til ex vivo-perfusionsmodellen, som i sig selv kan føre til lungeskade20.
Metodens begrænsninger: Mens musens luftrør er tilspidset nok til, at positivt slutudløbstryk (PEEP) giver mulighed for udvidelse af lungerne og giver en tæt pasform til ETT, er lungemekanik og flowvolumensløjfemålinger muligvis ikke mulige med denne version af reversibel orotracheal intubation. Disse lungefysiologiske målinger kan kræve en trakeotomi, som i modsætning til denne metode er uforenelig med en overlevelseslungeoperation. Reversibel orotracheal intubation tolereres godt af mus, og selv i mangel af paralytika er der meget lidt muse-respirator asynkron, forudsat at minutventilationen (MV = tidevandsvolumen x respirationsfrekvens) er tilstrækkelig høj nok til at forhindre det naturlige CO2 -drevne drev ved åndedrættet overtager (dvs. lige ud over den apnøse tærskel).
Der er flere overvejelser i forbindelse med iskæmi-reperfusion (IR) delen af denne procedure. For det første skal IR-proceduren udføres med så lidt fysisk traume i lungen som muligt. Vi anbefaler at sætte den mekaniske ventilation på pause og lade musen trække vejret spontant, når den kommer ind i brysthulen. Undertryksventilationen sammen med kirurgens greb om det andet eller tredje ribben og trækker det væk fra lungen, mens det forsigtigt kommer ind i brystet med et # 11 skalpelblad, reducerer chancen for at skade lungen med skalpellen. Alternativt har vi fundet ud af, at brug af et #12 buet skalpelblad, placeret således, at kurven vender opad, giver mulighed for mere forsigtig indtræden i brysthulen, hvilket potentielt reducerer skaden på den underliggende venstre lungespidsoverflade. Derudover er forbindelsen mellem venstre PA og bronchus mindre sikker tættere på hilum, hvilket gør passagen af den ultrafine tang mellem disse to strukturer lettere her.
Det næste kritiske skridt er at isolere den venstre PA fra bronchus nedenfor for at omslutte PA med en suturbinding. Det er vigtigt, at dette trin udføres omhyggeligt for at undgå traumer i lungetoppen. Vi anbefaler at komme ind i thoraxburet så cephalad som muligt for at minimere mængden af venstre lunge, der skal forskydes eller trækkes tilbage for at få adgang til PA og bronchus. Enhver del af lungen, der opretholder stump traume, skal udelukkes fra evaluering for isoleret IR-skade. Ofte fjernes toppen af venstre lunge, når lungerne samles til endelig analyse af steril lunge-IR-skade. Skade på toppen af lungen kan visualiseres under operationen på grund af tilstedeværelsen af blødning eller blodig misfarvning.
Mellem PA og bronchus nedenfor findes et bindevævslag, der skal brydes for at omkranse arterien med suturbåndet. At lære, hvor meget spænding der er tilladt, mens du griber og trækker venstre PA opad (dvs. mod brystkassen og væk fra bronchus), ved hjælp af det ikke-savtakkede, ikke-skadelige fartøj, der griber flad fin tang i venstre hånd, er et vigtigt første skridt til at mestre. Den venstre PA kan tolerere en overraskende mængde spænding og strække sig, når den trækkes opad. Vi finder det nyttigt at øge forstørrelsen af synsfeltet til maksimum og justere fokus, så det potentielle rum (en hvid linje af bindevæv, der klæber PA til bronchus) kan visualiseres tydeligt og skarpt sammen med den ultrafine tang (holdt i højre hånd). For at feltet skal forblive i fokus, er det vigtigt at stabilisere venstre hånd på den kirurgiske overflade, mens du trækker venstre PA op og væk fra bronchus. Den ultrafine tang kan derefter passeres i rummet mellem de to strukturer. De lukkede spidser skal passere let uden nogen reel modstand, og når de ses på den anden side af venstre PA, kan spidserne åbnes forsigtigt for yderligere at skabe plads til passage af suturmaterialet. Det er afgørende, at dette udføres ved hjælp af fuldstændig ubeskadiget ultrafin tang, som hurtigt kan bestemmes ved at trække en steril spritpind gennem de lukkede spidser for at observere, om spidserne river i materialet. Skadesspidser kan også identificeres ved at åbne og lukke tangen under maksimal forstørrelse af det kirurgiske mikroskop.
