Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

En internt bygget og lysdiodebaseret fotodynamisk terapianordning til forbedring af verteporfincytotoksicitet i en 2D-cellekulturmodel

Published: January 13, 2023 doi: 10.3791/64391

Summary

Her beskriver vi en ny, enkel og billig enhed til succesfuldt at udføre in vitro fotodynamisk terapi (PDT) assays ved hjælp af todimensionel HeLa-cellekultur og verteporfin som en fotosensibilisator.

Abstract

Dette papir beskriver en ny, enkel og billig enhed til at udføre in vitro fotodynamisk terapi (PDT) assays, kaldet PhotoACT. Enheden blev bygget ved hjælp af et sæt konventionelle programmerbare lysdioder (LED'er), et LCD-modul (Liquid Crystal Display) og en lyssensor forbundet til et kommercielt mikrocontrollerkort. Prototypens kassebaserede struktur blev lavet med fiberplader med medium densitet (MDF'er). Det indre rum kan samtidig tildele fire cellekultur multiwell mikroplader.

Som et bevis på konceptet studerede vi den cytotoksiske virkning af fotosensibilisatoren (PS) verteporfin mod HeLa-cellelinjen i todimensionel (2D) kultur. HeLa-celler blev behandlet med stigende koncentrationer af verteporfin i 24 timer. Det lægemiddelholdige supernatantmedium blev kasseret, de klæbende celler blev vasket med fosfatbufferet saltvand (PBS), og lægemiddelfrit medium blev tilsat. I denne undersøgelse blev effekten af verteporfin på celler undersøgt enten uden lyseksponering eller efter eksponering i 1 time for lys ved hjælp af rød-grøn-blå (RGB) værdier på 255, 255 og 255 (gennemsnitlig fluence på 49,1 ± 0,6 J / cm2). Efter 24 timer blev cellelevedygtigheden vurderet ved 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-assayet.

Eksperimentelle resultater viste, at eksponering af celler behandlet med verteporfin for lyset fra enheden forbedrer lægemidlets cytotoksiske virkning via en mekanisme medieret af reaktive iltarter (ROS). Derudover blev brugen af prototypen beskrevet i dette arbejde valideret ved at sammenligne resultaterne med en kommerciel PDT-enhed. Således repræsenterer denne LED-baserede fotodynamiske terapiprototype et godt alternativ til in vitro-undersøgelser af PDT.

Introduction

Blandt de mest dødelige ikke-smitsomme sygdomme udgør kræft en globalt førende årsag til for tidlig død. Det tegnede sig for næsten 10 millioner dødsfald i 2020, hvilket repræsenterer omkring en ud af seks dødsfald på verdensplan1. Derudover udgør multiresistensfænomenet (MDR) en enorm trussel mod folkesundheden, da godkendte kemoterapeutiske protokoller ikke når remissionsstadier for denne kliniske tilstand2. Kræftceller kan udvikle resistens over for kemoterapi gennem flere mekanismer; overekspressionen af nogle ATP-bindende kassettetransportører (ABC) - ATP-afhængige effluxpumper - betragtes imidlertid som hovedårsagen til MDR-udvikling inden for et tumormikromiljø3. Ud over MDR forstærker andre kræftkomplikationer, såsom tilbagefald og metastase, den presserende efterspørgsel efter at udvikle og forbedre terapeutiske tilgange til at overvinde denne onkologiske udfordring.

Den helbredende udnyttelse af lys er blevet praktiseret i århundreder4, og fotodynamisk terapi (PDT) repræsenterer en klinisk godkendt terapeutisk tilgang til solide tumorer. PDT kombinerer administrationen af en fotosensibilisator (PS) efterfulgt af lysbestråling for at generere reaktive iltarter (ROS) for at udøve selektiv cytotoksicitet i tumorceller. Denne terapeutiske tilgang er bedre end konventionelle metoder, herunder kirurgi, stråling og kemoterapi5; Det er en minimalt invasiv teknik, der viser lavere cytotoksicitet i bindevæv6. Den lette anvendelse og PS-akkumulering direkte i tumoren eller dens mikromiljø sikrer præcis målretning og følgelig mindre, uønskede systemiske bivirkninger7 og muligheden for gentagen behandling på samme sted. Desuden er omkostningerne lavere end for andre tilgange. På grund af dets lovende egenskaber kan PDT betragtes som en passende mulighed for både enkelt, især i tilfælde af inoperable tumorer eller adjuverende kræftbehandling7, og repræsenterer et alternativ til MDR relateret til kemoterapi 8,9.

