Summary
Aquí, describimos un dispositivo novedoso, simple y de bajo costo para realizar con éxito ensayos de terapia fotodinámica in vitro (TFD) utilizando cultivo de células HeLa bidimensionales y verteporfina como fotosensibilizador.
Abstract
Este documento describe un dispositivo novedoso, simple y de bajo costo para realizar ensayos de terapia fotodinámica in vitro (TFD), llamado PhotoACT. El dispositivo se construyó utilizando un conjunto de diodos emisores de luz (LED) programables convencionales, un módulo de pantalla de cristal líquido (LCD) y un sensor de luz conectado a una placa de microcontrolador comercial. La estructura basada en caja del prototipo se hizo con tableros de fibra de densidad media (MDF). El compartimento interno puede asignar simultáneamente cuatro microplacas multipocillos de cultivo celular.
Como prueba de concepto, estudiamos el efecto citotóxico de la verteporfina fotosensibilizadora (PS) contra la línea celular HeLa en cultivo bidimensional (2D). Las células HeLa fueron tratadas con concentraciones crecientes de verteporfina durante 24 h. Se descartó el medio sobrenadante que contenía fármaco, las células adherentes se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se agregó un medio libre de fármaco. En este estudio, el efecto de la verteporfina en las células se examinó sin exposición a la luz o después de la exposición durante 1 h a la luz utilizando valores rojo-verde-azul (RGB) de 255, 255 y 255 (fluencia promedio de 49.1 ± 0.6 J / cm2). Después de 24 h, la viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de bromuro de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazolio (MTT).
Los resultados experimentales mostraron que la exposición de las células tratadas con verteporfina a la luz del dispositivo mejora el efecto citotóxico del fármaco a través de un mecanismo mediado por especies reactivas de oxígeno (ROS). Además, el uso del prototipo descrito en este trabajo se validó comparando los resultados con un dispositivo PDT comercial. Por lo tanto, este prototipo de terapia fotodinámica basada en LED representa una buena alternativa para los estudios in vitro de TFD.
Introduction
Entre las enfermedades no transmisibles más letales, el cáncer representa una de las principales causas mundiales de muerte prematura. Representó casi 10 millones de muertes en 2020, lo que representa aproximadamente una de cada seis muertes en todo el mundo1. Además, el fenómeno de la resistencia a múltiples fármacos (MDR) representa una tremenda amenaza para la salud pública, ya que los protocolos quimioterapéuticos aprobados no alcanzan las etapas de remisión para esta condición clínica2. Las células cancerosas pueden desarrollar resistencia a la quimioterapia a través de varios mecanismos; sin embargo, la sobreexpresión de algunos transportadores de casetes de unión a ATP (ABC) - bombas de eflujo dependientes de ATP - se considera la principal causa del desarrollo de MDR dentro de un microambiente tumoral3. Además de la MDR, otras complicaciones del cáncer, como la recurrencia y la metástasis, refuerzan la demanda urgente de desarrollar y mejorar los enfoques terapéuticos para superar este desafío oncológico.
La utilización curativa de la luz se ha practicado durante siglos4, y la terapia fotodinámica (TFD) representa un enfoque terapéutico clínicamente aprobado para tumores sólidos. La TFD combina la administración de un fotosensibilizador (PS) seguido de irradiación lumínica para generar especies reactivas de oxígeno (ROS) para ejercer citotoxicidad selectiva en las células tumorales. Este enfoque terapéutico es superior a los métodos convencionales, incluyendo cirugía, radiación y quimioterapia5; Es una técnica mínimamente invasiva que muestra menor citotoxicidad en los tejidos conectivos6. La aplicación ligera y la acumulación de PS directamente en el tumor o su microambiente aseguran una focalización precisa y, en consecuencia, efectos secundarios sistémicos menores e indeseables7 y la posibilidad de repetir el tratamiento en el mismo sitio. Además, el costo es menor que el de otros enfoques. Debido a sus características prometedoras, la TFD puede ser considerada una opción apropiada tanto para el tratamiento del cáncer único, especialmente en el caso de tumores inoperables, como para el tratamiento adyuvantedel cáncer 7, y representa una alternativa para la MDR relacionada a la quimioterapia 8,9.