Det er let at opdage skader, der opstår på enten venstre PA eller venstre hovedbronkier, mens man forsøger at adskille dem. Skader på venstre PA resulterer i oversvømmelse af synsfeltet med blod og kan resultere i en ikke-bjærgelig operation, hvis skaden skaber et hul i selve PA. Især er der overflademikroskopiske blodkar på PA, der kan blive såret under den ultrafine pincetbevægelse og potentielt kan styres ved at placere en tør steril bomuldsspidspind over marken for at absorbere det blod, der vises. Hvis blødningen stopper, kan proceduren genoptages. Skader på venstre hovedbronchus er altid en situation, der ikke kan reddes, da der ikke er nogen enkel eller hurtig måde at reparere luftvejsskader på.
Trinnet med at adskille PA fra de underliggende bronchus kan oprindeligt praktiseres på en død mus uden tidspres eller distraktion af hjerteaktivitet og den bevægelse, den forårsager. Derudover gør blodets stasis i venstre PA det lettere at visualisere det (tykt og fyldigt kar), og alligevel stadig i stand til at blive samlet op af den ikke-skadende flade PA-tang. Evnen til at opdage skader i venstre bronchus er stadig mulig, da ventilationen af venstre lunge kan bruges til at vurdere tilstedeværelsen af en intakt ledende luftvej til venstre lunge. Denne øvelsessituation kan også bruges til at perfektionere oprettelsen af slipknot.
Der er en begrænset varighed af okklusion, ud over hvilken spontan reperfusion efter fjernelse af slipknot ikke er garanteret. I pilotundersøgelser sker dette et sted mellem 6 og 10 timer. Ud over dette forekommer reperfusion mindre umiddelbart efter fjernelse af slipknot. Da den iskæmiske periode strækker sig, kræver reperfusion manipulation af PA efter slipknot-fjernelse for at genoprette blodgennemstrømningen.
Disse følgende observationer er opnået fra fem medforfattere af dette papir, der repræsenterer deres kollektive erfaring med at lære, perfektionere, fejlfinde og forbedre denne procedure i den periode, hvor de gennemførte denne musekirurgiske model og er blevet opsummeret i nedenstående punkter:
I gennemsnit tog det 1-3 måneder at mestre denne kirurgiske procedure. En proceduremedarbejder anslog, at det tager cirka 50 operationer at blive letkøbt med de forskellige procedurer.
Succesraten i starten af udførelsen af proceduren var 20% -40%. Efter at have udført proceduren regelmæssigt og med fortrolighed steg succesraten til 80% -90%.
Den sværeste del af operationen var enstemmigt passagen af de ultrafine tang mellem venstre PA og venstre bronchus, og derefter den efterfølgende indfangning af suturmonofilamentet med tangen og dets passage mellem de to strukturer.
Fejl under passagen af monofilamentet mellem PA og venstre mainstem bronchus kan føre til en uoprettelig operation med katastrofal blødning af venstre PA eller irreversibel skade på venstre hovedbronchus.
Det maksimale antal operationer, der var mulige på 1 enkelt dag, blev anslået til at være 10 (ca. 35-45 minutter / kirurgi), mens det ideelle antal for proceduremæssig komfort og kirurgisk succes var fem eller seks.
Andre forskellige tips og forslag omfatter:
Undgå overskydende koffein, før du starter den kirurgiske dag for at opretholde en stabil håndposition.
Forøg forstørrelsen på mikroskopet til maksimum under den del af proceduren, når suturen føres mellem venstre PA og venstre hovedbronkier.
Brug blide og gradvise/trinvise bevægelser, når du rykker Dumont-tangen frem for at skabe plads mellem venstre PA og venstre hovedbronkier.
Stabiliser hænderne på den kirurgiske overflade, når du udfører alle kritiske trin.
Sørg for, at respirationsfrekvensen på ventilatoren er høj nok til at undgå spontane vejrtrækninger, især under de vigtige / kritiske dele af proceduren (sutur, der passerer mellem venstre PA og venstre hovedbronchus).
Et roligt og uforstyrret miljø til at udføre operationerne er afgørende for at forblive fokuseret og uforstyrret.
