Summary
Ici, nous décrivons un dispositif nouveau, simple et peu coûteux pour effectuer avec succès des tests de thérapie photodynamique in vitro (PDT) en utilisant une culture cellulaire HeLa bidimensionnelle et une vertéporfine comme photosensibilisant.
Abstract
Cet article décrit un dispositif nouveau, simple et peu coûteux pour effectuer des tests de thérapie photodynamique in vitro (PDT), appelé PhotoACT. Le dispositif a été construit à l’aide d’un ensemble de diodes électroluminescentes programmables (LED) conventionnelles, d’un module d’affichage à cristaux liquides (LCD) et d’un capteur de lumière connecté à une carte de microcontrôleur commerciale. La structure à base de boîte du prototype a été réalisée avec des panneaux de fibres de densité moyenne (MDF). Le compartiment interne peut attribuer simultanément quatre microplaques multipuits de culture cellulaire.
Comme preuve de concept, nous avons étudié l’effet cytotoxique de la vertéporfine photosensibilisante (PS) contre la lignée cellulaire HeLa en culture bidimensionnelle (2D). Les cellules HeLa ont été traitées avec des concentrations croissantes de vertéporfine pendant 24 heures. Le milieu surnageant contenant du médicament a été jeté, les cellules adhérentes ont été lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et un milieu sans médicament a été ajouté. Dans cette étude, l’effet de la vertéporfine sur les cellules a été examiné soit sans exposition à la lumière, soit après une exposition de 1 h à la lumière en utilisant des valeurs rouge-vert-bleu (RVB) de 255, 255 et 255 (fluence moyenne de 49,1 ± 0,6 J / cm2). Après 24 h, la viabilité cellulaire a été évaluée par le dosage du bromure de 3-(4,5-diméthyl-2-thiazolyl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT).
Les résultats expérimentaux ont montré que l’exposition des cellules traitées à la vertéporfine à la lumière du dispositif renforce l’effet cytotoxique du médicament via un mécanisme médié par les espèces réactives de l’oxygène (ROS). De plus, l’utilisation du prototype décrit dans ce travail a été validée en comparant les résultats avec un dispositif PDT commercial. Ainsi, ce prototype de thérapie photodynamique à base de LED représente une bonne alternative pour les études in vitro de la PDT.
Introduction
Parmi les maladies non transmissibles les plus mortelles, le cancer est l’une des principales causes mondiales de décès prématuré. Il a représenté près de 10 millions de décès en 2020, soit environ un décès sur six dans le monde1. De plus, le phénomène de multirésistance (MDR) représente une menace considérable pour la santé publique, car les protocoles chimiothérapeutiques approuvés n’atteignent pas les stades de rémission pour cette condition clinique2. Les cellules cancéreuses peuvent développer une résistance à la chimiothérapie par plusieurs mécanismes; cependant, la surexpression de certains transporteurs de cassettes de liaison à l’ATP (ABC) - les pompes à efflux dépendantes de l’ATP - est considérée comme la principale cause du développement de MDR dans un microenvironnement tumoral3. En plus de la MDR, d’autres complications du cancer, telles que la récidive et les métastases, renforcent la demande urgente de développer et d’améliorer des approches thérapeutiques pour surmonter ce défi oncologique.
L’utilisation curative de la lumière est pratiquée depuis des siècles4, et la thérapie photodynamique (PDT) représente une approche thérapeutique cliniquement approuvée pour les tumeurs solides. La PDT combine l’administration d’un photosensibilisateur (PS) suivie d’une irradiation lumineuse pour générer des espèces réactives de l’oxygène (ROS) afin d’exercer une cytotoxicité sélective dans les cellules tumorales. Cette approche thérapeutique est supérieure aux méthodes conventionnelles, y compris la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie5; Il s’agit d’une technique mini-invasive montrant une cytotoxicité plus faible dans les tissus conjonctifs6. L’application de lumière et l’accumulation de PS directement dans la tumeur ou son microenvironnement assurent un ciblage précis et, par conséquent, des effets secondaires systémiques mineurs et indésirables7 et la possibilité de traitements répétés sur le même site. De plus, le coût est inférieur à celui des autres approches. En raison de ses caractéristiques prometteuses, la PDT peut être considérée comme une option appropriée à la fois pour les tumeurs uniques, en particulier dans le cas de tumeurs inopérables, ou pour le traitement adjuvant du cancer7, et représente une alternative à la MDR liée à la chimiothérapie 8,9.