El primer informe que muestra una alta tasa de respuesta objetiva utilizando PDT se describió en 1975 en un modelo de ratón y rata10. Desde entonces, se han realizado estudios con TFD con resultados positivos7 tanto in vivo como in vitro con líneas celulares tumorales humanas en cultivo celular 2D11,12. Teniendo en cuenta la amplia aplicabilidad de la PS clínicamente aprobada, independientemente de sus vías de acumulación específicas y rangos de longitud de onda de los picos de absorción, el proceso general es el siguiente: (i) captación de PS, (ii) pico de concentración de PS en el tumor o su microambiente, (iii) aplicación de luz, (iv) interacción PS-luz, (v) transferencia de energía en estado excitado PS a cualquier sustrato tisular o moléculas de oxígeno circundantes, (vi) producción de ROS que involucra oxígeno singlete o anión superóxido, (vii) muerte de células tumorales a través de, esencialmente, necrosis o apoptosis (muerte directa), autofagia (mecanismo citoprotector), isquemia tisular (daño vascular), modulación inmune o una superposición de estos mecanismos7. En esta etapa final, la activación de una vía específica de muerte celular depende de muchos factores, como las características celulares, el diseño experimental y, lo más importante, la localización intracelular de PS y el daño dirigido relacionado con PDT13.
La verteporfina es un PS de segunda generación, aprobado por las agencias reguladoras para uso clínico en Noruega y China para tratar la degeneración macular relacionada con la edad7. Después de la administración de la dosis, se informó que este profármaco se acumuló parcialmente en las mitocondrias14 e indujo la fosforilación de la proteína tirosina celular y la fragmentación del ADN, lo que llevó a la apoptosis de las células tumorales15,16. Después de 24 h de incubación para la internalización de verteporfina, se recomienda un protocolo PDT utilizando una configuración de longitud de onda de 690 nm para lograr niveles efectivos de transferencia de radiación electromagnética a moléculas adyacentes 7,17.
En cuanto a la fuente de luz para PDT, los sistemas láser de diodo clásicos suelen ser caros, técnicamente complicados, de gran tamaño y, por lo tanto, inportátiles18,19. Como consecuencia de su perfil de longitud de onda única, que también se puede observar en equipos PDT basados en LED, la demanda de unidades independientes para cada aplicación de fotosensibilizador hace que la utilización de sistemas láser de diodo sea aún más compleja y económicamente inviable20,21. Por lo tanto, la utilización de maquinaria LED se considera la alternativa más prometedora para resolver no solo los costos22 y los problemas de mantenimiento, sino también para proporcionar una alta potencia de salida y menos dañina 23 y una capacidad de iluminación más amplia 24,25,26,27.
A pesar de la contribución potencial que los equipos basados en LED pueden ofrecer a los experimentos PDT28, la mayoría de las opciones comerciales aún poseen inconvenientes como la falta de portabilidad, el alto costo y los complejos proyectos de construcción y operación29. El objetivo principal de este trabajo fue ofrecer una herramienta simple y confiable para ensayos de TFD in vitro . Este documento describe PhotoACT, un dispositivo PDT basado en LED construido internamente, que es económico, fácil de usar y portátil. Como prueba de concepto, se ha demostrado que este dispositivo mejora la citotoxicidad de la verteporfina en un modelo de cultivo celular 2D y, por lo tanto, puede usarse como herramienta de investigación en experimentos PDT.
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Protocol
NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, reactivos y software utilizados en este protocolo.