Figur 2 sammenligner denne model med alternative modeller af lunge-IR-skade. Denne model af ventileret lungeiskæmireperfusion giver fordelene ved at minimere atelektase, hypoxi og mekanisk ventilation. Det er vigtigt, at den som overlevelsesoperation er kompatibel med anden skadesmodeller (f.eks. Eksperimentelle lungebetændelsesmodeller) og analyse af opløsningen af skade.
Afslutningsvis har vi beskrevet en overlevelsesoperation, der involverer skabelsen af lungeiskæmireperfusionsskade, som vi mener kan give værdifuld indsigt i de mekanismer og cellulære veje, der er involveret i ren IR-skade i lungen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af afdelingsstøtte fra Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California San Francisco og San Francisco General Hospital samt af en NIH R01-pris (til AP): 1R01HL146753.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Fiber Optic Light Pipe | Cole-Parmer | UX-41720-65 | Fiberoptic light pipe |
| Fiber Optic Light Source | AmScope | SKU: CL-HL250-B | Light source for fiberoptic lights |
| Germinator 500 | Cell Point Scientific, Inc. | No.5-1450 | Bead Sterilizer |
| Heating Pad | AIMS | 14-370-223 | Alternative option |
| Lithium.Ion Grooming Kits(hair clipper) | WAHL home products | SKU 09854-600B | To remove mouse hair on surgical site |
| Microscope | Nikon | SMZ-10 | Other newer options available at the company website |
| MiniVent Ventilator | Havard Apparatus | Model 845 | Mouse ventilator |
| Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | UX-08895-05 | Clean tools that been used in operation |
| Warming Pad | Kent Scientific | RT-0501 | To keep mouse warm while recovering from surgery |
| Weighing Scale | Cole-Parmer | UX-11003-41 | Weighing scale |
| Surgery Tools | |||
| 4-0 Silk Suture | Ethicon | 683G | For closing muscle layer |
| 7-0 Prolene Suture | Ethicon Industry | EP8734H | Using for making a slip knot of left pulmonary artery |
| Bard-Parker (11) Scalpel (Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade, sterile, single use) | Aspen Surgical | 372611 | For entering thoracic cavity (option 1) |
| Bard-Parker (12) Scalpel | Aspen Surgical | 372612 | For entering thoracic cavity (option 2) |
| Extra Fine Graefe Forceps | FST | 11150-10 | Muscle/rib holding forceps |
| Magnetic Fixator Retraction System | FST | 1. Base Plate (Nos. 18200-03) 2. Fixators (Nos. 18200-01) 3. Retractors (Nos. 18200-05 through 18200-12) 4. Elastomer (Nos.18200-07) 5. Retractor(No.18200-08) |
Small Animal Retraction System |
| Monoject Standard Hypodermic Needle | COVIDIEN | 05-561-20 | For medication delivery IP |
| Narrow Pattern Forceps | FST | 11002-12 | Skin level forceps |
| Needle holder/Needle driver | FST | 12565-14 | for holding needles |
| Needles | BD | 305110 | 26 gauge needle for externalizing slipknot (24 or 26 gauge needle okay too) |
| PA/Vessel Dilating forceps | FST | 00125-11 | To hold PA; non-damaging gripper |
| Scissors | FST | 14060-09 | Used for incision and cutting into the muscular layer durging surgery |
| Ultra Fine Dumont micro forceps | FST | 11295-10 (Dumont #5 forceps, Biology tip, tip dimension:0.05*0.02mm,11cm) | For passing through the space between the left pulmonary artery and bronchus |
| Reagents | |||
| 0.25% Bupivacaine | Hospira, Inc. | 0409-1159-02 | Topical analgesic used during surgical wound closure |
| Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) | Sigma-Aldrich | T48402-25G | Anesthetic, using for anesthetize the mouse for IR surgery, the concentration used in IR surgery is 250-400 mg/kg. |
| Buprenorphine | Covetrus North America | 59122 | Analgesic: concentration used for surgery is 0.05-0.1 mg/kg |
| Eye Lubricant | BAUSCH+LOMB | Soothe Lubricant Eye Ointment | Relieves dryness of the eye |
| Povidone-Iodine 10% Solution | MEDLINE INDUSTRIES INC | SKU MDS093944H (2 FL OZ, topical antiseptic) | Topical liquid applied for an effective first aid antiseptic at beginning of surgery |
| Materials | |||
| Alcohol Swab | BD brand | BD 326895 | for sterilzing area of injection and surgery |
| Plastic film | KIRKLAND | Stretch-Tite premium | Alternative for covering the sterilized surgical field (more cost effective) |
| Rodent Surgical Drapes | Stoelting | 50981 | Sterile field or drape for surgical field |
| Sterile Cotton Tipped Application | Pwi-Wnaps | 703033 | used for applying eye lubricant |
| Top Sponges | Dukal Corporaton | Reorder # 5360 | Stopping bleeding from skin/muscle |
References
- Shen, H., Kreisel, D., Goldstein, D. R. Processes of sterile inflammation. Journal of Immunology. 191 (6), 2857-2863 (2013).
