Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

CRISPR/Cas9-medierad högeffektiv geninriktning i embryonala stamceller för utveckling av genmanipulerade musmodeller

Published: August 24, 2022 doi: 10.3791/64385
* These authors contributed equally

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att utveckla genmodifierade musmodeller med embryonala stamceller, speciellt för stora DNA-knock-in (KI). Detta protokoll är inställt med hjälp av CRISPR/Cas9-genomredigering, vilket resulterar i signifikant förbättrad KI-effektivitet jämfört med den konventionella homologa rekombinationsmedierade linjäriserade DNA-inriktningsmetoden.

Abstract

CRISPR/Cas9-systemet har gjort det möjligt att utveckla genetiskt modifierade möss genom direkt genomredigering med hjälp av befruktade zygoter. Men även om effektiviteten i att utveckla gen-knockout-möss genom att inducera liten indelmutation skulle vara tillräcklig, är effektiviteten av embryogenomredigering för att göra stor DNA-knock-in (KI) fortfarande låg. Därför, till skillnad från den direkta KI-metoden i embryon, har geninriktning med embryonala stamceller (ESC) följt av embryoinjektion för att utveckla chimärmöss fortfarande flera fördelar (t.ex. hög genomströmning riktad in vitro, multi-allelmanipulation och Cre - och flox-genmanipulation kan utföras på kort tid). Dessutom kan stammar med svårhanterliga embryon in vitro, såsom BALB/c, också användas för ESC-inriktning. Detta protokoll beskriver den optimerade metoden för storskaligt DNA (flera kb) KI i ESC genom att tillämpa CRISPR/Cas9-medierad genomredigering följt av chimärmössproduktion för att utveckla genmanipulerade musmodeller.

Introduction

Genom att producera genetiskt modifierade möss och analysera deras fenotyp kan vi förstå specifika genfunktioner i detalj, in vivo. Många viktiga fynd har upptäckts med hjälp av genmodifierade djurmodeller inom life science-området. Sedan rapporten om genomredigeringsteknik med CRISPR/Cas91 har forskning med genetiskt modifierade möss dessutom snabbt spridit sig till många laboratorier 2,3. Genomredigering av muszygoter med CRISPR/Cas9 har uppnått acceptabel effektivitet för att utveckla kort DNA-modifiering, såsom indelmutationsorienterad gen knockout4, enkel nukleotidersättning eller kort peptidtagginsättning med enkelsträngade oligonukleotider (ssODN) som knock-in (KI) givare5. Å andra sidan förblir KI för stora DNA-fragment i zygoter genom genomredigering låg effektivitet jämfört med den kortstora DNA-modifieringen 6,7. Dessutom är det svårt att använda musstammar som BALB/c, som är en viktig stam för specifika forskningsområden som immunologi, för zygotbaserad genomredigering eftersom deras preimplantatoriska embryon är mottagliga för in vitro-manipulation.

Ett annat sätt att utveckla genetiskt modifierade musmodeller är att använda den embryonala stamcellsinriktningstekniken (ESC) följt av ESC-injektion i preimplantatoriskt embryo för att producera chimärer 8,9,10, som fortfarande rutinmässigt används som en konventionell metod. Även om förvärvsgraden för att erhålla exakta KI-ESC-kloner inte är särskilt hög i konventionella ESC-inriktningsmetoder, erbjuder ESC-inriktning vissa fördelar jämfört med zygotgenomredigering, särskilt för lång DNA KI. Till exempel är KI-effektiviteten hos långa DNA-fragment (> flera kb) i zygotgenomet mindre tydlig6,7, och många zygoter behövs för att utveckla ens en linje av KI-mus, vilket är oönskat i det nuvarande perspektivet av djurförsök. Till skillnad från zygotgenomredigering behöver lång DNA-inriktning på ESC följt av chimärproduktion betydligt färre embryon än zygotgenomredigering. Även om de preimplantatoriska embryona från BALB/c är mottagliga för in vitro-manipulation, kan deras ESC bibehållas och hanteras in vitro 11 som andra kompetenta 129- eller F1-bakgrunds-ESC, därför tillämpliga för chimärproduktioner. Men även om en målvektor innehåller 5' och 3' homologa armar och läkemedelsresistensgenkassetter för positivt eller negativt urval, är den konventionella KI-effektiviteten hos ESC i allmänhet otillräcklig på grund av den höga frekvensen av slumpmässig genomisk integration 8,10, Således krävs en förbättrad metod med exakt ESC-inriktningseffektivitet. Nyligen rapporterade vi en trimmad ESC KI-metod med CRISPR/Cas9-baserad genomredigering för att uppnå högre KI-effektivitet än konventionella inriktningsmetoder11. Metoden vi beskriver här är baserad på denna procedur som möjliggör långt DNA (> flera till 10 kb) KI till ESC med acceptabel effektivitet för rutinmässiga arbeten utan läkemedelsval; Således skulle vektorkonstruktionsförfarandet vara mycket enklare och behöva en kortare period, annars skulle cellodlingsperioden också bli betydligt kortare.

