Summary
Hier beschrijven we een nieuw, eenvoudig en goedkoop apparaat om met succes in vitro fotodynamische therapie (PDT) -testen uit te voeren met behulp van tweedimensionale HeLa-celcultuur en verteporfine als een fotosensitizer.
Abstract
Dit artikel beschrijft een nieuw, eenvoudig en goedkoop apparaat om in vitro fotodynamische therapie (PDT) assays uit te voeren, genaamd de PhotoACT. Het apparaat is gebouwd met behulp van een set conventionele programmeerbare lichtgevende diodes (LED's), een LCD-module (Liquid Crystal Display) en een lichtsensor die is aangesloten op een commercieel microcontrollerbord. De doosgebaseerde structuur van het prototype is gemaakt met vezelplaten met gemiddelde dichtheid (MDF's). Het interne compartiment kan tegelijkertijd vier celkweek multiwell microplaten toewijzen.
Als proof of concept bestudeerden we het cytotoxische effect van de photosensitizer (PS) verteporfine tegen de HeLa cellijn in tweedimensionale (2D) cultuur. HeLa-cellen werden behandeld met toenemende concentraties verteporfine gedurende 24 uur. Het geneesmiddelbevattende supernatantmedium werd weggegooid, de aanhangende cellen werden gewassen met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en medicijnvrij medium werd toegevoegd. In deze studie werd het effect van verteporfine op cellen onderzocht zonder blootstelling aan licht of na blootstelling gedurende 1 uur aan licht met behulp van rood-groen-blauwe (RGB) waarden van 255, 255 en 255 (gemiddelde fluence van 49,1 ± 0,6 J / cm2). Na 24 uur werd de levensvatbaarheid van de cel beoordeeld met de 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT)-test.
Experimentele resultaten toonden aan dat blootstelling van cellen behandeld met verteporfine aan het licht van het apparaat het cytotoxische effect van het medicijn verbetert via een mechanisme gemedieerd door reactieve zuurstofsoorten (ROS). Bovendien werd het gebruik van het prototype dat in dit werk wordt beschreven gevalideerd door de resultaten te vergelijken met een commercieel PDT-apparaat. Dit op LED gebaseerde prototype van fotodynamische therapie is dus een goed alternatief voor in vitro studies van PDT.
Introduction
Onder de meest dodelijke niet-overdraagbare ziekten vertegenwoordigt kanker een wereldwijd toonaangevende oorzaak van vroegtijdig overlijden. Het was goed voor bijna 10 miljoen sterfgevallen in 2020, wat neerkomt op ongeveer een op de zes sterfgevallen wereldwijd1. Bovendien vormt het fenomeen multidrugresistentie (MDR) een enorme bedreiging voor de volksgezondheid, omdat goedgekeurde chemotherapeutische protocollen de remissiestadia voor deze klinische aandoening niet bereiken2. Kankercellen kunnen resistentie tegen chemotherapie ontwikkelen via verschillende mechanismen; de overexpressie van sommige ATP-binding cassette (ABC) transporters - ATP-afhankelijke effluxpompen - wordt echter beschouwd als de belangrijkste oorzaak van MDR-ontwikkeling binnen een tumormicro-omgeving3. Naast MDR versterken andere kankercomplicaties, zoals recidief en metastase, de dringende vraag om therapeutische benaderingen te ontwikkelen en te verbeteren om deze oncologische uitdaging te overwinnen.
Het curatieve gebruik van licht wordt al eeuwenlang beoefend4, en fotodynamische therapie (PDT) vertegenwoordigt een klinisch goedgekeurde therapeutische benadering voor solide tumoren. PDT combineert de toediening van een fotosensitizer (PS) gevolgd door lichte bestraling om reactieve zuurstofsoorten (ROS) te genereren om selectieve cytotoxiciteit in tumorcellen uit te oefenen. Deze therapeutische benadering is superieur aan conventionele methoden, waaronder chirurgie, bestraling en chemotherapie5; het is een minimaal invasieve techniek die een lagere cytotoxiciteit in bindweefsels laat zien6. De lichte toepassing en PS-accumulatie direct in de tumor of zijn micro-omgeving zorgen voor nauwkeurige targeting en bijgevolg kleine, ongewenste systemische bijwerkingen7 en de mogelijkheid van herhaalde behandeling op dezelfde plaats. Bovendien zijn de kosten lager dan die van andere benaderingen. Vanwege de veelbelovende kenmerken kan PDT worden beschouwd als een geschikte optie voor zowel enkelvoudige, vooral in het geval van inoperabele tumoren, als adjuvante kankerbehandeling7, en vertegenwoordigt het een alternatief voor MDR gerelateerd aan chemotherapie 8,9.
