Summary
Hier beschreiben wir ein neuartiges, einfaches und kostengünstiges Gerät zur erfolgreichen Durchführung von In-vitro-Tests der photodynamischen Therapie (PDT) unter Verwendung zweidimensionaler HeLa-Zellkultur und Verteporfin als Photosensibilisator.
Abstract
Dieser Artikel beschreibt ein neuartiges, einfaches und kostengünstiges Gerät zur Durchführung von In-vitro-Tests der photodynamischen Therapie (PDT), das PhotoACT genannt wird. Das Gerät wurde mit einem Satz herkömmlicher programmierbarer Leuchtdioden (LEDs), einem LCD-Modul (Liquid Crystal Display) und einem Lichtsensor gebaut, der an eine kommerzielle Mikrocontrollerplatine angeschlossen ist. Die kastenbasierte Struktur des Prototyps wurde mit mitteldichten Faserplatten (MDFs) hergestellt. Das interne Kompartiment kann gleichzeitig vier Zellkultur-Multiwell-Mikroplatten zuordnen.
Als Proof of Concept untersuchten wir die zytotoxische Wirkung des Photosensibilisators (PS) Verteporfin gegen die HeLa-Zelllinie in zweidimensionaler (2D) Kultur. HeLa-Zellen wurden 24 h lang mit steigenden Konzentrationen von Verteporfin behandelt. Das arzneimittelhaltige Überstandsmedium wurde verworfen, die adhärenten Zellen wurden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und medikamentenfreies Medium hinzugefügt. In dieser Studie wurde die Wirkung von Verteporfin auf Zellen entweder ohne Lichtexposition oder nach 1-stündiger Lichtexposition anhand von Rot-Grün-Blau (RGB) Werten von 255, 255 und 255 (durchschnittliche Fluenz von 49,1 ± 0,6 J/cm2) untersucht. Nach 24 h wurde die Zelllebensfähigkeit mit dem 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay beurteilt.
Experimentelle Ergebnisse zeigten, dass die Exposition von mit Verteporfin behandelten Zellen gegenüber dem Licht des Geräts die zytotoxische Wirkung des Arzneimittels über einen Mechanismus verstärkt, der durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) vermittelt wird. Darüber hinaus wurde die Verwendung des in dieser Arbeit beschriebenen Prototyps validiert, indem die Ergebnisse mit einem kommerziellen PDT-Gerät verglichen wurden. Somit stellt dieser LED-basierte photodynamische Therapieprototyp eine gute Alternative für in vitro Studien der PDT dar.
Introduction
Unter den tödlichsten nichtübertragbaren Krankheiten ist Krebs eine weltweit häufigste Ursache für vorzeitige Todesfälle. Im Jahr 2020 entfielen fast 10 Millionen Todesfälle, was etwa einem von sechs Todesfällen weltweit entspricht1. Darüber hinaus stellt das Phänomen der Multidrug-Resistenz (MDR) eine enorme Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar, da zugelassene chemotherapeutische Protokolle für diesen klinischen Zustand keine Remissionsstadien erreichen2. Krebszellen können durch mehrere Mechanismen eine Resistenz gegen Chemotherapie entwickeln; Die Überexpression einiger ATP-bindender Kassettentransporter (ABC) - ATP-abhängige Effluxpumpen - gilt jedoch als Hauptursache für die MDR-Entwicklung innerhalb einer Tumormikroumgebung3. Neben der MDR verstärken andere Krebskomplikationen wie Rezidive und Metastasen die dringende Notwendigkeit, therapeutische Ansätze zur Bewältigung dieser onkologischen Herausforderung zu entwickeln und zu verbessern.
Die kurative Nutzung von Licht wird seit Jahrhundertenpraktiziert 4, und die photodynamische Therapie (PDT) stellt einen klinisch anerkannten Therapieansatz für solide Tumore dar. Die PDT kombiniert die Verabreichung eines Photosensibilisators (PS), gefolgt von Lichtbestrahlung, um reaktive Sauerstoffspezies (ROS) zu erzeugen, um selektive Zytotoxizität in Tumorzellen auszuüben. Dieser therapeutische Ansatz ist herkömmlichen Methoden wie Operation, Bestrahlung und Chemotherapie überlegen5; Es handelt sich um eine minimalinvasive Technik, die eine geringere Zytotoxizität im Bindegewebe aufweist6. Die Lichtapplikation und die PS-Akkumulation direkt im Tumor oder seiner Mikroumgebung gewährleisten ein präzises Targeting und folglich geringe, unerwünschte systemische Nebenwirkungen7 und die Möglichkeit einer wiederholten Behandlung an derselben Stelle. Darüber hinaus sind die Kosten niedriger als bei anderen Ansätzen. Aufgrund ihrer vielversprechenden Eigenschaften kann die PDT als geeignete Option sowohl für die einzelne, insbesondere bei inoperablen Tumoren, als auch für die adjuvante Krebsbehandlung7 angesehen werden und stellt eine Alternative für MDR im Zusammenhang mit der Chemotherapiedar 8,9.