1. Construcción del dispositivo
- Sierra de 3 mm de espesor de tableros de fibra de densidad media (MDF) para obtener piezas con las dimensiones mostradas en la Figura 1A.
NOTA: Utilice el archivo vectorial (archivo complementario 1) para el corte de control numérico computarizado (CNC). - Construya dos cajas con las siguientes dimensiones (largo x ancho x alto): 330 mm x 235 mm x 225 mm para las cajas más grandes, y 300 mm x 220 mm x 150 m para las cajas más pequeñas (Figura 1B).
- Perfore la parte posterior de la caja más grande para instalar un conector de gato de barril. Perfore la parte superior de la caja más grande y la parte superior e inferior de la caja más pequeña para proporcionar un pasaje para los cables eléctricos (Figura 1C).
- Pinte todas las superficies internas con tinta negra para promover una incidencia homogénea de la luz (Figura 1D).
- Coloque, en paralelo, tres cintas LED con 10 LED cada una en la superficie interior superior de la caja más pequeña (Figura 1E).
- Instale un sensor de brillo en el centro de la superficie interior inferior de la caja más pequeña (Figura 1F).
- Imprima la estructura de la unidad de control (Figura 1G) utilizando el archivo de impresión 3D (Archivo complementario 2).
- Instale todos los componentes (botón de encendido, potenciómetros, panel táctil de tiempo/inicio, LED, sensor de brillo, LCD, zumbador y fuente de alimentación) en los puertos de una placa de control ESP32 montada en el interior de la unidad de control (Figura 2).
- Cargue el código de programación (Archivo complementario 3, Archivo complementario 4 y Archivo complementario 5) y ejecute una prueba para comprobar que todas las conexiones funcionan (Figura 1H).
- Ensamble las cajas y fíjelas juntas para evitar huecos y, en consecuencia, interferencias de luz externas y pérdida de luz emitida. Fije la unidad de control montada al área perforada en la parte superior del prototipo (Figura 1I).
- Fije una puerta frontal del mismo material y dimensiones de 330 mm x 225 mm (largo x ancho) en la caja más grande con dos bisagras pequeñas. Además, coloque las cintas de velcro lateralmente en la caja más grande para reforzar el cierre del prototipo (Figura 1J). Instale una manija para manipular la puerta frontal del equipo.
- Coloque cuatro almohadillas de goma para los pies en la parte inferior del prototipo para garantizar una mayor estabilidad durante las operaciones (Figura 1K).
2. Líneas celulares: cultivo, siembra y tratamiento
- Productos químicos
- Disuelva la porfirina en dimetilsulfóxido (DMSO) para alcanzar una concentración de 100 mM.
PRECAUCIÓN: El DMSO debe manipularse con cuidado (manipularse con el uso de equipo de protección personal y en un área ventilada). Manipule cuidadosamente tanto las soluciones madre como las diluidas para evitar una exposición excesiva a la luz.
- Disuelva la porfirina en dimetilsulfóxido (DMSO) para alcanzar una concentración de 100 mM.
- Líneas celulares
- Cultivar la línea celular HeLa en el medio bajo en glucosa Modified Eagle's Medium (DMEM) de Dulbecco suplementado con 10% de suero bovino fetal y 1% de gentamicina.
- Conservar los matraces de cultivo en una incubadora de cultivo celular deCO2 al 5% a 37 °C.
- Administrar e inspeccionar las células hasta que alcancen el 80% -90% de confluencia.
- Proceso de siembra
- Retirar el medio de cultivo del matraz.
- Lave la monocapa celular con PBS.
- Separar el cultivo celular confluente con tripsina-EDTA (0,5%) 1x durante 5 min a 37 °C. Detener la acción de la tripsina resuspendiendo las células con medio de cultivo suplementado con 10% de suero fetal bovino y 1% de gentamicina.
- Contar las células resuspendidas con un hemocitómetro y sembrarlas en una placa de 96 pocillos a 2,0 × 104 células/pocillo.
