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Biochemistry

2D細胞培養モデルにおけるベルテポルフィン細胞毒性を高めるための自作発光ダイオードベースの光線力学治療装置

Published: January 13, 2023 doi: 10.3791/64391

Summary

ここでは、2次元HeLa細胞培養と光増感剤としての椎体を使用する in vitro 光線力学療法(PDT)アッセイを成功させるための、新しくてシンプルで低コストのデバイスについて説明します。

Abstract

この論文では、PhotoACTと呼ばれる 、in vitro 光線力学療法(PDT)アッセイを実行するための新しい、シンプルで低コストのデバイスについて説明します。このデバイスは、従来のプログラマブル発光ダイオード(LED)、液晶ディスプレイ(LCD)モジュール、および商用マイクロコントローラボードに接続された光センサのセットを使用して構築されました。プロトタイプのボックスベースの構造は、中密度ファイバーボード(MDF)で作られました。内部コンパートメントには、4つの細胞培養マルチウェルマイクロプレートを同時に配置できます。

概念実証として、HeLa細胞株に対する光増感剤(PS)バーテポルフィンの細胞毒性効果を2次元(2D)培養で研究しました。HeLa細胞を、増加濃度のバーテポルフィンで24時間処理した。薬物含有上清培地を廃棄し、接着細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、薬物非含有培地を加えた。この研究では、細胞に対する椎骨の影響を、光に曝露しない場合、または光に1時間曝露した後、赤緑青(RGB)値255、255、および255(平均フルエンス49.1±0.6 J / cm2)を使用して調べました。24時間後、細胞生存率は、3−(4,5−ジメチル−2−チアゾリル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)アッセイによって評価した。

実験結果は、椎骨で処理された細胞をデバイスからの光に曝露すると、活性酸素種(ROS)によって媒介されるメカニズム を介して 薬物の細胞毒性効果が高まることを示しました。さらに、この作業で説明されているプロトタイプの使用は、結果を市販のPDTデバイスと比較することによって検証されました。したがって、このLEDベースの光線力学療法プロトタイプは、PDTの in vitro 研究のための良い代替手段を表しています。

Introduction

最も致命的な非感染性疾患の中で、癌は早死の世界的な主要な原因を表しています。2020年には1,000万人近くが死亡し、世界の約6人に1人が死亡しました1。さらに、多剤耐性(MDR)現象は、承認された化学療法プロトコルがこの臨床状態の寛解段階に到達できないため、公衆衛生上の大きな脅威を表しています2。癌細胞は、いくつかのメカニズムを通じて化学療法に対する耐性を発達させることができます。しかし、一部のATP結合カセット(ABC)トランスポーター(ATP依存性排出ポンプ)の過剰発現は、腫瘍微小環境内でのMDR発生の主な原因と考えられています3。MDRに加えて、再発や転移などの他の癌合併症は、この腫瘍学的課題を克服するための治療アプローチを開発および改善するという緊急の要求を強化します。

光の治療的利用は何世紀にもわたって実践されており4、光線力学療法(PDT)は、固形腫瘍の臨床的に承認された治療アプローチを表しています。PDTは、光増感剤(PS)の投与とそれに続く光照射を組み合わせて活性酸素種(ROS)を生成し、腫瘍細胞に選択的な細胞毒性を発揮します。この治療アプローチは、手術、放射線療法、化学療法などの従来の方法よりも優れています5。これは、結合組織6においてより低い細胞毒性を示す低侵襲技術である。腫瘍またはその微小環境に直接光を当ててPSを蓄積することで、正確な標的化が保証され、その結果、軽微で望ましくない全身性の副作用7と、同じ部位での繰り返し治療の可能性が保証されます。さらに、コストは他のアプローチよりも低くなります。その有望な特徴により、PDTは、特に手術不能な腫瘍の場合の単一または補助的な癌治療7の両方にとって適切な選択肢と見なすことができ、化学療法に関連するMDRの代替手段となります8,9

