Summary
En muskirurgisk modell för att skapa skada på vänster lungischemireperfusion (IR) samtidigt som ventilationen bibehålls och hypoxi undviks.
Abstract
Ischemireperfusionsskada (IR) beror ofta på processer som involverar en övergående period av avbrutet blodflöde. I lungan tillåter isolerad IR experimentell studie av denna specifika process med fortsatt alveolär ventilation, vilket undviker de sammansatta skadliga processerna av hypoxi och atelektas. I det kliniska sammanhanget orsakas lungischemireperfusionsskada (även känd som lung-IRI eller LIRI) av många processer, inklusive men inte begränsat till lungemboli, återupplivat hemorragiskt trauma och lungtransplantation. Det finns för närvarande begränsade effektiva behandlingsalternativ för LIRI. Här presenterar vi en reversibel kirurgisk modell av lung-IR som involverar första orotrakeal intubation följt av ensidig vänster lungischemi och reperfusion med bevarad alveolär ventilation eller gasutbyte. Möss genomgår en vänster torakotomi, genom vilken den vänstra lungartären exponeras, visualiseras, isoleras och komprimeras med hjälp av en reversibel slipknot. Det kirurgiska snittet stängs sedan under den ischemiska perioden, och djuret väcks och extuberas. När musen spontant andas etableras reperfusion genom att släppa slipknoten runt lungartären. Denna kliniskt relevanta överlevnadsmodell möjliggör utvärdering av lung-IR-skada, upplösningsfasen, nedströms effekter på lungfunktionen samt två-hit-modeller som involverar experimentell lunginflammation. Även om det är tekniskt utmanande kan denna modell behärskas under några veckor till månader med en eventuell överlevnads- eller framgångsgrad på 80% -90%.
Introduction
Ischemireperfusionsskada (IR) kan uppstå när blodflödet återställs till en organ- eller vävnadsbädd efter en viss tids avbrott. I lungan kan IR förekomma isolerat eller i samband med andra skadliga processer såsom infektion, hypoxi, atelektas, volutrauma (från höga tidvattenvolymer under mekanisk ventilation), barotrauma (hög topp eller ihållande tryck under mekanisk ventilation) eller trubbig (icke-penetrerande) lungkontusionsskada 1,2,3 . Det finns fortfarande flera luckor i vår kunskap om mekanismerna för LIRI och effekterna av samtidiga processer (t.ex. infektion) på LIRI-resultat, och även behandlingsalternativen för LIRI är begränsade. En in vivo-modell av ren LIRI krävs för att identifiera patofysiologin för lung-IR-skada isolerat och för att studera dess bidrag till alla multi-hit-processer där lungskada är en komponent.
Murin lung-IR-modeller kan användas för att studera den lungspecifika patofysiologin för flera processer, inklusive lungtransplantation3, lungemboli4 och lungskada efter hemorragiskt trauma med återupplivning5. För närvarande används modeller inkluderar kirurgisk lungtransplantation6, hilar clamping7, ex vivo lungperfusion8 och ventilerad lunga IR9. Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för en murin ventilerad lung-IR-modell av steril lungskada. Det finns flera fördelar med detta tillvägagångssätt (figur 2), inklusive att det inducerar minimal hypoxi och minimal atelektas, och det är en överlevnadskirurgimodell som möjliggör långtidsstudier.
Skäl att välja denna modell av LIRI framför andra modeller som hilar clamping och ex vivo perfusionsmodeller är följande: denna modell minimerar de inflammatoriska bidragen från atelektas, mekanisk ventilation och hypoxi; det bevarar cyklisk ventilation; det upprätthåller ett intakt in vivo cirkulationsimmunsystem som kan svara på IR-skadan; och slutligen, som ett överlevnadsförfarande, tillåter det en mer långsiktig analys av mekanismerna för sekundär skadegenerering (2-träffmodeller) och skadeupplösning. Sammantaget tror vi att denna ventilerade lung-IR-modell ger den "renaste" formen av IR-skada som kan studeras experimentellt.