Den første rapport, der viste en høj objektiv responsrate ved hjælp af PDT, blev beskrevet i 1975 i en mus og rotte model10. Siden da er der udført undersøgelser ved hjælp af PDT med positive resultater7 både in vivo og in vitro med humane tumorcellelinjer i 2D-cellekultur11,12. I betragtning af den brede anvendelighed af klinisk godkendt PS, uanset deres specifikke akkumuleringsveje og bølgelængdeområder for absorptionstoppe, er den generelle proces som følger: (i) PS-optagelse, (ii) topning af PS-koncentration ved tumoren eller dens mikromiljø, (iii) lysapplikation, (iv) PS-lysinteraktion, (v) overførsel af PS-exciteret tilstandsenergi til enten vævssubstrat eller omgivende iltmolekyler, (vi) ROS-produktion, der involverer singlet oxygen eller superoxidanion, (vii) tumorcelledød via i det væsentlige nekrose eller apoptose (direkte død), autofagi (cytoprotektiv mekanisme), vævsikæmi (vaskulær skade), immunmodulation eller en overlapning af disse mekanismer7. I denne sidste fase afhænger aktiveringen af en bestemt celledødsvej af mange faktorer, såsom celleegenskaber, eksperimentelt design og vigtigst af alt PS intracellulær lokalisering og PDT-relateret målrettet skade13.

Verteporfin er en anden generation PS, godkendt af regulerende agenturer til klinisk brug i Norge og Kina til behandling af aldersrelateret makuladegeneration7. Efter dosislevering blev dette prodrug rapporteret delvist at akkumulere i mitokondrier14 og inducere cellulært protein tyrosinphosphorylering og DNA-fragmentering, hvilket førte til tumorcelleapoptose15,16. Efter 24 timers inkubation til verteporfin-internalisering anbefales en PDT-protokol ved hjælp af en 690 nm bølgelængdeopsætning for at opnå effektive niveauer af elektromagnetisk strålingsoverførsel til tilstødende molekyler 7,17.

Med hensyn til lyskilden til PDT er de klassiske diodelasersystemer normalt dyre, teknisk komplicerede, overdimensionerede og dermed ubærbare18,19. Som en konsekvens af dens enkeltbølgelængdeprofil, som også kan observeres i LED-baseret PDT-udstyr, gør efterspørgslen efter uafhængige enheder til hver fotosensibilisatorapplikation brugen af diodelasersystemer endnu mere kompleks og økonomisk umulig20,21. Derfor, brugen af LED-maskiner betragtes som det mest lovende alternativ til at løse ikke kun omkostninger22 og vedligeholdelsesproblemer, men også at give høj effekt og mindre skadelig 23 og bredere belysningskapacitet24,25,26,27.

På trods af det potentielle bidrag, som LED-baseret udstyr kan tilbyde til PDT-eksperimenter28, har de fleste kommercielle muligheder stadig ulemper såsom manglende bærbarhed, høje omkostninger og komplekse byggeprojekter og drift29. Hovedformålet med dette arbejde var at tilbyde et enkelt og pålideligt værktøj til in vitro PDT-assays. Dette papir beskriver PhotoACT, en internt bygget LED-baseret PDT-enhed, som er billig, brugervenlig og bærbar. Som et bevis på konceptet er denne enhed vist at forbedre cytotoksiciteten af verteporfin i en 2D-cellekulturmodel og kan derfor bruges som et forskningsværktøj i PDT-eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Se materialetabellen for detaljer relateret til alle materialer, reagenser og software, der bruges i denne protokol.

1. Enhedens konstruktion

  1. Sav 3 mm tykke fiberplader med medium densitet (MDF) for at opnå stykker med de dimensioner, der er vist i figur 1A.
    BEMÆRK: Brug vektorfilen (supplerende fil 1) til cnc-skæring (computer numerical control).
  2. Byg to kasser med følgende dimensioner (længde x bredde x højde): 330 mm x 235 mm x 225 mm til de større kasser og 300 mm x 220 mm x 150 m til de mindre kasser (figur 1B).
  3. Bor bagsiden af den større kasse for at installere et tøndestik. Bor toppen af den større kasse og k toppen og bunden af den mindre kasse for at give en passage til elektriske kabler (figur 1C).
  4. Mal alle indvendige overflader med sort blæk for at fremme homogen lysforekomst (figur 1D).
  5. Fastgør parallelt tre LED-bånd med 10 lysdioder hver på den øverste indvendige overflade af den mindre kasse (figur 1E).
  6. Installer en lysstyrkesensor i midten af den nederste indvendige overflade af den mindre kasse (figur 1F).
  7. Udskriv kontrolenhedens struktur (figur 1G) ved hjælp af 3D-udskrivningsfilen (supplerende fil 2).
  8. Installer alle komponenter (tænd / sluk-knap, potentiometre, tid / start touchpad, lysdioder, lysstyrkesensor, LCD, summer og strømforsyning) ved portene på et ESP32-kontrolkort monteret i styreenhedens indre (figur 2).
  9. Upload programmeringskoden (supplerende fil 3, supplerende fil 4 og supplerende fil 5), og kør en test for at kontrollere, at alle forbindelser fungerer (figur 1H).
  10. Saml kasserne og fastgør dem sammen for at undgå huller og følgelig ekstern lysinterferens og udsendt lystab. Fastgør den monterede styreenhed til det borede område øverst på prototypen (figur 1I).
  11. Fastgør en hoveddør af samme materiale og 330 mm x 225 mm (længde x bredde) dimensioner på den større kasse med to små hængsler. Fastgør også velcrobånd sidelæns til den større kasse for at forstærke prototypelukningen (figur 1J). Installer et håndtag for at manipulere udstyrets hoveddør.
  12. Fastgør fire gummifodpuder i bunden af prototypen for at sikre mere stabilitet under operationerne (figur 1K).