Protocol

Alla musexperiment godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid University of Tokyo (godkännandenummer PA17-63) och Osaka University (godkännandenummer Biken-AP-H30-01) och utfördes enligt deras riktlinjer samt ARRIVE-riktlinjerna (https://arriveguidelines.org).

1. Inriktning på vektorkonstruktion

  1. Förstärk en KI-kassett (CreERT här, mall-DNA för PCR kommer ursprungligen från ett kommersiellt gensyntesföretag) och ett ungefärligt 1 kb-fragment av 5'- eller 3'-homologiarmar med PCR. För DNA-kloning (steg 1.3), lägg till 15-mer överlappningssekvenser i slutet av 5 '-änden av varje PCR -primer. Rena PCR-DNA-fragmenten genom agarosgelelektrofores, följt av extraktion av DNA-fragmentet med hjälp av ett DNA-reningssats.
  2. Linjärisera ryggradsplasmiden (t.ex. pUC19 eller pBS) med hjälp av ett lämpligt restriktionsenzym som unikt smälter någonstans på multikloningsstället för kloning. Rena sedan den smälta plasmiden med hjälp av ett DNA-reningssats.
  3. Klona varje PCR-fragment (t.ex. 5'-homologiarm, 3'-homologiarm) och KI-sekvens samtidigt i den smälta plasmiden med hjälp av ett DNA-kloningssats enligt tillverkarens instruktioner.
  4. Transformera de kompetenta cellerna med hjälp av den konstruerade plasmiden (steg 1.3) genom upphettning vid 42 °C i 1 min i ett vattenbad och frö dem sedan på en LB-platta som innehåller lämplig koncentration av antibiotika såsom ampicillin eller kanamycin. Odla dem över natten för resistenta klonval.
  5. Plocka upp flera (fyra till åtta) enskilda kolonier med 200 μL pipettspetsar och överför spetsarna till 3 ml flytande LB som innehåller lämpliga antibiotika (100 μg / ml ampicillin eller 20 μL / ml kanamycin) och odla över natten vid 37 ° C med skakning.
  6. Rena plasmiden följande dag med hjälp av ett endotoxinfritt kommersiellt plasmidreningssats enligt tillverkarens instruktioner. Bekräfta den klonade sekvensen i plasmiden genom Sanger-sekvensering. Justera plasmidkoncentrationen vid 1 μg DNA/μl med nukleasfritt vatten. Använd plasmiden som genmålande vektor.

2. Beredning av musens embryonala fibroblast (MEF) som matarceller för ESC

  1. Offra 8-10 veckor gamla gravida ICR-honmöss (14,5 dagar postcoitum) genom cervikal dislokation. Torka av buken väl genom att använda 70% (v / v) etanol för sterilisering, skär buken med orbital sax och pincett och återställ den fosterhaltiga livmodern.
  2. Placera livmodern i en 100 mm skål som innehåller 10 ml fosfat bovint serum (PBS) som innehåller 100 U / ml penicillin och 100 μg / ml streptomycin. Ta bort placentas och extraembryoniska vävnader från fostren med orbital sax och pincett. Hacka fostren med orbitalsax och överför PBS-lösningen som innehåller de malet fostercellerna till ett 50 ml koniskt rör.
  3. Centrifugera vid 280 x g i 5 minuter vid 4 °C och kassera supernatanten genom aspiration. Tillsätt 10 ml 0,25% (w/v) trypsin-EDTA-lösning, blanda väl genom pipettering och inkubera sedan i 10 min vid 37 °C med ett vattenbad för trypsinsmältning.
  4. Tillsätt 20 ml MEF-medium (DMEM innehållande 10% (v/v) fetalt bovint serum, 100 U/ml penicillin och 100 μg/ml streptomycin) för att stoppa den enzymatiska reaktionen, blanda väl genom mild inversion och centrifugera vid 280 x g i 5 min vid 4 °C. Kassera supernatanten genom aspiration, tillsätt 10 ml MEF-medium och blanda väl genom pipettering.
  5. Frö cellsuspensionen i flera nya 100 mm skålar (förbered samma antal rätter som antalet foster med 10 ml MEF-medium för en 100 mm skål). Byt medium 4 till 5 h efter sådd för att ta bort obundna celler och låt den bifogade MEF växa. Passera cellerna när de når ~ 80% sammanflöde med trypsin.
  6. Placera odlingsrätterna som innehåller den prolifererande MEF i MEF-medium, cirka 12-15 dagar efter sådd, i en röntgenbestrålningsanordning. Exponera MEF med en 50 Gy röntgen (totalt) för att stoppa cellcykeln enligt tillverkarens instruktioner.
  7. Trypsinisera den bestrålade MEF genom att tillsätta 2 ml 0,25% trypsin-EDTA för en 100 mm skål i 5 min vid 37 ° C, tillsätt sedan 4 ml MEF-medium för att stoppa trypsinsmältningen och samla cellsuspensionen i ett nytt 50 ml rör.
  8. Tvätta MEF med ett nytt MEF-medium genom centrifugering vid 280 x g i 5 min vid 4 °C, räkna antalet celler med hjälp av en cellräknare med trypanblå färgning och frys dem vid 1,6 x 106 celler/rör i ett cellfrysande medium. Förvara tills det används; celler kan lagras stabilt i flytande kväve i flera år.