Der erste Bericht, der eine hohe objektive Ansprechrate unter Verwendung der PDT zeigte, wurde 1975 in einem Maus- und Rattenmodell10 beschrieben. Seitdem wurden Studien mit PDT mit positiven Ergebnissen7 sowohl in vivo als auch in vitro mit menschlichen Tumorzelllinien in 2D-Zellkulturdurchgeführt 11,12. Unter Berücksichtigung der breiten Anwendbarkeit klinisch zugelassener PS, unabhängig von ihren spezifischen Akkumulationswegen und Wellenlängenbereichen der Absorptionspeaks, ist der allgemeine Prozess wie folgt: (i) PS-Aufnahme, (ii) Spitzenwert der PS-Konzentration am Tumor oder seiner Mikroumgebung, (iii) Lichtanwendung, (iv) PS-Licht-Wechselwirkung, (v) Übertragung von PS-angeregter Energie entweder auf Gewebesubstrat oder umgebende Sauerstoffmoleküle, (vi) ROS-Produktion mit Singulett-Sauerstoff oder Superoxid-Anion, (vii) Tumorzelltod durch im Wesentlichen Nekrose oder Apoptose (direkter Tod), Autophagie (zytoprotektiver Mechanismus), Gewebeischämie (Gefäßschäden), Immunmodulation oder eine Überlappung dieser Mechanismen7. In diesem letzten Stadium hängt die Aktivierung eines spezifischen Zelltodwegs von vielen Faktoren ab, wie Zelleigenschaften, experimentellem Design und vor allem PS-intrazellulärer Lokalisation und PDT-bedingten gezielten Schäden13.
Verteporfin ist ein PS der zweiten Generation, das von Zulassungsbehörden für den klinischen Einsatz in Norwegen und China zur Behandlung der altersbedingten Makuladegeneration7 zugelassen wurde. Nach Dosisabgabe wurde berichtet, dass sich dieses Prodrug teilweise in Mitochondrienanreichert 14 und zelluläre Proteintyrosinphosphorylierung und DNA-Fragmentierung induziert, was zu einer Tumorzellapoptoseführt 15,16. Nach 24-stündiger Inkubation zur Verteporfin-Internalisierung wird ein PDT-Protokoll unter Verwendung eines Wellenlängenaufbaus von 690 nm empfohlen, um eine effektive elektromagnetische Strahlungsübertragung auf benachbarte Moleküle 7,17 zu erreichen.
Was die Lichtquelle für PDT betrifft, so sind die klassischen Diodenlasersysteme in der Regel teuer, technisch kompliziert, überdimensioniert und daher nicht portabel18,19. Aufgrund seines Single-Wellenlängen-Profils, das auch in LED-basierten PDT-Geräten beobachtet werden kann, macht die Nachfrage nach unabhängigen Einheiten für jede Photosensibilisator-Anwendung den Einsatz von Diodenlasersystemen noch komplexer und wirtschaftlich nicht realisierbar20,21. Daher gilt die Verwendung von LED-Maschinen als die vielversprechendste Alternative, um nicht nur Kosten 22 und Wartungsprobleme zu lösen, sondern auch eine hohe Leistung und weniger schädliche23 und eine breitere Beleuchtungsfähigkeit24,25,26,27 bereitzustellen.
Trotz des potenziellen Beitrags, den LED-basierte Geräte zu PDT-Experimenten leisten können28, weisen die meisten kommerziellen Optionen immer noch Nachteile auf, wie mangelnde Portabilität, hohe Kosten und komplexe Bauprojekte und Betrieb29. Das Hauptziel dieser Arbeit war es, ein einfaches und zuverlässiges Werkzeug für In-vitro-PDT-Assays anzubieten. Dieses Dokument beschreibt PhotoACT, ein selbst gebautes LED-basiertes PDT-Gerät, das kostengünstig, benutzerfreundlich und tragbar ist. Als Machbarkeitsnachweis wird gezeigt, dass dieses Gerät die Zytotoxizität von Verteporfin in einem 2D-Zellkulturmodell verbessert und daher als Forschungswerkzeug in PDT-Experimenten verwendet werden kann.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
HINWEIS: Details zu allen Materialien, Reagenzien und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden, finden Sie in der Materialtabelle .
1. Geräteaufbau
- Sägen Sie 3 mm dicke mitteldichte Faserplatten (MDF), um Teile mit den in Abbildung 1A gezeigten Abmessungen zu erhalten.
HINWEIS: Verwenden Sie die Vektordatei (Supplemental File 1) für CNC-Schneiden. - Bauen Sie zwei Boxen mit den folgenden Abmessungen (Länge x Breite x Höhe): 330 mm x 235 mm x 225 mm für die größeren Boxen und 300 mm x 220 mm x 150 m für die kleineren Boxen (Abbildung 1B).
- Bohren Sie die Rückseite des größeren Kartons, um einen Zylinderanschluss zu installieren. Bohren Sie die Oberseite des größeren Kastens und die Ober- und Unterseite des kleineren Kastens, um einen Durchgang für elektrische Kabel zu schaffen (Abbildung 1C).
- Bemalen Sie alle Innenflächen mit schwarzer Tinte, um einen homogenen Lichteinfall zu erzielen (Abbildung 1D).
- Bringen Sie parallel drei LED-Bänder mit jeweils 10 LEDs an der oberen Innenfläche des kleineren Kastens an (Abbildung 1E).
- Installieren Sie einen Helligkeitssensor in der Mitte der unteren Innenfläche des kleineren Gehäuses (Abbildung 1F).
- Drucken Sie die Struktur der Steuereinheit (Abbildung 1G) mit der 3D-Druckdatei (Zusatzdatei 2).