2. Cellelinjer: dyrkning, såning og behandling

  1. Kemikalier
    1. Porfyrinen opløses i dimethylsulfoxid (DMSO) for at opnå en koncentration på 100 mM.
      FORSIGTIG: DMSO skal manipuleres omhyggeligt (håndtering ved brug af personlige værnemidler og i et ventileret område). Manipuler både lager og fortyndede opløsninger omhyggeligt for at undgå overdreven lyseksponering.
  2. Cellelinjer
    1. Dyrk HeLa-cellelinjen i Dulbeccos Modificerede Eagle's Medium (DMEM) lavglukosemedium suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% gentamicin.
    2. Kulturkolberne opbevares i en 5% CO2 cellekulturinkubator ved 37 °C.
    3. Administrer og inspicer cellerne, indtil de når 80% -90% sammenløb.
  3. Såning proces
    1. Fjern dyrkningsmediet fra kolben.
    2. Vask cellemonolaget med PBS.
    3. Afmonter den sammenflydende cellekultur med trypsin-EDTA (0,5%) 1x i 5 minutter ved 37 °C. Stop virkningen af trypsin ved at resuere cellerne med kulturmedium suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% gentamicin.
    4. Tæl de resuspenderede celler med et hæmocytometer og frø dem i en 96-brøndplade ved 2,0 × 104 celler / brønd.
    5. Forbered to plader til mørke og lyse forhold.
    6. Inkuber pladerne i 24 timer til cellefastgørelse.
  4. Behandlingsproces
    1. Fjern mediet fra begge 96-brøndplader.
    2. Behandl cellerne med 100 μL stigende koncentrationer af verteporfin (0,045 til 24 μM, seriel fortynding).
    3. Inkuber cellerne med lægemiddelbehandling i 24 timer for at tillade internalisering af verteporfin.
    4. Efter 24 timer kasseres det medium, der indeholder lægemidlet, vaskes monolaget af celler med PBS (100 μL), og der tilsættes lægemiddelfrit medium (100 μL).
    5. Dæk en mikroplade med aluminiumsfolie for at beskytte den mod lyseksponering og inkuber den i 24 timer. Denne plade giver kontroldata for PDT-resultater (mørk tilstand). Den anden mikroplade vil blive brugt på lyseksponeringstilstanden i enheden.

3. Betjening af enheden

  1. Sæt PDT-enheden i stikkontakten, og tænd den ved at trykke på tænd / sluk-knappen .
  2. Placer den anden mikroplade (lystilstand) i PDT-enheden, og luk udstyret ved at fastgøre hoveddøren med velcrobåndene.
  3. Brug potentiometre til at justere RGB-konfigurationen (et RGB 255, 255 , 255 eksperiment her) og indstil farven på lysemission.
    BEMÆRK: Hver RGB-kombination har et specifikt emissionsspektrum, som skal justeres til eksperimenter med forskellige fotosensibilisatorer og følgelig forskellige absorbanskurver.
  4. Tryk på (+)/(-) touchpad'en for at justere tidskonfigurationen (et 60 minutters eksperiment her) og indstille varigheden af analysen.
    BEMÆRK: Tidskonfigurationen i forbindelse med bestrålingsværdien bestemmer processens fluens - den lette dosis, der anvendes i analysen.
  5. Kontroller opsætningsoplysningerne på displayet.
  6. Tryk på Start-knappen for at starte analysen. Sørg for, at der høres en en-bip buzzer i begyndelsen af analysen.
  7. I løbet af eksperimentet skal du observere realtidsinformation på displayet, såsom bestråling og tid tilbage.
  8. Åbn ikke hoveddøren, og du må ikke ændre konfiguration under PDT-analysen.
  9. I slutningen af analysen skal du vente på en fire-bip summer og på, at det elektroniske system slukker for alle lysdioder. Overhold en færdig besked og den endelige mængde energi, der er brugt - fluens - under eksperimentet i displayet.
    BEMÆRK: Den endelige fluenceværdi beregnes ved hjælp af ligning (1):
    Equation 1 (1)
    Hvor F er lig med J/cm 2 og I er lig med mW/cm 2 eller mJ/s·cm 2. Bestrålingsværdien tager hensyn til lysdiodernes styrke (emitterende kilde) og det ensartet bestrålede område af det mørke kammer (660 cm 2) (ligning [2]):
    Equation 2 (2)
    Den teoretiske bestrålingsværdi vises på enhedens display gennem hele PDT-analysen. Ved afslutningen af operationen skal du bruge ligning (3) til at beregne fluensen:
    Fluens (F) = bestråling (I, konstant værdi) × driftstid(er) (3)