Andra publikationer har beskrivit användningen av orotrakeal intubation av möss för att utföra IT-injektioner eller installationer10,11, men inte som utgångspunkt för en överlevnadsoperation som det är i denna modell. Placeringen av ett orotrakealt rör möjliggör utförandet av lungkirurgi genom att tillåta kollaps av den operativa lungan. Det möjliggör också återinflation av lungan i slutet av proceduren, vilket är avgörande för pneumotoraxen och för musens förmåga att återgå till spontan ventilation vid slutet av procedurerna. Slutligen är avlägsnandet av det säkrade orotrakealröret ett enkelt förfarande som, till skillnad från en invasiv trakeotomi, är kompatibelt med en överlevnadsoperation. Detta möjliggör långsiktiga forskningsstudier med fokus på att förstå progressionen och upplösningen av LIRI och associerade störningar, samt skapandet av kroniska skademodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer och steg som beskrivs nedan godkändes av den institutionella djurvårds- och användningskommittén (IACUC) vid University of California San Francisco. Vilken musstam som helst kan användas, även om vissa stammar har ett mer robust inflammatoriskt svar i lungan jämfört med andra12. Möss som är ungefär 12-15 veckors ålder (30-40 g) eller äldre tolererar och överlever lung-IR-operationen bättre än yngre möss. Både manliga och kvinnliga möss kan användas för dessa operationer.
1. Protokoll för intubation av mus
- Anestesi och förberedelse för intubation
- Torka av musens buk med en etanolpinne. Bedöva musen med en intraperitoneal injektion av tribrometanol (250-400 mg/kg). Bedöm lämpligt anestesidjup genom brist på pedalabstinensreflex. Placera ögonsmörjsalva nu eller senare (steg 2.1.4).
OBS: För denna procedur ger tribrometanol (och etomidat som ett alternativ) ett stabilt bedövningsplan utan att påverka de hemodynamiska förhållanden som krävs för denna operation. Detta bedövningsmedel används bara en gång för att undvika risken för peritoneala vidhäftningar. Isofluran kan också användas, men vi använder det inte här. Utövaren är fri att använda vilket bedövningsrecept de tycker passar. - Placera den bedövade musen på ett intubationsstativ eller plaststöd i ryggläge, upphängd av dess övre framtänder på loopade 4-0 suturer (siden eller annat) över två stödankare.
- För att hålla musen immobiliserad under intubationsproceduren, tejpa löst den nedre delen av bröstet (eller båda övre extremiteterna) till plattformen.
- Placera det fiberoptiska flexibla ljuset försiktigt på musens luftstrupe, något under stämbanden. Justera belysningsnivån så att endast ett mörkt fält är synligt när du tittar in i musens orofarynx förutom rött ljus som kommer under stämbanden, vilket visar målet för den slutliga placeringen av endotrakealröret. Observera att stämbandsrörelser ska vara synliga med blotta ögat eller, om det behövs, under förstoring.
- Torka av musens buk med en etanolpinne. Bedöva musen med en intraperitoneal injektion av tribrometanol (250-400 mg/kg). Bedöm lämpligt anestesidjup genom brist på pedalabstinensreflex. Placera ögonsmörjsalva nu eller senare (steg 2.1.4).
- Intubation förfarande
- Håll pincetten med den dominerande handen och använd dem för att försiktigt greppa och dra tungan ut ur munhålan.
- Öppna underkäken med pincett som hålls av den icke-dominerande handen och tryck sedan tången i struphuvudet för att försiktigt lyfta epiglottis. Vid denna tidpunkt släpper du tungan från pincetten.
- Leta efter stämbanden. De ska öppna och stänga enligt varje andetag. Håll kanylen med styrkabeln förinstallerad, sätt in trådens spets genom stämbanden.
- Var mycket försiktig så att du inte flyttar tråden genom att hålla en del av den som ligger utanför kanylen men strax ovanför stämbanden, dra tillbaka kanylen och lämna bara tråden på plats med sin distala ände i luftstrupen.
- Vid denna tidpunkt, utför en andra visualisering av stämbanden för att bekräfta att trådens distala spets förblir passerad genom de upplysta stämbanden och in i luftstrupen och inte finns i den obelysta matstrupen.
- Håll tråden utanför munnen med de böjda tångarna i vänster hand, stabiliserad mot en hård yta och avancera försiktigt 20G-katetern med tejpvingar över tråden.
- När den distala änden av tråden kommer ut från baksidan av 20G-katetern eller endotrakealröret, håll den änden med de böjda tångarna och för smidigt 20G-katetern in i luftstrupen.
- Ta försiktigt bort tråden från den distala änden av 20G-katetern med de böjda tångarna utan att lossa kateterns placering.
- Anslut katetern kort till ventilatorn innan du säkrar den för att bekräfta korrekt placering i luftstrupen och inte matstrupen. Bekräfta trakealplacering genom observation av mekaniska ventilationsberoende bilaterala bröstväggsrörelser och frånvaron av inflation i magen.