Le premier rapport montrant un taux de réponse objective élevé à l’aide de la PDT a été décrit en 1975 dans un modèle10 de souris et de rats. Depuis lors, des études ont été menées en utilisant la PDT avec des résultats positifs7 à la fois in vivo et in vitro avec des lignées cellulaires tumorales humaines en culture cellulaire2D 11,12. Compte tenu de la large applicabilité de la PS cliniquement approuvée, quelles que soient leurs voies d’accumulation spécifiques et leurs gammes de longueurs d’onde des pics d’absorption, le processus général est le suivant: (i) absorption du PS, (ii) pic de concentration de PS à la tumeur ou à son microenvironnement, (iii) application de lumière, (iv) interaction PS-lumière, (v) transfert de l’énergie PS excitée à l’état d’excitation PS au substrat tissulaire ou aux molécules d’oxygène environnantes, (vi) la production de ROS impliquant de l’oxygène singulet ou de l’anion superoxyde, (vii) la mort des cellules tumorales via, essentiellement, la nécrose ou l’apoptose (mort directe), l’autophagie (mécanisme cytoprotecteur), l’ischémie tissulaire (lésions vasculaires), la modulation immunitaire ou un chevauchement de ces mécanismes7. Dans cette dernière étape, l’activation d’une voie de mort cellulaire spécifique dépend de nombreux facteurs, tels que les caractéristiques cellulaires, la conception expérimentale et, surtout, la localisation intracellulaire PS et les dommages ciblés liés à la PDT13.
La vertéporfine est un PS de deuxième génération, approuvé par les organismes de réglementation pour une utilisation clinique en Norvège et en Chine pour traiter la dégénérescence maculaire liée à l’âge7. Après l’administration de la dose, il a été rapporté que cette prodrogue s’accumulait partiellement dans les mitochondries14 et induisait la phosphorylation de la protéine cellulaire tyrosine et la fragmentation de l’ADN, conduisant à l’apoptose des cellules tumorales15,16. Après 24 h d’incubation pour l’internalisation des vertéporfines, un protocole PDT utilisant une configuration de longueur d’onde de 690 nm est recommandé pour atteindre des niveaux efficaces de transfert de rayonnement électromagnétique aux molécules adjacentes 7,17.
En ce qui concerne la source lumineuse pour PDT, les systèmes laser à diodes classiques sont généralement coûteux, techniquement compliqués, surdimensionnés, et donc non portables18,19. En raison de son profil de longueur d’onde unique, qui peut également être observé dans les équipements PDT à base de LED, la demande d’unités indépendantes pour chaque application de photosensibilisateur rend l’utilisation de systèmes laser à diodes encore plus complexe et économiquement irréalisable20,21. Par conséquent, l’utilisation de machines LED est considérée comme l’alternative la plus prometteuse pour résoudre non seulement les coûts22 et les problèmes de maintenance, mais aussi pour fournir une puissance de sortie élevée et une capacité d’éclairage moins nocive 23 et plus large 24,25,26,27.
Malgré la contribution potentielle que l’équipement à base de LED peut offrir aux expériences PDT28, la plupart des options commerciales présentent encore des inconvénients tels qu’un manque de portabilité, des coûts élevés et des projets de construction et d’exploitationcomplexes 29. L’objectif principal de ce travail était d’offrir un outil simple et fiable pour les tests PDT in vitro . Cet article décrit PhotoACT, un appareil PDT à LED construit en interne, qui est peu coûteux, convivial et portable. En tant que preuve de concept, il a été démontré que ce dispositif améliore la cytotoxicité de la vertéporfine dans un modèle de culture cellulaire 2D et, par conséquent, peut être utilisé comme outil de recherche dans les expériences PDT.