- Installieren Sie alle Komponenten (Netzschalter, Potentiometer, Zeit-/Start-Touchpad, LEDs, Helligkeitssensor, LCD, Summer und Netzteil) an den Anschlüssen einer ESP32-Steuerplatine, die im Inneren der Steuereinheit montiert ist (Abbildung 2).
- Laden Sie den Programmiercode hoch (Zusatzdatei 3, Zusatzdatei 4 und Zusatzdatei 5), und führen Sie einen Test durch, um zu überprüfen, ob alle Verbindungen funktionieren (Abbildung 1H).
- Montieren Sie die Boxen und befestigen Sie sie, um Lücken und folglich externe Lichtinterferenzen und emittierte Lichtverluste zu vermeiden. Befestigen Sie die montierte Steuereinheit am Bohrbereich oben am Prototyp (Abbildung 1I).
- Befestigen Sie eine Haustür aus dem gleichen Material und den Abmessungen 330 mm x 225 mm (Länge x Breite) an der größeren Box mit zwei kleinen Scharnieren. Befestigen Sie außerdem Klettbänder seitlich an der größeren Box, um den Prototypverschluss zu verstärken (Abbildung 1J). Installieren Sie einen Griff, um die Fronttür des Geräts zu manipulieren.
- Befestigen Sie vier Gummifußpolster an der Unterseite des Prototyps, um mehr Stabilität während des Betriebs zu gewährleisten (Abbildung 1K).
2. Zelllinien: Kultivierung, Aussaat und Behandlung
- Chemikalien
- Das Porphyrin wird in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst, um eine Konzentration von 100 mM zu erreichen.
ACHTUNG: DMSO muss vorsichtig gehandhabt werden (Handhabung mit persönlicher Schutzausrüstung und in einem belüfteten Bereich). Manipulieren Sie sowohl Stamm- als auch verdünnte Lösungen sorgfältig, um übermäßige Lichteinwirkung zu vermeiden.
- Das Porphyrin wird in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst, um eine Konzentration von 100 mM zu erreichen.
- Zelllinien
- Kultivieren Sie die HeLa-Zelllinie in Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM) Low-Glucose-Medium, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Gentamicin.
- Die Kulturkolben werden in einem 5%CO2-Zellkulturinkubator bei 37 °C aufbewahrt.
- Verwalten und inspizieren Sie die Zellen, bis sie 80% -90% Konfluenz erreichen.
- Aussaatprozess
- Das Kulturmedium aus dem Kolben nehmen.
- Waschen Sie die Zelleinschicht mit PBS.
- Die konfluente Zellkultur mit Trypsin-EDTA (0,5%) 1x für 5 min bei 37 °C ablösen. Stoppen Sie die Wirkung von Trypsin, indem Sie die Zellen mit Kulturmedium resuspendieren, das mit 10% fetalem Rinderserum und 1% Gentamicin ergänzt wird.
- Zählen Sie die resuspendierten Zellen mit einem Hämozytometer und säen Sie sie in eine 96-Well-Platte bei 2,0 × 104 Zellen / Well.
- Bereiten Sie zwei Platten für dunkle und helle Bedingungen vor.
- Inkubieren Sie die Platten für 24 h zur Zellbefestigung.
- Behandlungsablauf
- Entfernen Sie das Medium von beiden 96-Well-Platten.
- Behandeln Sie die Zellen mit 100 μL steigender Konzentrationen von Verteporfin (0,045 bis 24 μM, serielle Verdünnung).
- Inkubieren Sie die Zellen mit einer medikamentösen Behandlung für 24 Stunden, um die Internalisierung von Verteporfin zu ermöglichen.
- Nach 24 h verwerfen Sie das Medium, das das Arzneimittel enthält, waschen Sie die Monoschicht der Zellen mit PBS (100 μL) und fügen Sie ein arzneimittelfreies Medium (100 μL) hinzu.
- Bedecken Sie eine Mikroplatte mit Aluminiumfolie, um sie vor Lichteinwirkung zu schützen, und inkubieren Sie sie für 24 Stunden. Diese Platte liefert Kontrolldaten für PDT-Ergebnisse (dunkler Zustand). Die andere Mikroplatte wird für die Lichtexpositionsbedingungen im Gerät verwendet.
3. Gerätebetrieb
- Schließen Sie das PDT-Gerät an die Steckdose an und schalten Sie es durch Drücken des Netzschalters ein.
- Legen Sie die andere Mikroplatte (Lichtbedingung) in das PDT-Gerät und schließen Sie das Gerät, indem Sie die Haustür mit den Klettbändern befestigen.
- Verwenden Sie die Potentiometer, um die RGB-Konfiguration anzupassen (hier ein RGB 255, 255, 255-Experiment ) und die Farbe der Lichtemission einzustellen.
HINWEIS: Jede RGB-Kombination hat ein spezifisches Emissionsspektrum, das für Experimente mit verschiedenen Photosensibilisatoren und folglich unterschiedliche Absorptionskurven angepasst werden muss. - Drücken Sie das (+)/(-) Touchpad, um die Zeitkonfiguration anzupassen (hier ein 60-minütiges Experiment) und die Dauer des Assays einzustellen.
HINWEIS: Die Zeitkonfiguration in Verbindung mit dem Bestrahlungsstärkewert bestimmt die Fluenz des Prozesses - die im Assay angewendete Lichtdosis. - Überprüfen Sie die Setup-Informationen am Display.
- Drücken Sie die Taste Start , um den Assay zu starten. Stellen Sie sicher, dass zu Beginn des Assays ein Signalton zu hören ist.