PDTを用いた高い客観的奏効率を示す最初の報告は、マウスおよびラットモデル10において1975年に記載された。それ以来、PDTを用いて研究が行われ、2D細胞培養におけるヒト腫瘍細胞株を用いたin vivoおよびin vitroの両方で陽性の結果7が得られました11,12。臨床的に承認されたPSの幅広い適用性を考慮すると、それらの特定の蓄積経路および吸収ピークの波長範囲にかかわらず、一般的なプロセスは以下の通りである:(i)PS取り込み、(ii)腫瘍またはその微小環境におけるPS濃度のピーク、(iii)光の適用、(iv)PS光相互作用、(v)PS励起状態エネルギーの組織基質または周囲の酸素分子のいずれかへの伝達、 (vi)一重項酸素またはスーパーオキシドアニオンを含むROS産生、(vii)腫瘍細胞死を介した、本質的に、壊死またはアポトーシス(直接死)、オートファジー(細胞保護機構)、組織虚血(血管損傷)、免疫調節、またはこれらの機構の重複7。この最終段階では、特定の細胞死経路の活性化は、細胞特性、実験デザイン、そして最も重要なことに、PS細胞内局在およびPDT関連の標的損傷などの多くの要因に依存する13

Verteporfinは第2世代のPSであり、加齢黄斑変性症を治療するためにノルウェーと中国で臨床使用するために規制当局によって承認されています7。用量送達後、このプロドラッグはミトコンドリアに部分的に蓄積し14、細胞タンパク質チロシンリン酸化およびDNA断片化を誘導し、腫瘍細胞のアポトーシスをもたらすことが報告された15,16。椎骨のインターナリゼーションのための24時間のインキュベーション後、隣接する分子への電磁放射伝達の有効レベルを達成するために、690nmの波長設定を使用するPDTプロトコルが推奨されます7,17

PDTの光源に関しては、従来のダイオードレーザーシステムは通常高価で、技術的に複雑で、特大であるため、持ち運びが困難です18,19。LEDベースのPDT機器でも観察できる単一波長プロファイルの結果として、各光増感剤アプリケーションのための独立したユニットの需要は、ダイオードレーザーシステムの利用をさらに複雑にし、経済的に実行不可能にします20,21。したがって、LED機械の利用は、コスト22とメンテナンスの問題を解決するだけでなく、高出力と害の少ない23とより広い照明能力を提供する最も有望な代替手段と考えられています24,25,26,27。

LEDベースの機器がPDT実験28に提供できる潜在的な貢献にもかかわらず、ほとんどの商用オプションには、携帯性の欠如、高コスト、複雑な建設プロジェクトおよび操作29などの欠点が依然としてあります。この研究の主な目的は、 in vitro PDTアッセイのためのシンプルで信頼性の高いツールを提供することでした。本稿では、安価で使いやすく、ポータブルな自社製のLEDベースのPDTデバイスであるPhotoACTについて説明します。概念実証として、このデバイスは、2D細胞培養モデルにおける椎骨ポルフィンの細胞毒性を高めることが示されているため、PDT実験の研究ツールとして使用できます。

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Protocol

注意: このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、およびソフトウェアに関連する詳細については、 材料の表 を参照してください。