4. Analyse af cellelevedygtighed

  1. Efter PDT-analysen skal du dække mikropladen, der blev udsat for lys og inkubere i 24 timer.
  2. Efter inkubationsperioden fjernes kulturmediet fra begge plader, monolaget af celler vaskes med PBS (100 μL), og der tilsættes MTT-opløsning (0,5 mg/ml, 100 μL). Inkuber begge plader - mørke og lyse forhold - i 4 timer for at muliggøre dannelse af formazankrystaller.
  3. MTT-opløsningen fjernes forsigtigt, og de lilla krystaller opløses med en DMSO/ethanolopløsning (1:1).
  4. Efter fuldstændig opløsning af krystallerne udføres absorbansmålingen ved hjælp af en mikropladelæser ved 595 nm.
    BEMÆRK: Enheden kan bruges i andre vigtige eksperimenter såsom ROS-medieret celledød udløst af fotosensibilisatorer efter lyseksponering ved flowcytometri30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den endelige PDT-enhed, kaldet PhotoACT, omfattede et mørkt kammer til at tildele op til fire multiwell-mikroplader med sin øvre indvendige overflade udstyret med et sæt af 30 spredte lysdioder programmeret til at udsende forskellige spektrum af synligt lys (figur 3 og supplerende fil 6). Enheden blev bygget ved hjælp af to tilknyttede kasser: en intern boks designet som et mørkt kammer til PDT-assays og en ekstern boks til at dække det indre kammer og holde kontrolenheden (figur 1B). Den indvendige boks blev malet sort (figur 1D) og sammensat af en båndmodel af LED RGB WS2812 (eller WS281B) med 30 lysdioder og med 1 m længde (som senere blev skåret i tre stykker) og 9 watt, som indeholder en indbygget processor. Dette apparat tillod en mere kontrolleret udnyttelse og følgelig mere præcis farveemission. De 30 lysdioder blev ligeligt fordelt over hele PDT-kammerets øvre indvendige overflade med tre parallelle bånd med 10 lysdioder hver (figur 1E). En homogen lysforekomst blev etableret på grund af den lave reflektivitet af de sorte indvendige overflader og den ensartede fordeling af LED-konfiguration. En TSL2561 lysstyrkesensor blev også indbygget i det nederste centrum af den interne boks for at indikere lysforekomsten og fungere som et kvalitetskontrolværktøj, der garanterer bestrålingsensartethed inde i det mørke kammer (supplerende tabel S1) og overvåger LED-systemets effekt, som vides at have et vist antal timers levetid (figur 1F ). Den eksterne kasse er en struktur, der dækker den indvendige kasse, sammensat af seks MDF-dele, malet grå og laserskåret for en perfekt pasform (figur 1A, B). Styreenheden blev designet ved hjælp af online software31, 3D printet med polymælkesyre som en enkelt del ved hjælp af en 3D-printer og malet grå. Den indeholder alle elektronikkomponenter, inklusive et display, potentiometre, knapper og en summer (figur 1I og figur 2).

For at muliggøre uafhængige justeringer af lysindfaldet blev ESP32-kontrolkortet valgt til at integrere styreenheden (figur 2). Denne konfiguration skal tillade en USB-grænseflade til programmering, bluetooth, Wi-Fi, dual core-processor, adskillige porte og muligheden for at kommunikere med et interintegreret kredsløb (I2C), en seriel perifer grænseflade (SPI) og andre grænseflader. For at betjene systemet blev der skrevet et program på C-sprog gennem et integreret udviklingsmiljø (IDE). Kodestrukturen32 er baseret på FreeRTOS, et gratis driftssystem i realtid understøttet af ESP32 controller board. Den henviste logik tillader uafhængig applikationsprogrammering, som kan behandles af ESP32 i echeloned eller parallelle tilgange, hvilket gør projektet og dets vedligeholdelses-, forbedrings- og opdateringsprocesser meget mere alsidige og sikre.