- Efter intubation
- Koppla bort katetern från ventilatorn. Fäst tejpvingarna (fästa vid katetern) genom musens underläpp med en 4-0 vicryl sutur för att ordentligt fästa endotrakealröret (ETT) på musen under alla efterföljande procedurer / manipulationer.
OBS: Alternativt kan silkestejp eller annan tejp användas för att säkra ETT, men försiktighet bör vidtas för att undvika att ETT lossnar under djurets rörelse från intubationssläden till den kirurgiska ytan. - Ta försiktigt bort musen från intubationssläden. Anslut katetern kort till ventilatorsatsen vid en tidvattenvolym 0,2-0,225 ml och en andningsfrekvens på 120-150 andetag per minut för att bekräfta korrekt trakealplacering av orotrakealröret och koppla sedan bort med musen som andas spontant genom orotrakealröret.
- Lämna inte djuret obevakat från och med denna tidpunkt tills det har återfått tillräckligt medvetande för att upprätthålla sternal recumbency i slutet av proceduren.
- Koppla bort katetern från ventilatorn. Fäst tejpvingarna (fästa vid katetern) genom musens underläpp med en 4-0 vicryl sutur för att ordentligt fästa endotrakealröret (ETT) på musen under alla efterföljande procedurer / manipulationer.
2. Lungischemi och reperfusion (IR) kirurgi protokoll
- Analgesi och beredning av operationsplatsen
- Torka av musens buk med en etanolpinne och injicera buprenorfin (0,05-0,1 mg/kg) intraperitonealt.
- Raka håret över vänster bröstkorg upp till vänster skulderblad. Ta bort överflödigt rakat hår med alkoholpinnar.
OBS: Steg 2.1.1 och 2.1.2 kan också utföras före intubation om det finns risk för att ETT lossnar när det är säkrat med silkestejp. - Placera musen på en värmedyna i vänster sidoläge eller 3/4 vriden position och anslut trakealröret på ventilatorn med en tidvattenvolym på 0,2-0,225 ml (~ 8 mg / kg) och en andningsfrekvens på 120-150 andetag per min. Använd inte extra syre för denna procedur.
- Applicera ögonsmörjmedel med en steril bomullspinne. Vrid musen till 3/4 vänster sida uppåt och immobilisera alla fyra lemmarna och svansen med laboratorietejp.
- Desinficera det rakade hudområdet och omgivande päls med povidon-jod och vänta tills lösningen torkar. Täck sedan det kirurgiska fältet med en steril drapering eller klar plastfilm och skapa en rektangulär öppning i draperiet eller plastfilmen för det kirurgiska fältet.
- Kirurgiskt ingrepp
- Bekräfta lämplig anestesinivå (tillhandahålls genom administrering av tribrometanol och buprenorfin som beskrivits tidigare) genom att testa svaret på tåknippet.
- Använd en sax och ett par större tångar (smala mönstertångar eller liknande) och gör ett 2 cm tvärgående hudsnitt under den underlägsna vinkeln på skulderbladet i vänster lateral bröstkorg. Använd saxen och ett finare par tångar (extra fina graefe tångar eller liknande) för att skära i muskelskiktet och dissekera ner till revbenen.
- Identifiera det andra interkostala utrymmet och håll den andra ribben med de extra fina tångarna. Dra revbenet uppåt, använd ett sterilt #11 eller #12 (krökt) skalpellblad (inget handtag behövs) för att komma in i pleuralutrymmet genom att separera och skära över 2:a-3:e rymdens interkostala muskler. Överväg att pausa ventilationen för att minska skador på vänster lungtopp.
- Sätt i tre steriliserade retraktorer. Använd den minsta/smalaste retraktorn cephalad längs revbenens orientering, den medelstora upprullningsdonet till vänster längs den 2:a ribban och den största upprullningsdonet till höger längs ytan på den 3:e ribban.
- Öppna bröstet med långsam och progressiv indragning med hjälp av de elastiska retraktorsnören. Exponera och identifiera den vänstra lungartären (PA) genom att flytta den vänstra lungtoppen bort med en steril bomullspinne.
- Använd mikrotången, ultrafina pincett i höger hand och PA eller kärlutvidgning i vänster hand, för att försiktigt exponera och skapa fältet där vänster PA och bronchus båda är synliga.