1. デバイス構築

  1. 厚さ3mmの中密度繊維板(MDF)を鋸で挽き、 図1Aに示す寸法のピースを得ました。
    注意: コンピューター数値制御(CNC)切断には、ベクターファイル(補足ファイル1)を使用してください。
  2. 次の寸法(長さx幅x高さ)の2つのボックスを作成します:大きいボックスの場合は330 mm x 235 mm x 225 mm、小さいボックスの場合は300 mm x 220 mm x 150 m(図1B)。
  3. 大きい方の箱の背面にドリルで穴を開けて、バレルジャックコネクタを取り付けます。大きい方の箱の上部にドリルを開け、小さい方の箱の上部と下部をドリルで開けて、電気ケーブル用の通路を確保します(図1C)。
  4. すべての内面を黒インクでペイントして、均一な光の入射を促進します(図1D)。
  5. 小さい方のボックスの上部内面に、それぞれ10個のLEDが付いた3本のLEDテープを並行して取り付けます(図1E)。
  6. 小さい方の箱の底面の内面の中央に輝度センサーを取り付けます(図1F)。
  7. 3D印刷ファイル(補足ファイル1G)を使用して、コントロールユニットの構造(図2G)を印刷します。
  8. すべてのコンポーネント(電源ボタン、ポテンショメータ、時刻/開始タッチパッド、LED、輝度センサー、LCD、ブザー、および電源装置)を、コントロールユニットの内部に取り付けられたESP32コントロールボードのポートに取り付けます(図2)。
  9. プログラミングコード(補足ファイル3、補足ファイル4、補足ファイル5)をアップロードし、テストを実行して、すべての接続が機能していることを確認します(図1H)。
  10. ボックスを組み立てて固定し、隙間を防ぎ、その結果、外光の干渉や放出された光の損失を防ぎます。取り付けられたコントロールユニットをプロトタイプの上部にあるドリル領域に取り付けます(図1I)。
  11. 同じ素材と330 mm x 225 mm(長さx幅)の寸法のフロントドアを、2つの小さなヒンジで大きなボックスに固定します。また、ベルクロテープを大きな箱に横向きに取り付けて、プロトタイプのクロージャーを補強します(図1J)。機器の正面玄関を操作するためのハンドルを取り付けます。
  12. プロトタイプの下部に4つのゴム製フットパッドを取り付けて、操作中の安定性を確保します(図1K)。

2.細胞株:培養、播種、処理

  1. 化学薬品
    1. ポルフィリンをジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解して、100 mMの濃度を達成します。
      注意: DMSOは慎重に操作する必要があります(個人用保護具を使用したり、換気された場所で取り扱ったりしてください)。ストック溶液と希釈液の両方を慎重に操作して、過度の光にさらされないようにします。
  2. 細胞株
    1. 10%ウシ胎児血清と1%ゲンタマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)低グルコース培地でHeLa細胞株を培養します。
    2. 培養フラスコを37°Cの5%CO2 細胞培養インキュベーターに保管する。
    3. 細胞が80%〜90%のコンフルエントに達するまで細胞を管理および検査します。
  3. 播種プロセス
    1. フラスコから培地を取り出します。
    2. 細胞単層をPBSで洗浄する。
    3. コンフルエントな細胞培養液をトリプシン-EDTA(0.5%)で1回、37°Cで5分間剥離します。 10%ウシ胎児血清と1%ゲンタマイシンを添加した培養液で細胞を再懸濁することにより、トリプシンの作用を停止します。
    4. 再懸濁した細胞を血球計算盤でカウントし、2.0 ×10 4 細胞/ウェルの96ウェルプレートに播種します。
    5. 暗い状態と明るい条件のために2つのプレートを準備します。
    6. 細胞付着のためにプレートを24時間インキュベートします。
  4. 治療の流れ
    1. 両方の96ウェルプレートから培地を除去します。
    2. 細胞を100 μLの増加する濃度のバーテポルフィン(0.045〜24 μM、段階希釈)で処理します。
    3. 細胞を薬物処理で24時間インキュベートして、椎体ポルフィンのインターナリゼーションを可能にします。
    4. 24時間後、薬物を含む培地を廃棄し、単層の細胞をPBS(100μL)で洗浄し、薬物を含まない培地(100μL)を加える。
    5. 1枚のマイクロプレートをアルミホイルで覆い、光にさらされないように保護し、24時間インキュベートします。このプレートは、PDT結果(暗条件)の制御データを提供します。もう一方のマイクロプレートは、デバイス内の光露光条件で使用されます。