3. Beredning av Cas9-RNP-DNA-blandning

  1. Lös upp trakrRNA och crisprRNA i utspädningsbuffert (varje RNA-koncentration vid 200 μM) genom pipettering. Blanda trakrRNA-lösningen, crisprRNA-lösningen och utspädningsbufferten (volymförhållandet 2:2:5) genom att försiktigt knacka och glödga varje RNA med hjälp av en termisk cykler vid 95 °C i 10 minuter följt av 1 °C/min nedtrappningscykler tills temperaturen når 4 °C.
    OBS: gRNA-sekvensen designades med CRISPOR, http://crispor.tefor.net.
  2. Inkubera glödgat RNA, 10 μg/μL Cas9-nukleas, och elektroporationsbufferten blandad i ett volymförhållande på 5:3:2 vid 37 °C i 20 minuter för att bilda Cas9-RNP-komplexet. I rutinarbete, blanda och inkubera 1,25 μL glödgat RNA, 0,75 μL Cas9-nukleas och 0,5 μL av elektroporationsbufferten för en locusgenomredigering.
  3. Blanda följande material i ett 1,5 ml rör: 10 μl elektroporationsbuffert, 1 μl Cas9-RNP-komplex (steg 3.2) och 1 μl cirkulär målvektor (1 μg/μl, steg 1.6). Den totala mängden Cas9-RNP-DNA-blandning är 12 μL. Håll Cas9-RNP-DNA-blandningen på is tills elektroporering.
    OBS: För att förhindra klyvning av gRNA efter KI, designa gRNA i en position där gRNA-igenkänningssekvensen delas av integrationen av KI-givaren. Om gRNA inte kan utformas på en sådan plats ingår flera nukleotid-tysta mutationer, genom vilka aminosyrasekvensen inte förändras, i KI-givarens plasmid.

4. Geninriktning av ekonomiska och sociala råd

  1. För att förbereda de gelatinbelagda cellodlingsskålarna, tillsätt 0,1% (w / v) gelatinlösning vid 2 ml för en 60 mm skål, 500 μL för en 24-brunnsplatta, 100 μL för en 96-brunnsplatta och inkubera i 2 timmar i en fuktig inkubator. Ta bort gelatinlösningen, tvätta två gånger med samma mängd PBS och förvara vid rumstemperatur tills den används.
  2. Tina mitotiskt inaktiverad fryst MEF-stam (steg 2.2) med ett 37 °C vattenbad i 1 min och placera MEF på en gelatinbelagd 60 mm skål (ett fryst stamrör med MEF som innehåller 1,6 x 106 celler för två 60 mm skålar, steg 2.2) 1 dag före ESC-sådd.
  3. Tina ett fryst ESC-stamrör (förvarat vid 2 x 10 5 ESC/rör; cellräkning utfördes med hjälp av en cellräknare) med ett 37 °C vattenbad i 1 min och placera 1 x 105 ESC på en 60 mm skål som innehåller försådd MEF (steg 4.1).
  4. Odling i 4 ml ESC-odlingsmedium (ESCM, DMEM-baserat modifierat medium med 15% (v / v) fetalt bovint serum, 2 mM L-glutaminsubstrat, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 0,1 mM 2-merkaptoetanol, leukemihämmande faktor och t2i (0,2 μM PD0325901 och 3 μM CHIR99021) som upprätthåller pluripotens av ESC11) vid 37 ° C med 5% CO2 tills ESC når 50% till 70% sammanflöde.
    OBS: Vi använder tre olika linjer av ESC: JM8. A3 från B6N, V6.5 från B6-129 F1 och egenutvecklad BALB/c ESC. Samma KI-protokoll i detta manuskript används för alla ESC-linjer.
  5. Tvätta odlingen ESC med 4 ml PBS och behandla sedan med 800 μL 0,25% trypsin-EDTA-lösning i 5 min vid 37 °C för matsmältning. Tillsätt 1 ml ESCM för att inaktivera trypsin och dissociera ESC till enstaka celler genom pipettering.
  6. Centrifugera den ESC-innehållande lösningen i 5 minuter vid 280 x g, kassera supernatanten, återsuspendera ESC i färsk 1 ml ESCM och räkna antalet celler med hjälp av en cellräknare med trypanblå färgning. Överför 1 x 10 5 ESC till ett nytt1,5 ml rör och tvätta dem tre gånger med PBS genom centrifugering vid 500 x g, 4 °C.
  7. Återsuspendera ESC-pelleten i 12 μl Cas9-RNP-DNA-blandningen (steg 3.3) och blanda väl genom försiktig pipettering för att undvika bubblande. Servera den återsuspenderade ESC för elektroporering. Elektroporationssystemet använder en enda puls vid 1 400 V och 30 ms för Cas9-RNP-DNA-transduktion (figur 1).
  8. Odla de elektroporerade ESC:erna i en 60 mm skål som innehåller 4 ml ESCM med mitotiskt inaktiverad MEF (avsnitt 4.2). Byt medium varje dag.
  9. Tvätta ESC: erna med 4 ml PBS 3 till 5 dagar efter elektroporeringen, behandla sedan med 800 μL 0,25% trypsin-EDTA och kultur vid 37 ° C i 5 minuter i en fuktig inkubator för matsmältning. Tillsätt 2 ml ESCM för att stoppa trypsinuppslutningen och centrifugera cellblandningen vid 280 x g i 5 minuter.
  10. Kassera supernatanten, återsuspendera ESC: erna i 1 ml färsk ESCM och räkna cellkoncentrationen med hjälp av en cellräknare med trypanblå färgning. För ESC:erna vid 1 x 103 ESC per 60 mm skål som innehåller ESCM och matar-MEF. Byt medium varje dag tills kolonin tar fart.
    OBS: Anledningen till att ESC passeras en gång före upphämtning var att genomredigering kan fortsätta att ske efter ESC-uppdelning, så den första kolonin är inte alltid klonen i många fall. Därför är den första passagen av ESC före koloniupphämtningen ett viktigt steg för att plocka upp enstaka kloner.