- Fiser, S. M., et al. Lung transplant reperfusion injury involves pulmonary macrophages and circulating leukocytes in a biphasic response. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 121 (6), 1069-1075 (2001).
- Lama, V. N., et al. Models of lung transplant research: A consensus statement from the National Heart, Lung, and Blood Institute workshop. JCI Insight. 2 (9), 93121 (2017).
- Miao, R., Liu, J., Wang, J. Overview of mouse pulmonary embolism models. Drug Discovery Today: Disease Models. 7 (3-4), 77-82 (2010).
- Mira, J. C., et al. Mouse injury model of polytrauma and shock. Methods in Molecular Biology. 1717, 1-15 (2018).
- Krupnick, A. S., et al. Orthotopic mouse lung transplantation as experimental methodology to study transplant and tumor biology. Nature Protocols. 4 (1), 86-93 (2009).
- Gielis, J. F., et al. A murine model of lung ischemia and reperfusion injury: Tricks of the trade. The Journal of Surgical Research. 194 (2), 659-666 (2015).
- Nelson, K., et al. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World Journal of Experimental Medicine. 4 (2), 7-15 (2014).
- Dodd-o, J. M., Hristopoulos, M. L., Faraday, N., Pearse, D. B. Effect of ischemia and reperfusion without airway occlusion on vascular barrier function in the in vivo mouse lung. Journal of Applied Physiology. 95 (5), 1971-1978 (2003).
- Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. Journal of Visualized Experiments. (93), e52261 (2014).
- Rayamajhi, M., et al. Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (51), e2702 (2011).
- Dodd-o, J. M., Hristopoulos, M. L., Welsh-Servinsky, L. E., Tankersley, C. G., Pearse, D. B. Strain-specific differences in sensitivity to ischemia-reperfusion lung injury in mice. Journal of Applied Physiology. 100 (5), 1590-1595 (2006).
- Prakash, A., et al. Lung ischemia reperfusion (IR) is a sterile inflammatory process influenced by commensal microbiota in mice. Shock. 44 (3), 272-279 (2015).
- Prakash, A., et al. Alveolar macrophages and toll-like receptor 4 mediate ventilated lung ischemia reperfusion injury in mice. Anesthesiology. 117 (4), 822-835 (2012).
- Dodd-o, J. M., et al. The role of natriuretic peptide receptor-A signaling in unilateral lung ischemia-reperfusion injury in the intact mouse. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 294 (4), 714-723 (2008).
- Prakash, A., Kianian, F., Tian, X., Maruyama, D. Ferroptosis mediates inflammation in lung ischemia-reperfusion (IR) sterile injury in mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201, (2020).
- Tian, X., et al. NLRP3 inflammasome mediates dormant neutrophil recruitment following sterile lung injury and protects against subsequent bacterial pneumonia in mice. Frontiers in Immunology. 8, 1337 (2017).
- Tian, X., Hellman, J., Prakash, A. Elevated gut microbiome-derived propionate levels are associated with reduced sterile lung inflammation and bacterial immunity in mice. Frontiers in Microbiology. 10, 159 (2019).
- Liu, Q., Tian, X., Maruyama, D., Arjomandi, M., Prakash, A. Lung immune tone via gut-lung axis: Gut-derived LPS and short-chain fatty acids' immunometabolic regulation of lung IL-1β, FFAR2, and FFAR3 expression. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 65-78 (2021).
- Dodd-o, J. M., et al. Interactive effects of mechanical ventilation and kidney health on lung function in an in vivo mouse model. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 296 (1), 3-11 (2009).
