Summary
Här beskriver vi en ny, enkel och billig enhet för att framgångsrikt utföra in vitro fotodynamisk terapi (PDT) analyser med tvådimensionell HeLa-cellodling och verteporfin som fotosensibiliserare.
Abstract
Detta dokument beskriver en ny, enkel och billig enhet för att utföra in vitro fotodynamisk terapi (PDT) -analyser, kallad PhotoACT. Enheten byggdes med hjälp av en uppsättning konventionella programmerbara lysdioder (lysdioder), en LCD-modul (liquid crystal display) och en ljussensor ansluten till ett kommersiellt mikrokontrollerkort. Prototypens lådbaserade struktur gjordes med fiberplattor med medelhög densitet (MDF). Det inre facket kan samtidigt allokera fyra mikroplattor för cellodling multiwell.
Som ett bevis på konceptet studerade vi den cytotoxiska effekten av fotosensibiliseraren (PS) verteporfin mot HeLa-cellinjen i tvådimensionell (2D) kultur. HeLa-celler behandlades med ökande koncentrationer av verteporfin i 24 timmar. Det läkemedelsinnehållande supernatantmediet kasserades, de vidhäftande cellerna tvättades med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och läkemedelsfritt medium tillsattes. I denna studie undersöktes effekten av verteporfin på celler antingen utan ljusexponering eller efter exponering i 1 timme för ljus med hjälp av rödgrönblå (RGB) värden på 255, 255 och 255 (genomsnittlig fluens på 49,1 ± 0,6 J / cm2). Efter 24 timmar bedömdes cellviabiliteten genom analysen 3-(4,5-dimetyl-2-tiazolyl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT).
Experimentella resultat visade att exponering av celler behandlade med verteporfin för ljuset från enheten förbättrar läkemedlets cytotoxiska effekt via en mekanism medierad av reaktiva syrearter (ROS). Dessutom validerades användningen av prototypen som beskrivs i detta arbete genom att jämföra resultaten med en kommersiell PDT-enhet. Således representerar denna LED-baserade fotodynamiska terapiprototyp ett bra alternativ för in vitro-studier av PDT.
Introduction
Bland de mest dödliga icke-överförbara sjukdomarna utgör cancer en globalt ledande orsak till för tidig död. Det stod för nästan 10 miljoner dödsfall 2020, vilket motsvarar ungefär ett av sex dödsfall i världen1. Dessutom utgör fenomenet multiresistans (MDR) ett enormt hot mot folkhälsan, eftersom godkända kemoterapeutiska protokoll inte når remissionsstadier för detta kliniska tillstånd2. Cancerceller kan utveckla resistens mot kemoterapi genom flera mekanismer; Överuttrycket av vissa ATP-bindande kassetttransportörer (ABC) - ATP-beroende effluxpumpar - anses dock vara den främsta orsaken till MDR-utveckling inom en tumörmikromiljö3. Förutom MDR förstärker andra cancerkomplikationer, såsom återfall och metastasering, den brådskande efterfrågan på att utveckla och förbättra terapeutiska metoder för att övervinna denna onkologiska utmaning.
Det botande utnyttjandet av ljus har praktiserats i århundraden4, och fotodynamisk terapi (PDT) representerar ett kliniskt godkänt terapeutiskt tillvägagångssätt för solida tumörer. PDT kombinerar administrering av en fotosensibiliserare (PS) följt av lätt bestrålning för att generera reaktiva syrearter (ROS) för att utöva selektiv cytotoxicitet i tumörceller. Detta terapeutiska tillvägagångssätt är överlägset konventionella metoder, inklusive kirurgi, strålning och kemoterapi5; Det är en minimalt invasiv teknik som visar lägre cytotoxicitet i bindväv6. Ljusapplikationen och PS-ackumuleringen direkt i tumören eller dess mikromiljö säkerställer exakt inriktning och följaktligen mindre, oönskade systemiska biverkningar7 och möjligheten till upprepad behandling på samma plats. Dessutom är kostnaden lägre än för andra tillvägagångssätt. På grund av dess lovande egenskaper kan PDT betraktas som ett lämpligt alternativ för både singel, särskilt vid inoperabla tumörer eller adjuvant cancerbehandling7, och representerar ett alternativ för MDR relaterat till kemoterapi 8,9.
Den första rapporten som visade en hög objektiv svarsfrekvens med PDT beskrevs 1975 i en mus- och råttmodell10. Sedan dess har studier genomförts med PDT med positiva utfall7 både in vivo och in vitro med humana tumörcellinjer i 2D-cellodling11,12. Med tanke på den breda tillämpligheten av kliniskt godkända PS, oavsett deras specifika ackumuleringsvägar och våglängdsintervall för absorptionstoppar, är den allmänna processen följande: (i) PS-upptag, (ii) toppning av PS-koncentration vid tumören eller dess mikromiljö, (iii) ljusapplikation, (iv) PS-ljusinteraktion, (v) överföring av PS-exciterad tillståndsenergi till antingen vävnadssubstrat eller omgivande syremolekyler, vi) ROS-produktion som involverar singlet syre eller superoxidanjon, (vii) tumörcellsdöd via, i huvudsak, nekros eller apoptos (direkt död), autofagi (cytoprotektiv mekanism), vävnadsischemi (vaskulär skada), immunmodulering eller en överlappning av dessa mekanismer7. I detta sista steg beror aktiveringen av en specifik celldödsväg på många faktorer, såsom cellegenskaper, experimentell design och, viktigast av allt, PS intracellulär lokalisering och PDT-relaterad riktad skada13.
Verteporfin är en andra generationens PS, godkänd av tillsynsmyndigheter för klinisk användning i Norge och Kina för att behandla åldersrelaterad makuladegeneration7. Efter dosleverans rapporterades denna prodrog delvis ackumuleras i mitokondrier14 och inducera cellulärt proteintyrosinfosforylering och DNA-fragmentering, vilket leder till tumörcellsapoptos15,16. Efter 24 timmars inkubation för verteporfininternalisering rekommenderas ett PDT-protokoll med en våglängdsinställning på 690 nm för att uppnå effektiva nivåer av elektromagnetisk strålningsöverföring till intilliggande molekyler 7,17.
När det gäller ljuskällan för PDT är de klassiska diodlassystemen vanligtvis dyra, tekniskt komplicerade, överdimensionerade och därmed oportabla18,19. Som en följd av dess envåglängdsprofil, som också kan observeras i LED-baserad PDT-utrustning, gör efterfrågan på oberoende enheter för varje fotosensibiliserande applikation användningen av diodlasersystem ännu mer komplex och ekonomiskt omöjlig20,21. Därför, användningen av LED-maskiner anses vara det mest lovande alternativet för att lösa inte bara kostnader 22 och underhållsproblem, utan också för att ge hög effekt och mindre skadlig23 och bredare belysningsförmåga24,25,26,27.
Trots det potentiella bidrag som LED-baserad utrustning kan erbjuda till PDT-experiment28, de flesta kommersiella alternativ har fortfarande nackdelar som brist på bärbarhet, höga kostnader och komplexa byggprojekt och drift29. Huvudsyftet med detta arbete var att erbjuda ett enkelt och pålitligt verktyg för in vitro PDT-analyser. Detta dokument beskriver PhotoACT, en egenbyggd LED-baserad PDT-enhet, som är billig, användarvänlig och bärbar. Som ett bevis på konceptet har denna enhet visat sig förbättra cytotoxiciteten hos verteporfin i en 2D-cellodlingsmodell och kan därför användas som ett forskningsverktyg i PDT-experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Se materialförteckningen för detaljer relaterade till alla material, reagenser och programvara som används i detta protokoll.
1. Enhetens konstruktion
- Såg 3 mm tjocka fiberplattor med medelhög densitet (MDF) för att erhålla bitar med måtten som visas i figur 1A.
OBS: Använd vektorfilen (Tilläggsfil 1) för datorskärning av numerisk kontroll (CNC). - Bygg två lådor med följande mått (längd x bredd x höjd): 330 mm x 235 mm x 225 mm för de större lådorna och 300 mm x 220 mm x 150 m för de mindre lådorna (figur 1B).
- Borra baksidan av den större lådan för att installera en fatuttagskontakt. Borra toppen av den större lådan och böj den övre och nedre delen av den mindre lådan för att ge en passage för elektriska kablar (figur 1C).
- Måla alla inre ytor med svart bläck för att främja homogen ljusincidens (figur 1D).
- Fäst parallellt tre LED-band med 10 lysdioder vardera vid den övre inre ytan av den mindre lådan (figur 1E).
- Installera en ljusstyrkesensor i mitten av den nedre inre ytan på den mindre lådan (figur 1F).
- Skriv ut styrenhetens struktur (bild 1G) med hjälp av 3D-utskriftsfilen (tilläggsfil 2).
- Installera alla komponenter (strömbrytare, potentiometrar, tid/start-pekplatta, lysdioder, ljusstyrka, LCD, summer och strömförsörjning) vid portarna på ett ESP32-styrkort monterat på styrenhetens inre (bild 2).
- Ladda upp programmeringskoden (Tilläggsfil 3, Tilläggsfil 4 och Tilläggsfil 5) och kör ett test för att kontrollera att alla anslutningar fungerar (bild 1H).
- Montera lådorna och fixa dem tillsammans för att undvika luckor och därmed yttre ljusstörningar och avgiven ljusförlust. Fäst den monterade styrenheten på det borrade området högst upp på prototypen (bild 1I).
- Fäst en ytterdörr av samma material och 330 mm x 225 mm (längd x bredd) mått på den större lådan med två små gångjärn. Fäst också kardborreband i sidled på den större lådan för att förstärka prototypförslutningen (figur 1J). Installera ett handtag för att manipulera utrustningens ytterdörr.
- Fäst fyra fotkuddar av gummi längst ner på prototypen för att säkerställa mer stabilitet under operationerna (figur 1K).
2. Cellinjer: odling, sådd och behandling
- Kemikalier
- Lös upp porfyrinet i dimetylsulfoxid (DMSO) för att uppnå en koncentration på 100 mM.
VARNING: DMSO måste hanteras försiktigt (hantering med användning av personlig skyddsutrustning och i ett ventilerat område). Manipulera både lager och utspädda lösningar noggrant för att undvika överdriven ljusexponering.
- Lös upp porfyrinet i dimetylsulfoxid (DMSO) för att uppnå en koncentration på 100 mM.
- Cellinjer
- Odla HeLa-cellinjen i Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM) lågglukosmedium kompletterat med 10% fetalt bovint serum och 1% gentamicin.
- Förvara odlingskolvarna i en 5% CO 2-cellodlingsinkubator vid 37 °C.
- Hantera och inspektera cellerna tills de når 80%-90% sammanflöde.
- Sådd process
- Ta bort odlingsmediet från kolven.
- Tvätta cellmonolagret med PBS.
- Lossa den konfluenta cellkulturen med trypsin-EDTA (0,5%) 1x i 5 min vid 37 °C. Stoppa verkan av trypsin genom att återsuspendera cellerna med odlingsmedium kompletterat med 10% fetalt bovint serum och 1% gentamicin.
- Räkna de återsuspenderade cellerna med en hemocytometer och frö dem till en 96-brunnsplatta vid 2,0 × 104 celler / brunn.
- Förbered två plattor för mörka och ljusa förhållanden.
- Inkubera plattorna i 24 timmar för cellfästning.
- Behandlingsprocess
- Ta bort mediet från båda 96-brunnsplattorna.
- Behandla cellerna med 100 μl ökande koncentrationer av verteporfin (0,045 till 24 μM, seriell utspädning).
- Inkubera cellerna med läkemedelsbehandling i 24 timmar för att möjliggöra verteporfin internalisering.
- Efter 24 h, kassera mediet som innehåller läkemedlet, tvätta monolagret av celler med PBS (100 μL) och tillsätt läkemedelsfritt medium (100 μL).
- Täck en mikroplatta med aluminiumfolie för att skydda den från ljusexponering och inkubera den i 24 timmar. Denna platta kommer att ge kontrolldata för PDT-resultat (mörkt tillstånd). Den andra mikroplattan kommer att användas på ljusexponeringstillståndet i enheten.
3. Enhetens funktion
- Anslut PDT-enheten till eluttaget och slå på den genom att trycka på strömbrytaren .
- Placera den andra mikroplattan (ljusförhållande) i PDT-enheten och stäng utrustningen genom att fästa ytterdörren med kardborrebanden.
- Använd potentiometrarna för att justera RGB-konfigurationen (ett RGB 255, 255 , 255-experiment här) och ställ in färgen på ljusemissionen.
OBS: Varje RGB-kombination har ett specifikt emissionsspektrum, som måste justeras för experiment med olika fotosensibiliserare och följaktligen olika absorbanskurvor. - Tryck på (+)/(-) pekplattan för att justera tidskonfigurationen (ett 60 minuters experiment här) och ställ in varaktigheten för analysen.
OBS: Tidskonfigurationen, i kombination med bestrålningsvärdet, kommer att bestämma flytningen av processen - ljusdosen som appliceras i analysen. - Kontrollera installationsinformationen på displayen.
- Tryck på Start-knappen för att starta analysen. Se till att en en-pip summer hörs i början av analysen.
- Under experimentets gång, observera realtidsinformation på displayen, såsom bestrålning och tid kvar.
- Öppna inte ytterdörren och ändra inte någon konfiguration under PDT-analysen.
- I slutet av analysen väntar du på en fyrpipig summer och tills det elektroniska systemet stänger av alla lysdioder. Observera ett slutfört meddelande och den slutliga mängden energi som förbrukas - fluens - under experimentet i displayen.
OBS: Fluens slutvärde beräknas med hjälp av ekvation (1):
(1)
Där F är lika med J/cm 2 och I är lika med mW/cm 2 eller mJ/s·cm 2. Bestrålningsvärdet tar hänsyn till styrkan hos lysdioderna (emitterande källa) och det jämnt bestrålade området i den mörka kammaren (660 cm 2) (ekvation [2]):
(2)
Det teoretiska strålningsvärdet visas på enhetens display under hela PDT-analysen. I slutet av operationen använder du ekvation (3) för att beräkna fluensen:
Fluens (F) = bestrålning (I, konstant värde) × driftstid (er) (3)
(1)
(2)4. Analys av cellviabilitet
- Efter PDT-analysen täcker du mikroplattan som utsattes för ljus och inkuberar i 24 timmar.
- Efter inkubationsperioden, ta bort odlingsmediet från båda plattorna, tvätta monolagret av celler med PBS (100 μL) och tillsätt MTT-lösning (0,5 mg / ml, 100 μL). Inkubera både plattor - mörka och ljusa förhållanden - i 4 timmar för att möjliggöra formazankristallbildning.
- Avlägsna MTT-lösningen försiktigt och lös upp de lila kristallerna med en DMSO/etanollösning (1:1).
- Efter fullständig upplösning av kristallerna, utför absorbansmätningen med användning av en mikroplattläsare vid 595 nm.
OBS: Enheten kan användas i andra viktiga experiment såsom ROS-medierad celldöd utlöst av fotosensibiliserare efter ljusexponering med flödescytometri30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den sista PDT-enheten, som heter PhotoACT, inkluderade en mörk kammare för att fördela upp till fyra multiwell-mikroplattor, med sin övre inre yta utrustad med en uppsättning av 30 spridda lysdioder programmerade för att avge distinkta spektrum av synligt ljus (figur 3 och kompletterande fil 6). Enheten byggdes med två tillhörande lådor: en intern låda utformad som en mörk kammare för PDT-analyserna och en extern låda för att täcka den inre kammaren och hålla styrenheten (figur 1B). Den interna lådan målades svart (figur 1D) och bestod av en tejpmodell av LED RGB WS2812 (eller WS281B) med 30 lysdioder och med 1 m längd (som senare skars i tre delar) och 9 watt, som rymmer en inbyggd processor. Denna apparat möjliggjorde ett mer kontrollerat utnyttjande och följaktligen mer exakt färgemission. De 30 lysdioderna fördelades lika över hela PDT-kammarens övre inre yta med tre parallella band med 10 lysdioder vardera (figur 1E). En homogen ljusincidens fastställdes på grund av den låga reflektiviteten hos de svarta inre ytorna och den enhetliga fördelningen av LED-konfigurationen. En TSL2561-ljusstyrkasensor införlivades också i den nedre mitten av den interna lådan för att indikera ljusincidensen och fungera som ett kvalitetskontrollverktyg, vilket garanterar bestrålningsuniformitet inuti den mörka kammaren (kompletterande tabell S1) och övervakar kraften i LED-systemet, som är känt för att ha ett visst antal timmars livslängd (Figur 1F ). Den externa lådan är en struktur som täcker den inre lådan, bestående av sex MDF-delar, målade grå och laserskurna för perfekt passform (figur 1A, B). Styrenheten designades med hjälp av online-programvara31, 3D-tryckt med polymjölksyra som en enda del med en 3D-skrivare och målade grå. Den innehåller alla elektronikkomponenter, inklusive en display, potentiometrar, knappar och en summer (figur 1I och figur 2).
För att möjliggöra oberoende ljusinfallsjusteringar valdes ESP32-styrkortet för att integrera styrenheten (figur 2). Denna konfiguration bör möjliggöra ett USB-gränssnitt för programmering, Bluetooth, Wi-Fi, processor med dubbla kärnor, många portar och möjligheten att kommunicera med en interintegrerad krets (I2C), ett seriellt perifert gränssnitt (SPI) och andra gränssnitt. För att driva systemet skrevs ett program på C-språk genom en integrerad utvecklingsmiljö (IDE). Kodstrukturen32 är baserad på FreeRTOS, ett gratis operativsystem i realtid som stöds av ESP32-styrkortet. Den refererade logiken möjliggör oberoende applikationsprogrammering, som kan bearbetas av ESP32 i echeloned eller parallella tillvägagångssätt, vilket gör projektet och dess underhålls-, förbättrings- och uppdateringsprocesser mycket mer mångsidiga och säkra.
Gränssnittet mellan maskinen och operatören är användarvänligt och bestod av en LCD-skärm (liquid crystal display), potentiometrar, knappar och en summer (figur 3 och tilläggsfil 6). Den lilla LCD-skärmen på 16 mm x 2 mm (kolumner kontra linjer) hade en inbyggd HD44780-styrenhet med ett I2C-kommunikationsprotokoll, vilket ger enkel installation respektive överföringsmångsidighet. Den preliminära installationen inkluderar RGB och tidsjusteringar av operatören. Ljusstorleken och färgkonfigurationen kan justeras med hjälp av potentiometrarna, som ändrar intensiteten (0 till 255) för de tre grundläggande färgkomponenterna -RGB. Dessa justeringar kan resultera i flera färgkompositioner som behandlas i den internationella RGB-färgtabellen33. Varje RGB-komposition äger en specifik våglängd, som måste justeras enligt PS som används i PDT-experimentet; Absorbanskurvan för PS och bestrålningens våglängd måste överlappas för att fotoaktiveringen ska kunna ske på ett tillfredsställande sätt (kompletterande figur S1). Under processen kan operationsstatus med återstående tid och information om ljusincidens nås på LCD-skärmen.
I slutet av den programmerade tiden stängde elektroniksystemet av alla lysdioder, avgav en hörbar varning och visade på displayen den totala mängden energi per område (J / cm²), som beräknades genom att multiplicera det konstanta värdet av bestrålning med driftstiden i sekunder. Denna digitala modell presenterade ett brett spektrum av detektionsnivåer (gränser mellan 0,1 och 40 000+ lux), ett I2C-gränssnitt och en låg intensitet av elektrisk ström (0,5 mA respektive 15 μA i drift respektive standby-status).
Som ett bevis på konceptet användes enheten för att förbättra den cytotoxiska effekten av verteporfin i 2D HeLa-cellodling efter ljusexponering på 1 h (49,1 ± 0,6 J / cm2). Som visas i figur 4A var GI50-värdet 3,1 μM för ljusförhållandet och 13,8 μM för mörkt tillstånd. Således validerade det 4,4-faldiga skiftet som jämförde villkoren användningen av verteporfin som PS och tillämpligheten av PhotoACT på PDT-analyser. För att validera användningen av prototypen som beskrivs i detta arbete användes en kommersiell PDT-enhet under samma experimentella förhållanden, inklusive en PS, celler och flyt, och resultaten jämfördes. Som visas i figur 4B fotoaktiverade båda enheterna verteporfin lika, vilket förbättrar den cytotoxiska effekten. Dessa resultat bekräftade tillämpligheten av detta i egenbyggda PDT-enheter (figur 4A,B). Slutligen bekräftades den ROS-medierade celldöden som utlöstes av verteporfin efter ljusexponering genom flödescytometri med DCFDA-analys (figur 4C,D).
Figur 1: PhotoACT konstruktions- och monteringsanvisningar. Detaljerad illustration av konstruktion av, borrning, målning, montering och accessorisering av komponenter i enheten. Panelen visar en steg-för-steg-guide för att bygga enheten. Förkortning: LED = lysdiod. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Styrenhetens konstruktion och elektroniska installationsanvisningar. Inzoomad vyritning av sprängd styrenhet och detaljerat schema för elektroniska anslutningar vid ESP32-styrkortportar med anslutningar och komponenter som används i prototypen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: PhotoACT-representation. Monteringsritning av den slutliga produktdesignen med materialförteckning, märkningsballonger och detaljerad bild av de övre inre lysdioderna. Figuren gör det möjligt att identifiera delar och komponenter i prototypen. Förkortningar: MDF = fiberplatta med medelhög densitet; LED = lysdiod. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: In vitro-fototoxicitet för verteporfin och ROS-generering. (A,B) Cellviabilitetsanalys utförd med MTT-metoden: analyserna utfördes för att utvärdera den cytotoxiska profilen för fotosensibiliseraren verteporfin vid olika koncentrationer. HeLa-celler behandlades i 24 timmar med olika koncentrationer av verteporfin (0,045-24 μM), utsattes för ljus (PhotoACT (A) eller kommersiell PDT-utrustning (B)) eller mörka förhållanden och utsattes sedan för MTT-analysen. Båda tillstånden visade en minskad cellviabilitet vid högre koncentrationer av verteporfin, men ljusexponeringen som erhölls från PDT-analyser förbättrade PS: s cytotoxiska profil, vilket innebär att PDT ökar cytotoxiciteten hos verteporfin. Viabilitetskurvorna monterades med hjälp av GraphPad Prism 6-programvaran. (C,D) HeLa-celler behandlades i 24 timmar med låga och höga koncentrationer av verteporfin (0,187 μM och 6 μM) och utsattes sedan för ljus (PhotoACT) eller mörka förhållanden. Intracellulära ROS-nivåer mättes efter bestrålning med flödescytometri med DCFDA-sond (inkubation i 30 minuter vid 1 μM). En högerförskjutning bland histogrammen innebar högre fluorescensintensitet på grund av en högre intracellulär ackumulering av DCF, och därmed större ROS-nivåer. Resultaten visade ingen relevant skillnad i ROS-nivåer i mörkertillstånd (C) men visade en dos-responsökning av ROS-nivåerna efter verteporfinfotoaktivering (D). Förkortningar: ROS = reaktiva syrearter; DCF = 2',7'-diklorfluorescein; DCFDA = 2',7'-diklorfluoresceindiacetat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 5: Enhetens beslutsflödesschema: preliminär felsökning av installation och åtgärd. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur S1: Överlappning mellan absorbanskurvan för verteporfin och enhetens LED-emissionsspektrum. Absorptionsspektrum av verteporfin med dess specifika absorbanstoppar (x,y') och LED-emissionsspektrum av RGB 255, 255, 255-vit färg (3,700K-5,000K CCT) som används för att fotoaktivera fotosensibiliseraren (x,y''). Överlappningen mellan de olika absorbanstopparna hos verteporfin och det vita bestrålande ljuset bekräftar fotoaktiveringen av fotosensibiliseraren, vilket också bekräftades av de biologiska resultaten. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande tabell S1: Enhetlighetstester för bestrålning. Omedelbar ljusstyrka (lumen) mätt med ljusstyrkasensorn vid olika punkter i det bestrålade området. De presenterade resultaten visar ingen uttrycksfull variation, vilket intygar enhetens enhetliga bestrålning. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 1: Vektorfil för skärning. Ritningsfil (DWG) för MDF-kortskärning. Filen måste användas för pc-skärning (Computer Numerical Control). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 2: 3D-utskriftsfil för enhetskontrollen. Stereolitografi (STL) -fil för att 3D-skriva ut enhetens styrenhet. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 3: C programmeringskod. Programmeringskod utvecklad i C-språk för att konfigurera utrustningens styrenhet. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 4: INO-programmeringskod. Programmeringskod utvecklad på INO-språk för att konfigurera utrustningens styrenhet. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 5: Sammanställningsinstruktioner. Markdown (MD) "READ ME" -fil med ytterligare instruktioner för programmering av kodkompilering. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 6: Designmodell av enheten. Förhandsgranskning av standardmodellen Standard for the Exchange of Product Data (STEP) för allmän visualisering av prototypen. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den slutliga PhotoACT-enheten var bekväm att konstruera med kommersiellt tillgängliga, billiga komponenter till en total kostnad på mindre än $ 50. Ytterligare fördelar inkluderar låga underhållskrav, kapacitet att bestråla flera typer av odlingsplattor, samtidig användning av upp till fyra enheter per analys, låg vikt (2 kg) / storlek (44 cm3) som möjliggör bärbarhet, exakt och reproducerbar bestrålning (data visas inte) och ett användarvänligt och enkelt installationsgränssnitt som inte kräver anslutning till datorer eller andra maskiner.
Vissa kritiska steg i både konstruktions- och driftsprotokoll gav upphov till förbättringsmöjligheter under projektutformningen. Eftersom en PDT-kammare kräver homogen ljusemission och konsekvent energimätning, förseglades de inre och yttre lådorna för att undvika både yttre ljusstörningar och utsänd ljusförlust. Ytterligare kardborreband fixerades i sidled på frontdörren för att förstärka kammarens stängning och säkerställa oavbrutna experiment. En representativ lysdiod installerades vid styrenheten för att certifiera den nödvändiga RGB-konfigurationen, vilket indikerar färgen och intensiteten hos det utsända ljuset under analysen. Slutligen genomgick programmeringskoden flera uppgraderingar för att förfina omedelbara densitetsmätningar och slutliga mängder energiutvärderingar, vilket godkände reproducerbarhet och matematisk konsistens. Några andra viktiga detaljer som kräver extra uppmärksamhet inkluderar: (i) homogen fördelning av lysdioder och central positionering av ljusstyrkasensorn för att få representativa och balanserade resultat, (ii) installation av alla komponenter enligt det elektroniska diagrammet (figur 2) och programmeringskod (tilläggsfil 3, kompletterande fil 4 och kompletterande fil 5 ) för att säkerställa korrekt drift och (iii) installationen (behålla samma RGB- och tidskonfiguration) innan du kör ett experiment för att säkerställa konsekventa repliker med tillförlitliga resultat. Även om RGB-systemet tillhandahåller flera synliga färgkompositioner med specifika våglängder, skulle experiment med icke-synligt ljus kräva specifika protokolluppgraderingar. Ett beslutsflödesschema presenteras i figur 5 för att ge en systematisk problemlösningsmetod för att hitta och korrigera problem eller fel under operationen.
Utformad för att möta kraven på in vitro-experiment med validerade resultat erhållna med terapeutisk aktivering av verteporfin för att inducera cytotoxicitet i 2D HeLa-celler (figur 4), kan PhotoACT rekommenderas för universitet, skolor, industrier och andra forskningscentra. Denna enhet bör utöka fördelarna med PDT till vetenskaplig forskning som utforskar verkningsmekanismen för fotosensibiliserare och deras kliniska tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Arthur Henrique Gomes de Oliveira och Lucas Julian Cruz Gomes för att de hjälpte till med filmprocessen. Detta projekt stöddes av det brasilianska forskningsrådet (CNPq, bidragsnummer 400953/2016-1-404286/2021-6) och Fundação Araucária-PPSUS 2020/2021 (SUS2020131000003). Denna studie finansierades också delvis av Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | Mammalian cell culture dissociation reagent |
| 3D printer | Flashforge | Finder model | |
| 96-well plates | Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture | ||
| Arduino | |||
| Brightness sensor | TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface | ||
| Buttons | |||
| Buzzer | |||
| Cell culture Flasks | Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes) | ||
| Centrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay | ||
| CO2 Incubator | |||
| Controller board | ESP32 | ||
| Design Software | Trimble | SketchUp | |
| DMEM High Glucose | Gibco | 11965092 | DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540-500ML | Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% (GC), suitable for plant cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12657029 | FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages. |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Gibco | 15750060 | Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination |
| Hemocytometer | Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay | ||
| Inverted Laboratory Microscope | Leica | DM IL LED | |
| Laminar Flow Hood | Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures | ||
| LCD display | |||
| LED RGB WS2812 | 5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts | ||
| MDF fiberboards | 3mm thickness medium-density fiberboards | ||
| Microcentrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay | ||
| Microplate reader | ThermoFischer | Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation. | |
| MTT Reagent | Invitrogen | M6494 | 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays |
| Operational System | Real Time Engineers ltd. | FreeRTOS | |
| P10 micripipette | Non-electronic, single-channel, 1-10 μL capacity | ||
| P1000 micropipette | Non-electronic, single-channel, 10-1000 μL capacity | ||
| P200 micropipette | Non-electronic, single-channel, 20-200 μL capacity | ||
| PDT Equipment | LumaCare | Model LC-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 | Gibco | 10010031 | Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures |
| Potentiometers | |||
| Tips | Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 μL maximum volumes | ||
| Verteporfin | Sigma-Aldrich | SML0534-5MG | Verteporfin, ≥94% (HPLC) |
References
- Ferlay, J., et al. International agency for research on cancer. Global Cancer Observatory: Cancer Today. 23 (7), https://gco.iarc.fr/today/home 323-326 (2018).
- Gottesman, M. M., Fojo, T., Bates, S. E. Multidrug resistance in cancer: role of Atp-dependent transporters. Nature Reviews Cancer. 2 (1), 48-58 (2002).
- Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Boothe-Genthe, C., Gottesman, G. A. Targeting multidrug resistance in cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 219-234 (2006).
- Ackroyd, R., Kelty, C., Brown, N., Reed, M. The history of photodetection and photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 74 (5), 656-669 (2001).
- Hamblin, M. R. Photodynamic therapy for cancer: what's past is prologue. Photochemistry and Photobiology. 96 (3), 506-516 (2020).
- Barr, H., et al. The contrasting mechanisms of colonic collagen damage between photodynamic therapy and thermal injury. Photochem Photobiol. 46 (5), 795-800 (1987).
- Algorri, J. F., Ochoa, M., Roldán-Varona, P., Rodríguez-Cobo, L., López-Higuera, J. M. Photodynamic therapy: A compendium of latest reviews. Cancers. 13 (17), 4447 (2021).
- Aniogo, E. C., Plackal, B., George, B. P. A., Abrahamse, H. The role of photodynamic therapy on multidrug resistant breast cancer. Cancer Cell International. 19, 91 (2019).
- Spring, B. Q., Rizvi, I., Xu, N., Hasan, T. The role of photodynamic therapy in overcoming cancer drug resistance. Photochemical & Photobiological Sciences. 14 (8), 1476-1491 (2015).
- Dougherty, T. J., Grindey, G. B., Fiel, R., Weishaupt, K. R., Boyle, D. G. Photoradiation therapy. II. Cure of animal tumors with hematoporphyrin and light. Journal of the National Cancer Institute. 55 (1), 115-121 (1975).
- Etcheverry, M. E., Pasquale, M. A., Garavaglia, M. Photodynamic therapy of HeLa cell cultures by using LED or laser sources. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 160, 271-277 (2016).
- Guo, Q., Dong, B., Nan, F., Guan, D., Zhang, Y. 5-Aminolevulinic acid photodynamic therapy in human cervical cancer via the activation of microRNA-143 and suppression of the Bcl-2/Bax signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 14 (1), 544-550 (2016).
- Mroz, P., Yaroslavsky, A., Kharkwal, G. B., Hamblin, M. R. Cell death pathways in photodynamic therapy of cancer. Cancers. 3 (2), 2516-2539 (2011).
- Mahalingam, S. M., Ordaz, J. D., Low, P. S. Targeting of a photosensitizer to the mitochondrion enhances the potency of photodynamic therapy. ACS Omega. 3 (6), 6066-6074 (2018).
- Granville, D. J., Levy, J. G., Hunt, D. W. C. Photodynamic treatment with benzoporphyrin derivative monoacid ring A produces protein tyrosine phosphorylation events and DNA fragmentation in murine P815 cells. Photochemistry and Photobiology. 67 (3), 358-362 (1998).
- Castano, A. P., Demidova, T. N., Hamblin, M. R. Mechanisms in photodynamic therapy: part two - cellular signaling, cell metabolism and modes of cell death. Photodiagnosis Photodynamic Therapy. 2 (1), 1-23 (2014).
- Detty, M. R., Gibson, S. L., Wagner, S. J. Current clinical and preclinical photosensitizers for use in photodynamic therapy. Journal of Medicinal Chemistry. 47 (16), 3897-3915 (2004).
- Allison, R. R. Photodynamic therapy: oncologic horizons. Future Oncology. 10 (1), 123-142 (2014).
- Chepurna, O., et al. Photodynamic therapy with laser scanning mode of tumor irradiation. Optical Fibers and Their Applications 2015. 9816, 323-326 (2015).
- Huang, Z. A review of progress in clinical photodynamic therapy. Technology in Cancer Research and Treatment. 4 (3), 283-293 (2005).
- Chepurna, O., et al. LED-based portable light source for photodynamic therapy. Optics in Health Care and Biomedical Optics. 11190, 109-115 (2019).
- Hasson, O., Wishkerman, A. CultureLED: A 3D printer-based LED illumination cultivation system for multi-well culture plates. HardwareX. 12, 00323 (2022).
- Wu, X., et al. Localised light delivery on melanoma cells using optical microneedles. Biomedical Optics Express. 13 (2), 1045-1060 (2022).
- Erkiert-Polguj, A., Halbina, A., Polak-Pacholczyk, I., Rotsztejn, H. Light-emitting diodes in photodynamic therapy in non-melanoma skin cancers-own observations and literature review. Journal of Cosmetic and Laser Therapy. 18 (2), 105-110 (2016).
- Neupane, J., Ghimire, S., Shakya, S., Chaudhary, L., Shrivastava, V. P. Effect of light emitting diodes in the photodynamic therapy of rheumatoid arthritis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 7 (1), 44-49 (2010).
- Lins, E. C., et al. A novel 785-nm laser diode-based system for standardization of cell culture irradiation. Photomedicine and Laser Surgery. 31 (10), 466-473 (2013).
- Hopkins, S. L., et al. An In vitro cell irradiation protocol for testing photopharmaceuticals and the effect of blue, green, and red light on human cancer cell lines. Photochemical and Photobiological Sciences. 15 (5), 644-653 (2016).
- Zhang, K., Waguespack, M., Kercher, E. M., Spring, B. Q. An automated and stable LED array illumination system for multiwell plate cell culture photodynamic therapy experiments. Research Square. , 1-18 (2022).
- Gálvez, E. N., et al. Analysis and evaluation of the operational characteristics of a new photodynamic therapy device. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 37, 102719 (2022).
- Bretin, L., et al. Photodynamic therapy activity of new human colorectal cancer. Cancers. 11 (10), 1474 (2019).
- T. SketchUp. , Available from: https://www.sketchup.com/ (2022).
- LCDR PhotoDynamic Therapy (PDT) Equipment Repository. GitHub, Inc. , Available from: https://github.com/PhotoDynamicTherapy (2022).
- W3C CSS Color Module Level 3. W3C, Inc. , Available from: https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB (2022).