Grænsefladen mellem maskinen og operatøren er brugervenlig og bestod af et LCD-display (liquid crystal display), potentiometre, knapper og en summer (figur 3 og supplerende fil 6). Den lille LCD-skærm på 16 mm x 2 mm (kolonner vs. linjer) havde en indbygget HD44780-controller med en I2C-kommunikationsprotokol, som giver henholdsvis nem installation og transmissionsalsidighed. Den foreløbige opsætning inkluderer RGB og tidsjusteringer af operatøren. Lysstørrelsen og farvekonfigurationen kan justeres ved hjælp af potentiometre, som ændrer intensiteten (0 til 255) af de tre grundlæggende farvekomponenter-RGB. Disse justeringer kan resultere i flere farvesammensætninger, der behandles i den internationale RGB-farvetabel33. Hver RGB-sammensætning ejer en bestemt bølgelængde, som skal justeres i henhold til den PS, der blev brugt i PDT-eksperimentet; PS's absorbanskurve og bestrålingens bølgelængde skal overlappes, for at fotoaktiveringen kan ske tilfredsstillende (supplerende figur S1). Undervejs i processen kan driftsstatus med den tid, der er tilbage, og oplysninger om lysforekomst tilgås på LCD-skærmen.

Ved afslutningen af den programmerede tid slukkede elektroniksystemet alle lysdioder, udsendte en hørbar advarsel og viste på displayet den samlede mængde energi pr. Areal (J / cm²), som blev beregnet ved at gange den konstante værdi af bestråling med driftstiden i sekunder. Denne digitale model præsenterede en bred vifte af detektionsniveauer (grænser mellem 0,1 og 40,000+ lux), en I2C-grænseflade og en lav intensitet af elektrisk strøm (henholdsvis 0,5 mA og 15 μA i drift og standbystatus).

Som et bevis på konceptet blev enheden brugt til at forbedre den cytotoksiske virkning af verteporfin i 2D HeLa-cellekultur efter lyseksponering på 1 time (49,1 ± 0,6 J / cm2). Som vist i figur 4A var GI50-værdien 3,1 μM for lystilstanden og 13,8 μM for den mørke tilstand. Således validerede 4,4-foldsskiftet, der sammenlignede betingelserne, brugen af verteporfin som PS og anvendeligheden af PhotoACT til PDT-assays. For at validere brugen af prototypen beskrevet i dette arbejde blev en kommerciel PDT-enhed brugt under de samme eksperimentelle betingelser, herunder en PS, celler og fluens, og resultaterne sammenlignede. Som vist i figur 4B fotoaktiverede begge enheder verteporfin ens, hvilket forbedrede den cytotoksiske virkning. Disse resultater bekræftede anvendeligheden af dette i husbygget PDT-enhed (figur 4A, B). Endelig blev den ROS-medierede celledød udløst af verteporfin efter lyseksponering bekræftet ved flowcytometri ved anvendelse af DCFDA-assay (figur 4C, D).