- Beobachten Sie im Verlauf des Experiments Echtzeitinformationen auf dem Display, wie Bestrahlungsstärke und verbleibende Zeit.
- Öffnen Sie während des PDT-Tests nicht die Frontklappe und ändern Sie keine Konfiguration.
- Warten Sie am Ende des Assays auf einen Summer mit vier Signaltönen und darauf, dass das elektronische System alle LEDs ausgeschaltet hat. Beachten Sie die Meldung Beendet und die endgültige Menge an Energie, die während des Experiments aufgewendet wurde - Fluence - im Display.
HINWEIS: Der Fluence-Endwert wird anhand von Gleichung (1) berechnet:
(1)
Dabei ist F gleich J/cm 2 und I gleich mW/cm 2 oder mJ/s·cm 2. Der Bestrahlungsstärkewert berücksichtigt die Potenz der LEDs (emittierende Quelle) und die gleichmäßig bestrahlte Fläche der Dunkelkammer (660 cm 2) (Gleichung [2]):
(2)
Der theoretische Bestrahlungsstärkewert wird während des gesamten PDT-Assays auf dem Gerätedisplay angezeigt. Verwenden Sie am Ende des Vorgangs Gleichung (3), um die Fluenz zu berechnen:
Fluenz (F) = Bestrahlungsstärke (I, konstanter Wert) × Betriebszeit(en ) (3)
(1)
(2)4. Zelllebensfähigkeitstest
- Nach dem PDT-Test die Mikroplatte, die Licht ausgesetzt wurde, abdecken und 24 h inkubieren.
- Nach der Inkubationszeit das Kulturmedium von beiden Platten entfernen, die Monoschicht der Zellen mit PBS (100 μL) waschen und MTT-Lösung (0,5 mg / ml, 100 μL) hinzufügen. Inkubieren Sie beide Platten - dunkle und helle Bedingungen - für 4 Stunden, um die Bildung von Formazankristallen zu ermöglichen.
- Entfernen Sie die MTT-Lösung vorsichtig und lösen Sie die violetten Kristalle mit einer DMSO/Ethanol-Lösung (1:1) auf.
- Nach vollständiger Auflösung der Kristalle wird die Absorptionsmessung mit einem Mikrotiterplattenleser bei 595 nm durchgeführt.
HINWEIS: Das Gerät kann in anderen wichtigen Experimenten verwendet werden, wie dem ROS-vermittelten Zelltod, der durch Photosensibilisatoren nach Lichtexposition durch Durchflusszytometrie30 ausgelöst wird.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Das letzte PDT-Gerät mit dem Namen PhotoACT enthielt eine dunkle Kammer zur Zuweisung von bis zu vier Multiwell-Mikrotiterplatten, wobei die obere Innenfläche mit einem Satz von 30 gestreuten LEDs ausgestattet war, die so programmiert waren, dass sie unterschiedliche Spektren sichtbaren Lichts emittieren (Abbildung 3 und Zusatzdatei 6). Das Gerät bestand aus zwei zugehörigen Boxen: einer internen Box, die als dunkle Kammer für die PDT-Assays konzipiert war, und einer externen Box, um die interne Kammer abzudecken und die Steuereinheit aufzunehmen (Abbildung 1B). Die interne Box war schwarz lackiert (Abbildung 1D) und bestand aus einem Bandmodell aus LED RGB WS2812 (oder WS281B) mit 30 LEDs und von 1 m Länge (das später in drei Teile geschnitten wurde) und 9 Watt, das einen eingebauten Prozessor enthält. Diese Vorrichtung ermöglichte eine kontrolliertere Nutzung und folglich eine genauere Farbemission. Die 30 LEDs waren durch drei parallele Bänder mit je 10 LEDs gleichmäßig über die gesamte obere Innenfläche der PDT-Kammer verteilt (Abbildung 1E). Durch die geringe Reflektivität der schwarzen Innenflächen und die gleichmäßige Verteilung der LED-Konfiguration wurde ein homogener Lichteinfall hergestellt. Ein TSL2561-Helligkeitssensor wurde ebenfalls in die untere Mitte der internen Box integriert, um den Lichteinfall anzuzeigen und als Qualitätskontrollwerkzeug zu dienen, um die gleichmäßige Bestrahlung innerhalb der dunklen Kammer zu gewährleisten (Zusatztabelle S1) und die Leistung des LED-Systems zu überwachen, von dem bekannt ist, dass es eine bestimmte Anzahl von Stunden Nutzungsdauer hat (Abbildung 1F ). Die äußere Box ist eine Struktur, die die innere Box bedeckt und aus sechs MDF-Teilen besteht, grau lackiert und lasergeschnitten, um eine perfekte Passform zu erzielen (Abbildungen 1A, B). Die Steuereinheit wurde mit der Online-Software 31 entworfen, mit Polymilchsäure als Einzelteil mit einem 3D-Drucker in3D gedruckt und grau lackiert. Es enthält alle elektronischen Komponenten, einschließlich Anzeige, Potentiometer, Tasten und einen Summer (Abbildung 1I und Abbildung 2).