3.デバイスの操作

  1. PDTデバイスを電源コンセントに差し込み、 電源 ボタンを押して電源をオンにします。
  2. もう一方のマイクロプレート(光の状態)をPDTデバイスに置き、フロントドアをベルクロテープで固定して機器を閉じます。
  3. ポテンショメータを使用してRGB構成を調整し(ここではRGB 255 、255、255 の実験)、発光の色を設定します。
    注:RGBの組み合わせごとに特定の発光スペクトルがあり、異なる光増感剤を使用した実験のために調整する必要があり、その結果、異なる吸光度曲線があります。
  4. (+) /(-)タッチパッド を押して時間 構成 を調整し(ここでは 60分の 実験)、 アッセイの期間を設定します
    注:放射照度値に関連する時間構成は、プロセスのフルエンス、つまりアッセイに適用される光線量を決定します。
  5. ディスプレイで セットアップ 情報を確認してください。
  6. スタートボタンを押してアッセイを開始します。アッセイの開始時にビープ音が1回鳴ることを確認します。
  7. 実験の過程で、 放射照度残り時間などのリアルタイム情報をディスプレイに観察します。
  8. PDTアッセイ中は、フロントドアを開けたり、構成を変更したりしないでください。
  9. アッセイの最後に、ビープ音が4回鳴り、電子システムがすべてのLEDをオフにするのを待ちます。ディスプレイで、 完了 メッセージと実験中に消費された最終的なエネルギー量(フルエンス)を観察します。
    注: フルエンスの最終値は、式 (1) を使用して計算されます。
    Equation 1 (1)
    ここで、F は J/cm 2 に等しく、I は mW/cm 2 または mJ/s·cm 2 に等しくなります。放射照度の値は、LED(発光源)の効力と暗室の均一に照射された領域(660cm2)を考慮します(式[2]):
    Equation 2 (2)
    理論上の放射照度値は、PDTアッセイ全体を通してデバイスディスプレイに表示されます。操作の最後に、式 (3) を使用してフルエンスを計算します。
    フルエンス(F)=放射照度(I、定数値)×動作時間(s) (3)

4. 細胞生存率アッセイ

  1. PDTアッセイ後、光にさらされたマイクロプレートを覆い、24時間インキュベートします。
  2. インキュベーション期間の後、両方のプレートから培養液を取り出し、単層の細胞をPBS(100 μL)で洗浄し、MTT溶液(0.5 mg/ml、100 μL)を加えます。プレートを暗条件と明条件の両方で4時間インキュベートして、ホルマザン結晶を形成します。
  3. MTT溶液を注意深く取り除き、紫色の結晶をDMSO /エタノール(1:1)溶液で溶解します。
  4. 結晶が完全に溶解した後、595nmでマイクロプレートリーダーを用いて吸光度測定を行う。
    注:このデバイスは、フローサイトメトリー30による光曝露後の光増感剤によって引き起こされるROS媒介細胞死などの他の重要な実験に使用できます。

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Representative Results

PhotoACTと名付けられた最後のPDTデバイスには、最大4つのマルチウェルマイクロプレートを割り当てるための暗室が含まれ、その上部内面には、異なるスペクトルの可視光を放出するようにプログラムされた30個の散乱LEDのセットが装備されています(図3 および 補足ファイル6)。このデバイスは、PDTアッセイ用の暗室として設計された内部ボックスと、内部チャンバーを覆い、制御ユニットを保持するための外部ボックスの2つの関連ボックスを使用して構築されました(図1B)。内部ボックスは黒く塗られ(図1D)、30個のLEDと長さ1 m(後で3つにカットされた)と内蔵プロセッサを保持する9ワットのLED RGB WS2812(またはWS281B)のテープモデルで構成されていました。この装置は、より制御された利用を可能にし、その結果、より正確な発色を可能にした。30個のLEDは、それぞれ10個のLEDを備えた3本の平行なテープによって、PDTチャンバーの上部内面全体に均等に配置されました(図1E)。黒い内面の反射率が低く、LED構成が均一に分布しているため、均一な光入射が確立されました。TSL2561輝度センサーも内部ボックスの下部中央に組み込まれ、光の入射を示し、品質管理ツールとして機能し、暗室内の照射均一性を保証し(補足表S1)、一定の耐用年数があることが知られているLEDシステムの電力を監視しました(図1F).外部ボックスは、内部ボックスを覆う構造で、6つのMDFパーツで構成され、灰色に塗装され、完全にフィットするようにレーザーカットされています(図1A、B)。制御ユニットは、オンラインソフトウェア31を用いて設計し、3Dプリンタを用いてポリ乳酸を単一部品として3Dプリントし、灰色に塗装した。ディスプレイ、ポテンショメータ、ボタン、ブザーなど、すべての電子部品を収納します(図1I および 図2)。