Figure 1
Figur 1: PhotoACT konstruktions- og monteringsvejledning. Detaljeret illustration af konstruktionen af, boring, maling, montering og tilbehør af komponenter i enheden. Panelet viser en trinvis vejledning til opbygning af enheden. Forkortelse: LED = lysemitterende diode. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Styreenhedens konstruktion og elektroniske installationsvejledning. Zoomet ind visning tegning af eksploderet styreenhed og detaljeret skema af elektroniske forbindelser på ESP32 controller board porte med forbindelser og komponenter, der anvendes i prototypen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: PhotoACT repræsentation. Monteringstegning af det endelige produktdesign med stykliste, mærkningsballoner og detaljeret visning af de øverste indvendige lysdioder. Figuren gør det muligt at identificere dele og komponenter i prototypen. Forkortelser: MDF = fiberplader med medium densitet; LED = lysemitterende diode. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: In vitro fototoksicitet af verteporfin og ROS generation. (A,B) Cellelevedygtighedsanalyse udført ved hjælp af MTT-metoden: Assays blev udført for at evaluere den cytotoksiske profil af fotosensibilisatorhvirvlen ved forskellige koncentrationer. HeLa-celler blev behandlet i 24 timer med forskellige koncentrationer af verteporfin (0,045-24 μM), udsat for lys (PhotoACT (A) eller kommercielt PDT-udstyr (B)) eller mørke forhold og derefter udsat for MTT-assayet. Begge betingelser viste en nedsat cellelevedygtighed ved højere koncentrationer af verteporfin, men lyseksponeringen - opnået fra PDT-assays - forbedrede den cytotoksiske profil af PS, hvilket indebærer, at PDT forbedrer cytotoksiciteten af verteporfin. Levedygtighedskurverne blev monteret ved hjælp af GraphPad Prism 6-software. (C,D) HeLa-celler blev behandlet i 24 timer med lave og høje koncentrationer af verteporfin (0,187 μM og 6 μM) og derefter udsat for lys (PhotoACT) eller mørke forhold. Intracellulære ROS-niveauer blev målt efter bestråling ved flowcytometri ved hjælp af DCFDA-sonde (inkubation i 30 minutter ved 1 μM). Et højreskift mellem histogrammerne indebar højere fluorescensintensitet på grund af en højere intracellulær akkumulering af DCF og dermed større ROS-niveauer. Resultaterne viste ingen relevant forskel i ROS-niveauer i mørk tilstand (C), men viste en dosis-respons-stigning i ROS-niveauer efter verteporfinfotoaktivering (D). Forkortelser: ROS = reaktive iltarter; DCF = 2',7'-dichlorfluorescein; DCFDA = 2',7'-dichlorhydrofluoresceindiacetat. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Enhedens beslutningsflowdiagram: foreløbig opsætning og fejlfinding. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur S1: Overlapning mellem absorbanskurven for verteporfin og enhedens LED-emissionsspektrum. Absorptionsspektrum af verteporfin med dets specifikke absorbanstoppe (x,y') og LED-emissionsspektrum på RGB 255, 255, 255-hvid farve (3,700K-5,000K CCT) brugt til at fotoaktivere fotosensibilisatoren (x,y''). Overlapningen mellem de forskellige absorbanstoppe af verteporfin og det hvide bestrålingslys bekræfter fotoaktiveringen af fotosensibilisatoren, hvilket også blev bekræftet af de biologiske resultater. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel S1: Ensartethedstest for bestråling. Øjeblikkelig lysstyrke (lumen) målt af lysstyrkesensoren på forskellige punkter i det bestrålede område. De præsenterede resultater viser ingen ekspressiv variation, som attesterer den ensartede bestråling af enheden. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 1: Vektorfil til skæring. Tegning (DWG) fil til MDF board skæring. Filen skal bruges til computer numerisk kontrol (CNC) skæring. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: 3D-udskrivningsfil af enhedskontrollens. Stereolitografi (STL) fil til 3D-udskrivning af enhedens styreenhed. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 3: C programmeringskode. Programmeringskode udviklet på C-sprog til konfiguration af udstyrets styreenhed. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 4: INO-programmeringskode. Programmeringskode udviklet på INO-sprog til konfiguration af udstyrets styreenhed. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 5: Kompileringsinstruktioner. Markdown (MD) "LÆS MIG" fil med yderligere instruktioner til programmering af kodekompilering. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 6: Designmodel af enheden. Eksempel på den tredimensionelle modelfil Standard for udveksling af produktdata (STEP) til generel visualisering af prototypen. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den endelige PhotoACT-enhed var praktisk at konstruere med kommercielt tilgængelige, billige komponenter til en samlet pris på mindre end $ 50. Yderligere fordele omfatter lave vedligeholdelseskrav, kapacitet til at bestråle flere typer kulturplader, samtidig brug af op til fire enheder pr. assay, lav vægt (2 kg)/størrelse (44 cm3), der muliggør bærbarhed, nøjagtig og reproducerbar bestråling (data ikke vist) og en brugervenlig og enkel opsætningsgrænseflade, der ikke kræver forbindelse til computere eller andre maskiner.

Visse kritiske trin i både konstruktions- og driftsprotokoller gav anledning til forbedringsmuligheder under projektudformningen. Da et PDT-kammer kræver homogen lysemission og ensartet energimåling, blev de indvendige og eksterne kasser forseglet for at undgå både udvendig lysinterferens og udsendt lystab. Yderligere velcrobånd blev fastgjort sidelæns på frontdøren for at forstærke kammerlukningen og sikre uafbrudte eksperimenter. En repræsentativ LED blev installeret ved styreenheden for at certificere den krævede RGB-konfiguration, der angiver farven og intensiteten af det udsendte lys under analysen. Endelig gennemgik programmeringskoden flere opgraderinger for at forfine øjeblikkelige densitetsmålinger og endelige mængder energievalueringer, der godkendte reproducerbarhed og matematisk konsistens. Nogle andre vigtige detaljer, der kræver ekstra opmærksomhed, inkluderer: (i) homogen fordeling af lysdioder og central positionering af lysstyrkesensoren for at opnå repræsentative og afbalancerede resultater, (ii) installation af alle komponenter i henhold til det elektroniske diagram (figur 2) og programmeringskode (supplerende fil 3, supplerende fil 4 og supplerende fil 5 ) for at sikre korrekt drift og (iii) opsætningen (bevarer den samme RGB- og tidskonfiguration), før du kører et eksperiment for at sikre ensartede replikater med pålidelige resultater. Selvom RGB-systemet giver flere synlige farvesammensætninger med specifikke bølgelængder, ville eksperimenter med ikke-synligt lys kræve specifikke protokolopgraderinger. Et beslutningsflowdiagram er vist i figur 5 for at give en systematisk problemløsningsmetode til at finde og rette problemer eller fejl under operationen.