Um unabhängige Lichteinfallsanpassungen zu ermöglichen, wurde die ESP32-Controllerplatine ausgewählt, um die Steuereinheit zu integrieren (Abbildung 2). Diese Konfiguration sollte eine USB-Schnittstelle für die Programmierung, Bluetooth, Wi-Fi, Dual-Core-Prozessor, zahlreiche Ports und die Möglichkeit zur Kommunikation mit einem interintegrierten Schaltkreis (I2C), einer seriellen Peripherieschnittstelle (SPI) und anderen Schnittstellen ermöglichen. Um das System zu bedienen, wurde ein Programm in C-Sprache über eine integrierte Entwicklungsumgebung (IDE) geschrieben. Die Codestruktur32 basiert auf FreeRTOS, einem freien Echtzeit-Betriebssystem, das vom ESP32-Controller-Board unterstützt wird. Die genannte Logik ermöglicht eine unabhängige Anwendungsprogrammierung, die von ESP32 in abgestuften oder parallelen Ansätzen verarbeitet werden kann, wodurch das Projekt und seine Wartungs-, Verbesserungs- und Aktualisierungsprozesse viel vielseitiger und sicherer werden.
Die Schnittstelle zwischen Maschine und Bediener ist benutzerfreundlich und bestand aus einer Flüssigkristallanzeige (LCD), Potentiometern, Tasten und einem Summer (Abbildung 3 und Zusatzdatei 6). Das kleine, 16 mm x 2 mm (Spalten vs. Linien) LCD verfügte über einen integrierten HD44780-Controller mit einem I2C-Kommunikationsprotokoll, der die einfache Installation bzw. Übertragungsvielseitigkeit verleiht. Das vorläufige Setup beinhaltet RGB- und Zeiteinstellungen durch den Bediener. Die Lichtstärke und Farbkonfiguration kann mit den Potentiometern eingestellt werden, die die Intensität (0 bis 255) der drei Grundfarbkomponenten RGB ändern. Diese Anpassungen können zu mehreren Farbkompositionen führen, die in der internationalen RGB-Farbtabelle33 behandelt werden. Jede RGB-Komposition besitzt eine bestimmte Wellenlänge, die entsprechend der im PDT-Experiment verwendeten PS angepasst werden muss. die Absorptionskurve des PS und die Wellenlänge der Bestrahlung müssen überlappt werden, damit die Photoaktivierung zufriedenstellend abläuft (ergänzende Abbildung S1). Entlang des Prozesses kann der Betriebsstatus mit der verbleibenden Zeit und Lichteinfallsinformationen auf dem LCD abgerufen werden.
Am Ende der programmierten Zeit schaltete die Elektronik alle LEDs aus, gab eine akustische Warnung aus und zeigte auf dem Display die Gesamtenergiemenge pro Fläche (J/cm²) an, die durch Multiplikation des konstanten Wertes der Bestrahlungsstärke mit der Betriebszeit in Sekunden berechnet wurde. Dieses digitale Modell bot eine breite Palette von Erkennungspegeln (Grenzen zwischen 0,1 und 40.000+ Lux), eine I2C-Schnittstelle und eine geringe Intensität des elektrischen Stroms (0,5 mA bzw. 15 μA im Betriebs- bzw. Standby-Status).
Als Proof of Concept wurde das Gerät verwendet, um die zytotoxische Wirkung von Verteporfin in 2D-HeLa-Zellkultur nach Lichtexposition von 1 h (49,1 ± 0,6 J/cm2) zu verstärken. Wie in Abbildung 4A dargestellt, betrug der GI50-Wert 3,1 μM für die hellen Bedingungen und 13,8 μM für die dunklen Bedingungen. Somit bestätigte die 4,4-fache Verschiebung im Vergleich der Bedingungen die Verwendung von Verteporfin als PS und die Anwendbarkeit von PhotoACT auf PDT-Assays. Um die Verwendung des in dieser Arbeit beschriebenen Prototyps zu validieren, wurde ein kommerzielles PDT-Gerät unter den gleichen experimentellen Bedingungen verwendet, einschließlich PS, Zellen und Fluence, und die Ergebnisse verglichen. Wie in Abbildung 4B gezeigt, photoaktivierten beide Geräte Verteporfin gleichermaßen, was die zytotoxische Wirkung verstärkt. Diese Ergebnisse bestätigten die Anwendbarkeit in selbst gebauten PDT-Geräten (Abbildung 4A,B). Schließlich wurde der ROS-vermittelte Zelltod, der durch Verteporfin nach Lichtexposition ausgelöst wurde, durch Durchflusszytometrie mittels DCFDA-Assay bestätigt (Abbildung 4C,D).