- Prepare dos platos para condiciones de oscuridad y luz.
- Incubar las placas durante 24 h para la fijación celular.
- Proceso de tratamiento
- Retire el medio de ambas placas de 96 pocillos.
- Tratar las células con 100 μL de concentraciones crecientes de verteporfina (0,045 a 24 μM, dilución seriada).
- Incubar las células con tratamiento farmacológico durante 24 h para permitir la internalización de verteporfina.
- Después de 24 h, deseche el medio que contiene el medicamento, lave la monocapa de células con PBS (100 μL) y agregue un medio libre de medicamento (100 μL).
- Cubra una microplaca con papel de aluminio para protegerla de la exposición a la luz e incube durante 24 h. Esta placa proporcionará datos de control para los resultados de PDT (condición oscura). La otra microplaca se utilizará en la condición de exposición a la luz en el dispositivo.
3. Funcionamiento del dispositivo
- Enchufe el dispositivo PDT a la toma de corriente y enciéndalo pulsando el botón de encendido .
- Coloque la otra microplaca (condición de luz) en el dispositivo PDT y cierre el equipo sujetando la puerta delantera con las cintas de velcro.
- Use los potenciómetros para ajustar la configuración RGB (un experimento RGB 255, 255, 255 aquí) y establezca el color de la emisión de luz.
NOTA: Cada combinación RGB tiene un espectro de emisión específico, que debe ajustarse para experimentos con diferentes fotosensibilizadores y, en consecuencia, diferentes curvas de absorbancia. - Pulse el panel táctil (+)/(- ) para ajustar la configuración de tiempo (un experimento de 60 minutos aquí) y establecer la duración del ensayo.
NOTA: La configuración del tiempo, en asociación con el valor de irradiancia, determinará la fluencia del proceso: la dosis de luz aplicada en el ensayo. - Compruebe la información de configuración en la pantalla.
- Presione el botón Inicio para iniciar el ensayo. Asegúrese de que se escuche un pitido al comienzo del ensayo.
- En el transcurso del experimento, observe información en tiempo real en la pantalla, como la irradiancia y el tiempo restante.
- No abra la puerta principal ni cambie ninguna configuración durante el ensayo PDT.
- Al final del ensayo, espere a que aparezca un zumbador de cuatro pitidos y a que el sistema electrónico apague todos los LED. Observe un mensaje terminado y la cantidad final de energía gastada -fluencia- durante el experimento en la pantalla.
NOTA: El valor final de fluencia se calcula utilizando la ecuación (1):
(1)
Donde F es igual a J/cm 2 e I es igual a mW/cm 2 o mJ/s·cm 2. El valor de irradiancia considera la potencia de los LED (fuente emisora) y el área uniformemente irradiada de la cámara oscura (660 cm 2) (ecuación [2]):
(2)
El valor teórico de irradiancia se muestra en la pantalla del dispositivo a lo largo de todo el ensayo PDT. Al final de la operación, use la ecuación (3) para calcular la fluencia:
Fluencia (F) = irradiancia (I, valor constante) × tiempo (s) de operación (s ) (3)
(1)
(2)4. Ensayo de viabilidad celular
- Después del ensayo PDT, cubra la microplaca que se expuso a la luz e incube durante 24 h.
- Después del período de incubación, retire el medio de cultivo de ambas placas, lave la monocapa de células con PBS (100 μL) y agregue solución MTT (0,5 mg / ml, 100 μL). Incubar ambas placas, en condiciones oscuras y claras, durante 4 h para permitir la formación de cristales de formazan.
- Retire la solución MTT con cuidado y disuelva los cristales púrpuras con una solución de DMSO/etanol (1:1).
- Después de la disolución completa de los cristales, realice la medición de absorbancia utilizando un lector de microplacas a 595 nm.