Het eerste rapport met een hoge objectieve respons met PDT werd in 1975 beschreven in een muis en rat model10. Sindsdien zijn studies uitgevoerd met PDT met positieve uitkomsten7 zowel in vivo als in vitro met menselijke tumorcellijnen in 2D-celcultuur11,12. Gezien de brede toepasbaarheid van klinisch goedgekeurde PS, ongeacht hun specifieke accumulatieroutes en golflengtebereiken van absorptiepieken, is het algemene proces als volgt: (i) PS-opname, (ii) pieken van PS-concentratie bij de tumor of zijn micro-omgeving, (iii) lichttoepassing, (iv) PS-lichtinteractie, (v) overdracht van PS-opgewekte energie naar weefselsubstraat of omringende zuurstofmoleculen, (vi) ROS-productie met singletzuurstof- of superoxide-anion, vii) tumorceldood via, in wezen, necrose of apoptose (directe dood), autofagie (cytoprotectief mechanisme), weefselischemie (vasculaire schade), immuunmodulatie of een overlapping van deze mechanismen7. In deze laatste fase hangt de activering van een specifieke celdoodroute af van vele factoren, zoals celkenmerken, experimenteel ontwerp en, belangrijker nog, PS intracellulaire lokalisatie en PDT-gerelateerde gerichte schade13.
Verteporfine is een ps van de tweede generatie, goedgekeurd door regelgevende instanties voor klinisch gebruik in Noorwegen en China voor de behandeling van leeftijdsgebonden maculaire degeneratie7. Na toediening van de dosis werd gemeld dat dit prodrug zich gedeeltelijk ophoopte in mitochondriën14 en cellulaire eiwit tyrosinefosforylering en DNA-fragmentatie induceerde, wat leidde tot tumorcelapoptose 15,16. Na 24 uur incubatie voor verteporfine internalisatie, wordt een PDT-protocol met behulp van een 690 nm golflengte-opstelling aanbevolen om effectieve niveaus van elektromagnetische stralingsoverdracht naar aangrenzende moleculen te bereiken 7,17.
Wat de lichtbron voor PDT betreft, zijn de klassieke diodelasersystemen meestal duur, technisch ingewikkeld, oversized en dus niet overdraagbaar18,19. Als gevolg van het profiel met één golflengte, dat ook kan worden waargenomen in LED-gebaseerde PDT-apparatuur, maakt de vraag naar onafhankelijke eenheden voor elke fotosensitizertoepassing het gebruik van diodelasersystemen nog complexer en economisch onhaalbaar20,21. Daarom wordt het gebruik van LED-machines beschouwd als het meest veelbelovende alternatief om niet alleen kosten22 en onderhoudsproblemen op te lossen, maar ook om een hoog vermogen en minder schadelijk23 en een breder verlichtingsvermogente bieden 24,25,26,27.
Ondanks de potentiële bijdrage die LED-gebaseerde apparatuur kan bieden aan PDT-experimenten28, hebben de meeste commerciële opties nog steeds nadelen, zoals een gebrek aan draagbaarheid, hoge kosten en complexe bouwprojecten en exploitatie29. Het belangrijkste doel van dit werk was om een eenvoudig en betrouwbaar hulpmiddel te bieden voor in vitro PDT-testen. Dit artikel beschrijft PhotoACT, een in eigen huis gebouwd LED-gebaseerd PDT-apparaat, dat goedkoop, gebruiksvriendelijk en draagbaar is. Als proof of concept is aangetoond dat dit apparaat de cytotoxiciteit van verteporfine in een 2D-celkweekmodel verbetert en daarom kan het worden gebruikt als een onderzoeksinstrument in PDT-experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Zie de tabel met materialen voor meer informatie over alle materialen, reagentia en software die in dit protocol worden gebruikt.
1. Constructie van het apparaat
- Zaag 3 mm dikke vezelplaten met gemiddelde dichtheid (MDF) om stukken te verkrijgen met de afmetingen die zijn aangegeven in figuur 1A.
OPMERKING: Gebruik het vectorbestand (aanvullend bestand 1) voor CNC-snijden (computer numerical control). - Bouw twee dozen met de volgende afmetingen (lengte x breedte x hoogte): 330 mm x 235 mm x 225 mm voor de grotere dozen en 300 mm x 220 mm x 150 m voor de kleinere dozen (figuur 1B).
- Boor de achterkant van de grotere doos om een barrel jack-connector te installeren. Boor de bovenkant van de grotere doos en de boven- en onderkant van de kleinere doos om een doorgang te bieden voor elektrische kabels (figuur 1C).
- Verf alle interne oppervlakken met zwarte inkt om een homogene lichtinval te bevorderen (figuur 1D).
- Bevestig parallel drie LED-tapes met elk 10 LED's aan het bovenste binnenoppervlak van de kleinere doos (figuur 1E).
- Installeer een helderheidssensor in het midden van het onderste binnenoppervlak van de kleinere doos (figuur 1F).
- Druk de structuur van de besturingseenheid (figuur 1G) af met behulp van het 3D-afdrukbestand (aanvullend bestand 2).