独立した光入射調整を可能にするために、ESP32コントローラボードを選択してコントロールユニットを統合しました(図2)。この構成では、プログラミング用の USB インターフェイス、Bluetooth、Wi-Fi、デュアル コア プロセッサ、多数のポート、および相互統合回路 (I2C)、シリアル周辺機器インターフェイス (SPI)、およびその他のインターフェイスと通信する機能を有効にする必要があります。システムを運用するために、統合開発環境(IDE)を介してC言語でプログラムを作成しました。コード構造32 は、ESP32コントローラボードによってサポートされる無料のリアルタイム運用システムであるFreeRTOSに基づいている。参照されるロジックにより、独立したアプリケーションプログラミングが可能になり、ESP32で階層的または並列アプローチで処理できるため、プロジェクトとその保守、改善、および更新プロセスがはるかに用途が広く安全になります。

機械とオペレータの間のインターフェースはユーザーフレンドリーで、液晶ディスプレイ(LCD)、ポテンショメータ、ボタン、およびブザーで構成されています(図3 および 補足ファイル6)。16 mm x 2 mm(列対線)の小型LCDには、I2C通信プロトコルを備えたHD44780コントローラーが組み込まれており、それぞれ設置の容易さと伝送の多様性が与えられています。予備セットアップには、RGBとオペレーターによる時間調整が含まれます。光の大きさと色の構成は、3つの基本色成分(RGB)の強度(0〜255)を変更するポテンショメータを使用して調整できます。これらの調整は、国際RGB色表33で扱われるいくつかの色組成をもたらし得る。各RGBコンポジションは特定の波長を所有しており、PDT実験で使用されるPSに従って調整する必要があります。PSの吸光度曲線と照射の波長は、光活性化が良好に起こるためには重なり合わなければならない(補足図S1)。プロセスに沿って、残り時間の動作ステータスと光入射情報にLCDでアクセスできます。

プログラムされた時間の終わりに、電子システムはすべてのLEDをオフにし、可聴警告を発し、放射照度の一定値に秒単位の動作時間を掛けて計算された面積あたりの総エネルギー量(J /cm²)をディスプレイに表示しました。このデジタルモデルは、広範囲の検出レベル(0.1〜40,000 + luxの制限)、I2Cインターフェース、および低強度の電流(動作状態とスタンバイ状態でそれぞれ0.5 mAと15 μA)を示しました。

概念実証として、この装置を使用して、1時間(49.1 ± 0.6 J / cm2)の光曝露後の2D HeLa細胞培養における椎骨ポルフィンの細胞毒性効果を高めました。図4Aに示すように、GI50の値は、明条件で3.1μM、暗条件で13.8μMでした。したがって、条件を比較する4.4倍のシフトは、PSとしてのバーテポルフィンの使用と、PDTアッセイへのPhotoACTの適用性を検証しました。この研究で説明されているプロトタイプの使用を検証するために、PS、細胞、フルエンスを含む同じ実験条件下で市販のPDTデバイスを使用し、結果を比較しました。図4Bに示されるように、両装置は等しく光活性化された椎骨ポルフィン、細胞傷害効果を増強する。これらの結果から、自作PDT装置への適用性が確認された(図4A,B)。最後に、光曝露後のバーテポルフィンによって引き起こされるROS媒介細胞死を、DCFDAアッセイを用いたフローサイトメトリーによって確認した(図4C、D)。