Abbildung 1: PhotoACT Bau- und Montageanleitung. Detaillierte Darstellung des Aufbaus, Bohrens, Lackierens, Montierens und Zubehörs von Komponenten im Gerät. Das Bedienfeld zeigt eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zum Bau des Geräts. Abkürzung: LED = Leuchtdiode. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Aufbau der Steuereinheit und elektronische Montageanleitung. Vergrößerte Ansichtszeichnung der explodierten Steuereinheit und detailliertes Schema der elektronischen Verbindungen an ESP32-Controller-Board-Ports mit Verbindungen und Komponenten, die im Prototyp verwendet wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: PhotoACT-Darstellung. Montagezeichnung des endgültigen Produktdesigns mit Stückliste, Beschriftungsballons und Detailansicht der oberen Innen-LEDs. Die Abbildung ermöglicht es, Teile und Komponenten des Prototyps zu identifizieren. Abkürzungen: MDF = mitteldichte Faserplatte; LED = Leuchtdiode. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: In-vitro-Phototoxizität von Verteporfin und ROS-Erzeugung . (A,B) Zelllebensfähigkeitstest mit der MTT-Methode: Die Assays wurden durchgeführt, um das zytotoxische Profil des Photosensibilisators Verteporfin bei verschiedenen Konzentrationen zu bewerten. HeLa-Zellen wurden 24 Stunden lang mit unterschiedlichen Konzentrationen von Verteporfin (0,045-24 μM) behandelt, Licht (PhotoACT (A) oder kommerziellen PDT-Geräten (B)) oder dunklen Bedingungen ausgesetzt und dann dem MTT-Test unterzogen. Beide Bedingungen zeigten eine verminderte Zelllebensfähigkeit bei höheren Konzentrationen von Verteporfin, aber die Lichtexposition, die aus PDT-Assays gewonnen wurde, verstärkte das zytotoxische Profil des PS, was bedeutet, dass die PDT die Zytotoxizität von Verteporfin erhöht. Die Rentabilitätskurven wurden mit der Software GraphPad Prism 6 angepasst. (C,D) HeLa-Zellen wurden 24 h lang mit niedrigen und hohen Konzentrationen von Verteporfin (0,187 μM und 6 μM) behandelt und dann hellen (PhotoACT) oder dunklen Bedingungen ausgesetzt. Die intrazellulären ROS-Spiegel wurden nach Bestrahlung mittels Durchflusszytometrie mit DCFDA-Sonde gemessen (Inkubation für 30 min bei 1 μM). Eine Rechtsverschiebung zwischen den Histogrammen implizierte eine höhere Fluoreszenzintensität aufgrund einer höheren intrazellulären Akkumulation von DCF und damit höhere ROS-Spiegel. Die Ergebnisse zeigten keinen relevanten Unterschied in den ROS-Spiegeln im dunklen Zustand (C), zeigten jedoch einen Dosis-Wirkungs-Anstieg der ROS-Spiegel nach Verteporfin-Photoaktivierung (D). Abkürzungen: ROS = reaktive Sauerstoffspezies; DCF = 2',7'-Dichlorfluorescein; DCFDA = 2',7'-Dichlorhydrofluoresceindiacetat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Entscheidungsflussdiagramm des Geräts: vorläufige Einrichtung und Fehlerbehebung im Betrieb. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung S1: Überlappung zwischen der Absorptionskurve von Verteporfin und dem LED-Emissionsspektrum des Gerätes. Absorptionsspektrum von Verteporfin mit seinen spezifischen Absorptionspeaks (x,y') und LED-Emissionsspektrum von RGB 255, 255, 255-weißer Farbe (3.700K-5.000K CCT), das zur Photoaktivierung des Photosensibilisators (x,y'') verwendet wird. Die Überlappung zwischen den unterschiedlichen Absorptionspeaks von Verteporfin und dem weiß bestrahlenden Licht bestätigt die Photoaktivierung des Photosensibilisators, was auch durch die biologischen Ergebnisse bestätigt wurde. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle S1: Prüfungen der Gleichmäßigkeit der Bestrahlung. Sofortige Leuchtkraft (Lumen), gemessen vom Helligkeitssensor an verschiedenen Punkten der bestrahlten Fläche. Die vorgestellten Ergebnisse zeigen keine ausdrucksstarken Variationen, die die gleichmäßige Bestrahlung des Gerätes belegen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Zusatzdatei 1: Vektordatei zum Schneiden. Zeichnungsdatei (DWG) zum Schneiden von MDF-Platten. Die Datei muss für CNC-Schneiden (Computer Numerical Control) verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Datei 2: 3D-Druckdatei der Gerätesteuerung. Stereolithographie-Datei (STL) zum 3D-Drucken der Steuereinheit des Geräts. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Datei 3: C-Programmiercode. Programmiercode, der in der Sprache C für die Konfiguration der Steuereinheit des Geräts entwickelt wurde. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Datei 4: INO-Programmiercode. Programmiercode, der in INO-Sprache entwickelt wurde, um die Steuereinheit der Ausrüstung zu konfigurieren. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Datei 5: Kompilierungsanweisungen. Markdown (MD) "READ ME" Datei mit zusätzlichen Anweisungen zur Programmierung der Codekompilierung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Datei 6: Entwurfsmodell des Geräts. Vorschau der dreidimensionalen Modelldatei Standard for the Exchange of Product Data (STEP) zur allgemeinen Visualisierung des Prototyps. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Das endgültige PhotoACT-Gerät war bequem mit kommerziell erhältlichen, kostengünstigen Komponenten zu Gesamtkosten von weniger als 50 US-Dollar zu konstruieren. Weitere Vorteile sind ein geringer Wartungsaufwand, die Fähigkeit, mehrere Arten von Kulturplatten zu bestrahlen, die gleichzeitige Verwendung von bis zu vier Einheiten pro Assay, ein geringes Gewicht (2 kg)/Größe (44 cm3), das Portabilität, genaue und reproduzierbare Bestrahlung (Daten nicht gezeigt) ermöglicht, und eine benutzerfreundliche und einfache Setup-Oberfläche, die keine Verbindung zu Computern oder anderen Maschinen erfordert.