- Installeer alle componenten (aan/uit-knop, potentiometers, tijd/start touchpad, LED's, helderheidssensor, LCD, zoemer en voeding) op de poorten van een ESP32-besturingskaart die aan de binnenkant van de besturingseenheid is gemonteerd (figuur 2).
- Upload de programmeercode (aanvullend bestand 3, aanvullend bestand 4 en aanvullend bestand 5) en voer een test uit om te controleren of alle verbindingen werken (figuur 1H).
- Monteer de dozen en bevestig ze aan elkaar om gaten te voorkomen, en bijgevolg externe lichtinterferentie en uitgestraald lichtverlies. Bevestig de gemonteerde besturingseenheid aan het geboorde gebied aan de bovenkant van het prototype (figuur 1I).
- Bevestig een voordeur van hetzelfde materiaal en 330 mm x 225 mm (lengte x breedte) afmetingen op de grotere doos met twee kleine scharnieren. Bevestig ook klittenband opzij aan de grotere doos om de prototypesluiting te versterken (figuur 1J). Installeer een handgreep om de voordeur van de apparatuur te manipuleren.
- Bevestig vier rubberen voetkussens aan de onderkant van het prototype om meer stabiliteit tijdens de bewerkingen te garanderen (figuur 1K).
2. Cellijnen: teelt, zaaien en behandeling
- Chemicaliën
- Los de porfyrine op in dimethylsulfoxide (DMSO) om een concentratie van 100 mM te bereiken.
LET OP: DMSO moet zorgvuldig worden gemanipuleerd (hanteren met behulp van persoonlijke beschermingsmiddelen en in een geventileerde ruimte). Manipuleer zowel voorraad als verdunde oplossingen zorgvuldig om overmatige blootstelling aan licht te voorkomen.
- Los de porfyrine op in dimethylsulfoxide (DMSO) om een concentratie van 100 mM te bereiken.
- Cellijnen
- Kweek de HeLa cellijn in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) laag-glucose medium aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% gentamicine.
- Bewaar de kweekkolven in een 5% CO2 cel kweekincubator bij 37 °C.
- Beheer en inspecteer de cellen totdat ze 80% -90% samenvloeiing bereiken.
- Zaaiproces
- Haal het kweekmedium uit de kolf.
- Was de cel monolaag met PBS.
- Maak de confluente celcultuur los met trypsine-EDTA (0,5%) 1x gedurende 5 min bij 37 °C. Stop de werking van trypsine door de cellen te resuspenderen met kweekmedium aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% gentamicine.
- Tel de geresuspendeerde cellen met een hemocytometer en zaai ze in een 96-well plaat op 2,0 × 104 cellen / put.
- Bereid twee borden voor op donkere en lichte omstandigheden.
- Incubeer de platen gedurende 24 uur voor celaanhechting.
- Behandelingsproces
- Verwijder het medium van beide 96-well platen.
- Behandel de cellen met 100 μL toenemende concentraties verteporfine (0,045 tot 24 μM, seriële verdunning).
- Incubeer de cellen met medicamenteuze behandeling gedurende 24 uur om verteporfine-internalisatie mogelijk te maken.
- Gooi na 24 uur het medium dat het medicijn bevat weg, was de monolaag van cellen met PBS (100 μL) en voeg medicijnvrij medium (100 μL) toe.
- Bedek een microplaat met aluminiumfolie om het te beschermen tegen blootstelling aan licht en incubeer het gedurende 24 uur. Deze plaat levert controlegegevens voor PDT-resultaten (donkere toestand). De andere microplaat wordt gebruikt bij de lichtblootstelling in het apparaat.
3. Werking van het apparaat
- Sluit het PDT-apparaat aan op het stopcontact en schakel het in door op de aan /uit-knop te drukken.
- Plaats de andere microplaat (lichtconditie) in het PDT-apparaat en sluit de apparatuur door de voordeur met de klittenbandbanden vast te maken.
- Gebruik de potentiometers om de RGB-configuratie aan te passen (een RGB 255, 255, 255 experiment hier) en stel de kleur van de lichtuitstraling in.
OPMERKING: Elke RGB-combinatie heeft een specifiek emissiespectrum, dat moet worden aangepast voor experimenten met verschillende fotosensitizers en bijgevolg verschillende absorptiecurven. - Druk op het touchpad (+)/(-) om de tijdconfiguratie aan te passen (een experiment van 60 minuten hier) en stel de duur van de test in.
OPMERKING: De tijdconfiguratie, in combinatie met de bestralingswaarde, bepaalt de vloeiendheid van het proces - de lichtdosis die in de test wordt toegepast. - Controleer de installatie-informatie op het display.
- Druk op de startknop om de test te starten. Zorg ervoor dat een zoemer met één pieptoon aan het begin van de test wordt gehoord.
- Observeer in de loop van het experiment real-time informatie op het display, zoals bestraling en resterende tijd.
- Open de voordeur niet en wijzig geen configuratie tijdens de PDT-test.
- Wacht aan het einde van de test op een zoemer met vier piepjes en op het elektronische systeem om alle LED's uit te schakelen. Bekijk een bericht Voltooid en de uiteindelijke hoeveelheid energie die tijdens het experiment is verbruikt in het display.
OPMERKING: De fluence eindwaarde wordt berekend met behulp van vergelijking (1):
(1)
Waarbij F gelijk is aan J/cm2 en I gelijk is aan mW/cm2 of mJ/s·cm2. De bestralingswaarde houdt rekening met de potentie van de LED's (emitterende bron) en het gelijkmatig bestraalde gebied van de donkere kamer (660 cm2) (vergelijking [2]):
(2)
De theoretische bestralingswaarde wordt weergegeven op het display van het apparaat gedurende de gehele PDT-test. Gebruik aan het einde van de bewerking vergelijking (3) om de fluence te berekenen:
Fluence (F) = bestralingssterkte (I, constante waarde) × bedrijfstijd (s) (3)
(1)
(2)4. Bepaling van de levensvatbaarheid van de cel
- Bedek na de PDT-test de microplaat die aan licht is blootgesteld en incubeer gedurende 24 uur.
- Verwijder na de incubatietijd het kweekmedium uit beide platen, was de monolaag van cellen met PBS (100 μL) en voeg MTT-oplossing (0,5 mg / ml, 100 μL) toe. Incubeer beide platen - donkere en lichte omstandigheden - gedurende 4 uur om formazan kristalvorming mogelijk te maken.
- Verwijder de MTT-oplossing voorzichtig en los de paarse kristallen op met een DMSO/ethanol (1:1) oplossing.
- Voer na volledige oplossing van de kristallen de absorptiemeting uit met behulp van een microplaatlezer bij 595 nm.
OPMERKING: Het apparaat kan worden gebruikt in andere belangrijke experimenten, zoals ROS-gemedieerde celdood veroorzaakt door fotosensitizers na blootstelling aan licht door flowcytometrie30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het laatste PDT-apparaat, genaamd de PhotoACT, bevatte een donkere kamer om maximaal vier multiwell-microplaten toe te wijzen, waarbij het bovenste binnenoppervlak was uitgerust met een set van 30 verspreide LED's die waren geprogrammeerd om verschillende spectrums van zichtbaar licht uit te zenden (figuur 3 en aanvullend bestand 6). Het apparaat is gebouwd met behulp van twee bijbehorende dozen: een interne doos die is ontworpen als een donkere kamer voor de PDT-testen en een externe doos om de interne kamer te bedekken en de besturingseenheid vast te houden (figuur 1B). De interne doos was zwart geverfd (figuur 1D) en bestond uit een tapemodel van LED RGB WS2812 (of WS281B) met 30 LED's en van 1 m lengte (die later in drie stukken werd gesneden) en 9 watt, die een ingebouwde processor bevat. Dit apparaat maakte een meer gecontroleerd gebruik en bijgevolg een nauwkeurigere kleuremissie mogelijk. De 30 LED's werden gelijk verdeeld over het gehele bovenste binnenoppervlak van de PDT-kamer door drie parallelle tapes met elk 10 LED's (figuur 1E). Een homogene lichtinval werd vastgesteld vanwege de lage reflectiviteit van de zwarte binnenoppervlakken en de uniforme verdeling van de LED-configuratie. Een TSL2561-helderheidssensor werd ook in het onderste midden van de interne doos opgenomen om de lichtinval aan te geven en te dienen als een kwaliteitscontroletool, waardoor de uniformiteit van de bestraling in de donkere kamer werd gegarandeerd (aanvullende tabel S1) en de kracht van het LED-systeem bewaakt, waarvan bekend is dat het een bepaald aantal uren nuttige levensduur heeft (figuur 1F ). De externe doos is een structuur die de interne doos bedekt, bestaande uit zes MDF-delen, grijs geverfd en lasergesneden voor een perfecte pasvorm (figuren 1A, B). De besturingseenheid is ontworpen met behulp van online software31, 3D-geprint met polymelkzuur als een enkel onderdeel met behulp van een 3D-printer en grijs geverfd. Het bevat alle elektronische componenten, waaronder een display, potentiometers, knoppen en een zoemer (figuur 1I en figuur 2).
Om onafhankelijke lichtinvalaanpassingen mogelijk te maken, werd de ESP32-besturingskaart geselecteerd om de besturingseenheid te integreren (figuur 2). Deze configuratie moet een USB-interface voor programmering, bluetooth, Wi-Fi, dual-core processor, talrijke poorten en de mogelijkheid om te communiceren met een inter-geïntegreerde schakeling (I2C), een seriële perifere interface (SPI) en andere interfaces mogelijk maken. Om het systeem te bedienen, werd een programma geschreven in C-taal via een geïntegreerde ontwikkelomgeving (IDE). De codestructuur32 is gebaseerd op FreeRTOS, een gratis, real-time operationeel systeem dat wordt ondersteund door de ESP32-controllerkaart. De genoemde logica maakt onafhankelijke applicatieprogrammering mogelijk, die door ESP32 kan worden verwerkt in echeloned of parallelle benaderingen, waardoor het project en de onderhouds-, verbeterings- en updateprocessen veel veelzijdiger en veiliger worden.
De interface tussen de machine en de operator is gebruiksvriendelijk en bestond uit een liquid crystal display (LCD), potentiometers, knoppen en een zoemer (Figuur 3 en Aanvullend Bestand 6). Het kleine LCD-scherm van 16 mm x 2 mm (kolommen versus lijnen) had een ingebouwde HD44780-controller met een I2C-communicatieprotocol, wat het gemak van installatie en transmissie veelzijdigheid verleent. De voorlopige installatie omvat RGB- en tijdaanpassingen door de operator. De lichtmagnitude en kleurconfiguratie kunnen worden aangepast met behulp van de potentiometers, die de intensiteit (0 tot 255) van de drie basiskleurcomponenten-RGB wijzigen. Deze aanpassingen kunnen resulteren in verschillende kleurcomposities die worden behandeld in de internationale RGB-kleurentabel33. Elke RGB-compositie bezit een specifieke golflengte, die moet worden aangepast aan de PS die in het PDT-experiment wordt gebruikt; de absorptiecurve van de PS en de golflengte van de bestraling moeten overlappen om de fotoactivering op bevredigende wijze te laten plaatsvinden (aanvullende figuur S1). Tijdens het proces is de bedrijfsstatus met de resterende tijd en lichtinvalinformatie toegankelijk op het LCD-scherm.
Aan het einde van de geprogrammeerde tijd schakelde het elektronicasysteem alle LED's uit, gaf een hoorbare waarschuwing en toonde op het display de totale hoeveelheid energie per gebied (J / cm²), die werd berekend door de constante waarde van de bestraling te vermenigvuldigen met de bedrijfstijd in seconden. Dit digitale model presenteerde een breed scala aan detectieniveaus (limieten tussen 0,1 en 40.000+ lux), een I2C-interface en een lage intensiteit van elektrische stroom (respectievelijk 0,5 mA en 15 μA in bedrijf en stand-bystatus).
Als proof of concept werd het apparaat gebruikt om het cytotoxische effect van verteporfine in 2D HeLa-celcultuur te versterken na blootstelling aan licht van 1 uur (49,1 ± 0,6 J / cm2). Zoals te zien is in figuur 4A, was de GI50-waarde 3,1 μM voor de lichtconditie en 13,8 μM voor de donkere toestand. De 4,4-voudige verschuiving waarin de omstandigheden werden vergeleken, valideerde dus het gebruik van verteporfine als PS en de toepasbaarheid van PhotoACT op PDT-assays. Om het gebruik van het prototype dat in dit werk wordt beschreven te valideren, werd een commercieel PDT-apparaat gebruikt onder dezelfde experimentele omstandigheden, waaronder een PS, cellen en fluence, en de resultaten vergeleken. Zoals te zien is in figuur 4B, fotoactiveerden beide apparaten verteporfine in gelijke mate, waardoor het cytotoxische effect werd versterkt. Deze resultaten bevestigden de toepasbaarheid van dit in eigen huis gebouwde PDT-apparaat (figuur 4A, B). Ten slotte werd de ROS-gemedieerde celdood veroorzaakt door verteporfine na blootstelling aan licht bevestigd door flowcytometrie met behulp van DCFDA-assay (figuur 4C, D).
Figuur 1: PhotoACT bouw- en montage-instructies. Gedetailleerde illustratie van de constructie van, boren, schilderen, monteren en accessoriseren van componenten in het apparaat. Het paneel toont een stapsgewijze handleiding om het apparaat te bouwen. Afkorting: LED = light-emitting diode. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: De constructie van de besturingseenheid en elektronische installatie-instructies. Ingezoomde weergavetekening van de geëxplodeerde besturingseenheid en een gedetailleerd schema van elektronische verbindingen op esp32-controllerkaartpoorten met aansluitingen en componenten die in het prototype zijn gebruikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: PhotoACT-weergave. Montagetekening van het uiteindelijke productontwerp met stuklijst, etiketteringsballonnen en gedetailleerde weergave van de bovenste LED's in het interieur. De figuur maakt het mogelijk om delen en componenten van het prototype te identificeren. Afkortingen: MDF = vezelplaat met gemiddelde dichtheid; LED = lichtgevende diode. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: In vitro fototoxiciteit van verteporfine en ROS-generatie. (A,B) Cel levensvatbaarheidstest uitgevoerd met behulp van de MTT-methode: de testen werden uitgevoerd om het cytotoxische profiel van de photosensitizer verteporfine bij verschillende concentraties te evalueren. HeLa-cellen werden gedurende 24 uur behandeld met verschillende concentraties verteporfine (0,045-24 μM), blootgesteld aan licht (PhotoACT (A) of commerciële PDT-apparatuur (B)) of donkere omstandigheden, en vervolgens onderworpen aan de MTT-test. Beide aandoeningen toonden een verminderde levensvatbaarheid van cellen bij hogere concentraties verteporfine, maar de blootstelling aan licht - verkregen uit PDT-testen - verbeterde het cytotoxische profiel van de PS, wat impliceert dat PDT de cytotoxiciteit van verteporfine verbetert. De levensvatbaarheidscurves werden gemonteerd met graphpad Prism 6-software. (C,D) HeLa-cellen werden gedurende 24 uur behandeld met lage en hoge concentraties verteporfine (0,187 μM en 6 μM) en vervolgens blootgesteld aan licht (PhotoACT) of donkere omstandigheden. Intracellulaire ROS-niveaus werden gemeten na bestraling door flowcytometrie met behulp van DCFDA-sonde (incubatie gedurende 30 minuten bij 1 μM). Een verschuiving naar rechts tussen de histogrammen impliceerde een hogere fluorescentie-intensiteit vanwege een hogere intracellulaire accumulatie van DCF, en dus grotere ROS-niveaus. De resultaten toonden geen relevant verschil in ROS-niveaus in de donkere toestand (C), maar toonden een dosis-responsverhoging in ROS-niveaus na verteporfinefotoactivatie (D). Afkortingen: ROS = reactieve zuurstofsoorten; DCF = 2',7'-dichloorfluoresceïne; DCFDA = 2',7'-dichloorholafluoresceïnediacetaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Het beslissingsschema van het apparaat: voorlopige installatie en probleemoplossing voor de werking. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Aanvullende figuur S1: Overlap tussen de absorptiecurve van verteporfine en het LED-emissiespectrum van het apparaat. Absorptiespectrum van verteporfine met zijn specifieke absorptiepieken (x,y') en LED-emissiespectrum van RGB 255, 255, 255-witte kleur (3.700K-5.000K CCT) gebruikt om de fotosensitizer (x,y'') te fotoactiveren. De overlap tussen de verschillende absorptiepieken van verteporfine en het witte bestralende licht bevestigt de foto-activiteit van de fotosensitizer, die ook werd bevestigd door de biologische resultaten. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel S1: Uniformiteitstests voor bestraling. Onmiddellijke helderheid (lumen) gemeten door de helderheidssensor op verschillende punten van het bestraalde gebied. De gepresenteerde resultaten vertonen geen expressieve variatie, die de uniforme bestraling van het apparaat bevestigen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 1: Vectorbestand voor snijden. Tekenbestand (DWG) voor MDF-bordsnijden. Het bestand moet worden gebruikt voor cnc-snijden (computer numerical control). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 2: 3D-afdrukbestand van de unit control's. Stereolithografie (STL) bestand om de besturingseenheid van het apparaat 3D te printen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 3: C-programmeercode. Programmeercode ontwikkeld in C-taal voor het configureren van de besturingseenheid van de apparatuur. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 4: INO-programmeercode. Programmeercode ontwikkeld in INO-taal voor het configureren van de besturingseenheid van de apparatuur. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 5: Instructies voor het compileren. Markdown (MD) "READ ME" -bestand met aanvullende instructies voor het compileren van programmeercode. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 6: Ontwerpmodel van het apparaat. Preview van het driedimensionale modelbestand Standard for the Exchange of Product Data (STEP) voor algemene visualisatie van het prototype. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het uiteindelijke PhotoACT-apparaat was handig om te bouwen met commercieel verkrijgbare, goedkope componenten voor een totale kostprijs van minder dan $ 50. Bijkomende voordelen zijn onder meer lage onderhoudsvereisten, de capaciteit om meerdere soorten kweekplaten te bestralen, het gelijktijdige gebruik van maximaal vier eenheden per test, een laag gewicht (2 kg) / grootte (44 cm3) dat draagbaarheid, nauwkeurige en reproduceerbare bestraling mogelijk maakt (gegevens niet weergegeven) en een gebruiksvriendelijke en eenvoudige installatie-interface die geen verbinding met computers of andere machines vereist.
Bepaalde kritieke stappen van zowel bouw- als exploitatieprotocollen gaven aanleiding tot verbeteringsmogelijkheden tijdens het ontwerp van het project. Omdat een PDT-kamer homogene lichtemissie en consistente energiemeting vereist, werden de interne en externe dozen afgedicht om zowel interferentie van het buitenlicht als lichtverlies te voorkomen. Extra klittenbandbanden werden zijwaarts op de voordeur bevestigd om de kamersluiting te versterken en ononderbroken experimenten te garanderen. Een representatieve LED werd geïnstalleerd bij de besturingseenheid om de vereiste RGB-configuratie te certificeren, die de kleur en intensiteit van het uitgestraalde licht tijdens de test aangeeft. Ten slotte onderging de programmeercode verschillende upgrades om directe dichtheidsmetingen en uiteindelijke hoeveelheden energie-evaluaties te verfijnen, waarbij reproduceerbaarheid en wiskundige consistentie werden onderschreven. Enkele andere belangrijke details die extra aandacht vereisen, zijn: (i) homogene verdeling van LED's en centrale positionering van de helderheidssensor om representatieve en uitgebalanceerde resultaten te verkrijgen, (ii) installatie van alle componenten volgens het elektronische diagram (figuur 2) en programmeercode (aanvullend bestand 3, aanvullend bestand 4 en aanvullend bestand 5 ) om de juiste werking te garanderen, en (iii) de installatie (met behoud van dezelfde RGB- en tijdconfiguratie) voordat een experiment wordt uitgevoerd om consistente replicaties met betrouwbare resultaten te garanderen. Hoewel het RGB-systeem meerdere zichtbare kleursamenstellingen met specifieke golflengten biedt, zouden experimenten met niet-zichtbaar licht specifieke protocolupgrades vereisen. In figuur 5 wordt een beslissingsstroomdiagram gepresenteerd om een systematische probleemoplossende aanpak te bieden om problemen of fouten tijdens de operatie te vinden en te corrigeren.
Ontworpen om te voldoen aan de eisen van in vitro experimenten met gevalideerde resultaten verkregen met de therapeutische activering van verteporfine om cytotoxiciteit in 2D HeLa-cellen te induceren (figuur 4), kan de PhotoACT worden aanbevolen voor universiteiten, scholen, industrieën en andere onderzoekscentra. Dit apparaat moet de voordelen van PDT uitbreiden naar wetenschappelijk onderzoek naar het werkingsmechanisme van fotosensitizers en hun klinische toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
We bedanken Arthur Henrique Gomes de Oliveira en Lucas Julian Cruz Gomes voor hun hulp bij het filmproces. Dit project werd ondersteund door de Brazilian Research Council (CNPq, subsidienummers 400953/2016-1-404286/2021-6) en Fundação Araucária-PPSUS 2020/2021 (SUS2020131000003). Deze studie werd ook gedeeltelijk gefinancierd door Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | Mammalian cell culture dissociation reagent |
| 3D printer | Flashforge | Finder model | |
| 96-well plates | Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture | ||
| Arduino | |||
| Brightness sensor | TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface | ||
| Buttons | |||
| Buzzer | |||
| Cell culture Flasks | Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes) | ||
| Centrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay | ||
| CO2 Incubator | |||
| Controller board | ESP32 | ||
| Design Software | Trimble | SketchUp | |
| DMEM High Glucose | Gibco | 11965092 | DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540-500ML | Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% (GC), suitable for plant cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12657029 | FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages. |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Gibco | 15750060 | Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination |
| Hemocytometer | Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay | ||
| Inverted Laboratory Microscope | Leica | DM IL LED | |
| Laminar Flow Hood | Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures | ||
| LCD display | |||
| LED RGB WS2812 | 5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts | ||
| MDF fiberboards | 3mm thickness medium-density fiberboards | ||
| Microcentrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay | ||
| Microplate reader | ThermoFischer | Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation. | |
| MTT Reagent | Invitrogen | M6494 | 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays |
| Operational System | Real Time Engineers ltd. | FreeRTOS | |
| P10 micripipette | Non-electronic, single-channel, 1-10 μL capacity | ||
| P1000 micropipette | Non-electronic, single-channel, 10-1000 μL capacity | ||
| P200 micropipette | Non-electronic, single-channel, 20-200 μL capacity | ||
| PDT Equipment | LumaCare | Model LC-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 | Gibco | 10010031 | Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures |
| Potentiometers | |||
| Tips | Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 μL maximum volumes | ||
| Verteporfin | Sigma-Aldrich | SML0534-5MG | Verteporfin, ≥94% (HPLC) |
References
- Ferlay, J., et al. International agency for research on cancer. Global Cancer Observatory: Cancer Today. 23 (7), https://gco.iarc.fr/today/home 323-326 (2018).
- Gottesman, M. M., Fojo, T., Bates, S. E. Multidrug resistance in cancer: role of Atp-dependent transporters. Nature Reviews Cancer. 2 (1), 48-58 (2002).
- Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Boothe-Genthe, C., Gottesman, G. A. Targeting multidrug resistance in cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 219-234 (2006).
- Ackroyd, R., Kelty, C., Brown, N., Reed, M. The history of photodetection and photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 74 (5), 656-669 (2001).
- Hamblin, M. R. Photodynamic therapy for cancer: what's past is prologue. Photochemistry and Photobiology. 96 (3), 506-516 (2020).
- Barr, H., et al. The contrasting mechanisms of colonic collagen damage between photodynamic therapy and thermal injury. Photochem Photobiol. 46 (5), 795-800 (1987).
- Algorri, J. F., Ochoa, M., Roldán-Varona, P., Rodríguez-Cobo, L., López-Higuera, J. M. Photodynamic therapy: A compendium of latest reviews. Cancers. 13 (17), 4447 (2021).
- Aniogo, E. C., Plackal, B., George, B. P. A., Abrahamse, H. The role of photodynamic therapy on multidrug resistant breast cancer. Cancer Cell International. 19, 91 (2019).
- Spring, B. Q., Rizvi, I., Xu, N., Hasan, T. The role of photodynamic therapy in overcoming cancer drug resistance. Photochemical & Photobiological Sciences. 14 (8), 1476-1491 (2015).
- Dougherty, T. J., Grindey, G. B., Fiel, R., Weishaupt, K. R., Boyle, D. G. Photoradiation therapy. II. Cure of animal tumors with hematoporphyrin and light. Journal of the National Cancer Institute. 55 (1), 115-121 (1975).
- Etcheverry, M. E., Pasquale, M. A., Garavaglia, M. Photodynamic therapy of HeLa cell cultures by using LED or laser sources. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 160, 271-277 (2016).
- Guo, Q., Dong, B., Nan, F., Guan, D., Zhang, Y. 5-Aminolevulinic acid photodynamic therapy in human cervical cancer via the activation of microRNA-143 and suppression of the Bcl-2/Bax signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 14 (1), 544-550 (2016).
- Mroz, P., Yaroslavsky, A., Kharkwal, G. B., Hamblin, M. R. Cell death pathways in photodynamic therapy of cancer. Cancers. 3 (2), 2516-2539 (2011).
- Mahalingam, S. M., Ordaz, J. D., Low, P. S. Targeting of a photosensitizer to the mitochondrion enhances the potency of photodynamic therapy. ACS Omega. 3 (6), 6066-6074 (2018).
- Granville, D. J., Levy, J. G., Hunt, D. W. C. Photodynamic treatment with benzoporphyrin derivative monoacid ring A produces protein tyrosine phosphorylation events and DNA fragmentation in murine P815 cells. Photochemistry and Photobiology. 67 (3), 358-362 (1998).
- Castano, A. P., Demidova, T. N., Hamblin, M. R. Mechanisms in photodynamic therapy: part two - cellular signaling, cell metabolism and modes of cell death. Photodiagnosis Photodynamic Therapy. 2 (1), 1-23 (2014).
- Detty, M. R., Gibson, S. L., Wagner, S. J. Current clinical and preclinical photosensitizers for use in photodynamic therapy. Journal of Medicinal Chemistry. 47 (16), 3897-3915 (2004).
- Allison, R. R. Photodynamic therapy: oncologic horizons. Future Oncology. 10 (1), 123-142 (2014).
- Chepurna, O., et al. Photodynamic therapy with laser scanning mode of tumor irradiation. Optical Fibers and Their Applications 2015. 9816, 323-326 (2015).
- Huang, Z. A review of progress in clinical photodynamic therapy. Technology in Cancer Research and Treatment. 4 (3), 283-293 (2005).
- Chepurna, O., et al. LED-based portable light source for photodynamic therapy. Optics in Health Care and Biomedical Optics. 11190, 109-115 (2019).
- Hasson, O., Wishkerman, A. CultureLED: A 3D printer-based LED illumination cultivation system for multi-well culture plates. HardwareX. 12, 00323 (2022).
- Wu, X., et al. Localised light delivery on melanoma cells using optical microneedles. Biomedical Optics Express. 13 (2), 1045-1060 (2022).
- Erkiert-Polguj, A., Halbina, A., Polak-Pacholczyk, I., Rotsztejn, H. Light-emitting diodes in photodynamic therapy in non-melanoma skin cancers-own observations and literature review. Journal of Cosmetic and Laser Therapy. 18 (2), 105-110 (2016).
- Neupane, J., Ghimire, S., Shakya, S., Chaudhary, L., Shrivastava, V. P. Effect of light emitting diodes in the photodynamic therapy of rheumatoid arthritis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 7 (1), 44-49 (2010).
- Lins, E. C., et al. A novel 785-nm laser diode-based system for standardization of cell culture irradiation. Photomedicine and Laser Surgery. 31 (10), 466-473 (2013).
- Hopkins, S. L., et al. An In vitro cell irradiation protocol for testing photopharmaceuticals and the effect of blue, green, and red light on human cancer cell lines. Photochemical and Photobiological Sciences. 15 (5), 644-653 (2016).
- Zhang, K., Waguespack, M., Kercher, E. M., Spring, B. Q. An automated and stable LED array illumination system for multiwell plate cell culture photodynamic therapy experiments. Research Square. , 1-18 (2022).
- Gálvez, E. N., et al. Analysis and evaluation of the operational characteristics of a new photodynamic therapy device. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 37, 102719 (2022).
- Bretin, L., et al. Photodynamic therapy activity of new human colorectal cancer. Cancers. 11 (10), 1474 (2019).
- T. SketchUp. , Available from: https://www.sketchup.com/ (2022).
- LCDR PhotoDynamic Therapy (PDT) Equipment Repository. GitHub, Inc. , Available from: https://github.com/PhotoDynamicTherapy (2022).
- W3C CSS Color Module Level 3. W3C, Inc. , Available from: https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB (2022).