Figure 1
図1:PhotoACTの構築と組み立ての手順。 デバイスへのコンポーネントの構築、穴あけ、塗装、取り付け、およびアクセサリ化の詳細な図。パネルには、デバイスを構築するためのステップバイステップガイドが表示されます。略称:LED =発光ダイオード。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:コントロールユニットの構造と電子設置手順。 分解されたコントロールユニットの拡大図と、プロトタイプで使用された接続とコンポーネントを備えたESP32コントローラーボードポートでの電子接続の詳細なスキーム。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:フォトアクト表現。 部品表、ラベルバルーン、上部内部LEDの詳細図を含む最終製品設計の組立図。この図は、プロトタイプの部品とコンポーネントを識別することを可能にします。略語:MDF =中密度繊維板;LED = 発光ダイオード。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:バーテポルフィンの インビトロ 光毒性とROS生成 。 (A,B)MTT法を用いて実施した細胞生存率アッセイ:アッセイは、異なる濃度での光増感剤バーテポルフィンの細胞毒性プロファイルを評価するために実施された。HeLa細胞を異なる濃度のバーテポルフィン(0.045-24μM)で24時間処理し、光(PhotoACT(A)または市販のPDT機器(B))または暗条件にさらした後、MTTアッセイにかけました。どちらの条件も、高濃度の椎骨で細胞生存率の低下を示しましたが、PDTアッセイから得られた光曝露はPSの細胞毒性プロファイルを増強し、これはPDTが椎骨の細胞毒性を高めることを意味します。生存率曲線は、GraphPad Prism 6ソフトウェアを使用してフィッティングしました。(C,D)HeLa細胞を低濃度および高濃度のバーテポルフィン(0.187μMおよび6μM)で24時間処理した後、光(PhotoACT)または暗条件に曝露した。細胞内ROSレベルは、DCFDAプローブを用いたフローサイトメトリー(1μMで30分間のインキュベーション)により照射後に測定した。ヒストグラム間の右シフトは、DCFの細胞内蓄積が高く、したがってROSレベルが高いため、蛍光強度が高いことを意味しました。結果は、暗条件(C)でのROSレベルに関連する差を示さなかったが、椎骨ポルフィン光活性化後のROSレベルの用量反応の増加を示した(D)。略語:ROS =活性酸素種;DCF = 2',7'-ジクロロフルオレセイン;DCFDA = 2',7'-ジクロロヒドロフルオレセインジアセテート。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:デバイスの決定フローチャート:予備セットアップと操作のトラブルシューティングこの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足図S1:椎骨の吸光度曲線とデバイスのLED発光スペクトルとの重複。 特定の吸光度ピーク(x、y')を持つ椎骨の吸収スペクトルと、光増感剤(x、y'')を光活性化するために利用されるRGB 255、255、255白色(3,700K-5,000K CCT)のLED発光スペクトル。バーテポルフィンの異なる吸光度ピークと白色照射光の重なりは、光増感剤の光活性化を裏付けており、これも生物学的結果によって確認された。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表S1:照射均一性試験。 照射領域のさまざまなポイントで輝度センサーによって測定された瞬間光度(ルーメン)。提示された結果は、装置の均一な照射を証明する表現的な変動を示さない。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:切断用のベクターファイル。 MDFボード切断用の図面(DWG)ファイル。このファイルは、コンピューター数値制御(CNC)切断に使用する必要があります。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル2:ユニットコントロールの3D印刷ファイル。 デバイスの制御ユニットを3Dプリントするためのステレオリソグラフィー(STL)ファイル。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル3:Cプログラミングコード。 機器の制御ユニットを構成するためのC言語で開発されたプログラミングコード。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル4:INOプログラミングコード。 機器の制御ユニットを構成するためにINO言語で開発されたプログラミングコード。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル5:コンパイル手順。 Markdown (MD) "READ ME" ファイルに、プログラミング コード コンパイルのための追加の指示が含まれています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル6:デバイスの設計モデル。 プロトタイプの一般的な視覚化のための製品データ交換標準(STEP)3次元モデルファイルのプレビュー。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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Discussion

最終的なPhotoACTデバイスは、市販の低コストコンポーネントで50ドル未満の総コストで構築するのに便利でした。さらに、メンテナンスの要求が少ないこと、複数種類の培養プレートを照射できること、アッセイごとに最大4ユニットの同時使用、携帯性を可能にする軽量(2kg)/サイズ(44cm3)、正確で再現性のある照射(データ未表示)、コンピュータや他の機械への接続を必要としないユーザーフレンドリーでシンプルなセットアップインターフェースなどの利点があります。