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Protocol
REMARQUE : Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et logiciels utilisés dans ce protocole.
1. Construction de l’appareil
- Scie des panneaux de fibres de densité moyenne (MDF) de 3 mm d’épaisseur pour obtenir des pièces dont les dimensions sont indiquées à la figure 1A.
Remarque : Utilisez le fichier vectoriel (fichier supplémentaire 1) pour la découpe par commande numérique par ordinateur (CNC). - Construire deux boîtes avec les dimensions suivantes (longueur x largeur x hauteur) : 330 mm x 235 mm x 225 mm pour les plus grandes boîtes, et 300 mm x 220 mm x 150 m pour les plus petites boîtes (Figure 1B).
- Percez l’arrière de la plus grande boîte pour installer un connecteur de prise de barillet. Percez le haut de la plus grande boîte et le haut et le bas de la plus petite boîte pour permettre un passage aux câbles électriques (Figure 1C).
- Peignez toutes les surfaces internes avec de l’encre noire pour favoriser une incidence homogène de la lumière (Figure 1D).
- Fixez, en parallèle, trois rubans de DEL de 10 LED chacun sur la surface intérieure supérieure du boîtier plus petit (Figure 1E).
- Installez un capteur de luminosité au centre de la surface intérieure inférieure du boîtier plus petit (Figure 1F).
- Imprimez la structure de l’unité de commande (Figure 1G) à l’aide du fichier d’impression 3D (Fichier supplémentaire 2).
- Installez tous les composants (bouton d’alimentation, potentiomètres, pavé tactile d’heure/de démarrage, voyants, capteur de luminosité, écran LCD, avertisseur sonore et bloc d’alimentation) aux ports d’une carte de commande ESP32 montée à l’intérieur de l’unité de commande (Figure 2).
- Téléchargez le code de programmation (fichier supplémentaire 3, fichier supplémentaire 4 et fichier supplémentaire 5) et exécutez un test pour vérifier que toutes les connexions fonctionnent (Figure 1H).
- Assemblez les boîtes et fixez-les ensemble pour éviter les espaces et, par conséquent, les interférences lumineuses externes et les pertes de lumière émise. Fixez l’unité de commande montée à la zone percée au sommet du prototype (figure 1I).
- Fixez une porte d’entrée du même matériau et de 330 mm x 225 mm (longueur x largeur) sur la plus grande boîte avec deux petites charnières. Fixez également des bandes velcro latéralement à la plus grande boîte pour renforcer la fermeture prototype (Figure 1J). Installez une poignée pour manipuler la porte d’entrée de l’équipement.
- Fixez quatre repose-pieds en caoutchouc au bas du prototype pour assurer une plus grande stabilité pendant les opérations (figure 1K).
2. Lignées cellulaires : culture, semis et traitement
- Produits chimiques
- Dissoudre la porphyrine dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) pour obtenir une concentration de 100 mM.
ATTENTION : Le DMSO doit être manipulé avec précaution (manipulation à l’aide d’un équipement de protection individuelle et dans un endroit ventilé). Manipuler soigneusement les solutions mères et diluées pour éviter une exposition excessive à la lumière.
- Dissoudre la porphyrine dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) pour obtenir une concentration de 100 mM.
- Lignées cellulaires
- Cultivez la lignée cellulaire HeLa dans le milieu hypoglycémique Modified Eagle’s Medium (DMEM) de Dulbecco complété par 10 % de sérum bovin fœtal et 1 % de gentamicine.
- Conserver les flacons de culture dans un incubateur de culture cellulaire à 5 % de CO2 à 37 °C.
- Gérer et inspecter les cellules jusqu’à ce qu’elles atteignent 80% à 90% de confluence.
- Processus d’ensemencement
- Retirer le milieu de culture de la fiole.
- Lavez la monocouche cellulaire avec du PBS.
- Détacher la culture cellulaire confluente avec la trypsine-EDTA (0,5%) 1x pendant 5 min à 37 °C. Arrêter l’action de la trypsine en remettant les cellules en suspension avec un milieu de culture supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal et 1% de gentamicine.