PhotoACT er designet til at imødekomme kravene til in vitro-eksperimenter med validerede resultater opnået med terapeutisk aktivering af verteporfin for at inducere cytotoksicitet i 2D HeLa-celler (figur 4) og kan anbefales til universiteter, skoler, industrier og andre forskningscentre. Denne enhed bør udvide fordelene ved PDT til videnskabelig forskning, der udforsker virkningsmekanismen for fotosensibilisatorer og deres kliniske anvendelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Vi takker Arthur Henrique Gomes de Oliveira og Lucas Julian Cruz Gomes for at hjælpe med filmprocessen. Dette projekt blev støttet af det brasilianske forskningsråd (CNPq, tilskudsnumre 400953/2016-1-404286/2021-6) og Fundação Araucária-PPSUS 2020/2021 (SUS2020131000003). Denne undersøgelse blev også delvist finansieret af Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5% Trypsin-EDTA (10x) Gibco 15400054 Mammalian cell culture dissociation reagent
3D printer Flashforge Finder model
96-well plates Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture
Arduino
Brightness sensor TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface
Buttons
Buzzer
Cell culture Flasks Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes)
Centrifuge Tubes Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay
CO2 Incubator
Controller board ESP32
Design Software Trimble SketchUp
DMEM High Glucose Gibco 11965092 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells.
DMSO Sigma-Aldrich D4540-500ML Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% (GC), suitable for plant cell culture
Fetal Bovine Serum  Gibco 12657029 FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages.
Gentamicin (50 mg/mL) Gibco 15750060 Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination
Hemocytometer Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay
Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED
Laminar Flow Hood Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures
LCD display
LED RGB WS2812 5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts
MDF fiberboards 3mm thickness medium-density fiberboards
Microcentrifuge Tubes Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay
Microplate reader ThermoFischer Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation.
MTT Reagent Invitrogen M6494 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays
Operational System Real Time Engineers ltd. FreeRTOS
P10 micripipette Non-electronic, single-channel, 1-10 μL capacity
P1000 micropipette Non-electronic, single-channel, 10-1000 μL capacity
P200 micropipette Non-electronic, single-channel, 20-200 μL capacity
PDT Equipment LumaCare Model LC-122
Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 Gibco 10010031 Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures
Potentiometers
Tips Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 μL maximum volumes
Verteporfin Sigma-Aldrich SML0534-5MG Verteporfin, ≥94% (HPLC)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ferlay, J., et al. International agency for research on cancer. Global Cancer Observatory: Cancer Today. 23 (7), https://gco.iarc.fr/today/home 323-326 (2018).
  2. Gottesman, M. M., Fojo, T., Bates, S. E. Multidrug resistance in cancer: role of Atp-dependent transporters. Nature Reviews Cancer. 2 (1), 48-58 (2002).
  3. Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Boothe-Genthe, C., Gottesman, G. A. Targeting multidrug resistance in cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 219-234 (2006).
  4. Ackroyd, R., Kelty, C., Brown, N., Reed, M. The history of photodetection and photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 74 (5), 656-669 (2001).
  5. Hamblin, M. R. Photodynamic therapy for cancer: what's past is prologue. Photochemistry and Photobiology. 96 (3), 506-516 (2020).
  6. Barr, H., et al. The contrasting mechanisms of colonic collagen damage between photodynamic therapy and thermal injury. Photochem Photobiol. 46 (5), 795-800 (1987).
  7. Algorri, J. F., Ochoa, M., Roldán-Varona, P., Rodríguez-Cobo, L., López-Higuera, J. M. Photodynamic therapy: A compendium of latest reviews. Cancers. 13 (17), 4447 (2021).
  8. Aniogo, E. C., Plackal, B., George, B. P. A., Abrahamse, H. The role of photodynamic therapy on multidrug resistant breast cancer. Cancer Cell International. 19, 91 (2019).
  9. Spring, B. Q., Rizvi, I., Xu, N., Hasan, T. The role of photodynamic therapy in overcoming cancer drug resistance. Photochemical & Photobiological Sciences. 14 (8), 1476-1491 (2015).
  10. Dougherty, T. J., Grindey, G. B., Fiel, R., Weishaupt, K. R., Boyle, D. G. Photoradiation therapy. II. Cure of animal tumors with hematoporphyrin and light. Journal of the National Cancer Institute. 55 (1), 115-121 (1975).