- Använd PA-tången, plocka upp vänster PA och dra försiktigt men bestämt uppåt och cephalad för att visualisera den transparenta bronchusen nedan. Öka förstoringen på dissektionsmikroskopet (se utrustningslistan för mer information) vid denna punkt till maximalt (2x).
OBS: Sterilisera all utrustning före användning. För att upprätthålla sterilitet bör dessutom endast spetsarna på kirurgiska instrument komma in i det sterila kirurgiska fältet. - Medan du drar tillbaka PA bort från bronkusen, passera försiktigt de stängda ultrafina tångarna genom utrymmet mellan vänster PA och bronchus. Använd sedan dessa tångar för att hålla och dra en 7-0 eller 8-0 prolene sutur genom utrymmet mellan vänster lungartär (ovan) och bronchus (nedan).
- Omringa den vänstra PA genom att binda en slipknot för att skapa en ocklusion i PA. Blodflödesavbrott visualiseras lätt under mikroskopet. Detta markerar initieringen av den ischemiska perioden.
- Externalisera den fria änden av knuten genom en annan ingångspunkt i den främre vänstra bröstkorgen med en 24G-28G nål och säkra slutet av suturen med en liten tejpbit för enklare identifiering senare.
- Blås upp lungan igen för att driva ut så mycket luft ur bröstkaviteten som möjligt med hjälp av en PEEP-ventil / slang på gnagarventilatorn. Stäng sedan bröstkorgen med två avbrutna 4-0 nylonsuturer.
- Stäng muskeln och det subkutana skiktet med en löpande 4-0 nylonsutur. Applicera sedan två eller tre droppar aktuellt bupivakain (0,5%) på snittet. Använd en 4-0 nylon sutur för att stänga hudskiktet med en löpande sutur.
- Postoperativ vård
- När spontan ventilation har återupptagits, koppla bort endotrakealröret från ventilatorn och extubera musen.
- Placera musen på värmedynan för att bibehålla kroppstemperaturen under tidig återhämtning efter anestesi.
- Övervaka musen noggrant medan du återhämtar dig från generell anestesi. Dra den externaliserade slipknot försiktigt i slutet av den ischemiska perioden (30 min eller 1 h).
- Flytta musen från värmedynan till en bur när den har uppvisat tecken på återhämtning: självrätande och/eller rörelse.
- Efter reperfusionsperioden (1 h eller 3 h), avliva djuret och samla blod genom hjärtpunktion och lungvävnad för vidare analys. För 1 h reperfusion, samla plasma för ELISA, vävnad för RNA och proteinanalys; För 3 h reperfusion, samla dessutom vävnad för histologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Inflammation genererad av ensidig ventilerad steril lungischemireperfusion (IR) -skada: Efter 1 h ischemi observerade vi ökade nivåer av cytokiner i serumet och i lungvävnaden av både ELISA och qRT-PCR som nådde en topp på 1 h efter reperfusion och snabbt återvände till baslinjen inom 12-24 timmar efter reperfusion13. För prover som samlades in vid 3 timmar efter reperfusion observerade vi intensiv neutrofil infiltration i den vänstra lungvävnaden och noterade att inflammationens intensitet var beroende av den använda musstammen (figur 1). I synnerhet försvinner inflammationen som genereras i frånvaro av en samexisterande eller efterföljande infektiös process gradvis och lungorna återgår till sin normala lungarkitektur (genom histopatologi) med efferocytos eller utgång av neutrofiler från de skadade lungorna inom 12-24 timmar efter reperfusion13. Observera att vi observerade mild men detekterbar inflammation, som till stor del var neutrofil och observerades också i den icke-operativa högra lungan, vilket vi antar beror på hyperperfusionsskada14.
Vävnadsprovsamling för denna lung-IR-modell skiljer sig inte från den för andra lung-IR-modeller: blod kan samlas in för plasmaberedning via hjärtpunktion eller IVC-cannulation; lungvävnad kan skördas för protein- eller RNA-beredning och sedan för vidare analys av western blot, ELISA eller qPCR.