- Compter les cellules remises en suspension à l’aide d’un hémocytomètre et les ensemencer dans une plaque de 96 puits à 2,0 × 104 cellules/puits.
- Préparez deux assiettes pour les conditions sombres et claires.
- Incuber les plaques pendant 24 h pour la fixation des cellules.
- Processus de traitement
- Retirez le milieu des deux plaques de 96 puits.
- Traiter les cellules avec 100 μL de concentrations croissantes de vertéporfine (0,045 à 24 μM, dilution en série).
- Incuber les cellules avec un traitement médicamenteux pendant 24 h pour permettre l’internalisation de la vertéporfine.
- Après 24 h, jeter le milieu contenant le médicament, laver la monocouche de cellules avec du PBS (100 μL) et ajouter un milieu sans médicament (100 μL).
- Couvrir une microplaque de papier d’aluminium pour la protéger de l’exposition à la lumière et incuber pendant 24 h. Cette plaque fournira des données de contrôle pour les résultats PDT (condition d’obscurité). L’autre microplaque sera utilisée dans les conditions d’exposition à la lumière dans l’appareil.
3. Fonctionnement de l’appareil
- Branchez l’appareil PDT sur la prise électrique et allumez-le en appuyant sur le bouton d’alimentation .
- Placez l’autre microplaque (état d’éclairage) dans le dispositif PDT et fermez l’équipement en fixant la porte d’entrée avec les bandes velcro.
- Utilisez les potentiomètres pour ajuster la configuration RVB (une expérience RVB 255 , 255, 255 ici) et définissez la couleur de l’émission de lumière.
NOTE: Chaque combinaison RVB a un spectre d’émission spécifique, qui doit être ajusté pour des expériences avec différents photosensibilisateurs et, par conséquent, différentes courbes d’absorbance. - Appuyez sur le pavé tactile (+)/(-) pour ajuster la configuration de l’heure (une expérience de 60 minutes ici) et définir la durée du test.
NOTE: La configuration temporelle, associée à la valeur d’éclairement énergétique, déterminera la fluence du procédé - la dose lumineuse appliquée dans le test. - Vérifiez les informations de configuration à l’écran.
- Appuyez sur le bouton Démarrer pour lancer le test. Assurez-vous qu’un signal sonore à un bip se fait entendre au début de l’essai.
- Au cours de l’expérience, observez les informations en temps réel sur l’écran, telles que l’irradiance et le temps restant.
- N’ouvrez pas la porte d’entrée et ne modifiez aucune configuration pendant le test PDT.
- À la fin du test, attendez qu’un buzzer à quatre bips et que le système électronique éteigne toutes les LED. Observez un message Terminé et la quantité finale d’énergie dépensée - fluence - pendant l’expérience dans l’affichage.
REMARQUE : La valeur finale de fluence est calculée à l’aide de l’équation (1) :
(1)
Où F est égal à J/cm 2 et I égal à mW/cm 2 ou mJ/s·cm 2. La valeur d’éclairement énergétique tient compte de la puissance des LED (source émettrice) et de la zone uniformément irradiée de la chambre noire (660cm2) (équation [2]):
(2)
La valeur d’irradiance théorique est affichée sur l’écran de l’appareil tout au long du test PDT. À la fin de l’opération, utilisez l’équation (3) pour calculer la fluence :
Fluence (F) = irradiance (I, valeur constante) × temps de fonctionnement (s) (3)
(1)
(2)4. Essai de viabilité cellulaire
- Après le test PDT, couvrir la microplaque exposée à la lumière et incuber pendant 24 h.
- Après la période d’incubation, retirer le milieu de culture des deux plaques, laver la monocouche de cellules avec du PBS (100 μL) et ajouter une solution de MTT (0,5 mg/ml, 100 μL). Incuber les deux plaques - conditions sombres et claires - pendant 4 h pour permettre la formation de cristaux de formazan.
- Retirer soigneusement la solution de MTT et dissoudre les cristaux violets avec une solution de DMSO/éthanol (1:1).
- Après dissolution complète des cristaux, effectuer la mesure d’absorbance à l’aide d’un lecteur de microplaques à 595 nm.
REMARQUE: Le dispositif peut être utilisé dans d’autres expériences importantes telles que la mort cellulaire médiée par ROS déclenchée par des photosensibilisateurs après exposition à la lumière par cytométrieen flux 30.
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Representative Results
Le dernier dispositif PDT, nommé PhotoACT, comprenait une chambre sombre pour attribuer jusqu’à quatre microplaques multipuits, avec sa surface intérieure supérieure équipée d’un ensemble de 30 LED dispersées programmées pour émettre des spectres distincts de lumière visible (Figure 3 et Fichier supplémentaire 6). Le dispositif a été construit à l’aide de deux boîtiers associés : un boîtier interne conçu comme une chambre sombre pour les tests PDT, et un boîtier externe pour couvrir la chambre interne et contenir l’unité de commande (Figure 1B). Le boîtier interne a été peint en noir (Figure 1D) et composé d’un modèle de bande de LED RGB WS2812 (ou WS281B) avec 30 LED et de 1 m de longueur (qui a ensuite été coupé en trois morceaux) et 9 watts, qui contient un processeur intégré. Cet appareil a permis une utilisation plus contrôlée et, par conséquent, une émission de couleurs plus précise. Les 30 LED étaient réparties également sur toute la surface intérieure supérieure de la chambre PDT par trois bandes parallèles de 10 LED chacune (Figure 1E). Une incidence homogène de la lumière a été établie en raison de la faible réflectivité des surfaces intérieures noires et de la répartition uniforme de la configuration des LED. Un capteur de luminosité TSL2561 a également été incorporé dans le centre inférieur du boîtier interne pour indiquer l’incidence de la lumière et servir d’outil de contrôle de la qualité, garantissant l’uniformité de l’irradiation à l’intérieur de la chambre noire (tableau supplémentaire S1) et surveillant la puissance du système LED, connu pour avoir un certain nombre d’heures de vie utile (Figure 1F ). La boîte externe est une structure qui recouvre la boîte interne, composée de six pièces en MDF, peintes en gris et découpées au laser pour un ajustement parfait (figures 1A, B). L’unité de contrôle a été conçue à l’aide du logiciel en ligne 31, imprimée en 3D avec de l’acide polylactique en une seule pièce à l’aide d’une imprimante3D et peinte en gris. Il contient tous les composants électroniques, y compris un écran, des potentiomètres, des boutons et un buzzer (Figure 1I et Figure 2).
Pour permettre des réglages indépendants de l’incidence de la lumière, la carte contrôleur ESP32 a été sélectionnée pour intégrer l’unité de commande (Figure 2). Cette configuration devrait permettre une interface USB pour la programmation, le bluetooth, le Wi-Fi, le processeur double cœur, de nombreux ports et la possibilité de communiquer avec un circuit inter-intégré (I2C), une interface périphérique série (SPI) et d’autres interfaces. Pour faire fonctionner le système, un programme a été écrit en langage C via un environnement de développement intégré (IDE). La structure de code32 est basée sur FreeRTOS, un système opérationnel gratuit en temps réel pris en charge par la carte contrôleur ESP32. La logique référée permet une programmation d’applications indépendantes, qui peuvent être traitées par ESP32 dans des approches échelonnées ou parallèles, ce qui rend le projet et ses processus de maintenance, d’amélioration et de mise à jour beaucoup plus polyvalents et sécurisés.
L’interface entre la machine et l’opérateur est conviviale et se compose d’un écran à cristaux liquides (LCD), de potentiomètres, de boutons et d’un buzzer (Figure 3 et Fichier supplémentaire 6). Le petit écran LCD de 16 mm x 2 mm (colonnes vs lignes) avait un contrôleur HD44780 intégré avec un protocole de communication I2C, ce qui confère la facilité d’installation et la polyvalence de transmission, respectivement. La configuration préliminaire comprend des ajustements RVB et temporels par l’opérateur. L’amplitude de la lumière et la configuration des couleurs peuvent être ajustées à l’aide des potentiomètres, qui modifient l’intensité (0 à 255) des trois composants de couleur de base-RVB. Ces ajustements peuvent aboutir à plusieurs compositions de couleurs abordées dans le tableau international des couleurs RVB33. Chaque composition RVB possède une longueur d’onde spécifique, qui doit être ajustée en fonction du PS utilisé dans l’expérience PDT; la courbe d’absorbance du PS et la longueur d’onde de l’irradiation doivent être superposées pour que la photoactivation se produise de manière satisfaisante (figure supplémentaire S1). Tout au long du processus, l’état de fonctionnement avec le temps restant et les informations sur l’incidence de la lumière sont accessibles sur l’écran LCD.
À la fin du temps programmé, le système électronique a éteint toutes les LED, émis un avertissement sonore et affiché sur l’écran la quantité totale d’énergie par zone (J/cm²), calculée en multipliant la valeur constante de l’éclairement énergétique par le temps de fonctionnement en secondes. Ce modèle numérique présentait une large gamme de niveaux de détection (limites comprises entre 0,1 et 40 000+ lux), une interface I2C et une faible intensité de courant électrique (0,5 mA et 15 μA en fonctionnement et en état de veille, respectivement).
Comme preuve de concept, le dispositif a été utilisé pour améliorer l’effet cytotoxique de la vertéporfine dans une culture cellulaire HeLa 2D après une exposition à la lumière de 1 h (49,1 ± 0,6 J/cm2). Comme le montre la figure 4A, la valeur GI50 était de 3,1 μM pour l’état de lumière et de 13,8 μM pour l’état d’obscurité. Ainsi, le décalage de 4,4 fois comparant les conditions a validé l’utilisation de la vertéporfine comme PS et l’applicabilité de PhotoACT aux tests PDT. Pour valider l’utilisation du prototype décrit dans ce travail, un dispositif PDT commercial a été utilisé dans les mêmes conditions expérimentales, y compris un PS, des cellules et une fluence, et les résultats ont été comparés. Comme le montre la figure 4B, les deux dispositifs ont photoactivé la vertéporfine de manière égale, renforçant ainsi l’effet cytotoxique. Ces résultats ont confirmé l’applicabilité de ce dispositif dans un dispositif PDT construit en maison (Figure 4A,B). Enfin, la mort cellulaire médiée par les ROS déclenchée par la vertéporfine après exposition à la lumière a été confirmée par cytométrie en flux à l’aide du test DCFDA (Figure 4C,D).
Figure 1 : Instructions de construction et de montage de PhotoACT. Illustration détaillée de la construction, du perçage, de la peinture, du montage et de l’accessoirisation des composants dans l’appareil. Le panneau affiche un guide étape par étape pour construire l’appareil. Abréviation : LED = diode électroluminescente. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Instructions de construction et d’installation électronique de l’unité de commande. Dessin en vue agrandie de l’unité de commande éclatée et schéma détaillé des connexions électroniques aux ports de la carte contrôleur ESP32 avec connexions et composants utilisés dans le prototype. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Représentation PhotoACT. Dessin d’assemblage de la conception finale du produit avec nomenclature, ballons d’étiquetage et vue détaillée des LED intérieures supérieures. La figure permet d’identifier les pièces et composants du prototype. Abréviations : MDF = panneau de fibres de densité moyenne; LED = diode électroluminescente. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Phototoxicité in vitro de la vertéporfine et génération de ROS. (A,B) Essai de viabilité cellulaire réalisé à l’aide de la méthode MTT: les essais ont été effectués pour évaluer le profil cytotoxique de la vertéporfine photosensibilisante à différentes concentrations. Les cellules HeLa ont été traitées pendant 24 heures avec différentes concentrations de vertéporfine (0,045-24 μM), exposées à la lumière (PhotoACT (A) ou équipement PDT commercial (B)) ou à l’obscurité, puis soumises au test MTT. Les deux conditions ont montré une diminution de la viabilité cellulaire à des concentrations plus élevées de vertéporfine, mais l’exposition à la lumière obtenue à partir des tests PDT a amélioré le profil cytotoxique de la PS, ce qui implique que la PDT améliore la cytotoxicité de la vertéporfine. Les courbes de viabilité ont été ajustées à l’aide du logiciel GraphPad Prism 6. (C, D) Les cellules HeLa ont été traitées pendant 24 heures avec des concentrations faibles et élevées de vertéporfine (0,187 μM et 6 μM), puis exposées à la lumière (PhotoACT) ou à l’obscurité. Les niveaux intracellulaires de ROS ont été mesurés après irradiation par cytométrie en flux à l’aide de la sonde DCFDA (incubation pendant 30 min à 1 μM). Un décalage à droite entre les histogrammes impliquait une intensité de fluorescence plus élevée en raison d’une accumulation intracellulaire plus élevée de DCF, et donc de niveaux de ROS plus élevés. Les résultats n’ont montré aucune différence significative dans les niveaux de ROS dans l’état sombre (C), mais ont montré une augmentation dose-réponse des niveaux de ROS après photoactivation de la vertéporfine (D). Abréviations : ROS = espèces réactives de l’oxygène; DCF = 2',7'-dichlorofluorescéine; DCFDA = diacétate de 2',7'-dichlorohydrofluorescéine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : organigramme de décision de l’appareil : configuration préliminaire et dépannage des opérations. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire S1 : Chevauchement entre la courbe d’absorbance de la vertéporfine et le spectre d’émission de LED du dispositif. Spectre d’absorption de la vertéporfine avec ses pics d’absorbance spécifiques (x,y') et spectre d’émission LED de couleur RVB 255, 255, 255-blanc (3,700K-5,000K CCT) utilisé pour photoactiver le photosensibilisant (x,y''). Le chevauchement entre les différents pics d’absorbance de la vertéporfine et la lumière blanche irradiante corrobore la photoactivation du photosensibilisant, qui a également été confirmée par les résultats biologiques. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire S1: Essais d’uniformité d’irradiation. Luminosité instantanée (lumen) mesurée par le capteur de luminosité en différents points de la zone irradiée. Les résultats présentés ne montrent aucune variation expressive, ce qui atteste de l’irradiation uniforme de l’appareil. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 1 : Fichier vectoriel pour la découpe. Fichier de dessin (DWG) pour la découpe de panneaux MDF. Le fichier doit être utilisé pour le découpage par commande numérique par ordinateur (CNC). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 2 : fichier d’impression 3D du contrôle de l’unité. Fichier de stéréolithographie (STL) pour imprimer en 3D l’unité de contrôle de l’appareil. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 3 : code de programmation C. Code de programmation développé en langage C pour configurer l’unité de contrôle de l’équipement. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 4 : Code de programmation INO. Code de programmation développé en langage INO pour la configuration de l’unité de contrôle de l’équipement. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 5 : Instructions de compilation. Markdown (MD) « LISEZ-MOI » avec des instructions supplémentaires pour la compilation de code de programmation. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 6 : Modèle de conception de l’appareil. Aperçu du fichier de modèle tridimensionnel Standard for the Exchange of Product Data (STEP) pour la visualisation générale du prototype. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Le dernier appareil PhotoACT était pratique à construire avec des composants disponibles dans le commerce et à faible coût à un coût total inférieur à 50 $. Les avantages supplémentaires incluent de faibles exigences d’entretien, la capacité d’irradier plusieurs types de plaques de culture, l’utilisation simultanée de jusqu’à quatre unités par essai, un faible poids (2 kg)/taille (44 cm3) qui permet la portabilité, une irradiation précise et reproductible (données non présentées) et une interface de configuration conviviale et simple qui ne nécessite pas de connexion à des ordinateurs ou à d’autres machines.
Certaines étapes critiques des protocoles de construction et d’exploitation ont donné lieu à des possibilités d’amélioration lors de la conception du projet. Comme une chambre PDT nécessite une émission de lumière homogène et une mesure d’énergie cohérente, les boîtiers internes et externes ont été scellés pour éviter à la fois les interférences lumineuses extérieures et les pertes de lumière émises. Des bandes velcro supplémentaires ont été fixées latéralement sur la porte frontale pour renforcer la fermeture de la chambre et assurer des expériences ininterrompues. Une LED représentative a été installée à l’unité de contrôle pour certifier la configuration RVB requise, indiquant la couleur et l’intensité de la lumière émise pendant le test. Enfin, le code de programmation a subi plusieurs mises à niveau pour affiner les mesures instantanées de densité et les quantités finales d’évaluations énergétiques, approuvant la reproductibilité et la cohérence mathématique. Parmi les autres détails majeurs qui nécessitent une attention particulière, citons: (i) la distribution homogène des LED et le positionnement central du capteur de luminosité pour obtenir des résultats représentatifs et équilibrés, (ii) l’installation de tous les composants selon le schéma électronique (Figure 2) et le code de programmation (Fichier supplémentaire 3, Fichier supplémentaire 4 et Fichier supplémentaire 5 ) pour assurer un fonctionnement correct, et (iii) la configuration (en conservant la même configuration RVB et temporelle) avant d’exécuter une expérience afin d’assurer des répliques cohérentes avec des résultats fiables. Bien que le système RVB fournisse plusieurs compositions de couleurs visibles avec des longueurs d’onde spécifiques, les expériences en lumière non visible nécessiteraient des mises à niveau de protocole spécifiques. Un organigramme décisionnel est présenté à la figure 5 pour fournir une approche systématique de résolution de problèmes afin de trouver et de corriger les problèmes ou les erreurs pendant l’opération.
Conçu pour répondre aux exigences de l’expérimentation in vitro avec des résultats validés obtenus avec l’activation thérapeutique de la vertéporfine pour induire une cytotoxicité dans les cellules HeLa 2D (Figure 4), le PhotoACT peut être recommandé pour les universités, les écoles, les industries et autres centres de recherche. Ce dispositif devrait étendre les avantages de la PDT à la recherche scientifique explorant le mécanisme d’action des photosensibilisateurs et leurs applications cliniques.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Acknowledgments
Nous remercions Arthur Henrique Gomes de Oliveira et Lucas Julian Cruz Gomes pour leur aide dans le processus de tournage. Ce projet a été soutenu par le Conseil brésilien de la recherche (CNPq, numéros de subvention 400953/2016-1-404286/2021-6) et Fundação Araucária-PPSUS 2020/2021 (SUS2020131000003). Cette étude a également été financée en partie par Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | Mammalian cell culture dissociation reagent |
| 3D printer | Flashforge | Finder model | |
| 96-well plates | Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture | ||
| Arduino | |||
| Brightness sensor | TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface | ||
| Buttons | |||
| Buzzer | |||
| Cell culture Flasks | Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes) | ||
| Centrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay | ||
| CO2 Incubator | |||
| Controller board | ESP32 | ||
| Design Software | Trimble | SketchUp | |
| DMEM High Glucose | Gibco | 11965092 | DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540-500ML | Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% (GC), suitable for plant cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12657029 | FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages. |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Gibco | 15750060 | Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination |
| Hemocytometer | Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay | ||
| Inverted Laboratory Microscope | Leica | DM IL LED | |
| Laminar Flow Hood | Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures | ||
| LCD display | |||
| LED RGB WS2812 | 5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts | ||
| MDF fiberboards | 3mm thickness medium-density fiberboards | ||
| Microcentrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay | ||
| Microplate reader | ThermoFischer | Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation. | |
| MTT Reagent | Invitrogen | M6494 | 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays |
| Operational System | Real Time Engineers ltd. | FreeRTOS | |
| P10 micripipette | Non-electronic, single-channel, 1-10 μL capacity | ||
| P1000 micropipette | Non-electronic, single-channel, 10-1000 μL capacity | ||
| P200 micropipette | Non-electronic, single-channel, 20-200 μL capacity | ||
| PDT Equipment | LumaCare | Model LC-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 | Gibco | 10010031 | Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures |
| Potentiometers | |||
| Tips | Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 μL maximum volumes | ||
| Verteporfin | Sigma-Aldrich | SML0534-5MG | Verteporfin, ≥94% (HPLC) |
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