建設プロトコルと運用プロトコルの両方の特定の重要なステップは、プロジェクトの構想中に改善の機会を生み出しました。PDTチャンバーは均質な発光と一貫したエネルギー測定を必要とするため、外部光干渉と放射光損失の両方を回避するために、内部ボックスと外部ボックスを密閉しました。追加のベルクロテープを正面ドアに横向きに固定して、チャンバーの閉鎖を補強し、中断のない実験を確保しました。必要なRGB構成を証明するために、コントロールユニットに代表的なLEDを取り付け、アッセイ中に放出された光の色と強度を示しました。最後に、プログラミングコードは、即時密度測定と最終的なエネルギー評価量を改善するためにいくつかのアップグレードを受け、再現性と数学的一貫性を支持しました。特別な注意が必要なその他の主要な詳細には、(i)LEDの均一な分布と、代表的なバランスの取れた結果を得るための輝度センサーの中央配置、(ii)電子図(図2)およびプログラミングコード(補足ファイル3、補足ファイル4、 および 補足ファイル5)に従ってすべてのコンポーネントをインストールすることが含まれます。)正しい動作を保証し、(iii)実験を実行する前にセットアップ(同じRGBと時間構成を維持)して、信頼性の高い結果で一貫した反復を保証します。RGBシステムは特定の波長の複数の可視色組成を提供しますが、非可視光実験には特定のプロトコルのアップグレードが必要です。意思決定フローチャートを 図5 に示し、操作中に問題またはエラーを検出して修正するための体系的な問題解決アプローチを提供します。

PhotoACTは、2D HeLa細胞に細胞毒性を誘導するバーテポルフィンの治療的活性化で得られた検証済みの結果(図4)でin vitro実験の要求を満たすように設計されており、大学、学校、産業、およびその他の研究センターに推奨できます。このデバイスは、光増感剤の作用機序とその臨床応用を探求する科学研究にPDTの利点を拡張するはずです。

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Disclosures

著者は競合する利益を宣言しません。

Acknowledgments

撮影プロセスを手伝ってくれたアーサー・エンリケ・ゴメス・デ・オリベイラとルーカス・ジュリアン・クルス・ゴメスに感謝します。このプロジェクトは、ブラジル研究評議会(CNPq、助成金番号400953 / 2016-1-404286 / 2021-6)およびFundaçãoAraucária-PPSUS 2020/2021(SUS2020131000003)の支援を受けました。この研究は、Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil(CAPES)-Finance Code 001によっても資金提供を受けた。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5% Trypsin-EDTA (10x) Gibco 15400054 Mammalian cell culture dissociation reagent
3D printer Flashforge Finder model
96-well plates Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture
Arduino
Brightness sensor TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface
Buttons
Buzzer
Cell culture Flasks Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes)
Centrifuge Tubes Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay
CO2 Incubator
Controller board ESP32
Design Software Trimble SketchUp
DMEM High Glucose Gibco 11965092 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells.
DMSO Sigma-Aldrich D4540-500ML Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% (GC), suitable for plant cell culture
Fetal Bovine Serum  Gibco 12657029 FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages.
Gentamicin (50 mg/mL) Gibco 15750060 Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination
Hemocytometer Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay
Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED
Laminar Flow Hood Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures
LCD display
LED RGB WS2812 5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts
MDF fiberboards 3mm thickness medium-density fiberboards
Microcentrifuge Tubes Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay
Microplate reader ThermoFischer Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation.
MTT Reagent Invitrogen M6494 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays
Operational System Real Time Engineers ltd. FreeRTOS
P10 micripipette Non-electronic, single-channel, 1-10 μL capacity
P1000 micropipette Non-electronic, single-channel, 10-1000 μL capacity
P200 micropipette Non-electronic, single-channel, 20-200 μL capacity
PDT Equipment LumaCare Model LC-122
Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 Gibco 10010031 Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures
Potentiometers
Tips Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 μL maximum volumes
Verteporfin Sigma-Aldrich SML0534-5MG Verteporfin, ≥94% (HPLC)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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生化学、第191号、
2D細胞培養モデルにおけるベルテポルフィン細胞毒性を高めるための自作発光ダイオードベースの光線力学治療装置
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Zanzarini, I. d. S., Barbosa, G.,More

Zanzarini, I. d. S., Barbosa, G., Prado, L. d. O., Zattoni, I. F., Da Paz, G., Prado, A. L. d., Volanski, W., Lavarda, M. D., Rego, F. G. d. M., Picheth, G., Moure, V. R., Valdameri, G. An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model. J. Vis. Exp. (191), e64391, doi:10.3791/64391 (2023).

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