5. PCR-genotypning av riktade ekonomiska och sociala råd

  1. Aspirera ESCM från ESC-odlingsskålen 5 till 7 dagar efter den första passagen (steg 4.9) och tillsätt 4 ml PBS. Plocka upp enstaka ESC-kolonier med 5 μL PBS med en 20 μL pipett under ett stereomikroskop (30x till 40x förstoring). Placera de enskilda kolonierna i en brunn av en rundbottnad 96-brunnsplatta innehållande 15 μL 0,25% trypsin-EDTA-lösning.
  2. Håll 96-brunnsplattan på is tills 48 enskilda kolonier plockas upp. Inkubera 96-brunnsplattan i 5 minuter i en 37 °C fuktig 5% CO 2-inkubator, tillsätt sedan 80 μL ESCM för att stoppa trypsinuppslutningen och dissociera ESC-kolonier i enstaka celler genom pipettering.
    OBS: Eftersom KI-effektiviteten för denna metod vanligtvis är 10% -50%, plockar vi rutinmässigt upp 48 kloner och utför först genotypning med 24 av dem. Om flera KI-kloner inte kan erhållas vid denna tidpunkt, screenar vi vidare för KI med de återstående 24 klonerna.
  3. Överför 40 μL ESC-suspension (steg 5) till en gelatinbelagd matarfri 96-brunnsplatta innehållande 50 μl ESCM per brunn för PCR-genotypning. Överför de återstående 60 μl ESC-suspensionen till en brunn i en gelatinbelagd 24-brunnsplatta, som innehåller 500 μL ESCM och matar-MEF, för att göra det frysta ESC-beståndet.
  4. Lagra enskilda ESC-kloner odlade i 24-brunnsplattan (steg 5.3) tills de når 60% till 80% sammanflöde. Återställ enskilda ESC-kloner genom trypsinisering som nämnts ovan, samla celler i ett nytt 1,5 ml rör och centrifugera vid 280 x g i 5 minuter. Kassera supernatanten, återsuspendera cellerna i 500 μl cellfrysningsmedium och frys dem med en djupfrysare på -80 °C.
  5. För PCR-genotypning, odla ESC-kloner i den 96-brunns matarfria plattan (steg 5.3) tills ESC når mer än 90% sammanflöde. Ta bort ESCM från varje brunn efter aspiration och tvätta två gånger med 100 μL PBS.
  6. Aspirera PBS och tillsätt 100 μL lysbuffert innehållande proteinas K, blanda väl och överför ESC-lysatet till ett nytt 1,5 ml rör. Värm ESC-lysatet vid 65 °C i minst 1 timme med hjälp av en värmekammare. Extrahera och rena det genomiska DNA:t med hjälp av en konventionell fenol-kloroform DNA-reningsmetod följt av etanolutfällning.
  7. Lös upp det utfällda DNA:t i 20 μl DNasfritt vatten och bestäm renheten och koncentrationen av DNA med hjälp av en spektrofotometer. Utför genomisk PCR med hjälp av locusspecifika primeruppsättningar för att förstärka målregionen. Kontrollera sedan sekvensen och välj ESC-klonerna med önskade KI-sekvenser.