NOTA: El dispositivo puede ser utilizado en otros experimentos importantes como la muerte celular mediada por ROS desencadenada por fotosensibilizadores después de la exposición a la luz por citometría de flujo30.
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Representative Results
El dispositivo PDT final, llamado PhotoACT, incluía una cámara oscura para asignar hasta cuatro microplacas multipocil, con su superficie interior superior equipada con un conjunto de 30 LED dispersos programados para emitir distintos espectros de luz visible (Figura 3 y Archivo Suplementario 6). El dispositivo se construyó utilizando dos cajas asociadas: una caja interna diseñada como una cámara oscura para los ensayos PDT, y una caja externa para cubrir la cámara interna y sostener la unidad de control (Figura 1B). La caja interna estaba pintada de negro (Figura 1D) y compuesta por un modelo de cinta de LED RGB WS2812 (o WS281B) con 30 LEDs y de 1 m de longitud (que luego se cortó en tres piezas) y 9 vatios, que contiene un procesador incorporado. Este aparato permitió una utilización más controlada y, en consecuencia, una emisión de color más precisa. Los 30 LEDs se distribuyeron equitativamente sobre toda la superficie interior superior de la cámara PDT mediante tres cintas paralelas con 10 LEDs cada una (Figura 1E). Se estableció una incidencia de luz homogénea debido a la baja reflectividad de las superficies interiores negras y la distribución uniforme de la configuración del LED. También se incorporó un sensor de brillo TSL2561 en la parte inferior central de la caja interna para indicar la incidencia lumínica y servir como herramienta de control de calidad, garantizando la uniformidad de la irradiación dentro de la cámara oscura (Tabla Suplementaria S1) y monitoreando la potencia del sistema LED, que se sabe que tiene un cierto número de horas de vida útil (Figura 1F ). La caja externa es una estructura que cubre la caja interna, compuesta por seis partes de MDF, pintadas de gris y cortadas con láser para un ajuste perfecto (Figuras 1A, B). La unidad de control fue diseñada utilizando el software en línea 31, impreso en 3D con ácido poliláctico como una sola pieza utilizando una impresora3D y pintado de gris. Contiene todos los componentes electrónicos, incluyendo una pantalla, potenciómetros, botones y un zumbador (Figura 1I y Figura 2).
Para permitir ajustes independientes de incidencia de luz, se seleccionó la placa controladora ESP32 para integrar la unidad de control (Figura 2). Esta configuración debería permitir una interfaz USB para programación, bluetooth, Wi-Fi, procesador de doble núcleo, numerosos puertos y la capacidad de comunicarse con un circuito interintegrado (I2C), una interfaz periférica serie (SPI) y otras interfaces. Para operar el sistema, se escribió un programa en lenguaje C a través de un entorno de desarrollo integrado (IDE). La estructura de código32 se basa en FreeRTOS, un sistema operativo gratuito en tiempo real compatible con la placa controladora ESP32. La lógica referida permite la programación independiente de aplicaciones, que pueden ser procesadas por ESP32 en enfoques escalonados o paralelos, haciendo que el proyecto y sus procesos de mantenimiento, mejora y actualización sean mucho más versátiles y seguros.
La interfaz entre la máquina y el operador es fácil de usar y consiste en una pantalla de cristal líquido (LCD), potenciómetros, botones y un zumbador (Figura 3 y Archivo complementario 6). La pequeña pantalla LCD de 16 mm x 2 mm (columnas vs. líneas) tenía un controlador HD44780 incorporado con un protocolo de comunicación I2C, que confiere la facilidad de instalación y versatilidad de transmisión, respectivamente. La configuración preliminar incluye ajustes RGB y de tiempo por parte del operador. La magnitud de la luz y la configuración del color se pueden ajustar utilizando los potenciómetros, que modifican la intensidad (0 a 255) de los tres componentes básicos de color: RGB. Estos ajustes pueden dar lugar a varias composiciones de color tratadas en la tabla internacional de colores RGB33. Cada composición RGB posee una longitud de onda específica, que debe ajustarse de acuerdo con el PS utilizado en el experimento PDT; la curva de absorbancia del PS y la longitud de onda de la irradiación deben superponerse para que la fotoactivación se produzca satisfactoriamente (figura suplementaria S1). A lo largo del proceso, se puede acceder al estado de la operación con el tiempo restante y la información de incidencia de luz en la pantalla LCD.
Al final del tiempo programado, el sistema electrónico apagó todos los LED, emitió una advertencia audible y mostró en la pantalla la cantidad total de energía por área (J / cm²), que se calculó multiplicando el valor constante de irradiancia por el tiempo de operación en segundos. Este modelo digital presentó una amplia gama de niveles de detección (límites entre 0.1 y 40,000+ lux), una interfaz I2C y una baja intensidad de corriente eléctrica (0.5 mA y 15 μA en estado de operación y espera, respectivamente).
Como prueba de concepto, el dispositivo se utilizó para mejorar el efecto citotóxico de la verteporfina en cultivo celular HeLa 2D después de una exposición a la luz de 1 h (49,1 ± 0,6 J/cm2). Como se muestra en la Figura 4A, el valor GI50 fue de 3,1 μM para la condición de luz y 13,8 μM para la condición de oscuridad. Por lo tanto, el desplazamiento de 4,4 veces que comparó las condiciones validó el uso de verteporfina como PS y la aplicabilidad de PhotoACT a los ensayos de TFD. Para validar el uso del prototipo descrito en este trabajo, se utilizó un dispositivo PDT comercial bajo las mismas condiciones experimentales, incluyendo un PS, células y fluencia, y se compararon los resultados. Como se muestra en la Figura 4B, ambos dispositivos fotoactivados con verteporfina por igual, potenciando el efecto citotóxico. Estos resultados confirmaron la aplicabilidad de esto en el dispositivo PDT construido en casa (Figura 4A, B). Finalmente, la muerte celular mediada por ROS desencadenada por verteporfina después de la exposición a la luz se confirmó mediante citometría de flujo utilizando el ensayo DCFDA (Figura 4C, D).
Figura 1: Instrucciones de construcción y montaje de PhotoACT. Ilustración detallada de la construcción, perforación, pintura, montaje y accesorios de componentes en el dispositivo. El panel muestra una guía paso a paso para construir el dispositivo. Abreviatura: LED = diodo emisor de luz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Instrucciones de construcción e instalación electrónica de la unidad de control. Dibujo de vista ampliada de la unidad de control explotada y esquema detallado de conexiones electrónicas en los puertos de la placa controladora ESP32 con conexiones y componentes utilizados en el prototipo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Representación de PhotoACT. Plano de montaje del diseño final del producto con lista de materiales, globos de etiquetado y vista detallada de los LED interiores superiores. La figura permite identificar partes y componentes del prototipo. Abreviaturas: MDF = tablero de fibra de densidad media; LED = diodo emisor de luz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Fototoxicidad in vitro de la generación de verteporfina y ROS. (A,B) Ensayo de viabilidad celular realizado mediante el método MTT: los ensayos se realizaron para evaluar el perfil citotóxico de la verteporfina fotosensibilizadora a diferentes concentraciones. Las células HeLa fueron tratadas durante 24 h con diferentes concentraciones de verteporfina (0,045-24 μM), expuestas a luz (PhotoACT (A) o equipos PDT comerciales (B)) o condiciones de oscuridad, y luego sometidas al ensayo MTT. Ambas condiciones mostraron una disminución de la viabilidad celular a concentraciones más altas de verteporfina, pero la exposición a la luz, obtenida de los ensayos de TFD, mejoró el perfil citotóxico de la PS, lo que implica que la TFD aumenta la citotoxicidad de la verteporfina. Las curvas de viabilidad se ajustaron utilizando el software GraphPad Prism 6. (C,D) Las células HeLa se trataron durante 24 h con concentraciones bajas y altas de verteporfina (0,187 μM y 6 μM) y luego se expusieron a condiciones de luz (PhotoACT) u oscuridad. Los niveles de ROS intracelular se midieron después de la irradiación por citometría de flujo utilizando sonda DCFDA (incubación durante 30 min a 1 μM). Un desplazamiento a la derecha entre los histogramas implicó una mayor intensidad de fluorescencia debido a una mayor acumulación intracelular de DCF y, por lo tanto, mayores niveles de ROS. Los resultados no mostraron diferencias relevantes en los niveles de ROS en la condición oscura (C), pero mostraron un aumento dosis-respuesta en los niveles de ROS después de la fotoactivación de verteporfina (D). Abreviaturas: ROS = especies reactivas de oxígeno; DCF = 2',7'-diclorofluoresceína; DCFDA = 2',7'-diclorohidrofluoresceína diacetato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Diagrama de flujo de decisión del dispositivo: configuración preliminar y solución de problemas de operación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria S1: Superposición entre la curva de absorbancia de verteporfina y el espectro de emisión LED del dispositivo. Espectro de absorción de verteporfina con sus picos de absorbancia específicos (x,y') y espectro de emisión LED de RGB 255, 255, color blanco 255 (3,700K-5,000K CCT) utilizado para fotoactivar el fotosensibilizador (x,y''). La superposición entre los diferentes picos de absorbancia de verteporfina y la luz blanca irradiante corrobora la fotoactivación del fotosensibilizador, que también fue confirmada por los resultados biológicos. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Cuadro suplementario S1: Ensayos de uniformidad de irradiación. Luminosidad instantánea (lúmen) medida por el sensor de brillo en diferentes puntos del área irradiada. Los resultados presentados no muestran variación expresiva, lo que atestigua la irradiación uniforme del dispositivo. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo complementario 1: Archivo vectorial para cortar. Archivo de dibujo (DWG) para corte de tableros de MDF. El archivo debe utilizarse para el corte por control numérico computarizado (CNC). Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo complementario 2: archivo de impresión 3D del control de la unidad. Archivo de estereolitografía (STL) para imprimir en 3D la unidad de control del dispositivo. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo complementario 3: Código de programación en C. Código de programación desarrollado en lenguaje C para configurar la unidad de control del equipo. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo complementario 4: Código de programación INO. Código de programación desarrollado en lenguaje INO para la configuración de la unidad de control del equipo. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo complementario 5: Instrucciones de compilación. Markdown (MD) Archivo "léame" con instrucciones adicionales para la compilación de código de programación. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo complementario 6: Modelo de diseño del dispositivo. Vista previa del archivo de modelo tridimensional Standard for the Exchange of Product Data (STEP) para la visualización general del prototipo. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El dispositivo PhotoACT final fue conveniente de construir con componentes de bajo costo disponibles comercialmente a un costo total de menos de $ 50. Las ventajas adicionales incluyen bajas demandas de mantenimiento, la capacidad de irradiar múltiples tipos de placas de cultivo, el uso simultáneo de hasta cuatro unidades por ensayo, bajo peso (2 kg) / tamaño (44 cm3) que permite la portabilidad, irradiación precisa y reproducible (datos no mostrados) y una interfaz de configuración fácil de usar y simple que no requiere conexión a computadoras u otras máquinas.
Ciertos pasos críticos de los protocolos de construcción y operación dieron lugar a oportunidades de mejora durante la concepción del proyecto. Como una cámara PDT requiere una emisión de luz homogénea y una medición de energía constante, las cajas internas y externas se sellaron para evitar la interferencia de la luz exterior y la pérdida de luz emitida. Se fijaron cintas de velcro adicionales lateralmente en la puerta frontal para reforzar el cierre de la cámara y garantizar experimentos ininterrumpidos. Se instaló un LED representativo en la unidad de control para certificar la configuración RGB requerida, indicando el color y la intensidad de la luz emitida durante el ensayo. Finalmente, el código de programación se sometió a varias actualizaciones para refinar las mediciones de densidad instantáneas y las cantidades finales de evaluaciones de energía, respaldando la reproducibilidad y la consistencia matemática. Algunos otros detalles importantes que requieren atención adicional incluyen: (i) distribución homogénea de los LED y posicionamiento central del sensor de brillo para obtener resultados representativos y equilibrados, (ii) instalación de todos los componentes de acuerdo con el diagrama electrónico (Figura 2) y el código de programación (Archivo complementario 3, Archivo complementario 4 y Archivo complementario 5 ) para garantizar el funcionamiento correcto, y (iii) la configuración (manteniendo la misma configuración RGB y de tiempo) antes de ejecutar un experimento para garantizar réplicas consistentes con resultados confiables. Aunque el sistema RGB proporciona múltiples composiciones de color visibles con longitudes de onda específicas, los experimentos de luz no visible requerirían actualizaciones de protocolo específicas. En la Figura 5 se presenta un diagrama de flujo de decisión para proporcionar un enfoque sistemático de resolución de problemas para encontrar y corregir problemas o errores durante la operación.
Diseñado para satisfacer las demandas de la experimentación in vitro con resultados validados obtenidos con la activación terapéutica de verteporfina para inducir citotoxicidad en células HeLa 2D (Figura 4), PhotoACT se puede recomendar para universidades, escuelas, industrias y otros centros de investigación. Este dispositivo debería extender los beneficios de PDT a la investigación científica que explora el mecanismo de acción de los fotosensibilizadores y sus aplicaciones clínicas.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Agradecemos a Arthur Henrique Gomes de Oliveira y Lucas Julian Cruz Gomes por ayudar con el proceso de filmación. Este proyecto fue apoyado por el Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CNPq, números de subvención 400953/2016-1-404286/2021-6) y la Fundação Araucária-PPSUS 2020/2021 (SUS2020131000003). Este estudio también fue financiado en parte por la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Código de Finanzas 001.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | Mammalian cell culture dissociation reagent |
| 3D printer | Flashforge | Finder model | |
| 96-well plates | Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture | ||
| Arduino | |||
| Brightness sensor | TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface | ||
| Buttons | |||
| Buzzer | |||
| Cell culture Flasks | Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes) | ||
| Centrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay | ||
| CO2 Incubator | |||
| Controller board | ESP32 | ||
| Design Software | Trimble | SketchUp | |
| DMEM High Glucose | Gibco | 11965092 | DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540-500ML | Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% (GC), suitable for plant cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12657029 | FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages. |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Gibco | 15750060 | Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination |
| Hemocytometer | Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay | ||
| Inverted Laboratory Microscope | Leica | DM IL LED | |
| Laminar Flow Hood | Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures | ||
| LCD display | |||
| LED RGB WS2812 | 5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts | ||
| MDF fiberboards | 3mm thickness medium-density fiberboards | ||
| Microcentrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay | ||
| Microplate reader | ThermoFischer | Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation. | |
| MTT Reagent | Invitrogen | M6494 | 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays |
| Operational System | Real Time Engineers ltd. | FreeRTOS | |
| P10 micripipette | Non-electronic, single-channel, 1-10 μL capacity | ||
| P1000 micropipette | Non-electronic, single-channel, 10-1000 μL capacity | ||
| P200 micropipette | Non-electronic, single-channel, 20-200 μL capacity | ||
| PDT Equipment | LumaCare | Model LC-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 | Gibco | 10010031 | Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures |
| Potentiometers | |||
| Tips | Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 μL maximum volumes | ||
| Verteporfin | Sigma-Aldrich | SML0534-5MG | Verteporfin, ≥94% (HPLC) |
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