  11. Etcheverry, M. E., Pasquale, M. A., Garavaglia, M. Photodynamic therapy of HeLa cell cultures by using LED or laser sources. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 160, 271-277 (2016).
  12. Guo, Q., Dong, B., Nan, F., Guan, D., Zhang, Y. 5-Aminolevulinic acid photodynamic therapy in human cervical cancer via the activation of microRNA-143 and suppression of the Bcl-2/Bax signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 14 (1), 544-550 (2016).
  13. Mroz, P., Yaroslavsky, A., Kharkwal, G. B., Hamblin, M. R. Cell death pathways in photodynamic therapy of cancer. Cancers. 3 (2), 2516-2539 (2011).
  14. Mahalingam, S. M., Ordaz, J. D., Low, P. S. Targeting of a photosensitizer to the mitochondrion enhances the potency of photodynamic therapy. ACS Omega. 3 (6), 6066-6074 (2018).
  15. Granville, D. J., Levy, J. G., Hunt, D. W. C. Photodynamic treatment with benzoporphyrin derivative monoacid ring A produces protein tyrosine phosphorylation events and DNA fragmentation in murine P815 cells. Photochemistry and Photobiology. 67 (3), 358-362 (1998).
  16. Castano, A. P., Demidova, T. N., Hamblin, M. R. Mechanisms in photodynamic therapy: part two - cellular signaling, cell metabolism and modes of cell death. Photodiagnosis Photodynamic Therapy. 2 (1), 1-23 (2014).
  17. Detty, M. R., Gibson, S. L., Wagner, S. J. Current clinical and preclinical photosensitizers for use in photodynamic therapy. Journal of Medicinal Chemistry. 47 (16), 3897-3915 (2004).
  18. Allison, R. R. Photodynamic therapy: oncologic horizons. Future Oncology. 10 (1), 123-142 (2014).
  19. Chepurna, O., et al. Photodynamic therapy with laser scanning mode of tumor irradiation. Optical Fibers and Their Applications 2015. 9816, 323-326 (2015).
  20. Huang, Z. A review of progress in clinical photodynamic therapy. Technology in Cancer Research and Treatment. 4 (3), 283-293 (2005).
  21. Chepurna, O., et al. LED-based portable light source for photodynamic therapy. Optics in Health Care and Biomedical Optics. 11190, 109-115 (2019).
  22. Hasson, O., Wishkerman, A. CultureLED: A 3D printer-based LED illumination cultivation system for multi-well culture plates. HardwareX. 12, 00323 (2022).
  23. Wu, X., et al. Localised light delivery on melanoma cells using optical microneedles. Biomedical Optics Express. 13 (2), 1045-1060 (2022).
  24. Erkiert-Polguj, A., Halbina, A., Polak-Pacholczyk, I., Rotsztejn, H. Light-emitting diodes in photodynamic therapy in non-melanoma skin cancers-own observations and literature review. Journal of Cosmetic and Laser Therapy. 18 (2), 105-110 (2016).
  25. Neupane, J., Ghimire, S., Shakya, S., Chaudhary, L., Shrivastava, V. P. Effect of light emitting diodes in the photodynamic therapy of rheumatoid arthritis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 7 (1), 44-49 (2010).
  26. Lins, E. C., et al. A novel 785-nm laser diode-based system for standardization of cell culture irradiation. Photomedicine and Laser Surgery. 31 (10), 466-473 (2013).
  27. Hopkins, S. L., et al. An In vitro cell irradiation protocol for testing photopharmaceuticals and the effect of blue, green, and red light on human cancer cell lines. Photochemical and Photobiological Sciences. 15 (5), 644-653 (2016).
  28. Zhang, K., Waguespack, M., Kercher, E. M., Spring, B. Q. An automated and stable LED array illumination system for multiwell plate cell culture photodynamic therapy experiments. Research Square. , 1-18 (2022).
  29. Gálvez, E. N., et al. Analysis and evaluation of the operational characteristics of a new photodynamic therapy device. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 37, 102719 (2022).
  30. Bretin, L., et al. Photodynamic therapy activity of new human colorectal cancer. Cancers. 11 (10), 1474 (2019).
  31. T. SketchUp. , Available from: https://www.sketchup.com/ (2022).
  32. LCDR PhotoDynamic Therapy (PDT) Equipment Repository. GitHub, Inc. , Available from: https://github.com/PhotoDynamicTherapy (2022).
  33. W3C CSS Color Module Level 3. W3C, Inc. , Available from: https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB (2022).

Tags

Biokemi udgave 191
En internt bygget og lysdiodebaseret fotodynamisk terapianordning til forbedring af verteporfincytotoksicitet i en 2D-cellekulturmodel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zanzarini, I. d. S., Barbosa, G.,More

Zanzarini, I. d. S., Barbosa, G., Prado, L. d. O., Zattoni, I. F., Da Paz, G., Prado, A. L. d., Volanski, W., Lavarda, M. D., Rego, F. G. d. M., Picheth, G., Moure, V. R., Valdameri, G. An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model. J. Vis. Exp. (191), e64391, doi:10.3791/64391 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter