Summary

アデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシド変異体のエンジニアリング、バーコード化、スクリーニングによる次世代遺伝子治療ベクターの単離(英語)

Published: October 18, 2022
doi:

Summary

次世代AAVの作成のための新規特性を持つ候補のバーコード化によるAAVペプチドディスプレイライブラリの生成とその後の検証。

Abstract

アデノ随伴ウイルス(AAV)に由来する遺伝子送達ベクターは、遺伝病の治療のための最も有望なツールの1つであり、有望な臨床データといくつかのAAV遺伝子治療の承認によって証明されています。AAVベクターの成功の2つの主な理由は、(i)異なる特性を持つさまざまな天然に存在するウイルス血清型の事前分離、および(ii)その後の分子工学とハイスループットでの転用のための強力な技術の確立です。これらの技術の可能性をさらに高めるために、最近、選択されたAAVカプシドをDNAおよびRNAレベルでバーコード化するための戦略が実装され、単一の動物のすべての主要な臓器および細胞タイプで包括的かつ並行したin vivo層別化が可能になります。ここでは、AAVペプチドディスプレイを使用して、利用可能なカプシドエンジニアリング技術の多様な武器を表す、この一連の補完的な手段を網羅する基本的なパイプラインを紹介します。したがって、まず、所望の特性を有する候補のin vivo選択のためのAAVペプチドディスプレイライブラリを生成するための極めて重要なステップを説明し、続いて、二次in vivoスクリーニングのために最も興味深いカプシド変異体をバーコード化する方法のデモンストレーションを行います。次に、バーコード増幅やアダプターライゲーションを含む次世代シーケンシング(NGS)用のライブラリ作成の方法論を例示し、NGSデータ解析中の最も重要なステップの概要で締めくくります。ここで報告されているプロトコルは汎用性と適応性があるため、研究者はそれらを簡単に利用して、お気に入りの疾患モデルや遺伝子治療アプリケーションに最適なAAVキャプシドバリアントを濃縮できます。

Introduction

遺伝子導入療法は、細胞に遺伝物質を導入して、細胞の遺伝物質を修復、置換、または変更して、病気を予防、治療、治癒、または改善することです。遺伝子導入は、インビボとエクスビボの両方で、非ウイルス性とウイルス性の異なる送達システムに依存しています。ウイルスは、標的細胞を効率的に形質導入するために自然に進化しており、送達ベクターとして使用できます。遺伝子治療に使用されるさまざまな種類のウイルスベクターの中で、アデノ随伴ウイルスは、病原性の欠如、安全性、免疫原性の低下、そして最も重要なことに、長期の非組み込み型発現を維持する能力のためにますます使用されています1,2,3AAV遺伝子治療は、過去10年間でかなりの成果を上げてきました。3つの治療法が、欧州医薬品庁と米国食品医薬品局によってヒトでの使用が承認されています3,4。他の場所でレビューされているように、血友病、筋肉、心臓、神経疾患などのさまざまな疾患を治療するためのいくつかの臨床試験も進行中です3。何十年にもわたる進歩にもかかわらず、遺伝子治療の分野は近年一連の挫折を経験しており4、最も重要なのは、特に筋肉などの巨大な組織、または脳などの到達が困難な組織の場合、用量制限毒性のために保留された臨床試験5での死亡6です。

現在臨床試験で使用されているAAVベクターは、いくつかの例外を除いて天然血清型に属しています1。AAVエンジニアリングは、優れた臓器または細胞特異性と効率を備えたベクターを開発する機会を提供します。過去20年間で、ペプチドディスプレイ、ループスワップ、カプシドDNAシャッフリング、エラー発生型PCR、ターゲットデザインなど、いくつかのアプローチが成功裏に適用され、多様な特性を持つ個々のAAVバリアントまたはそのライブラリが生成されました7。次に、これらは、他の場所でレビューされているように、目的の特性を持つバリアントを選択するために、指向性進化の複数のラウンドにかけられます1,3。すべてのカプシド進化戦略の中で、ペプチドディスプレイAAVライブラリは、比較的簡単に生成でき、高い多様性とハイスループットシーケンシングを達成できるため、進化を追跡できるといういくつかのユニークな特性により、最も広く使用されています。