Bestimmte kritische Schritte sowohl der Bau- als auch der Betriebsprotokolle führten zu Verbesserungsmöglichkeiten bei der Projektkonzeption. Da eine PDT-Kammer eine homogene Lichtemission und eine konsistente Energiemessung erfordert, wurden die internen und externen Boxen abgedichtet, um sowohl äußere Lichtinterferenzen als auch emittierte Lichtverluste zu vermeiden. Zusätzliche Klettbänder wurden seitlich an der Fronttür angebracht, um den Kammerverschluss zu verstärken und ununterbrochene Experimente zu gewährleisten. Eine repräsentative LED wurde an der Steuereinheit installiert, um die erforderliche RGB-Konfiguration zu zertifizieren, die die Farbe und Intensität des emittierten Lichts während des Assays anzeigt. Schließlich wurde der Programmiercode mehreren Upgrades unterzogen, um sofortige Dichtemessungen und Endmengen von Energiebewertungen zu verfeinern und Reproduzierbarkeit und mathematische Konsistenz zu unterstützen. Einige andere wichtige Details, die besondere Aufmerksamkeit erfordern, sind: (i) homogene Verteilung der LEDs und zentrale Positionierung des Helligkeitssensors, um repräsentative und ausgewogene Ergebnisse zu erhalten, (ii) Installation aller Komponenten gemäß dem elektronischen Diagramm (Abbildung 2) und dem Programmiercode (Zusatzdatei 3, Zusatzdatei 4 und Zusatzdatei 5). ), um einen korrekten Betrieb sicherzustellen, und (iii) das Setup (unter Beibehaltung der gleichen RGB- und Zeitkonfiguration) vor dem Ausführen eines Experiments, um konsistente Replikationen mit zuverlässigen Ergebnissen zu gewährleisten. Obwohl das RGB-System mehrere sichtbare Farbkompositionen mit bestimmten Wellenlängen bereitstellt, würden Experimente mit nicht sichtbarem Licht spezifische Protokollaktualisierungen erfordern. Abbildung 5 zeigt ein Entscheidungsflussdiagramm, das einen systematischen Problemlösungsansatz zum Auffinden und Beheben von Problemen oder Fehlern während des Betriebs bietet.
Das PhotoACT wurde entwickelt, um die Anforderungen von In-vitro-Experimenten mit validierten Ergebnissen zu erfüllen, die mit der therapeutischen Aktivierung von Verteporfin zur Induktion von Zytotoxizität in 2D-HeLa-Zellen erzielt wurden (Abbildung 4), und kann für Universitäten, Schulen, Industrien und andere Forschungszentren empfohlen werden. Dieses Gerät sollte die Vorteile der PDT auf die wissenschaftliche Forschung ausdehnen, die den Wirkmechanismus von Photosensibilisatoren und ihre klinischen Anwendungen erforscht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir danken Arthur Henrique Gomes de Oliveira und Lucas Julian Cruz Gomes für die Unterstützung bei den Dreharbeiten. Dieses Projekt wurde vom brasilianischen Forschungsrat (CNPq, Förderkennzeichen 400953/2016-1-404286/2021-6) und der Fundação Araucária-PPSUS 2020/2021 (SUS2020131000003) unterstützt. Diese Studie wurde auch teilweise von Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001 finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | Mammalian cell culture dissociation reagent |
| 3D printer | Flashforge | Finder model | |
| 96-well plates | Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture | ||
| Arduino | |||
| Brightness sensor | TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface | ||
| Buttons | |||
| Buzzer | |||
| Cell culture Flasks | Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes) | ||
| Centrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay | ||
| CO2 Incubator | |||
| Controller board | ESP32 | ||
| Design Software | Trimble | SketchUp | |
| DMEM High Glucose | Gibco | 11965092 | DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540-500ML | Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% (GC), suitable for plant cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12657029 | FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages. |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Gibco | 15750060 | Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination |
| Hemocytometer | Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay | ||
| Inverted Laboratory Microscope | Leica | DM IL LED | |
| Laminar Flow Hood | Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures | ||
| LCD display | |||
| LED RGB WS2812 | 5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts | ||
| MDF fiberboards | 3mm thickness medium-density fiberboards | ||
| Microcentrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay | ||
| Microplate reader | ThermoFischer | Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation. | |
| MTT Reagent | Invitrogen | M6494 | 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays |
| Operational System | Real Time Engineers ltd. | FreeRTOS | |
| P10 micripipette | Non-electronic, single-channel, 1-10 μL capacity | ||
| P1000 micropipette | Non-electronic, single-channel, 10-1000 μL capacity | ||
| P200 micropipette | Non-electronic, single-channel, 20-200 μL capacity | ||
| PDT Equipment | LumaCare | Model LC-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 | Gibco | 10010031 | Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures |
| Potentiometers | |||
| Tips | Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 μL maximum volumes | ||
| Verteporfin | Sigma-Aldrich | SML0534-5MG | Verteporfin, ≥94% (HPLC) |
References
- Ferlay, J., et al. International agency for research on cancer. Global Cancer Observatory: Cancer Today. 23 (7), https://gco.iarc.fr/today/home 323-326 (2018).
- Gottesman, M. M., Fojo, T., Bates, S. E. Multidrug resistance in cancer: role of Atp-dependent transporters. Nature Reviews Cancer. 2 (1), 48-58 (2002).
- Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Boothe-Genthe, C., Gottesman, G. A. Targeting multidrug resistance in cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 219-234 (2006).
- Ackroyd, R., Kelty, C., Brown, N., Reed, M. The history of photodetection and photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 74 (5), 656-669 (2001).
- Hamblin, M. R. Photodynamic therapy for cancer: what's past is prologue. Photochemistry and Photobiology. 96 (3), 506-516 (2020).