Figur 1: Histologi av lungsektioner hos möss av vild typ av två olika stammar. (A) C3H och (B) C57BL/6 möss. Båda stammarna av möss fick 1 h ischemi och 3 h reperfusion, och vävnaden visas vid 10x förstoring. 40x förstoringen visas i insatsen. Neutrofil infiltration observerades i båda stammarna, där C3H-stammen visade markant högre inflammationsnivåer jämfört med C57BL/6 som rapporterats tidigare12. Skalstrecket är 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Jämförelse av fördelar (blå text) och nackdelar (röd text) med de tre vanligaste musexperimentella lung-IR-skademodellerna (LIRI). Denna jämförelse belyser valet av ventilerad lung-IR (beskrivs i detta manuskript) som den ideala modellen för att studera ren lung-IR. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta manuskript beskriver stegen för att utföra den ventilerade lung-IR-modellen som utvecklats av Dodd-o et al.9. Denna modell har hjälpt till att identifiera molekylära vägar som är involverade i generering och upplösning av inflammation från lung-IR isolerat 14,15,16,17, lung-IR i kombination med samtidig infektion 18 och lung-IR i förhållande till tarm-lungaxeln och bidraget från tarmmikrobiomet13,18,19 . Även om det är tekniskt mer utmanande, möjliggör den nuvarande modellen utvärdering av lung-IR utan de sammansatta effekterna av avbruten cyklisk lunginflation och hypoxi. Det minimerar också perioden med mekanisk ventilationsexponering, till skillnad från ex vivo-perfusionsmodellen, som i sig kan leda till lungskada20.
Metodens begränsningar: Medan musens luftstrupe är tillräckligt avsmalnande för att positivt utgångstryck (PEEP) möjliggör expansion av lungorna och ger en tät passform för ETT, kanske lungmekanik och flödesvolymslingmätningar inte är möjliga med denna version av reversibel orotrakeal intubation. Dessa lungfysiologiska mätningar kan kräva en trakeotomi, som till skillnad från denna metod är oförenlig med en överlevnadslungkirurgi. Reversibel orotrakeal intubation tolereras väl av möss, och även i frånvaro av paralytika finns det mycket lite musventilator-asynkroni förutsatt att minutventilationen (MV = tidvattenvolym x andningsfrekvens) är tillräckligt hög för att förhindra den naturliga CO2-drivna enheten genom att andan tar över (dvs strax över apnétröskeln).
Det finns flera överväganden relaterade till ischemi-reperfusion (IR) delen av denna procedur. För det första bör IR-proceduren utföras med så lite fysiskt trauma mot lungan som möjligt. Vi rekommenderar att du pausar den mekaniska ventilationen och låter musen andas spontant när du går in i brösthålan. Undertrycksventilationen, tillsammans med kirurgens grepp om det andra eller tredje revbenet och drar det bort från lungan medan du försiktigt går in i bröstet med ett skalpellblad #11, minskar risken för att skada lungan med skalpellen. Alternativt har vi funnit att användning av ett #12 krökt skalpellblad, placerat så att kurvan vetter uppåt, möjliggör mer noggrant inträde i brösthålan, vilket potentiellt minskar skadan på den underliggande vänstra lungtoppen. Dessutom är anslutningen mellan vänster PA och bronchus mindre säker närmare hilum, vilket gör passagen av de ultrafina pincettarna mellan dessa två strukturer enklare här.
Nästa kritiska steg är att isolera vänster PA från bronchus nedan för att omsluta PA med en suturbindning. Det är viktigt att detta steg utförs noggrant för att undvika trauma mot lungtoppen. Vi rekommenderar att du går in i bröstburet så cephalad som möjligt för att minimera mängden vänster lunga som behöver förskjutas eller dras tillbaka för att komma åt PA och bronkus. Varje del av lungan som drabbas av trubbigt trauma måste uteslutas från utvärdering för isolerad IR-skada. Ofta skärs toppen av den vänstra lungan bort när lungorna samlas för slutlig analys av steril lung-IR-skada. Skada på lungens topp kan visualiseras under operationen på grund av närvaron av puncta av blödning eller blodig missfärgning.
Mellan PA och bronkus nedan finns ett bindvävsskikt som måste brytas för att omsluta artären med suturbandet. Att lära sig hur mycket spänning som är tillåten när man tar tag i och drar vänster PA uppåt (dvs. mot bröstkorgen och bort från bronkusen), med hjälp av det icke-tandade, icke-skadliga kärlet som tar tag i platta fina tångar i vänster hand, är ett viktigt första steg att behärska. Den vänstra PA tål en överraskande mängd spänning och sträcker sig när den dras uppåt. Vi tycker att det är till hjälp att öka förstoringen av synfältet till maximalt och justera fokus så att det potentiella utrymmet (en vit linje av bindväv som fäster PA till bronkus) kan visualiseras tydligt och skarpt tillsammans med de ultrafina pincettarna (hålls i höger hand). För att fältet ska förbli i fokus är det viktigt att stabilisera vänster hand på operationsytan medan du drar vänster PA upp och bort från bronkusen. De ultrafina tångarna kan sedan passeras i utrymmet mellan de två strukturerna. De stängda spetsarna ska passera lätt utan något verkligt motstånd, och när de väl ses på andra sidan vänster PA kan spetsarna öppnas försiktigt för att ytterligare skapa utrymme för suturmaterialets passage. Det är viktigt att detta utförs med helt oskadade ultrafina pincett, som snabbt kan bestämmas genom att dra en steril alkoholpinne genom de stängda spetsarna för att observera om spetsarna rivs på materialet. Skadetips kan också identifieras genom att öppna och stänga pincetten under maximal förstoring av det kirurgiska mikroskopet.