最初に成功したペプチド挿入AAVライブラリは、ほぼ20年前に記述されました。最初の1つでは、Peraboら8 は、ランダムに生成されたオリゴヌクレオチドのプールが、カプシドから突き出た3倍軸のVP1キャプシドタンパク質のアミノ酸587に対応する位置のプラスミドに挿入された修飾AAV2キャプシドのライブラリを構築しました。アデノウイルスの共感染を用いて、AAVライブラリーを複数回の選択を通じて進化させ、最終的な再標的変異体は、親のAAV28に難治性の細胞株を形質導入できることが示された。その後まもなく、Müllerら9 はライブラリ作成のための2段階システムを導入し、プロトコルを大幅に改善しました。最初に、プラスミドライブラリは、アデノウイルスヘルパープラスミドとともに、キメラカプシドを含むAAVライブラリを生成するために使用されます。このAAVシャトルライブラリは、細胞ごとに1つのウイルスゲノムを導入することを目的として、感染多重度(MOI)の低い細胞に感染するために使用されます。アデノウイルスとの同時感染により、ゲノムとキャプシド9が一致するAAVの産生が保証されます。約10年後、ダルカラ10in vivo 指向進化を使用して7m8バリアントを作成しました。この変異体は、10アミノ酸挿入(LALGETTRPA)を有し、そのうち3つはリンカーとして作用し、硝子体内注射後の外網膜を効率的に標的とする10。このエンジニアリングキャプシドは、これまでにクリニックにたどり着いた数少ないエンジニアリングキャプシドの1つであるため、並外れたサクセスストーリーです11

この分野は、次世代シーケンシング(NGS)技術の導入により、2番目の後押しを経験しました。2014年のAdachi et al.12と2015年のMarsic et al.13の2つの出版物は、バーコード化されたAAVキャプシドライブラリの分布を高精度で追跡するNGSの力を紹介しました。数年後、バーコード領域のNGSは、カプシドの進化に従うようにペプチド挿入領域に適応されました。Körbelinら14は、肺を標的とするAAV2ベースのキャプシドを同定するためにNGSガイド下スクリーニングを実施した。NGS分析は、選択ラウンド間の濃縮スコア、組織特異性を決定するための一般的な特異性スコア、そして最後に合計スコア14の3つの評価スコアを計算するのに役立ちました。Gradinaruラボ15は、細胞タイプ特異的な選択を容易にするCre組換えベースのAAVターゲット進化(CREATE)システムを同年に発表しました。このシステムでは、ポリA信号が2つのloxPサイトに隣接しているため、カプシドライブラリはCre反転可能スイッチを備えています。次に、AAVライブラリをCreマウスに注入し、ポリAシグナルがCre+細胞でのみ反転し、リバースPCRプライマーとキャプシド遺伝子内のフォワードプライマーを結合させるためのテンプレートを提供します。この非常に特異的なPCRレスキューにより、AAV-PHPの同定が可能になりました。血液脳関門15を通過できるB変異体。このシステムはさらにM-CREATE(Multiplexed-CREATE)に進化し、NGSと合成ライブラリ生成がパイプライン16に統合されました。

マグワイアラボ17のこのシステムの改良されたRNAベースのバージョンであるiTransduceは、細胞を機能的に形質導入し、そのゲノムを発現するカプシドのDNAレベルでの選択を可能にします。ペプチドディスプレイライブラリーのウイルスゲノムは、ユビキタスプロモーターの制御下にあるCre遺伝子と、p41プロモーターの制御下にあるカプシド遺伝子とを含む。このライブラリーは、tdTomatoの上流にloxP-STOP-loxPカセットを有するマウスに注入される。ウイルスゲノムを発現し、したがってCreがtdTomatoを発現するAAV変異体で形質導入された細胞は、細胞マーカーと組み合わせて、選別および選択することができる17。同様に、Nonnenmacher et al.18およびTabebordbarら19は、カプシド遺伝子ライブラリーを組織特異的プロモーターの制御下に置いた。異なる動物モデルに注射した後、ウイルスRNAを使用してカプシド変異体を単離した。