6. Beredning av åttacellsstadium embryo och mikroinjektion av ESC

  1. Injicera 5 IE av dräktiga sto serumgonadotrofin (PMSG) intraperitonealt i vuxna ICR-honor. Efter 48 h, injicera 5 IE humant koriongonadotrofin (hCG) i samma honor och para sedan de hormonbehandlade honorna med ICR-hanarna. Kontrollera kopulatorpluggen i slidan dagen efter (embryonal dag 0,5, ED0,5).
    OBS: För att utvärdera chimerism efter pälsfärgförhållanden, använd blastocyst från ICR-stammen som mottagare för en ESC som har svart eller agouti-pälsfärgbakgrund, eller blastocyst från C57BL / 6-stammen som mottagare för en ESC som har albinobakgrund.
  2. Samla ovidukten vid ED1.5 och placera den i HEPES-buffrade medium (FHM) droppar. Återställ embryona i tvåcells- eller fyrcellsstadiet genom att spola äggledaren med FHM med hjälp av en spolnål som sätts in i infundibulumet.
  3. Tvätta de uppsamlade embryona genom att flytta dem till flera färska FHM-droppar med en munpipett. Odla embryona i 50 μl KSOM-droppe på en 35 mm cellodlingsskål täckt med mineralolja vid 37 °C, 5% CO 2-inkubator i 1 dag tills åttacells- eller morulastadiet (ED2.5) har uppnåtts.
  4. Om embryona inte används nästa samlingsdag, frys dem genom förglasning enligt CARD-protokollet (http://card.medic.kumamoto-u.ac.jp/card/english/sigen/manual/ebvitri.html) och förvara dem i flytande kväve tills de används.
  5. Förbered glaspipetter för att hålla embryona (80-100 μm ytterdiameter) och ESC-injektion (ca 13 μm diameter) med hjälp av en avdragare och mikroforge.
  6. Integrera en hållpipett som innehåller FHM i en kapillärhållare ansluten till en mikroinjektor och ställ in på vänster sida av mikromanipulatorn. Anslut en injektionspipett till en annan mikroinjektor och ställ in den på höger sida. Rikta in de två pipetterna rakt i fältet för synen på mikroskopet.
  7. Fördela 5 μL droppar av 12% (w/v) polyvinylpyrrolidon (PVP) i FHM-medium och 5 μL droppar FHM på samma lock på en 60 mm skål sida vid sida och täck dropparna med mineralolja. Överför embryon i 5 μL FHM-droppen och tillsätt 1-5 μL av ESC-suspensionen till FHM-droppen som innehåller embryon.
    OBS: Lämna ESC- och MEF-suspensionen i 30 minuter i 4 ml ESM på 60 mm odlingsskål före droppberedningen. Eftersom MEF håller sig till botten snabbare än ESC, möjliggör denna 30-minuters inkubation koncentrationen av obundna ES-celler i supernatanten.
  8. Tvätta inuti injektionspipetten med PVP och flytta sedan till droppen som innehåller embryon och ESC.
  9. Plocka upp tre individuella ECS-dubbletter som just har avslutat sin celldelning (sex celler) i injektionspipetten. Håll ett åttacelligt eller morulastegsembryo, som har slutfört komprimering, med hållpipetten genom aspiration. Gör ett hål i zona pellucida med en piezoelektrisk puls (intensitet: 3; hastighet: 3). Utvisa den sexcelliga ESC inuti zona pellucida och dra pipetten ur embryona.
  10. Tvätta de ESC-injicerade embryona med flera KSOM-droppar försiktigt med hjälp av en munpipett och inkubera dem i en ny 50 μL KSOM-droppe täckt med mineralolja vid 37 °C, 5% CO2 tills embryona utvecklas till blastocyststadiet.
  11. Överför de 10 ESC-injicerade blastocysterna till varje livmoderhorn hos pseudopregnant honmöss (2,5 dagar postcoitum, 20 blastocyster per capita).
  12. Efter att surrogatmamman har fött barn, välj minst två manliga chimärer med det högsta chimerismförhållandet (70% eller högre som bekräftats av pälsfärg) och para dem sedan med lämpliga stamhonor för att få F1 heterozygot KI.
  13. Avla enskilda KI-möss med lämpliga partners för att få möss med önskvärda genotyper eller genetiska bakgrunder som är lämpliga för forskning.

Representative Results

Vi har riktat in oss på specifika gener i ESC följt av chimärproduktion för att utveckla genmanipulerad musproduktion enligt vårt tidigare manuskript11. ESC-genotypning (beskrivs i avsnitt 4) utförs rutinmässigt med PCR med hjälp av primers. Primers är utformade på genomiska sekvenser utanför homologiarmarna och de specifika sekvenserna i KI DNA-fragmentet (figur 2A). I så fall förstärks ingen allel av vildtyp, medan en PCR-amplicon av en viss storlek detekteras endast när det riktade exogena DNA:t är KI vid mållokusen. Representativa genotypnings-PCR-resultat visas i figur 2B. Nio av 22 kloner (40,9%) visade ett KI-specifikt band i det här fallet. Tre representativa inriktningsresultat, inklusive resultatet som visas i figur 2, visas i tabell 1. Dessa resultat indikerar att metoden som visas här är effektiv och reproducerbar för gen KI utan några läkemedelsval.

ESC plockas upp i en injektionspipett, sedan görs ett hål i zona pellucida med hjälp av ett piezoelektriskt plus, och ESC frigörs mellan embryonala celler (figur 3). Tekniskt sett liknar detta protokoll för att injicera en ESC i ett åttacells- eller morula-stadiumembryo protokollet för ESC-injektion i en blastocyst som vanligtvis används i många musanläggningar. Representativa chimära möss visas i figur 4. För utvärdering av pälsfärg av chimerism användes embryot från ICR-stammen (albino, vitt hår) som mottagare av B6 eller B6-129 F1 ESC, och B6-embryon användes som mottagare av BALB / c ESC (figur 4).

Figure 1
Figur 1: Ett schema över CRISPR/Cas9 ribonukleoprotein (RNP)-medierad cirkulär plasmidintegration i det specifika locuset för ett ESC-genom. Elektroporation introducerar en cirkulär plasmid som en målvektor i ESC med Cas9-RNP. Förkortningar: GOI = gen av intresse, HA = homologiarm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Genomiska PCR-analyser för KI-screening av riktade ESC-kloner. (A) KI-specifika PCR-primers är utformade på genomiska sekvenser utanför homologiarmarna (framåt) och i de specifika sekvenserna i KI:s DNA-fragment (omvänd). (B) Representativa resultat av genotypning av PCR. Ett genom av vild typ användes som en negativ kontroll. Förkortningar: GOI = gen av intresse, HA = homologiarm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Representativa bilder av embryoinjektion i åttacellsstadiet . (A) För mikroinjektion plockas tre dubbletter av ESC (sex celler, pilspetsar) upp. (B) Ett hål i zona pellucida görs med en piezoelektrisk puls, och ESC utvisas mellan varje blastomer. Skalstrecket som visas är 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Representativa bilder av chimärmöss . (A,B) ESC härledd från C57BL/6N (JM8. A3, Agouti hår; A) eller B6-129 F1 (Agouti hår; B) injiceras i ICR-embryon (albino, vitt hår), följt av överföring av embryona till modersurrogaten. (C) ESC som härrör från BALB/c (albino, vitt hår) injiceras i C57BL/6J (svart hår) embryon, följt av överföring av embryona till modersurrogat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Projekt-ID Kromosom 5'HA längd (bp) 3'HA längd (bp) Infoga storlek (bp) Antal analyserade kloner Antal KI-kloner Effektivitet (%) Anmärkningar
R26-CC* Chr6 965 1006 5321 23 2 8.7% -
R4-03* Chr8 1000 997 3070 22 6 27.3% -
P4-01* Chr15 1000 1000 2569 22 9 40.9% Visas i figur 2

Tabell 1: KI-effektivitet i tre oberoende genomiska loci i ESC. *Dessa projekt har hittills inte publicerats. Namnet på dessa gener kommer att avslöjas i oberoende manuskript i framtiden.

Discussion

Geninriktning av ESC följt av chimärproduktion har konventionellt använts för att utveckla genmanipulerade möss. Ändå förblir gen-knock-in-effektiviteten låg trots att målvektorn innehåller långa (> flera kb i vanliga) homologiarmar med positiva eller negativa läkemedelsselektionsgenkassetter. Vårt protokoll introducerade en avstämd ESC KI-metod för långt exogent DNA med användning av en cirkulär plasmid utan några läkemedelsvalkassetter som en målvektor åtföljd av Cas9-RNP-medierad genomredigering med en acceptabel effektivitet för rutinarbeten. Således kan detta protokoll bidra till att avsevärt minska den tid det tar att producera genetiskt modifierade chimära möss jämfört med den konventionella ESC-inriktningen.

I detta protokoll använde vi CRISPR/Cas9-RNP för att inducera platsspecifika dubbelsträngsbrott i genomet, och en cirkulär plasmid användes som målvektor istället för en linjäriserad. Linjäriserade plasmider används konventionellt som en målvektor för gen KI på grund av deras ökade effektivitet av genomisk integration 8,9,10. Många genomiska integrationer är dock ospecifika trots att vektorn innehåller homologa armar9. Å andra sidan används cirkulära plasmider sällan som inriktningsvektorer på grund av deras svårintegrerade funktion i genomet hos ESC12 eller fibroblaster13. Således skulle det vara möjligt att applicering av en cirkulär plasmid som en inriktningsvektor åtföljd av CRISPR / Cas9-medierad genomredigering minimerar ospecifik slumpmässig integration men maximerar den platsspecifika integrationen i ESC-genomet. Det skulle vara anmärkningsvärt att induktionseffektiviteten hos dubbelsträngsbrottet med CRISPR / Cas9 är ganska viktigt14, så det skulle vara viktigt att använda gRNA som inducerar en dubbelsträngsbrytning med hög effektivitet. Det bör övervägas att omforma gRNA när KI-effektiviteten är för låg. I det fall som visas i figur 2 visade 40,9 % av ESC-klonerna ett KI-specifikt band. Faktum är att vi som institutets kärnlaboratorium rutinmässigt utför geninriktning med hjälp av ESC med den metod som beskrivs här och har uppnått KI-effektivitet på 10% -50% för 1-2 kb-sekvenser som Cre, CreERT eller fluorescerande reportrar, även om det finns vissa variationer beroende på genlokus. De längsta DNA-sekvenser vi framgångsrikt har KI med denna metod är cirka 11,2 kb in i Rosa26-locus, och effektiviteten var 12,2% (fem KI-kolonier av 41 analyserade kolonier).

Det bör också noteras att detta protokoll använder embryon i åttacells- eller morulastadiet som mottagare för ESC-mikroinjektion men inte blastocyststadiumembryon. Även om vi inte har genomfört jämförande experiment i detta dokument, har flera rapporter visat att injektion av ESC i åttacells- eller morula-embryon avsevärt förbättrar effektiviteten av ESC-bidrag till chimära avkommor jämfört med ESC-injektionen i blastocyster15,16,17,18 . Faktum är att ESC-injektioner av olika ESC-linjer, inklusive C57BL/6, B6-129 F1 och BALB/c, vanligtvis resulterade i högbeläggningsfärgchimärutveckling hos vissa, men inte alla, avkommor (se figur 4). Metodens begränsning är att de ESC som injiceras i det preimplantatoriska embryot inte alltid kunde bidra till könsceller i en chimär19,20. Germlineöverföring av ESC skulle bero på kvaliteten på varje ESC-klon19. Därför skulle det vara fördelaktigt att utveckla flera ESC-klonlinjer som en säkerhetskopia för stabil chimär musproduktion. Sammanfattningsvis använder de protokoll som presenteras här enkla målvektorer som endast inkluderar varje homologiarm och gen av intresse för KI utan någon läkemedelsresistent kassett. Därför skulle vektorkonstruktionen vara mycket enklare och odlingsperioden skulle kunna förkortas jämfört med den konventionella ESC-inriktningstekniken. Detta skulle hjälpa till att snabbt och underlättande producera olika typer av genetiskt modifierade möss för framtida analys inom life science.

Disclosures

Författarna har inga konkurrerande intressen att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Saki Nishioka i Osaka University, Biotechnology Research and Development (ideell organisation) och Mio Kikuchi och Reiko Sakamoto i Institute of Medical Science, University of Tokyo, för deras utmärkta tekniska hjälp. Detta arbete stöddes av: ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik (MEXT) / Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI-bidrag till MI (JP19H05750, JP21H05033) och MO (20H03162); Bidraget från kärnforskningen för evolutionsvetenskap och evolutionsteknik (CREST), Japan Science and Technology Agency (JST) till MI (JPMJCR21N1); Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development till MI (R01HD088412); Bill & Melinda Gates Foundation till MI (Grand Challenges Explorations grant INV-001902); och bidraget för gemensamt forskningsprojekt från Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University till MI och MO.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BALB/c ESC - - ESC developed from BALB/c strain
Bambanker Nippon Genetics CS-02-001 Cell-freezeing medium. Section 2.6 and elsewhere
Cas9 Nuclease V3 IDT 1081059 Section 3.2 and elsewhere.
CHIR99021 FUJIFILM Wako 038-23101 Section 4.3
CreERT gene fragment GeneWiz Section 1.1.
CRISPR-Cas9 crisprRNA IDT crisprRNA. Section 3.1 and elsewhere.
CRISPR-Cas9 tracrRNA IDT 1072534 tracrRNA. Section 3.1 and elsewhere.
DMEM Nacalai 08458-45 MEF medium. Section 2.3 and elsewhere
Duplex buffer IDT 1072534 RNA dilution buffer. Section 3.1 and elsewhere.
FastGene Gel/PCR Extraction Kit Nippon Genetics FG-91302 Section 1.1 and 1.2.
GlutaMax Thermo Fisher 35-050-061 L-glutatime substrate
hCG ASKA Animal Health Section 6.1.
In-Fusion HD Cloning Kit Clontech 639648 DNA cloning kit. Section 1.3 and elsewhere
JM8.A3 ESC EuMMCR - ESC developed from C57BL/6N strain
Knock-out DMEM Thermo Fisher 10829018 Section 4.3 and elsewhere, DMEM-based modified commercial medium.
KSOM Merck MR-121-D Section 6.3 and 6.9.
Leukemia inhibitory factor FUJIFILM Wako 125-05603 Section 4.3. No unit concentration data is supplied by the provider. Used 1,000-fold dilution in this protocol.
Neon Electroporation system Thermo Fisher MPK5000 Section 3.2, 4.5 and elsewhere. The system containes electroporation buffer as well used in section 3.2.
NucleoSpin Plasmid Transfection-grade Takara U0490B Section 1.6.
PD0325901 FUJIFILM Wako 162-25291 Section 4.3
PMSG ASKA Animal Health Section 6.1.
Tail lysis buffer Nacalai 06169-95 Section 5.5.
Trypsin-EDTA Nacalai 32777-15 Section 2.2 and elsewhere
V6.5 ESC - - ESC developed from B6J-129 F1 strain
X-ray irradiation device Hitachi MBR-1618R-BE Section 2.6.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  2. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  3. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
  4. Oji, A., et al. CRISPR/Cas9 mediated genome editing in ES cells and its application for chimeric analysis in mice. Scientific Reports. 6, 31666 (2016).
  5. Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).
  6. Chen, F., et al. High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases. Nature Methods. 8 (9), 753-755 (2011).
  7. Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).
  8. Mansour, S. L., Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes. Nature. 336 (6197), 348-352 (1988).
  9. Johnson, R. S., et al. Targeting of nonexpressed genes in embryonic stem cells via homologous recombination. Science. 245 (4923), 1234-1236 (1989).
  10. Hasty, P., Ramires-Solis, R., Krumlauf, R., Bradley, A. Introduction of a subtle mutation into the Hox-2.6 locus in embryonic stem cells. Nature. 350 (6315), 243-246 (1991).
  11. Ozawa, M., Emori, C., Ikawa, M. Gene targeting in mouse embryonic stem cells via CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP) mediated genome editing. Genome Editing in Animals - Methods and Protocols 2nd edition. Hatada, I. , (2022).
  12. Yagi, M., et al. Derivation of ground-state female ES cells maintaining gamete-derived DNA methylation. Nature. 548 (7666), 224-227 (2017).
  13. Gassmann, M., Donoho, G., Berg, P. Maintenance of an extrachromosomal plasmid vector in mouse embryonic stem cells. Proceedings of National Academy of Sciences. 92 (5), 1292-1296 (1995).
  14. Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science. 322 (5903), 949-953 (2008).
  15. Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nature Biotechnology. 25 (1), 91-99 (2007).
  16. Hu, M., et al. Efficient production of chimeric mice from embryonic stem cells injected into 4- to 8-cell and blastocyst embryos. Journal of Animal Science and Biotechnology. 4 (1), 1-7 (2013).
  17. Guo, J., et al. Contribution of Mouse Embryonic Stem Cells and Induced Pluripotent Stem Cells to Chimeras through Injection and Coculture of Embryos. Stem Cells International. 2014, 409021 (2014).
  18. Bodai, Z., Bishop, A. L., Gantz, V. M., Komor, A. C. Targeting double-strand break indel byproducts with secondary guide RNAs improves Cas9 HDR-mediated genome editing efficiencies. Nature Communications. 13 (1), 2351 (2022).
  19. Kobayashi, T., Goto, T., Oikawa, M., Sanbo, M., Yoshida, F., Terada, R., Niizeki, N., Kajitani, N., Kazuki, K., Kazuki, Y., Hochi, S., Nakauchi, H., Surani, A., Hirabayashi, M. Blastocyst complementation using Prdm14-deficient rats enables efficient germline transmission and generation of functional mouse spermatids in rats. Nature Communications. 12 (1), 1328 (2021).
  20. Miura, K., Matoba, S., Hirose, M., Ogura, A. Generation of chimeric mice with spermatozoa fully derived from embryonic stem cells using a triple-target CRISPR method for Nanos3. Biology of Reproduction. 104 (1), 223-233 (2021).

Tags

Utvecklingsbiologi utgåva 186
CRISPR/Cas9-medierad högeffektiv geninriktning i embryonala stamceller för utveckling av genmanipulerade musmodeller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ozawa, M., Emori, C., Ikawa, M.More

Ozawa, M., Emori, C., Ikawa, M. CRISPR/Cas9-Mediated Highly Efficient Gene Targeting in Embryonic Stem Cells for Developing Gene-Manipulated Mouse Models. J. Vis. Exp. (186), e64385, doi:10.3791/64385 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter