Summary
Aqui, descrevemos um dispositivo novo, simples e de baixo custo para realizar com sucesso ensaios de terapia fotodinâmica in vitro (TFD) usando cultura de células HeLa bidimensionais e verteporfina como fotossensibilizador.
Abstract
Este artigo descreve um dispositivo novo, simples e de baixo custo para realizar ensaios de terapia fotodinâmica in vitro (TFD), chamado PhotoACT. O dispositivo foi construído usando um conjunto de diodos emissores de luz programáveis convencionais (LEDs), um módulo de display de cristal líquido (LCD) e um sensor de luz conectado a uma placa microcontroladora comercial. A estrutura baseada em caixa do protótipo foi feita com painéis de fibra de média densidade (MDFs). O compartimento interno pode alocar simultaneamente quatro microplacas multipoços de cultura celular.
Como prova de conceito, estudamos o efeito citotóxico do fotossensibilizador (PS) verteporfina contra a linhagem celular HeLa em cultura bidimensional (2D). As células HeLa foram tratadas com concentrações crescentes de verteporfina por 24 h. O meio sobrenadante contendo fármaco foi descartado, as células aderentes foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e o meio livre de drogas foi adicionado. Neste estudo, o efeito da verteporfina nas células foi examinado sem exposição à luz ou após exposição por 1 h à luz usando valores vermelho-verde-azul (RGB) de 255, 255 e 255 (fluência média de 49,1 ± 0,6 J/cm2). Após 24 h, a viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazólio (MTT).
Os resultados experimentais mostraram que a exposição das células tratadas com verteporfina à luz do dispositivo aumenta o efeito citotóxico da droga através de um mecanismo mediado por espécies reativas de oxigênio (ROS). Além disso, o uso do protótipo descrito neste trabalho foi validado comparando-se os resultados com um dispositivo PDT comercial. Assim, este protótipo de terapia fotodinâmica à base de LED representa uma boa alternativa para estudos in vitro de TFD.
Introduction
Entre as doenças não transmissíveis mais letais, o câncer representa uma das principais causas globais de morte prematura. Foi responsável por quase 10 milhões de mortes em 2020, representando cerca de uma em cada seis mortes em todo o mundo1. Além disso, o fenômeno da multirresistência (MDR) representa uma tremenda ameaça à saúde pública, uma vez que os protocolos quimioterápicos aprovados não atingem os estágios de remissão para essa condição clínica2. As células cancerosas podem desenvolver resistência à quimioterapia através de vários mecanismos; no entanto, a superexpressão de alguns transportadores de de ligação a ATP (ABC) - bombas de efluxo dependentes de ATP - é considerada a principal causa do desenvolvimento de MDR dentro de um microambiente tumoral3. Além da MDR, outras complicações do câncer, como recidiva e metástase, reforçam a demanda urgente de desenvolver e aprimorar abordagens terapêuticas para superar esse desafio oncológico.
A utilização curativa da luz tem sido praticada há séculos4, e a terapia fotodinâmica (TFD) representa uma abordagem terapêutica clinicamente aprovada para tumores sólidos. A TFD combina a administração de um fotossensibilizador (PS) seguido de irradiação de luz para gerar espécies reativas de oxigênio (ROS) para exercer citotoxicidade seletiva em células tumorais. Essa abordagem terapêutica é superior aos métodos convencionais, incluindo cirurgia, radiação e quimioterapia5; é uma técnica minimamente invasiva que apresenta menor citotoxicidade nos tecidos conjuntivos6. A aplicação de luz e o acúmulo de PS diretamente no tumor ou em seu microambiente garantem direcionamento preciso e, consequentemente, efeitos colaterais sistêmicos menores e indesejáveis7 e a possibilidade de tratamento repetido no mesmo local. Além disso, o custo é menor do que o de outras abordagens. Devido às suas características promissoras, a TFD pode ser considerada uma opção adequada tanto para a doença isolada, principalmente no caso de tumores inoperáveis, quanto para o tratamento adjuvante docâncer7, e representa uma alternativa para a MDR relacionada à quimioterapia 8,9.
O primeiro relato mostrando uma alta taxa de resposta objetiva usando PDT foi descrito em 1975 em um rato e rato modelo10. Desde então, estudos têm sido realizados utilizando TFD com desfechos positivos7 in vivo e in vitro com linhagens celulares tumorais humanas em cultura de células 2D11,12. Considerando a ampla aplicabilidade do PS clinicamente aprovado, independentemente de suas vias de acumulação específicas e faixas de comprimento de onda dos picos de absorção, o processo geral é o seguinte: (i) captação de PS, (ii) pico de concentração de PS no tumor ou em seu microambiente, (iii) aplicação de luz, (iv) interação PS-luz, (v) transferência de energia de estado excitada de PS para o substrato tecidual ou moléculas de oxigênio circundantes, (vi) produção de ERO envolvendo oxigênio singlete ou ânion superóxido, (vii) morte de células tumorais via, essencialmente, necrose ou apoptose (morte direta), autofagia (mecanismo citoprotetor), isquemia tecidual (dano vascular), modulação imunológica ou sobreposição desses mecanismos7. Nessa etapa final, a ativação de uma via específica de morte celular depende de muitos fatores, como características celulares, delineamento experimental e, mais importante, localização intracelular da PS e dano direcionado relacionado à TFD13.
A verteporfina é um PS de segunda geração, aprovado por agências reguladoras para uso clínico na Noruega e na China para tratar a degeneração macular relacionada à idade7. Após a administração da dose, foi relatado que esse pró-fármaco se acumula parcialmente nas mitocôndrias14 e induz fosforilação da proteína tirosina celular e fragmentação do DNA, levando à apoptose das células tumorais15,16. Após 24 h de incubação para internalização da verteporfina, recomenda-se um protocolo PDT utilizando uma configuração de comprimento de onda de 690 nm para atingir níveis efetivos de transferência de radiação eletromagnética para moléculas adjacentes 7,17.
Em relação à fonte de luz para TFD, os sistemas clássicos de laser de diodo geralmente são caros, tecnicamente complicados, superdimensionados e, portanto, não portáteis18,19. Como consequência de seu perfil de comprimento de onda único, que também pode ser observado em equipamentos PDT baseados em LED, a demanda por unidades independentes para cada aplicação de fotossensibilizador torna a utilização de sistemas de laser de diodo ainda mais complexa e economicamente inviável20,21. Portanto, a utilização de máquinas de LED é considerada a alternativa mais promissora para resolver não apenas os custos22 e problemas de manutenção, mas também para proporcionar alta potência de saída e menos prejudicial 23 e maior capacidade de iluminação 24,25,26,27.
Apesar da contribuição potencial que os equipamentos baseados em LED podem oferecer para os experimentos de TFD28, a maioria das opções comerciais ainda possui desvantagens, como falta de portabilidade, alto custo e projetos e operações de construção e operação complexos29. O principal objetivo deste trabalho foi oferecer uma ferramenta simples e confiável para ensaios de TFD in vitro . Este artigo descreve o PhotoACT, um dispositivo PDT baseado em LED construído internamente, que é barato, fácil de usar e portátil. Como prova de conceito, este dispositivo é mostrado para aumentar a citotoxicidade da verteporfina em um modelo de cultura de células 2D e, portanto, pode ser usado como uma ferramenta de pesquisa em experimentos de PDT.
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Protocol
NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes e software usados neste protocolo.
1. Construção do dispositivo
- Serra de 3 mm de espessura de painéis de fibra de média densidade (MDF) para obtenção de peças com as dimensões mostradas na Figura 1A.
Observação : use o arquivo vetorial (arquivo suplementar 1) para o corte de controle numérico computadorizado (CNC). - Construa duas caixas com as seguintes dimensões (comprimento x largura x altura): 330 mm x 235 mm x 225 mm para as caixas maiores e 300 mm x 220 mm x 150 m para as caixas menores (Figura 1B).
- Perfure a parte de trás da caixa maior para instalar um conector de tomada de barril. Perfure a parte superior da caixa maior e coloque a parte superior e inferior da caixa menor para fornecer uma passagem para cabos elétricos (Figura 1C).
- Pintar todas as superfícies internas com tinta preta para promover uma incidência de luz homogênea (Figura 1D).
- Anexe, em paralelo, três fitas de LED com 10 LEDs cada na superfície interna superior da caixa menor (Figura 1E).
- Instale um sensor de brilho no centro da superfície interna inferior da caixa menor (Figura 1F).
- Imprima a estrutura da unidade de controle (Figura 1G) usando o arquivo de impressão 3D (Arquivo Suplementar 2).
- Instale todos os componentes (botão liga/desliga, potenciômetros, touchpad de tempo/partida, LEDs, sensor de brilho, LCD, campainha e fonte de alimentação) nas portas de uma placa de controle ESP32 montada no interior da unidade de controle (Figura 2).
- Carregue o código de programação (Arquivo Suplementar 3, Arquivo Suplementar 4 e Arquivo Suplementar 5) e execute um teste para verificar se todas as conexões estão funcionando (Figura 1H).
- Monte as caixas e fixe-as juntas para evitar lacunas e, consequentemente, interferência de luz externa e perda de luz emitida. Conecte a unidade de controle montada à área perfurada na parte superior do protótipo (Figura 1I).
- Fixe uma porta da frente do mesmo material e dimensões de 330 mm x 225 mm (comprimento x largura) na caixa maior com duas dobradiças pequenas. Além disso, prenda fitas de velcro lateralmente à caixa maior para reforçar o fechamento do protótipo (Figura 1J). Instale uma maçaneta para manipular a porta da frente do equipamento.
- Fixe quatro almofadas de borracha na parte inferior do protótipo para garantir mais estabilidade durante as operações (Figura 1K).
2. Linhagens celulares: cultivo, semeadura e tratamento
- Produtos químicos
- Dissolva a porfirina em dimetilsulfóxido (DMSO) para atingir uma concentração de 100 mM.
CUIDADO: O DMSO deve ser manipulado com cuidado (manuseio com o uso de equipamentos de proteção individual e em área ventilada). Manipule cuidadosamente as unidades populacionais e as soluções diluídas para evitar uma exposição excessiva à luz.
- Dissolva a porfirina em dimetilsulfóxido (DMSO) para atingir uma concentração de 100 mM.
- Linhagens celulares
- Cultivar a linhagem celular HeLa em meio de baixa glicose Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de gentamicina.
- Manter os frascos de cultura numa incubadora de cultura de células de CO2 a 5% a 37 °C.
- Gerencie e inspecione as células até que elas atinjam 80% a 90% de confluência.
- Processo de semeadura
- Retirar o meio de cultura do balão.
- Lave a monocamada celular com PBS.
- Retirar a cultura de células confluentes com tripsina-EDTA (0,5%) 1x por 5 min a 37 °C. Interromper a ação da tripsina ressuspendendo as células com meio de cultura suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de gentamicina.
- Conte as células ressuspensas com um hemocitômetro e semeie-as em uma placa de 96 poços a 2,0 × 104 células/poço.
- Prepare duas placas para condições escuras e claras.
- Incubar as placas por 24 h para fixação celular.
- Processo de tratamento
- Remova o meio de ambas as placas de 96 poços.
- Tratar as células com 100 μL de concentrações crescentes de verteporfina (0,045 a 24 μM, diluição em série).
- Incubar as células com tratamento medicamentoso por 24 h para permitir a internalização da verteporfina.
- Após 24 h, descarte o meio que contém a droga, lave a monocamada de células com PBS (100 μL) e adicione o meio livre de drogas (100 μL).
- Cubra uma microplaca com papel alumínio para protegê-la da exposição à luz e incube-a por 24 h. Esta placa fornecerá dados de controle para os resultados de PDT (condição escura). A outra microplaca será utilizada na condição de exposição à luz no dispositivo.
3. Funcionamento do dispositivo
- Conecte o dispositivo PDT à tomada elétrica e ligue-o pressionando o botão liga/desliga .
- Coloque a outra microplaca (condição de luz) no dispositivo PDT e feche o equipamento prendendo a porta da frente com as fitas de velcro.
- Use os potenciômetros para ajustar a configuração RGB (um experimento RGB 255, 255, 255 aqui) e definir a cor da emissão de luz.
NOTA: Cada combinação RGB possui um espectro de emissão específico, que deve ser ajustado para experimentos com diferentes fotossensibilizadores e, consequentemente, diferentes curvas de absorbância. - Pressione o touchpad (+)/(- ) para ajustar a configuração de tempo (um experimento de 60 minutos aqui) e definir a duração do ensaio.
NOTA: A configuração do tempo, em associação com o valor de irradiância, determinará a fluência do processo - a dose de luz aplicada no ensaio. - Verifique as informações de configuração no visor.
- Pressione o botão Iniciar para iniciar o ensaio. Certifique-se de que uma campainha de um bipe seja ouvida no início do ensaio.
- No decorrer do experimento, observe informações em tempo real no visor, como irradiância e tempo restante.
- Não abra a porta da frente nem altere qualquer configuração durante o ensaio PDT.
- No final do ensaio, aguarde uma campainha de quatro bipes e que o sistema eletrônico desligue todos os LEDs. Observe uma mensagem Concluído e a quantidade final de energia gasta - fluência - durante o experimento na tela.
NOTA: O valor final da fluência é calculado utilizando a equação (1):
(1)
Onde F é igual a J/cm 2 e I é igual a mW/cm 2 ou mJ/s·cm 2. O valor de irradiância considera a potência dos LEDs (fonte emissora) e a área uniformemente irradiada da câmara escura (660 cm 2) (equação [2]):
(2)
O valor teórico de irradiância é mostrado na tela do dispositivo durante todo o ensaio PDT. No final da operação, use a equação (3) para calcular a fluência:
Fluência (F) = irradiância (I, valor constante) × tempo(s) de operação (s) (3)
(1)
(2)4. Ensaio de viabilidade celular
- Após o ensaio de TFD, cubra a microplaca que foi exposta à luz e incube por 24 h.
- Após o período de incubação, retirar o meio de cultura de ambas as placas, lavar a monocamada de células com PBS (100 μL) e adicionar solução de MTT (0,5 mg/ml, 100 μL). Incubar ambas as placas - condições escuras e claras - por 4 h para permitir a formação de cristais formazan.
- Remova cuidadosamente a solução de MTT e dissolva os cristais roxos com uma solução de DMSO/etanol (1:1).
- Após a dissolução completa dos cristais, efectuar a medição da absorvância utilizando um leitor de microplacas a 595 nm.
NOTA: O dispositivo pode ser utilizado em outros experimentos importantes, como a morte celular mediada por EROs desencadeada por fotossensibilizadores após exposição à luz por citometria de fluxo30.
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Representative Results
O dispositivo PDT final, chamado de PhotoACT, incluía uma câmara escura para alocar até quatro microplacas multipoço, com sua superfície interna superior equipada com um conjunto de 30 LEDs dispersos programados para emitir espectros distintos de luz visível (Figura 3 e Arquivo Suplementar 6). O dispositivo foi construído utilizando duas caixas associadas: uma caixa interna projetada como uma câmara escura para os ensaios de PDT e uma caixa externa para cobrir a câmara interna e segurar a unidade de controle (Figura 1B). A caixa interna foi pintada de preto (Figura 1D) e composta por um modelo de fita de LED RGB WS2812 (ou WS281B) com 30 LEDs e de 1 m de comprimento (que posteriormente foi cortado em três pedaços) e 9 watts, que contém um processador embutido. Esse aparato permitiu uma utilização mais controlada e, consequentemente, uma emissão de cores mais precisa. Os 30 LEDs foram igualmente distribuídos por toda a superfície interna superior da câmara PDT por três fitas paralelas com 10 LEDs cada (Figura 1E). Uma incidência de luz homogênea foi estabelecida devido à baixa refletividade das superfícies interiores pretas e à distribuição uniforme da configuração do LED. Um sensor de brilho TSL2561 também foi incorporado no centro inferior da caixa interna para indicar a incidência de luz e servir como ferramenta de controle de qualidade, garantindo uniformidade de irradiação dentro da câmara escura (Tabela Suplementar S1) e monitorando a potência do sistema LED, que é conhecido por ter um certo número de horas de vida útil (Figura 1F ). A caixa externa é uma estrutura que cobre a caixa interna, composta por seis peças de MDF, pintadas de cinza e cortadas a laser para um ajuste perfeito (Figuras 1A,B). A unidade de controle foi projetada usando o software on-line 31, impresso em 3D com ácido polilático como uma única peça usando uma impressora3D e pintado de cinza. Ele contém todos os componentes eletrônicos, incluindo um visor, potenciômetros, botões e uma campainha (Figura 1I e Figura 2).
Para permitir ajustes independentes de incidência de luz, a placa controladora ESP32 foi selecionada para integrar a unidade de controle (Figura 2). Essa configuração deve permitir uma interface USB para programação, bluetooth, Wi-Fi, processador dual core, várias portas e a capacidade de se comunicar com um circuito interintegrado (I2C), uma interface periférica serial (SPI) e outras interfaces. Para operar o sistema, um programa foi escrito em linguagem C através de um ambiente de desenvolvimento integrado (IDE). A estruturade código 32 é baseada no FreeRTOS, um sistema operacional gratuito e em tempo real suportado pela placa controladora ESP32. A referida lógica permite a programação de aplicações independentes, que podem ser processadas pelo ESP32 em abordagens escalonadas ou paralelas, tornando o projeto e seus processos de manutenção, melhoria e atualização muito mais versáteis e seguros.
A interface entre a máquina e o operador é fácil de usar e consistia em um display de cristal líquido (LCD), potenciômetros, botões e uma campainha (Figura 3 e Arquivo Suplementar 6). O pequeno LCD de 16 mm x 2 mm (colunas vs. linhas) tinha um controlador HD44780 embutido com um protocolo de comunicação I2C, que confere a facilidade de instalação e versatilidade de transmissão, respectivamente. A configuração preliminar inclui RGB e ajustes de tempo pelo operador. A magnitude da luz e a configuração de cor podem ser ajustadas usando os potenciômetros, que modificam a intensidade (0 a 255) dos três componentes básicos de cor-RGB. Esses ajustes podem resultar em várias composições de cores abordadas na tabela internacional de cores RGB33. Cada composição RGB possui um comprimento de onda específico, que deve ser ajustado de acordo com o PS utilizado no experimento PDT; a curva de absorvância do PS e o comprimento de onda da irradiação devem ser sobrepostos para que a fotoativação ocorra satisfatoriamente (Figura suplementar S1). Ao longo do processo, o status da operação com o tempo restante e as informações de incidência de luz podem ser acessados no LCD.
Ao final do tempo programado, o sistema eletrônico desligou todos os LEDs, emitiu um aviso sonoro e mostrou no visor a quantidade total de energia por área (J/cm²), que foi calculada multiplicando o valor constante da irradiância pelo tempo de operação em segundos. Este modelo digital apresentou uma ampla gama de níveis de detecção (limites entre 0,1 e 40.000+ lux), uma interface I2C e uma baixa intensidade de corrente elétrica (0,5 mA e 15 μA em operação e estado de espera, respectivamente).
Como prova de conceito, o dispositivo foi utilizado para potencializar o efeito citotóxico da verteporfina em cultura de células HeLa 2D após exposição à luz de 1 h (49,1 ± 0,6 J/cm2). Como mostrado na Figura 4A, o valor do GI50 foi de 3,1 μM para a condição de luz e 13,8 μM para a condição de escuro. Assim, o deslocamento de 4,4 vezes comparando as condições validou o uso da verteporfina como PS e a aplicabilidade do PhotoACT aos ensaios de TFD. Para validar o uso do protótipo descrito neste trabalho, um dispositivo PDT comercial foi utilizado nas mesmas condições experimentais, incluindo um PS, células e fluência, e os resultados comparados. Como mostra a Figura 4B, ambos os dispositivos fotoativaram a verteporfina igualmente, aumentando o efeito citotóxico. Esses resultados confirmaram a aplicabilidade deste em dispositivo PDT construído em casa (Figura 4A,B). Finalmente, a morte celular mediada por EROs desencadeada por verteporfina após exposição à luz foi confirmada por citometria de fluxo usando o ensaio DCFDA (Figura 4C,D).
Figura 1: Instruções de construção e montagem do PhotoACT. Ilustração detalhada da construção, perfuração, pintura, montagem e acessórios componentes no dispositivo. O painel mostra um guia passo a passo para construir o dispositivo. Abreviação: LED = diodo emissor de luz. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Instruções de construção e instalação eletrônica da unidade de controle. Desenho de visão ampliada da unidade de controle explodida e esquema detalhado de conexões eletrônicas nas portas da placa controladora ESP32 com conexões e componentes usados no protótipo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Representação do PhotoACT. Desenho de montagem do design do produto final com lista de materiais, balões de rotulagem e visão detalhada dos LEDs internos superiores. A figura permite identificar partes e componentes do protótipo. Abreviaturas: MDF = MDF de fibra de média densidade; LED = diodo emissor de luz. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Fototoxicidade in vitro da geração de verteporfina e EROs. (A,B) Ensaio de viabilidade celular realizado pelo método MTT: os ensaios foram conduzidos para avaliar o perfil citotóxico do fotossensibilizador verteporfina em diferentes concentrações. As células HeLa foram tratadas por 24 h com diferentes concentrações de verteporfina (0,045-24 μM), expostas à luz (PhotoACT (A) ou equipamento PDT comercial (B)) ou a condições escuras e, em seguida, submetidas ao ensaio de MTT. Ambas as condições mostraram uma diminuição da viabilidade celular em concentrações mais altas de verteporfina, mas a exposição à luz obtida a partir de ensaios de TFD aumentou o perfil citotóxico do PS, o que implica que a TFD aumenta a citotoxicidade da verteporfina. As curvas de viabilidade foram ajustadas utilizando-se o software GraphPad Prism 6. (C,D) As células HeLa foram tratadas por 24 h com baixas e altas concentrações de verteporfina (0,187 μM e 6 μM) e, em seguida, expostas a condições claras (PhotoACT) ou escuras. Os níveis de EROs intracelulares foram medidos após irradiação por citometria de fluxo utilizando sonda DCFDA (incubação por 30 min a 1 μM). Um desvio para a direita entre os histogramas implicou maior intensidade de fluorescência devido a um maior acúmulo intracelular de DCF e, portanto, maiores níveis de ROS. Os resultados não mostraram diferença relevante nos níveis de EROs na condição escura (C), mas mostraram um aumento da dose-resposta nos níveis de ERO após a fotoativação da verteporfina (D). Abreviaturas: ROS = espécies reativas de oxigênio; DCF = 2',7'-diclorofluoresceína; DCFDA = diacetato de 2',7'-diclorohidrofluoresceína. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Fluxograma de decisão do dispositivo: configuração preliminar e solução de problemas de operação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar S1: Sobreposição entre a curva de absorvância da verteporfina e o espectro de emissão de LED do dispositivo. Espectro de absorção de verteporfina com seus picos de absorbância específicos (x,y') e espectro de emissão de LED de cor RGB 255, 255, 255-branca (3.700K-5.000K CCT) utilizado para fotoativar o fotossensibilizador (x,y''). A sobreposição entre os diferentes picos de absorbância da verteporfina e a luz branca irradiante corrobora a fotoativação do fotossensibilizador, o que também foi confirmado pelos resultados biológicos. Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela Suplementar S1: Testes de uniformidade de irradiação. Luminosidade instantânea (lúmen) medida pelo sensor de brilho em diferentes pontos da área irradiada. Os resultados apresentados não mostram variação expressiva, o que atesta a irradiação uniforme do dispositivo. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo suplementar 1: Arquivo vetorial para corte. Arquivo de desenho (DWG) para corte de placa de MDF. O arquivo deve ser usado para o corte de controle numérico computadorizado (CNC). Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 2: Arquivo de impressão 3D do controle da unidade. Arquivo de estereolitografia (STL) para imprimir em 3D a unidade de controle do dispositivo. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 3: Código de programação C. Código de programação desenvolvido em linguagem C para configuração da unidade de controle do equipamento. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 4: Código de programação INO. Código de programação desenvolvido em linguagem INO para configuração da unidade de controle do equipamento. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 5: Instruções de compilação. Markdown (MD) "READ ME" arquivo com instruções adicionais para a compilação de código de programação. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo suplementar 6: Modelo de design do dispositivo. Visualização do arquivo de modelo tridimensional STEP (Standard for the Exchange of Product Data) para visualização geral do protótipo. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
O dispositivo PhotoACT final foi conveniente para construir com componentes de baixo custo disponíveis comercialmente a um custo total de menos de US $ 50. As vantagens adicionais incluem baixas demandas de manutenção, a capacidade de irradiar vários tipos de placas de cultura, o uso simultâneo de até quatro unidades por ensaio, baixo peso (2 kg)/tamanho (44 cm3) que permite portabilidade, irradiação precisa e reprodutível (dados não mostrados) e uma interface de configuração simples e fácil de usar que não requer conexão com computadores ou outras máquinas.
Certas etapas críticas dos protocolos de construção e operação deram origem a oportunidades de melhoria durante a concepção do projeto. Como uma câmara PDT requer emissão de luz homogênea e medição de energia consistente, as caixas internas e externas foram seladas para evitar interferência de luz externa e perda de luz emitida. Fitas de velcro adicionais foram fixadas lateralmente na porta frontal para reforçar o fechamento da câmara e garantir experimentos ininterruptos. Um LED representativo foi instalado na unidade de controle para certificar a configuração RGB necessária, indicando a cor e a intensidade da luz emitida durante o ensaio. Finalmente, o código de programação passou por várias atualizações para refinar medições de densidade instantânea e quantidades finais de avaliações de energia, endossando a reprodutibilidade e a consistência matemática. Alguns outros detalhes importantes que requerem atenção extra incluem: (i) distribuição homogênea de LEDs e posicionamento central do sensor de brilho para obter resultados representativos e equilibrados, (ii) instalação de todos os componentes de acordo com o diagrama eletrônico (Figura 2) e código de programação (Arquivo Suplementar 3, Arquivo Suplementar 4 e Arquivo Suplementar 5 ) para garantir a operação correta e (iii) a configuração (mantendo o mesmo RGB e configuração de tempo) antes de executar um experimento para garantir replicações consistentes com resultados confiáveis. Embora o sistema RGB forneça várias composições de cores visíveis com comprimentos de onda específicos, experimentos de luz não visível exigiriam atualizações de protocolo específicas. Um fluxograma de decisão é apresentado na Figura 5 para fornecer uma abordagem sistemática de resolução de problemas para encontrar e corrigir problemas ou erros durante a operação.
Projetado para atender às demandas de experimentação in vitro com resultados validados obtidos com a ativação terapêutica da verteporfina para induzir citotoxicidade em células HeLa 2D (Figura 4), o PhotoACT pode ser recomendado para universidades, escolas, indústrias e outros centros de pesquisa. Este dispositivo deve estender os benefícios da TFD à pesquisa científica que explora o mecanismo de ação dos fotossensibilizadores e suas aplicações clínicas.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos a Arthur Henrique Gomes de Oliveira e Lucas Julian Cruz Gomes por ajudarem no processo de filmagem. Este projeto contou com o apoio do Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq, número de bolsas 400953/2016-1-404286/2021-6) e da Fundação Araucária-PPSUS 2020/2021 (SUS2020131000003). Este estudo também foi financiado em parte pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Código Financeiro 001.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | Mammalian cell culture dissociation reagent |
| 3D printer | Flashforge | Finder model | |
| 96-well plates | Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture | ||
| Arduino | |||
| Brightness sensor | TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface | ||
| Buttons | |||
| Buzzer | |||
| Cell culture Flasks | Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes) | ||
| Centrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay | ||
| CO2 Incubator | |||
| Controller board | ESP32 | ||
| Design Software | Trimble | SketchUp | |
| DMEM High Glucose | Gibco | 11965092 | DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540-500ML | Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% (GC), suitable for plant cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12657029 | FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages. |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Gibco | 15750060 | Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination |
| Hemocytometer | Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay | ||
| Inverted Laboratory Microscope | Leica | DM IL LED | |
| Laminar Flow Hood | Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures | ||
| LCD display | |||
| LED RGB WS2812 | 5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts | ||
| MDF fiberboards | 3mm thickness medium-density fiberboards | ||
| Microcentrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay | ||
| Microplate reader | ThermoFischer | Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation. | |
| MTT Reagent | Invitrogen | M6494 | 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays |
| Operational System | Real Time Engineers ltd. | FreeRTOS | |
| P10 micripipette | Non-electronic, single-channel, 1-10 μL capacity | ||
| P1000 micropipette | Non-electronic, single-channel, 10-1000 μL capacity | ||
| P200 micropipette | Non-electronic, single-channel, 20-200 μL capacity | ||
| PDT Equipment | LumaCare | Model LC-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 | Gibco | 10010031 | Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures |
| Potentiometers | |||
| Tips | Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 μL maximum volumes | ||
| Verteporfin | Sigma-Aldrich | SML0534-5MG | Verteporfin, ≥94% (HPLC) |
References
- Ferlay, J., et al. International agency for research on cancer. Global Cancer Observatory: Cancer Today. 23 (7), https://gco.iarc.fr/today/home 323-326 (2018).
- Gottesman, M. M., Fojo, T., Bates, S. E. Multidrug resistance in cancer: role of Atp-dependent transporters. Nature Reviews Cancer. 2 (1), 48-58 (2002).
- Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Boothe-Genthe, C., Gottesman, G. A. Targeting multidrug resistance in cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 219-234 (2006).
- Ackroyd, R., Kelty, C., Brown, N., Reed, M. The history of photodetection and photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 74 (5), 656-669 (2001).
- Hamblin, M. R. Photodynamic therapy for cancer: what's past is prologue. Photochemistry and Photobiology. 96 (3), 506-516 (2020).
- Barr, H., et al. The contrasting mechanisms of colonic collagen damage between photodynamic therapy and thermal injury. Photochem Photobiol. 46 (5), 795-800 (1987).
- Algorri, J. F., Ochoa, M., Roldán-Varona, P., Rodríguez-Cobo, L., López-Higuera, J. M. Photodynamic therapy: A compendium of latest reviews. Cancers. 13 (17), 4447 (2021).
- Aniogo, E. C., Plackal, B., George, B. P. A., Abrahamse, H. The role of photodynamic therapy on multidrug resistant breast cancer. Cancer Cell International. 19, 91 (2019).
- Spring, B. Q., Rizvi, I., Xu, N., Hasan, T. The role of photodynamic therapy in overcoming cancer drug resistance. Photochemical & Photobiological Sciences. 14 (8), 1476-1491 (2015).
- Dougherty, T. J., Grindey, G. B., Fiel, R., Weishaupt, K. R., Boyle, D. G. Photoradiation therapy. II. Cure of animal tumors with hematoporphyrin and light. Journal of the National Cancer Institute. 55 (1), 115-121 (1975).
- Etcheverry, M. E., Pasquale, M. A., Garavaglia, M. Photodynamic therapy of HeLa cell cultures by using LED or laser sources. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 160, 271-277 (2016).
- Guo, Q., Dong, B., Nan, F., Guan, D., Zhang, Y. 5-Aminolevulinic acid photodynamic therapy in human cervical cancer via the activation of microRNA-143 and suppression of the Bcl-2/Bax signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 14 (1), 544-550 (2016).
- Mroz, P., Yaroslavsky, A., Kharkwal, G. B., Hamblin, M. R. Cell death pathways in photodynamic therapy of cancer. Cancers. 3 (2), 2516-2539 (2011).
- Mahalingam, S. M., Ordaz, J. D., Low, P. S. Targeting of a photosensitizer to the mitochondrion enhances the potency of photodynamic therapy. ACS Omega. 3 (6), 6066-6074 (2018).
- Granville, D. J., Levy, J. G., Hunt, D. W. C. Photodynamic treatment with benzoporphyrin derivative monoacid ring A produces protein tyrosine phosphorylation events and DNA fragmentation in murine P815 cells. Photochemistry and Photobiology. 67 (3), 358-362 (1998).
- Castano, A. P., Demidova, T. N., Hamblin, M. R. Mechanisms in photodynamic therapy: part two - cellular signaling, cell metabolism and modes of cell death. Photodiagnosis Photodynamic Therapy. 2 (1), 1-23 (2014).
- Detty, M. R., Gibson, S. L., Wagner, S. J. Current clinical and preclinical photosensitizers for use in photodynamic therapy. Journal of Medicinal Chemistry. 47 (16), 3897-3915 (2004).
- Allison, R. R. Photodynamic therapy: oncologic horizons. Future Oncology. 10 (1), 123-142 (2014).
- Chepurna, O., et al. Photodynamic therapy with laser scanning mode of tumor irradiation. Optical Fibers and Their Applications 2015. 9816, 323-326 (2015).
- Huang, Z. A review of progress in clinical photodynamic therapy. Technology in Cancer Research and Treatment. 4 (3), 283-293 (2005).
- Chepurna, O., et al. LED-based portable light source for photodynamic therapy. Optics in Health Care and Biomedical Optics. 11190, 109-115 (2019).
- Hasson, O., Wishkerman, A. CultureLED: A 3D printer-based LED illumination cultivation system for multi-well culture plates. HardwareX. 12, 00323 (2022).
- Wu, X., et al. Localised light delivery on melanoma cells using optical microneedles. Biomedical Optics Express. 13 (2), 1045-1060 (2022).
- Erkiert-Polguj, A., Halbina, A., Polak-Pacholczyk, I., Rotsztejn, H. Light-emitting diodes in photodynamic therapy in non-melanoma skin cancers-own observations and literature review. Journal of Cosmetic and Laser Therapy. 18 (2), 105-110 (2016).
- Neupane, J., Ghimire, S., Shakya, S., Chaudhary, L., Shrivastava, V. P. Effect of light emitting diodes in the photodynamic therapy of rheumatoid arthritis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 7 (1), 44-49 (2010).
- Lins, E. C., et al. A novel 785-nm laser diode-based system for standardization of cell culture irradiation. Photomedicine and Laser Surgery. 31 (10), 466-473 (2013).
- Hopkins, S. L., et al. An In vitro cell irradiation protocol for testing photopharmaceuticals and the effect of blue, green, and red light on human cancer cell lines. Photochemical and Photobiological Sciences. 15 (5), 644-653 (2016).
- Zhang, K., Waguespack, M., Kercher, E. M., Spring, B. Q. An automated and stable LED array illumination system for multiwell plate cell culture photodynamic therapy experiments. Research Square. , 1-18 (2022).
- Gálvez, E. N., et al. Analysis and evaluation of the operational characteristics of a new photodynamic therapy device. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 37, 102719 (2022).
- Bretin, L., et al. Photodynamic therapy activity of new human colorectal cancer. Cancers. 11 (10), 1474 (2019).
- T. SketchUp. , Available from: https://www.sketchup.com/ (2022).
- LCDR PhotoDynamic Therapy (PDT) Equipment Repository. GitHub, Inc. , Available from: https://github.com/PhotoDynamicTherapy (2022).
- W3C CSS Color Module Level 3. W3C, Inc. , Available from: https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB (2022).