別の方法は、バーコードを使用してcapsidライブラリにタグを付けることです。ビョルクルンドラボ20 は、このアプローチを使用してペプチド挿入キャプシドライブラリをバーコード化し、バーコード化された合理的なAAVベクトル進化(BRAVE)を開発しました。1つのプラスミドでは、Rep2Capカセットを、倒立末端リピート(ITR)に隣接する黄色蛍光タンパク質(YFP)発現、バーコードタグ付き導入遺伝子の隣にクローニングします。 キャップ の端とバーコードの先頭の間のloxPサイトを使用して、 in vitro Cre組換えにより、NGSに十分小さいフラグメントが生成され、それによってペプチド挿入と固有のバーコード(ルックアップテーブル、LUT)との関連付けが可能になります。AAV産生はプラスミドライブラリを用いて行われ、mRNAで発現されたバーコードは、 in vivo 適用後に再びNGS20でスクリーニングされる。カプシドライブラリがキャプシド遺伝子全体のバリアント(すなわち、シャッフルされたライブラリ)を含む場合、ロングリードシーケンシングを使用する必要があります。いくつかのグループは、バーコードを使用してこれらの多様なライブラリにタグを付け、より高い読み取り深度でNGSを可能にしています。Kay lab21 は、 キャップ ポリA信号の下流にバーコードを使用して、非常に多様なキャプシドシャッフルライブラリにタグを付けました。最初のステップでは、バーコード化されたプラスミドライブラリが生成され、シャッフルされたカプシド遺伝子ライブラリがその中にクローニングされました。次に、MiSeq(ショートリード、より高い読み取り深度)とPacBio(ロングリード、より低い読み取り深度)のNGSとサンガーシーケンシングの組み合わせを使用して、LUT21を生成しました。2019年、チャーチラボ22 のオグデンと同僚は、すべての位置に一点変異、挿入、欠失を持つライブラリを使用して、複数の機能に対するAAV2キャプシド適合性を描写し、最終的に機械誘導設計を可能にしました。ライブラリの生成のために、カプシド遺伝子のより小さな断片を合成し、バーコードでタグ付けし、次世代配列を決定し、次に完全なカプシド遺伝子にクローニングしました。NGSデータはLUTを生成するために使用されました。次に、バーコードとショートリードシーケンスのみを使用してライブラリをスクリーニングし、より高い読み取り深度22を可能にしました。

バーコードライブラリは、カプシドライブラリを数回選択した後、またはカプシド進化研究とは無関係に、既知の天然および工学的バリアントのプールをスクリーニングするために主に使用されてきました。このようなライブラリの利点は、動物の数を減らし、動物間の変動を最小限に抑えながら、複数のカプシドをスクリーニングする機会です。この技術をAAV分野に導入した最初の研究は、ほぼ10年前に発表されました。中井研究室12は、AAV9のVP1上のアミノ酸356〜736をカバーする191個の二重アラニン変異体を12 ヌクレオチドのバーコードでタグ付けした。NGSを用いて、ライブラリーを、ガラクトース結合および他の特性について インビボ でスクリーニングした12。Marsicらは、1年後の二重バーコード分析も使用して、AAV変異体の生体分布を描写した13。非ヒト霊長類を対象としたより最近の研究では、異なる送達経路を使用して29個のカプシドの中枢神経系における生体分布を比較しました23。私たちの研究室は最近、天然および人工AAVを含む183のバリアントのバーコードAAVライブラリ画面を公開しました。DNAおよびRNAレベルでのこれらのスクリーニングは、マウスにおける高筋向性AAV変異体24ならびにマウス脳において高い細胞型特異性を示す他のもの25の同定につながった。

ここでは、この研究で使用された方法論について説明し、AAVペプチドディスプレイライブラリのスクリーニングを含むように拡張します。これには、AAV2ペプチドディスプレイライブラリの生成、定量のためのデジタルドロップレットPCR(dd-PCR)法、そして最後にAAV変異体を分析するためのNGSパイプラインが含まれ、Weinmannらの研究に一部基づいています24。最後に、バーコードAAVライブラリの生成と、同じ出版物で使用されるNGSパイプラインの説明が提供されます。

Protocol

1. AAV2ランダム7量体ペプチドディスプレイライブラリーの調製 注:AAV2ランダムペプチドディスプレイライブラリの調製では、縮重オリゴヌクレオチドを一本鎖DNAとして合成し、それを二本鎖DNAに変換し、消化し、アクセプタープラスミドにライゲートし、エレクトロポレートします。 縮重オリゴヌクレオチドの設計縮重オリゴヌクレオチドを注?…

Representative Results

AAV2ペプチドディスプレイライブラリの作製。 改変されたAAVの選択に向けた最初のステップとして、プラスミドライブラリの生成について説明します。ペプチドインサートは、縮重プライマーを使用して製造されます。コドンの組み合わせを64から20に減らすと、タンパク質レベルではなくDNAのライブラリの多様性を減らすことで、終止コドンを排除し、NGS分析を容易にするとい?…

Discussion

このプロトコルでは、ペプチドディスプレイAAVキャプシドエンジニアリングとバーコードAAVライブラリスクリーニング、およびライブラリ組成とキャプシド性能のバイオインフォマティクス分析に必要な手順が概説されています。このプロトコルは、ほとんどのウイルス学研究所が分子生物学技術の習熟度に匹敵するプログラミングスキルに遅れをとっているため、これらのタイプのライブ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

D.G.は、DFG共同研究センターSFB1129(Projektnummer 240245660)およびTRR179(Projektnummer 272983813)を通じたドイツ研究財団(DFG)、ならびにドイツ感染研究センター(DZIF、BMBF;TTU-HIV 04.819)。

Materials

Amplification primer ELLA Biotech (Munich, Germany) Second-strand synthesis of oligonucleotide insert
Agilent DNA 1000 Reagents Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) 5067-1504 DNA fragment validation
Agilent 2100 Bioanalyzer System Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) G2938C DNA fragment validation
AllPrep DNA/RNA Mini Kit  Qiagen (Venlo, Netherlands) 80204 DNA/RNA extraction
Agilent DNA 1000 Reagents Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) 5067-1504 NGS Library preparation
Agilent 2100 Bioanalyzer System Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) G2938C NGS Library preparation
BC-seq fw:  IDT (San Joce, CA, CA, USA) ATCACTCTCGGCATGGACGAGC  NGS Library preparation
BC-seq rv:   IDT (San Joce, CA, CA, USA) GGCTGGCAACTAGAAGGCACA  NGS Library preparation
β-Mercaptoethanol Millipore Sigma (Burlington, MA, USA) 44-420-3250ML DNA/RNA extraction
BglI New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) R0143 Digestion of double-stranded insert
C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1851196 dd-PCR cycler
dNTPS  New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) N0447S NGS Library preparation
ddPCR Supermix for probes (no dUTP) Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1863024 dd-PCR supermix
Droplet Generation Oil for Probes Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1863005 dd-PCR droplet generation oil
DG8 Cartridges for QX100 / QX200 Droplet Generator Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1864008 dd-PCR droplet generation cartridge
DG8 Cartridge Holder Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1863051 dd-PCR cartridge holder
Droplet Generator DG8 Gasket Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1863009 dd-PCR cover for cartridge
ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 12001925 dd-PCR 96-well plate
E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells Lucigen (Middleton, WI, USA) 60081-1 Electrocompetent cells
Electroporation cuvettes, 1mm Biozym Scientific (Oldendorf, Germany) 748050 Electroporation
GAPDH primer/probe mix Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) Mm00186825_cn Taqman qPCR primer
Genepulser Xcell Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1652660 Electroporation
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems (Waltham, MA, USA) 4368814 cDNA reverse transcription
ITR_fw IDT (San Joce, CA, USA) GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) dd-PCR primer
ITR_rv IDT (San Joce, CA, USA) CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) dd-PCR primer
ITR_probe IDT (San Joce, CA, USA) HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) dd-PCR probe
Illumina NextSeq 500 system Illumina Inc (San Diego, CA, USA) SY-415-1001 NGS Library sequencing
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)* Roche AG (Basel, Switzerland) KK2600 07958919001 NGS sample prepration
MagnaBot 96 Magnetic Separation Device Promega GmbH (Madison, WI, USA) V8151 Sample prepration for NGS library
NanoDrop 2000 spectrophotometer Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) ND-2000 Digestion of double-stranded insert
NGS_frw Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC NGS primer
NGS_rev Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) CGC CTT GTG TGT TGA CAT C NGS primer
NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles) Illumina Inc (San Diego, CA, USA) FC-404-2005 NGS Library sequencing
Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit  NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA) 9092-256 NGS Library preparation
PX1 Plate Sealer  Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1814000 dd-PCR plate sealer
Pierceable Foil Heat Seal Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1814040 dd-PCR sealing foil
Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) F530S Second-strand synthesis of oligonucleotide insert
PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA) 24765-1G AAV library preparation
ProNex Size-Selective Purification System Promega GmbH (Madison, WI, USA) NG2002 Sample prepration for NGS library
Phusion Hot Start II Polymerase  Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) F549L NGS Library preparation
Proteinase K Roche AG (Basel, Switzerland) 5963117103 DNA/RNA extraction
pRep2Cap2_PIS ITR-Rep2Cap2-ITR vector. Peptide insertion site within the Cap2 ORF, manufactured/prepared in the lab 
QX200 Droplet Generator Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1864002 dd-PCR droplet generator
QX200 Droplet Reader Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1864003 dd-PCR droplet analysis
QIAquick Nucleotide Removal Kit Qiagen (Venlo, Netherlands) 28306 Second-strand synthesis of oligonucleotide insert purification
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen (Venlo, Netherlands) 28704 Plasmid vector purification
QIAGEN Plasmid Maxi Kit Qiagen (Venlo, Netherlands) 12162 Plasmid library DNA preparation
Qiaquick PCR Purification kit Qiagen (Venlo, Netherlands) 28104 Sample prepration for NGS library
Qubit fluorometer Invitrogen (Waltham, MA, USA) Q32857 NGS Library preparation
Qubit dsDNA HS Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) Q32851 NGS Library preparation
QuantiFast PCR Master Mix Qiagen (Venlo, Netherlands) 1044234 Taqman qPCR
rep_fw IDT (San Joce, CA, USA) AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC dd-PCR primer
rep_rv IDT (San Joce, CA, USA) CAATCACGGCGCACATGT dd-PCR primer
rep_probe IDT (San Joce, CA, USA) FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1 dd-PCR probe
RNase-free DNase Qiagen (Venlo, Netherlands) 79254 DNA/RNA extraction
SfiI New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) R0123 Digestion of vector
5 mm, steel Beads Qiagen (Venlo, Netherlands) 69989 DNA/RNA extraction
TRIMER-oligonucleotides ELLA Biotech (Munich, Germany) Degenerate oligonucleotide
T4 Ligase New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) M0202L Plasmid library ligation
TissueLyserLT Qiagen (Venlo, Netherlands) 85600 DNA/RNA extraction
YFP_fw IDT (San Joce, CA, USA) GAGCGCACCATCTTCTTCAAG dd-PCR primer
YFP_rv IDT (San Joce, CA, USA) TGTCGCCCTCGAACTTCAC dd-PCR primer
YFP_probe IDT (San Joce, CA, USA) FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1 dd-PCR probe
Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (Capped) Zymo research (Irvine, CA, USA) D4013 Vector and Ligation purification

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Cite This Article
Rapti, K., Maiakovska, O., Becker, J., Szumska, J., Zayas, M., Bubeck, F., Liu, J., Gerstmann, E., Krämer, C., Wiedtke, E., Grimm, D. Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus (AAV) Capsid Variants. J. Vis. Exp. (188), e64389, doi:10.3791/64389 (2022).

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