- Barr, H., et al. The contrasting mechanisms of colonic collagen damage between photodynamic therapy and thermal injury. Photochem Photobiol. 46 (5), 795-800 (1987).
- Algorri, J. F., Ochoa, M., Roldán-Varona, P., Rodríguez-Cobo, L., López-Higuera, J. M. Photodynamic therapy: A compendium of latest reviews. Cancers. 13 (17), 4447 (2021).
- Aniogo, E. C., Plackal, B., George, B. P. A., Abrahamse, H. The role of photodynamic therapy on multidrug resistant breast cancer. Cancer Cell International. 19, 91 (2019).
- Spring, B. Q., Rizvi, I., Xu, N., Hasan, T. The role of photodynamic therapy in overcoming cancer drug resistance. Photochemical & Photobiological Sciences. 14 (8), 1476-1491 (2015).
- Dougherty, T. J., Grindey, G. B., Fiel, R., Weishaupt, K. R., Boyle, D. G. Photoradiation therapy. II. Cure of animal tumors with hematoporphyrin and light. Journal of the National Cancer Institute. 55 (1), 115-121 (1975).
- Etcheverry, M. E., Pasquale, M. A., Garavaglia, M. Photodynamic therapy of HeLa cell cultures by using LED or laser sources. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 160, 271-277 (2016).
- Guo, Q., Dong, B., Nan, F., Guan, D., Zhang, Y. 5-Aminolevulinic acid photodynamic therapy in human cervical cancer via the activation of microRNA-143 and suppression of the Bcl-2/Bax signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 14 (1), 544-550 (2016).
- Mroz, P., Yaroslavsky, A., Kharkwal, G. B., Hamblin, M. R. Cell death pathways in photodynamic therapy of cancer. Cancers. 3 (2), 2516-2539 (2011).
- Mahalingam, S. M., Ordaz, J. D., Low, P. S. Targeting of a photosensitizer to the mitochondrion enhances the potency of photodynamic therapy. ACS Omega. 3 (6), 6066-6074 (2018).
- Granville, D. J., Levy, J. G., Hunt, D. W. C. Photodynamic treatment with benzoporphyrin derivative monoacid ring A produces protein tyrosine phosphorylation events and DNA fragmentation in murine P815 cells. Photochemistry and Photobiology. 67 (3), 358-362 (1998).
- Castano, A. P., Demidova, T. N., Hamblin, M. R. Mechanisms in photodynamic therapy: part two - cellular signaling, cell metabolism and modes of cell death. Photodiagnosis Photodynamic Therapy. 2 (1), 1-23 (2014).
- Detty, M. R., Gibson, S. L., Wagner, S. J. Current clinical and preclinical photosensitizers for use in photodynamic therapy. Journal of Medicinal Chemistry. 47 (16), 3897-3915 (2004).
- Allison, R. R. Photodynamic therapy: oncologic horizons. Future Oncology. 10 (1), 123-142 (2014).
- Chepurna, O., et al. Photodynamic therapy with laser scanning mode of tumor irradiation. Optical Fibers and Their Applications 2015. 9816, 323-326 (2015).
- Huang, Z. A review of progress in clinical photodynamic therapy. Technology in Cancer Research and Treatment. 4 (3), 283-293 (2005).
- Chepurna, O., et al. LED-based portable light source for photodynamic therapy. Optics in Health Care and Biomedical Optics. 11190, 109-115 (2019).
- Hasson, O., Wishkerman, A. CultureLED: A 3D printer-based LED illumination cultivation system for multi-well culture plates. HardwareX. 12, 00323 (2022).
- Wu, X., et al. Localised light delivery on melanoma cells using optical microneedles. Biomedical Optics Express. 13 (2), 1045-1060 (2022).
- Erkiert-Polguj, A., Halbina, A., Polak-Pacholczyk, I., Rotsztejn, H. Light-emitting diodes in photodynamic therapy in non-melanoma skin cancers-own observations and literature review. Journal of Cosmetic and Laser Therapy. 18 (2), 105-110 (2016).
- Neupane, J., Ghimire, S., Shakya, S., Chaudhary, L., Shrivastava, V. P. Effect of light emitting diodes in the photodynamic therapy of rheumatoid arthritis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 7 (1), 44-49 (2010).
- Lins, E. C., et al. A novel 785-nm laser diode-based system for standardization of cell culture irradiation. Photomedicine and Laser Surgery. 31 (10), 466-473 (2013).
- Hopkins, S. L., et al. An In vitro cell irradiation protocol for testing photopharmaceuticals and the effect of blue, green, and red light on human cancer cell lines. Photochemical and Photobiological Sciences. 15 (5), 644-653 (2016).
- Zhang, K., Waguespack, M., Kercher, E. M., Spring, B. Q. An automated and stable LED array illumination system for multiwell plate cell culture photodynamic therapy experiments. Research Square. , 1-18 (2022).
- Gálvez, E. N., et al. Analysis and evaluation of the operational characteristics of a new photodynamic therapy device. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 37, 102719 (2022).
- Bretin, L., et al. Photodynamic therapy activity of new human colorectal cancer. Cancers. 11 (10), 1474 (2019).
- T. SketchUp. , Available from: https://www.sketchup.com/ (2022).
- LCDR PhotoDynamic Therapy (PDT) Equipment Repository. GitHub, Inc. , Available from: https://github.com/PhotoDynamicTherapy (2022).
- W3C CSS Color Module Level 3. W3C, Inc. , Available from: https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB (2022).