Det är lätt att upptäcka skador som uppstår på antingen vänster PA eller vänster huvudbronkus när man försöker separera dem. Skador på vänster PA resulterar i översvämning av synfältet med blod och kan resultera i en icke-bärgningsbar operation om skadan skapar ett hål i själva PA. I synnerhet finns det ytmikroskopiska blodkärl på PA som kan skadas under den ultrafina pincettrörelsen och kan potentiellt hanteras genom att placera en torr steril bomullspinne över fältet för att absorbera blodet som visas. Om blödningen slutar kan proceduren återupptas. Skador på vänster huvudbronkus är alltid en icke-bärgningsbar situation eftersom det inte finns något enkelt eller snabbt sätt att reparera luftvägsskador.
Steget att separera PA från den underliggande bronkusen kan initialt övas på en död mus utan tidspress eller distraktion av hjärtaktivitet och den rörelse den orsakar. Dessutom gör blodstasen i vänster PA att den lättare kan visualiseras (tjockt och fylligt kärl), och ändå kunna plockas upp av de icke-skadade platta PA-tångarna. Förmågan att upptäcka skador i vänster bronkus är fortfarande möjlig, eftersom ventilationen av vänster lunga kan användas för att bedöma förekomsten av en intakt ledande luftväg till vänster lunga. Denna övningssituation kan också användas för att göra skapandet av slipknoten perfekt.
Det finns en begränsad varaktighet av ocklusion, utöver vilken spontan reperfusion efter avlägsnande av slipknoten inte garanteras. I pilotstudier sker detta någonstans mellan 6 och 10 timmar. Utöver detta sker reperfusion mindre omedelbart efter avlägsnande av slipknoten. När den ischemiska perioden sträcker sig kräver reperfusion manipulation av PA efter borttagning av slipknot för att återupprätta blodflödet.
Följande observationer har erhållits från fem medförfattare till detta papper som representerar deras kollektiva erfarenhet av att lära sig, fullända, felsöka och förbättra denna procedur under den period då de genomförde denna muskirurgiska modell och har sammanfattats i punkterna nedan:
I genomsnitt tog det 1-3 månader att behärska detta kirurgiska ingrepp. En procedurist uppskattade att det krävs cirka 50 operationer för att bli facil med de olika ingreppen.
Framgångsgraden i början av proceduren var 20% -40%. Efter att ha utfört proceduren regelbundet och med förtrogenhet ökade framgångsgraden till 80% -90%.
Den svåraste delen av operationen var enhälligt passagen av de ultrafina pincettarna mellan vänster PA och vänster bronchus, och sedan den efterföljande fångsten av suturmonofilamentet med pincetten och dess passage mellan de två strukturerna.
Misstag under passagen av monofilamentet mellan PA och vänster huvudstambronkus kan leda till en obrukbar operation med katastrofal blödning av vänster PA eller irreversibel skada på vänster huvudbronk.
Det maximala antalet operationer som var möjliga på 1 enda dag uppskattades till 10 (vid cirka 35-45 min / operation), medan det ideala antalet för proceduralist komfort och kirurgisk framgång var fem eller sex.
Andra diverse tips och förslag inkluderar:
Undvik överskott av koffein innan du börjar operationsdagen för att upprätthålla en stadig handposition.
Öka förstoringen på mikroskopet till maximalt under den del av proceduren när suturen passerar mellan vänster PA och vänster huvudbronkus.
Använd mjuka och gradvisa/inkrementella rörelser när du avancerar Dumont-tången för att skapa utrymme mellan vänster PA och vänster huvudbronkus.
Stabilisera händerna på den kirurgiska ytan när du utför alla kritiska steg.
Se till att andningsfrekvensen på ventilatorn är tillräckligt hög för att undvika spontana andetag, särskilt under de viktigaste / kritiska delarna av proceduren (sutur som passerar mellan vänster PA och vänster huvudbronkus).
En lugn och ostörd miljö för att utföra operationerna är viktigt för att hålla fokus och ouppmärksam.
I figur 2 jämförs denna modell med alternativa modeller av lung-IR-skada. Denna modell av ventilerad lungischemireperfusion erbjuder fördelarna med att minimera atelektas, hypoxi och mekanisk ventilation. Viktigt är att den som en överlevnadskirurgi är kompatibel med andra skademodeller (t.ex. experimentella lunginflammationsmodeller) och analys av upplösningen av skada.
Sammanfattningsvis har vi beskrivit en överlevnadskirurgi som involverar skapandet av lungischemireperfusionsskada som vi tror kan ge värdefull inblick i de mekanismer och cellulära vägar som är involverade i ren IR-skada i lungan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av avdelningsstöd från Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California San Francisco och San Francisco General Hospital, samt av en NIH R01-utmärkelse (till AP): 1R01HL146753.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Fiber Optic Light Pipe | Cole-Parmer | UX-41720-65 | Fiberoptic light pipe |
| Fiber Optic Light Source | AmScope | SKU: CL-HL250-B | Light source for fiberoptic lights |
| Germinator 500 | Cell Point Scientific, Inc. | No.5-1450 | Bead Sterilizer |
| Heating Pad | AIMS | 14-370-223 | Alternative option |
| Lithium.Ion Grooming Kits(hair clipper) | WAHL home products | SKU 09854-600B | To remove mouse hair on surgical site |
| Microscope | Nikon | SMZ-10 | Other newer options available at the company website |
| MiniVent Ventilator | Havard Apparatus | Model 845 | Mouse ventilator |
| Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | UX-08895-05 | Clean tools that been used in operation |
| Warming Pad | Kent Scientific | RT-0501 | To keep mouse warm while recovering from surgery |
| Weighing Scale | Cole-Parmer | UX-11003-41 | Weighing scale |
| Surgery Tools | |||
| 4-0 Silk Suture | Ethicon | 683G | For closing muscle layer |
| 7-0 Prolene Suture | Ethicon Industry | EP8734H | Using for making a slip knot of left pulmonary artery |
| Bard-Parker (11) Scalpel (Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade, sterile, single use) | Aspen Surgical | 372611 | For entering thoracic cavity (option 1) |
| Bard-Parker (12) Scalpel | Aspen Surgical | 372612 | For entering thoracic cavity (option 2) |
| Extra Fine Graefe Forceps | FST | 11150-10 | Muscle/rib holding forceps |
| Magnetic Fixator Retraction System | FST | 1. Base Plate (Nos. 18200-03) 2. Fixators (Nos. 18200-01) 3. Retractors (Nos. 18200-05 through 18200-12) 4. Elastomer (Nos.18200-07) 5. Retractor(No.18200-08) |
Small Animal Retraction System |
| Monoject Standard Hypodermic Needle | COVIDIEN | 05-561-20 | For medication delivery IP |
| Narrow Pattern Forceps | FST | 11002-12 | Skin level forceps |
| Needle holder/Needle driver | FST | 12565-14 | for holding needles |
| Needles | BD | 305110 | 26 gauge needle for externalizing slipknot (24 or 26 gauge needle okay too) |
| PA/Vessel Dilating forceps | FST | 00125-11 | To hold PA; non-damaging gripper |
| Scissors | FST | 14060-09 | Used for incision and cutting into the muscular layer durging surgery |
| Ultra Fine Dumont micro forceps | FST | 11295-10 (Dumont #5 forceps, Biology tip, tip dimension:0.05*0.02mm,11cm) | For passing through the space between the left pulmonary artery and bronchus |
| Reagents | |||
| 0.25% Bupivacaine | Hospira, Inc. | 0409-1159-02 | Topical analgesic used during surgical wound closure |
| Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) | Sigma-Aldrich | T48402-25G | Anesthetic, using for anesthetize the mouse for IR surgery, the concentration used in IR surgery is 250-400 mg/kg. |
| Buprenorphine | Covetrus North America | 59122 | Analgesic: concentration used for surgery is 0.05-0.1 mg/kg |
| Eye Lubricant | BAUSCH+LOMB | Soothe Lubricant Eye Ointment | Relieves dryness of the eye |
| Povidone-Iodine 10% Solution | MEDLINE INDUSTRIES INC | SKU MDS093944H (2 FL OZ, topical antiseptic) | Topical liquid applied for an effective first aid antiseptic at beginning of surgery |
| Materials | |||
| Alcohol Swab | BD brand | BD 326895 | for sterilzing area of injection and surgery |
| Plastic film | KIRKLAND | Stretch-Tite premium | Alternative for covering the sterilized surgical field (more cost effective) |
| Rodent Surgical Drapes | Stoelting | 50981 | Sterile field or drape for surgical field |
| Sterile Cotton Tipped Application | Pwi-Wnaps | 703033 | used for applying eye lubricant |
| Top Sponges | Dukal Corporaton | Reorder # 5360 | Stopping bleeding from skin/muscle |
References
- Shen, H., Kreisel, D., Goldstein, D. R. Processes of sterile inflammation. Journal of Immunology. 191 (6), 2857-2863 (2013).
- Fiser, S. M., et al. Lung transplant reperfusion injury involves pulmonary macrophages and circulating leukocytes in a biphasic response. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 121 (6), 1069-1075 (2001).
- Lama, V. N., et al. Models of lung transplant research: A consensus statement from the National Heart, Lung, and Blood Institute workshop. JCI Insight. 2 (9), 93121 (2017).
- Miao, R., Liu, J., Wang, J. Overview of mouse pulmonary embolism models. Drug Discovery Today: Disease Models. 7 (3-4), 77-82 (2010).
- Mira, J. C., et al. Mouse injury model of polytrauma and shock. Methods in Molecular Biology. 1717, 1-15 (2018).
- Krupnick, A. S., et al. Orthotopic mouse lung transplantation as experimental methodology to study transplant and tumor biology. Nature Protocols. 4 (1), 86-93 (2009).
- Gielis, J. F., et al. A murine model of lung ischemia and reperfusion injury: Tricks of the trade. The Journal of Surgical Research. 194 (2), 659-666 (2015).
- Nelson, K., et al. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World Journal of Experimental Medicine. 4 (2), 7-15 (2014).
- Dodd-o, J. M., Hristopoulos, M. L., Faraday, N., Pearse, D. B. Effect of ischemia and reperfusion without airway occlusion on vascular barrier function in the in vivo mouse lung. Journal of Applied Physiology. 95 (5), 1971-1978 (2003).
- Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. Journal of Visualized Experiments. (93), e52261 (2014).
- Rayamajhi, M., et al. Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (51), e2702 (2011).
- Dodd-o, J. M., Hristopoulos, M. L., Welsh-Servinsky, L. E., Tankersley, C. G., Pearse, D. B. Strain-specific differences in sensitivity to ischemia-reperfusion lung injury in mice. Journal of Applied Physiology. 100 (5), 1590-1595 (2006).
- Prakash, A., et al. Lung ischemia reperfusion (IR) is a sterile inflammatory process influenced by commensal microbiota in mice. Shock. 44 (3), 272-279 (2015).
- Prakash, A., et al. Alveolar macrophages and toll-like receptor 4 mediate ventilated lung ischemia reperfusion injury in mice. Anesthesiology. 117 (4), 822-835 (2012).
- Dodd-o, J. M., et al. The role of natriuretic peptide receptor-A signaling in unilateral lung ischemia-reperfusion injury in the intact mouse. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 294 (4), 714-723 (2008).
- Prakash, A., Kianian, F., Tian, X., Maruyama, D. Ferroptosis mediates inflammation in lung ischemia-reperfusion (IR) sterile injury in mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201, (2020).
- Tian, X., et al. NLRP3 inflammasome mediates dormant neutrophil recruitment following sterile lung injury and protects against subsequent bacterial pneumonia in mice. Frontiers in Immunology. 8, 1337 (2017).
- Tian, X., Hellman, J., Prakash, A. Elevated gut microbiome-derived propionate levels are associated with reduced sterile lung inflammation and bacterial immunity in mice. Frontiers in Microbiology. 10, 159 (2019).
- Liu, Q., Tian, X., Maruyama, D., Arjomandi, M., Prakash, A. Lung immune tone via gut-lung axis: Gut-derived LPS and short-chain fatty acids' immunometabolic regulation of lung IL-1β, FFAR2, and FFAR3 expression. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 65-78 (2021).
- Dodd-o, J. M., et al. Interactive effects of mechanical ventilation and kidney health on lung function in an in vivo mouse model. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 296 (1), 3-11 (2009).
