Summary
Burada, iki boyutlu HeLa hücre kültürü ve verteporfin kullanarak in vitro fotodinamik terapi (PDT) testlerini başarılı bir şekilde gerçekleştirmek için yeni, basit ve düşük maliyetli bir cihazı fotosensitizör olarak tanımladık.
Abstract
Bu yazıda, PhotoACT adı verilen in vitro fotodinamik terapi (PDT) tahlillerini gerçekleştirmek için yeni, basit ve düşük maliyetli bir cihaz açıklanmaktadır. Cihaz, bir dizi geleneksel programlanabilir ışık yayan diyot (LED), bir sıvı kristal ekran (LCD) modülü ve ticari bir mikrodenetleyici kartına bağlı bir ışık sensörü kullanılarak üretilmiştir. Prototipin kutu tabanlı yapısı, orta yoğunluklu suntalarla (MDF'ler) yapıldı. İç bölme aynı anda dört hücre kültürü multiwell mikroplakasını tahsis edebilir.
Kavramın bir kanıtı olarak, iki boyutlu (2D) kültürde fotosensitizör (PS) verteporfinin HeLa hücre hattına karşı sitotoksik etkisini inceledik. HeLa hücreleri 24 saat boyunca artan verteporfin konsantrasyonları ile tedavi edildi. İlaç içeren süpernatant ortam atıldı, yapışkan hücreler fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkandı ve ilaçsız ortam eklendi. Bu çalışmada, verteporfinin hücreler üzerindeki etkisi, ışığa maruz kalmadan veya 255, 255 ve 255 kırmızı-yeşil-mavi (RGB) değerleri (ortalama akıcılık 49.1 ± 0.6 J /cm2) kullanılarak ışığa 1 saat maruz kaldıktan sonra incelenmiştir. 24 saat sonra, hücre canlılığı 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazolyum bromür (MTT) testi ile değerlendirildi.
Deneysel sonuçlar, verteporfin ile muamele edilen hücrelerin cihazdan gelen ışığa maruz kalmasının, reaktif oksijen türlerinin (ROS) aracılık ettiği bir mekanizma aracılığıyla ilacın sitotoksik etkisini arttırdığını göstermiştir. Ek olarak, bu çalışmada açıklanan prototipin kullanımı, sonuçların ticari bir PDT cihazı ile karşılaştırılmasıyla doğrulanmıştır. Bu nedenle, bu LED tabanlı fotodinamik terapi prototipi, PDT'nin in vitro çalışmaları için iyi bir alternatiftir.
Introduction
En ölümcül bulaşıcı olmayan hastalıklar arasında kanser, erken ölümün küresel bir önde gelen nedenini temsil etmektedir. 2020'de yaklaşık 10 milyon ölümden sorumluydu ve dünya çapında altı ölümden birini temsilediyordu 1. Ek olarak, çoklu ilaç direnci (MDR) fenomeni, onaylanmış kemoterapötik protokoller bu klinik durum2 için remisyon aşamalarına ulaşamaaşamadığından muazzam bir halk sağlığı tehdidini temsil etmektedir. Kanser hücreleri çeşitli mekanizmalarla kemoterapiye direnç geliştirebilir; Bununla birlikte, bazı ATP bağlayıcı kaset (ABC) taşıyıcılarının (ATP'ye bağımlı efflux pompalar) aşırı ekspresyonu, bir tümör mikroortamında MDR gelişiminin ana nedeni olarak kabul edilir3. ÇİD'ye ek olarak, nüks ve metastaz gibi diğer kanser komplikasyonları, bu onkolojik zorluğun üstesinden gelmek için terapötik yaklaşımların geliştirilmesi ve iyileştirilmesi için acil talebi güçlendirmektedir.
Işığın küratif kullanımı yüzyıllardır uygulanmaktadır4 ve fotodinamik terapi (PDT) solid tümörler için klinik olarak onaylanmış bir terapötik yaklaşımı temsil etmektedir. PDT, tümör hücrelerinde seçici sitotoksisite uygulamak için reaktif oksijen türleri (ROS) üretmek için bir fotosensitizörün (PS) uygulanmasını ve ardından hafif ışınlamayı birleştirir. Bu terapötik yaklaşım, cerrahi, radyasyon ve kemoterapi dahil olmak üzere geleneksel yöntemlerden üstündür5; bağ dokularında daha düşük sitotoksisite gösteren minimal invaziv bir tekniktir6. Doğrudan tümörde veya mikro ortamında ışık uygulaması ve PS birikimi, hassas hedefleme ve sonuç olarak küçük, istenmeyen sistemik yan etkiler7 ve aynı bölgede tekrarlanan tedavi olasılığını sağlar. Dahası, maliyet diğer yaklaşımlardan daha düşüktür. Umut verici özellikleri nedeniyle PDT, özellikle inoperabl tümörlerde veya adjuvan kanser tedavisi7 durumunda hem tek başına hem de tek başına uygun bir seçenek olarak düşünülebilir ve kemoterapi 8,9 ile ilişkili MDR için bir alternatifi temsil eder.
PDT kullanılarak yüksek objektif yanıt oranı gösteren ilk rapor 1975 yılında fare ve sıçan model10'da tanımlanmıştır. O zamandan beri, PDT kullanılarak, 2D hücre kültürü11,12'de insan tümör hücre hatları ile hem in vivo hem de in vitro pozitif sonuçlar7 ile çalışmalar yapılmıştır. Klinik olarak onaylanmış PS'nin geniş uygulanabilirliği göz önüne alındığında, spesifik birikim yolakları ve absorpsiyon piklerinin dalga boyu aralıklarına bakılmaksızın, genel süreç aşağıdaki gibidir: (i) PS alımı, (ii) tümörde veya mikro ortamında PS konsantrasyonunun zirveye ulaşması, (iii) ışık uygulaması, (iv) PS-ışık etkileşimi, (v) PS uyarılmış durum enerjisinin doku substratına veya çevresindeki oksijen moleküllerine aktarılması, (vi) singlet oksijen veya süperoksit anyonu içeren ROS üretimi, (vii) esasen nekroz veya apoptoz (doğrudan ölüm), otofaji (sitoprotektif mekanizma), doku iskemisi (vasküler hasar), immün modülasyon veya bu mekanizmaların örtüşmesi yoluyla tümör hücresi ölümü7. Bu son aşamada, spesifik bir hücre ölüm yolunun aktivasyonu, hücre özellikleri, deneysel tasarım ve en önemlisi PS hücre içi lokalizasyonu ve PDT ile ilişkili hedeflenen hasar gibi birçok faktöre bağlıdır13.
Verteporfin, yaşa bağlı makula dejenerasyonunu tedavi etmek için Norveç ve Çin'de klinik kullanım için düzenleyici kurumlar tarafından onaylanan ikinci nesil bir PS'dir7. Doz verildikten sonra, bu ön ilacın kısmen mitokondri14'te biriktiği ve hücresel protein tirozin fosforilasyonunu ve DNA fragmantasyonunu indükleyerek tümör hücresi apoptozu 15,16'ya yol açtığı bildirilmiştir. Verteporfin içselleştirmesi için 24 saatlik inkübasyondan sonra, bitişik moleküllere etkili elektromanyetik radyasyon transferi seviyeleri elde etmek için 690 nm dalga boyu kurulumu kullanan bir PDT protokolü önerilir 7,17.
PDT için ışık kaynağı ile ilgili olarak, klasik diyot lazer sistemleri genellikle pahalı, teknik olarak karmaşık, büyük boyutlu ve dolayısıyla taşınabilir olmayan 18,19'dur. LED tabanlı PDT ekipmanlarında da gözlemlenebilen tek dalga boyu profilinin bir sonucu olarak, her fotosensitizör uygulaması için bağımsız ünitelere olan talep, diyot lazer sistemlerinin kullanımını daha da karmaşık ve ekonomik olarak imkansız hale getirmektedir20,21. Bu nedenle, LED makinelerin kullanımı sadece maliyet22 ve bakım sorunlarını çözmek için değil, aynı zamanda yüksek güç çıkışı ve daha az zararlı 23 ve daha geniş aydınlatma kapasitesi 24,25,26,27 sağlamak için en umut verici alternatif olarak kabul edilir.
LED tabanlı ekipmanın PDT deneylerine sunabileceği potansiyel katkıya rağmen28, çoğu ticari seçenek hala taşınabilirlik eksikliği, yüksek maliyet ve karmaşık inşaat projeleri ve işletme29 gibi dezavantajlara sahiptir. Bu çalışmanın temel amacı, in vitro PDT testleri için basit ve güvenilir bir araç sunmaktı. Bu makalede, ucuz, kullanıcı dostu ve taşınabilir olan, şirket içi LED tabanlı bir PDT cihazı olan PhotoACT açıklanmaktadır. Kavramın bir kanıtı olarak, bu cihazın bir 2D hücre kültürü modelinde verteporfinin sitotoksisitesini arttırdığı gösterilmiştir ve bu nedenle PDT deneylerinde bir araştırma aracı olarak kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve yazılımlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.
1. Cihaz yapımı
- Testere 3 mm kalınlığında orta yoğunluklu suntalar (MDF) Şekil 1A'da gösterilen boyutlara sahip parçalar elde etmek için.
NOT: Bilgisayar sayısal denetimi (CNC) kesimi için vektör dosyasını (Ek Dosya 1) kullanın. - Aşağıdaki boyutlarda iki kutu oluşturun (uzunluk x genişlik x yükseklik): Büyük kutular için 330 mm x 235 mm x 225 mm ve küçük kutular için 300 mm x 220 mm x 150 m (Şekil 1B).
- Bir namlu jakı konektörü takmak için daha büyük kutunun arkasını delin. Elektrik kabloları için bir geçit sağlamak üzere daha büyük kutunun üstünü ve alt kısmını delin ve küçük kutunun üstünü ve altını delin (Şekil 1C).
- Homojen ışık insidansını teşvik etmek için tüm iç yüzeyleri siyah mürekkeple boyayın (Şekil 1D).
- Paralel olarak, daha küçük kutunun üst iç yüzeyine her biri 10 LED'li üç LED bant takın (Şekil 1E).
- Küçük kutunun alt iç yüzeyinin ortasına bir parlaklık sensörü takın (Şekil 1F).
- Kontrol ünitesinin yapısını (Şekil 1G) 3B baskı dosyasını (Ek Dosya 2) kullanarak yazdırın.
- Tüm bileşenleri (güç düğmesi, potansiyometreler, zaman/çalıştırma dokunmatik yüzeyi, LED'ler, parlaklık sensörü, LCD, zil sesi ve güç kaynağı) kontrol ünitesinin iç kısmına monte edilmiş bir ESP32 kontrol kartının bağlantı noktalarına takın (Şekil 2).
- Programlama kodunu (Ek Dosya 3, Ek Dosya 4 ve Ek Dosya 5) yükleyin ve tüm bağlantıların çalışıp çalışmadığını kontrol etmek için bir test çalıştırın (Şekil 1H).
- Kutuları monte edin ve boşlukları önlemek için bunları birbirine sabitleyin ve sonuç olarak dış ışık paraziti ve yayılan ışık kaybı. Monte edilmiş kontrol ünitesini prototipin üst kısmındaki delinmiş alana takın (Şekil 1I).
- Aynı malzemeden bir ön kapıyı ve 330 mm x 225 mm (uzunluk x genişlik) boyutlarını iki küçük menteşeli büyük kutuya sabitleyin. Ayrıca, prototip kapağını güçlendirmek için cırt cırtlı bantları daha büyük kutuya yana doğru takın (Şekil 1J). Ekipmanın ön kapısını manipüle etmek için bir tutamak takın.
- İşlemler sırasında daha fazla stabilite sağlamak için prototipin altına dört lastik ayak yastığı takın (Şekil 1K).
2. Hücre hatları: ekim, tohumlama ve tedavi
- Kimyasal
- 100 mM'lik bir konsantrasyon elde etmek için porfirini dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözün.
DİKKAT: DMSO dikkatli bir şekilde manipüle edilmelidir (kişisel koruyucu ekipman kullanımı ile ve havalandırılan bir alanda ele alınmalıdır). Aşırı ışığa maruz kalmayı önlemek için hem stok hem de seyreltilmiş çözeltileri dikkatlice manipüle edin.
- 100 mM'lik bir konsantrasyon elde etmek için porfirini dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözün.
- Hücre çizgileri
- HeLa hücre hattını, %10 fetal sığır serumu ve %1 gentamisin ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) düşük glikozlu ortamında geliştirin.
- Kültür şişelerini 37 ° C'de% 5 CO2 hücre kültürü inkübatöründe tutun.
- Hücreleri% 80 -% 90 birleşime ulaşana kadar yönetin ve inceleyin.
- Tohumlama işlemi
- Kültür ortamını şişeden çıkarın.
- Hücre tek katmanını PBS ile yıkayın.
- Akıcı hücre kültürünü tripsin-EDTA (% 0.5) ile 37 ° C'de 5 dakika boyunca 1x ayırın. Tripsin etkisini, hücreleri% 10 fetal sığır serumu ve% 1 gentamisin ile desteklenmiş kültür ortamı ile yeniden askıya alarak durdurun.
- Yeniden askıya alınan hücreleri bir hemositometre ile sayın ve bunları 2.0 × 104 hücre / kuyuda 96 delikli bir plakaya tohumlayın.
- Karanlık ve aydınlık koşullar için iki tabak hazırlayın.
- Hücre bağlantısı için plakaları 24 saat boyunca inkübe edin.
- Tedavi süreci
- Ortamı her iki 96 delikli plakadan çıkarın.
- Hücreleri 100 μL artan verteporfin konsantrasyonları (0.045 ila 24 μM, seri seyreltme) ile tedavi edin.
- Verteporfin içselleşmesine izin vermek için hücreleri 24 saat boyunca ilaç tedavisi ile inkübe edin.
- 24 saat sonra, ilacı içeren ortamı atın, hücrelerin tek katmanını PBS (100 μL) ile yıkayın ve ilaçsız ortam (100 μL) ekleyin.
- Işığa maruz kalmaktan korumak için bir mikro plakayı alüminyum folyo ile örtün ve 24 saat boyunca inkübe edin. Bu plaka PDT sonuçları için kontrol verileri sağlayacaktır (karanlık durum). Diğer mikro plaka, cihazdaki ışığa maruz kalma durumunda kullanılacaktır.
3. Cihazın çalışması
- PDT aygıtını elektrik prizine takın ve güç düğmesine basarak açın.
- Diğer mikro plakayı (ışık durumu) PDT cihazına yerleştirin ve ön kapıyı cırt cırtlı bantlarla sabitleyerek ekipmanı kapatın.
- RGB yapılandırmasını ayarlamak için potansiyometreleri kullanın (burada bir RGB 255 , 255, 255 denemesi) ve ışık emisyonunun rengini ayarlayın.
NOT: Her RGB kombinasyonunun, farklı fotosensitizörlerle yapılan deneyler ve sonuç olarak farklı absorbans eğrileri için ayarlanması gereken belirli bir emisyon spektrumu vardır. - Zaman yapılandırmasını ayarlamak için (+)/(-) dokunmatik yüzeye basın (burada 60 dakikalık bir deneme) ve tahlilin süresini ayarlayın.
NOT: Işınım değeri ile ilişkili olarak zaman konfigürasyonu, işlemin akıcılığını (tahlilde uygulanan ışık dozu) belirleyecektir. - Ekrandaki kurulum bilgilerini kontrol edin.
- Testi başlatmak için Başlat düğmesine basın. Tahlilin başında tek bip sesi duyulduğundan emin olun.
- Deney sırasında, ekranda ışıma ve kalan süre gibi gerçek zamanlı bilgileri gözlemleyin.
- PDT testi sırasında ön kapıyı açmayın veya herhangi bir konfigürasyonu değiştirmeyin.
- Tahlilin sonunda, dört bip sesi ve elektronik sistemin tüm LED'leri kapatmasını bekleyin. Ekranda deney sırasında Bitti mesajını ve harcanan son enerji miktarını-akıcılığını- gözlemleyin.
NOT: Akıcılık nihai değeri denklem (1) kullanılarak hesaplanır:
(1)
Burada F, J/cm2'ye, I ise mW/cm2 veya mJ/s·cm2'ye eşittir. Işınım değeri, LED'lerin gücünü (yayan kaynak) ve karanlık odanın düzgün ışınlanmış alanını (660cm2) dikkate alır (denklem [2]):
(2)
Teorik ışıma değeri, tüm PDT testi boyunca cihaz ekranında gösterilir. İşlemin sonunda, akıcılığı hesaplamak için denklem (3) kullanın:
Akıcılık (F) = ışıma (I, sabit değer) × çalışma süresi(ler)i (3)
(1)
(2)4. Hücre canlılığı testi
- PDT testinden sonra, ışığa maruz kalan mikro plakayı örtün ve 24 saat boyunca inkübe edin.
- Kuluçka döneminden sonra, kültür ortamını her iki plakadan çıkarın, hücrelerin tek katmanını PBS (100 μL) ile yıkayın ve MTT çözeltisi (0.5 mg / ml, 100 μL) ekleyin. Formazan kristal oluşumuna izin vermek için hem plakaları -karanlık hem de aydınlık koşullarda- 4 saat boyunca inkübe edin.
- MTT çözeltisini dikkatlice çıkarın ve mor kristalleri bir DMSO / etanol (1: 1) çözeltisi ile çözün.
- Kristallerin tamamen çözünmesinden sonra, 595 nm'de bir mikroplaka okuyucu kullanarak absorbans ölçümünü gerçekleştirin.
NOT: Cihaz, akış sitometrisi30 ile ışığa maruz kaldıktan sonra fotosensitizörler tarafından tetiklenen ROS aracılı hücre ölümü gibi diğer önemli deneylerde kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PhotoACT olarak adlandırılan son PDT cihazı, dört adede kadar çok kuyulu mikro plakayı tahsis etmek için karanlık bir oda içeriyordu ve üst iç yüzeyi, farklı görünür ışık spektrumları yaymak üzere programlanmış 30 dağınık LED seti ile donatılmıştı (Şekil 3 ve Ek Dosya 6). Cihaz iki ilişkili kutu kullanılarak inşa edilmiştir: PDT tahlilleri için karanlık bir oda olarak tasarlanmış bir iç kutu ve iç odayı örtmek ve kontrol ünitesini tutmak için harici bir kutu (Şekil 1B). Dahili kutu siyaha boyandı (Şekil 1D) ve 30 LED'li LED RGB WS2812 (veya WS281B) bant modelinden ve 1 m uzunluğunda (daha sonra üç parçaya bölündü) ve dahili bir işlemciye sahip 9 watt'tan oluşuyordu. Bu cihaz daha kontrollü bir kullanıma ve sonuç olarak daha doğru renk emisyonuna izin verdi. 30 LED, PDT odasının tüm üst iç yüzeyine, her biri 10 LED'li üç paralel bant ile eşit olarak dağıtılmıştır (Şekil 1E). Siyah iç yüzeylerin düşük yansıtıcılığı ve LED konfigürasyonunun düzgün dağılımı nedeniyle homojen bir ışık insidansı tespit edilmiştir. Işık insidansını göstermek ve bir kalite kontrol aracı olarak hizmet etmek, karanlık oda içindeki ışınlama homojenliğini garanti etmek (Ek Tablo S1) ve belirli sayıda çalışma ömrüne sahip olduğu bilinen LED sisteminin gücünü izlemek için dahili kutunun alt ortasına bir TSL2561 parlaklık sensörü de dahil edilmiştir (Şekil 1F ). Dış kutu, altı MDF parçasından oluşan, gri boyalı ve mükemmel bir uyum için lazer kesimli iç kutuyu kaplayan bir yapıdır (Şekil 1A, B). Kontrol ünitesi, çevrimiçi yazılım31, 3D yazıcı kullanılarak tek bir parça olarak polilaktik asitle basılmış 3D baskı ve griye boyanmış olarak tasarlanmıştır. Bir ekran, potansiyometreler, düğmeler ve bir zil de dahil olmak üzere tüm elektronik bileşenleri tutar (Şekil 1I ve Şekil 2).
Bağımsız ışık insidansı ayarlamalarını etkinleştirmek için, kontrol ünitesini entegre etmek üzere ESP32 kontrol kartı seçildi (Şekil 2). Bu yapılandırma, programlama, bluetooth, Wi-Fi, çift çekirdekli işlemci, çok sayıda bağlantı noktası ve bir tümleşik devre (I2C), bir seri çevre birimi arabirimi (SPI) ve diğer arabirimlerle iletişim kurma yeteneği için bir USB arabirimine izin vermelidir. Sistemi çalıştırmak için, entegre bir geliştirme ortamı (IDE) aracılığıyla C dilinde bir program yazılmıştır. Kod yapısı 32 , ESP32 denetleyici kartı tarafından desteklenen ücretsiz, gerçek zamanlı bir işletim sistemi olan FreeRTOS'a dayanmaktadır. Bahsedilen mantık, ESP32 tarafından kademeli veya paralel yaklaşımlarla işlenebilen bağımsız uygulama programlamasına izin vererek projeyi ve bakım, iyileştirme ve güncelleme süreçlerini çok daha çok yönlü ve güvenli hale getirir.
Makine ve operatör arasındaki arayüz kullanıcı dostudur ve sıvı kristal ekran (LCD), potansiyometreler, düğmeler ve bir zilden oluşur (Şekil 3 ve Ek Dosya 6). Küçük, 16 mm x 2 mm (sütunlara karşı çizgiler) LCD, sırasıyla kurulum kolaylığı ve iletim çok yönlülüğü sağlayan I2C iletişim protokolüne sahip dahili bir HD44780 denetleyiciye sahipti. Ön kurulum, operatör tarafından RGB ve zaman ayarlamalarını içerir. Işık büyüklüğü ve renk konfigürasyonu, üç temel renk bileşeninin-RGB'nin yoğunluğunu (0 ila 255) değiştiren potansiyometreler kullanılarak ayarlanabilir. Bu ayarlamalar, uluslararası RGB renkleri tablosu33'te ele alınan çeşitli renk kompozisyonlarına neden olabilir. Her RGB bileşimi, PDT deneyinde kullanılan PS'ye göre ayarlanması gereken belirli bir dalga boyuna sahiptir; Fotoaktivasyonun tatmin edici bir şekilde gerçekleşmesi için PS'nin absorbans eğrisi ve ışınlamanın dalga boyu üst üste binmelidir (Ek Şekil S1). İşlem boyunca kalan süre ile çalışma durumu ve ışık insidansı bilgilerine LCD üzerinden ulaşılabilir.
Programlanan sürenin sonunda, elektronik sistem tüm LED'leri kapattı, sesli bir uyarı yaydı ve ekranda alan başına toplam enerji miktarını (J / cm²) gösterdi; bu, ışımanın sabit değerinin saniyeler içinde çalışma süresiyle çarpılmasıyla hesaplandı. Bu dijital model, çok çeşitli algılama seviyeleri (0,1 ila 40.000+ lüks arasındaki sınırlar), bir I2C arayüzü ve düşük yoğunluklu bir elektrik akımı (sırasıyla çalışma ve bekleme durumunda 0,5 mA ve 15 μA) sundu.
Kavramın bir kanıtı olarak, cihaz 1 saat (49.1 ± 0.6 J / cm2) ışığa maruz kaldıktan sonra2D HeLa hücre kültüründe verteporfinin sitotoksik etkisini arttırmak için kullanıldı. Şekil 4A'da gösterildiği gibi, GI50 değeri ışık koşulu için 3.1 μM ve karanlık durum için 13.8 μM idi. Böylece, koşulları karşılaştıran 4.4 kat kayma, verteporfinin PS olarak kullanımını ve PhotoACT'nin PDT tahlillerine uygulanabilirliğini doğruladı. Bu çalışmada açıklanan prototipin kullanımını doğrulamak için, bir PS, hücreler ve akıcılık da dahil olmak üzere aynı deneysel koşullar altında ticari bir PDT cihazı kullanıldı ve sonuçlar karşılaştırıldı. Şekil 4B'de gösterildiği gibi, her iki cihaz da verteporfin'i eşit şekilde fotoaktif hale getirerek sitotoksik etkiyi arttırır. Bu sonuçlar, bunun ev yapımı PDT cihazında uygulanabilirliğini doğruladı (Şekil 4A, B). Son olarak, ışığa maruz kaldıktan sonra verteporfin tarafından tetiklenen ROS aracılı hücre ölümü, DCFDA testi kullanılarak akış sitometrisi ile doğrulandı (Şekil 4C, D).
Resim 1: PhotoACT yapım ve montaj talimatları. Bileşenlerin cihaza konstrüksiyonu, delinmesi, boyanması, montajı ve aksesuarının ayrıntılı gösterimi. Panel, cihazı oluşturmak için adım adım bir kılavuz gösterir. Kısaltma: LED = ışık yayan diyot. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: Kontrol ünitesi yapımı ve elektronik kurulum talimatları. Patlamış kontrol ünitesinin yakınlaştırılmış görünüm çizimi ve prototipte kullanılan bağlantılar ve bileşenlerle ESP32 kontrol kartı portlarındaki elektronik bağlantıların ayrıntılı şeması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: PhotoACT gösterimi. Malzeme listesi, etiketleme balonları ve üst iç LED'lerin ayrıntılı görünümü ile nihai ürün tasarımının montaj çizimi. Şekil, prototipin parçalarını ve bileşenlerini tanımlamaya izin verir. Kısaltmalar: MDF = orta yoğunluklu sunta; LED = ışık yayan diyot. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Verteporfin ve ROS jenerasyonunun in vitro fototoksisitesi. (A,B) MTT yöntemi kullanılarak yapılan hücre canlılığı testi: Tahliller, fotosensitizör verteporfinin sitotoksik profilini farklı konsantrasyonlarda değerlendirmek için yapıldı. HeLa hücreleri, farklı konsantrasyonlarda verteporfin (0.045-24 μM) ile 24 saat boyunca tedavi edildi, ışığa (PhotoACT (A) veya ticari PDT ekipmanı (B)) veya karanlık koşullara maruz bırakıldı ve daha sonra MTT testine tabi tutuldu. Her iki durum da daha yüksek verteporfin konsantrasyonlarında azalmış bir hücre canlılığı gösterdi, ancak PDT testlerinden elde edilen ışığa maruz kalma, PS'nin sitotoksik profilini arttırdı, bu da PDT'nin verteporfinin sitotoksisitesini arttırdığı anlamına geliyor. Canlılık eğrileri GraphPad Prism 6 yazılımı kullanılarak yerleştirildi. (C,D) HeLa hücreleri, düşük ve yüksek konsantrasyonlarda verteporfin (0.187 μM ve 6 μM) ile 24 saat boyunca tedavi edildi ve daha sonra ışığa (PhotoACT) veya karanlık koşullara maruz bırakıldı. Hücre içi ROS seviyeleri, DCFDA probu kullanılarak akış sitometrisi ile ışınlamadan sonra ölçüldü (1 μM'de 30 dakika boyunca inkübasyon). Histogramlar arasında sağa kayma, daha yüksek hücre içi DCF birikimi ve dolayısıyla daha yüksek ROS seviyeleri nedeniyle daha yüksek floresan yoğunluğu anlamına geliyordu. Sonuçlar, karanlık durumda (C) ROS seviyelerinde anlamlı bir fark göstermedi, ancak verteporfin fotoaktivasyonundan (D) sonra ROS seviyelerinde doz-yanıt artışı gösterdi. Kısaltmalar: ROS = reaktif oksijen türleri; DCF = 2',7'-diklorofloresein; DCFDA = 2',7'-diklorohidrofloresein diasetat. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Cihazın karar akış şeması: ön kurulum ve işlem sorunlarını giderme. Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil S1: Verteporfinin absorbans eğrisi ile cihazın LED emisyon spektrumu arasındaki örtüşme. Fotosensitizörü (x,y'') fotoaktive etmek için kullanılan spesifik absorbans zirveleri (x,y') ve RGB 255, 255, 255-beyaz rengin (3,700K-5,000K CCT) LED emisyon spektrumu ile verteporfinin absorpsiyon spektrumu. Verteporfinin farklı absorbans zirveleri ile beyaz ışınlayan ışık arasındaki örtüşme, biyolojik sonuçlarla da doğrulanan fotosensitizörün fotoaktivasyonunu doğrular. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Tablo S1: Işınlama tekdüzeliği testleri. Işınlanan alanın farklı noktalarında parlaklık sensörü tarafından ölçülen anlık parlaklık (lümen). Sunulan sonuçlar, cihazın düzgün ışınlanmasını doğrulayan hiçbir ifade varyasyonu göstermemektedir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Dosya 1: Kesme için vektör dosyası. MDF levha kesimi için çizim (DWG) dosyası. Dosya, bilgisayar sayısal denetimi (CNC) kesimi için kullanılmalıdır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Dosya 2: Ünite kontrolünün 3D baskı dosyası. Stereolitografi (STL) dosyasını cihazın kontrol ünitesine 3D yazdırın. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Dosya 3: C programlama kodu. Ekipmanın kontrol ünitesini yapılandırmak için C dilinde geliştirilmiş programlama kodu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Dosya 4: INO programlama kodu. Ekipmanın kontrol ünitesini yapılandırmak için INO dilinde geliştirilen programlama kodu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Dosya 5: Derleme talimatları. Markdown (MD) "READ ME" dosyası, programlama kodu derlemesi için ek talimatlar içerir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Dosya 6: Cihazın tasarım modeli. Prototipin genel görselleştirmesi için Ürün Verileri Değişimi Standardı (STEP) üç boyutlu model dosyasının önizlemesi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Son PhotoACT cihazı, ticari olarak temin edilebilen, düşük maliyetli bileşenlerle toplam maliyeti 50 dolardan az olan bileşenlerle inşa etmek için uygundu. Ek avantajlar arasında düşük bakım talepleri, birden fazla kültür plakası türünü ışınlama kapasitesi, tahlil başına dört üniteye kadar aynı anda kullanım, taşınabilirliğe izin veren düşük ağırlık (2 kg) / boyut (44cm3), doğru ve tekrarlanabilir ışınlama (veriler gösterilmemiştir) ve bilgisayarlara veya diğer makinelere bağlantı gerektirmeyen kullanıcı dostu ve basit bir kurulum arayüzü bulunmaktadır.
Hem inşaat hem de işletme protokollerinin bazı kritik adımları, proje anlayışı sırasında iyileştirme fırsatlarına yol açmıştır. Bir PDT odası homojen ışık emisyonu ve tutarlı enerji ölçümü gerektirdiğinden, hem dış ışık parazitini hem de yayılan ışık kaybını önlemek için iç ve dış kutular kapatılmıştır. Ek cırt cırtlı bantlar, haznenin kapanmasını güçlendirmek ve kesintisiz deneyler sağlamak için ön kapıya yana doğru sabitlendi. Gerekli RGB konfigürasyonunu onaylamak için kontrol ünitesine, analiz sırasında yayılan ışığın rengini ve yoğunluğunu gösteren temsili bir LED takıldı. Son olarak, programlama kodu, anlık yoğunluk ölçümlerini ve son miktarda enerji değerlendirmelerini hassaslaştırmak, tekrarlanabilirliği ve matematiksel tutarlılığı onaylamak için birkaç yükseltmeye tabi tutuldu. Ekstra dikkat gerektiren diğer bazı önemli ayrıntılar şunlardır: (i) LED'lerin homojen dağılımı ve temsili ve dengeli sonuçlar elde etmek için parlaklık sensörünün merkezi olarak konumlandırılması, (ii) tüm bileşenlerin elektronik şemaya (Şekil 2) ve programlama koduna (Ek Dosya 3, Ek Dosya 4 ve Ek Dosya 5) göre kurulması ) doğru çalışmayı sağlamak için ve (iii) güvenilir sonuçlarla tutarlı çoğaltmalar sağlamak için bir denemeyi çalıştırmadan önce kurulum (aynı RGB ve zaman yapılandırmasını koruyarak). RGB sistemi, belirli dalga boylarına sahip birden fazla görünür renk bileşimi sağlasa da, görünür olmayan ışık deneyleri belirli protokol yükseltmeleri gerektirecektir. Operasyon sırasında problemleri veya hataları bulmak ve düzeltmek için sistematik bir problem çözme yaklaşımı sağlamak üzere Şekil 5'te bir karar akış şeması sunulmuştur.
2D HeLa hücrelerinde sitotoksisiteyi indüklemek için verteporfinin terapötik aktivasyonu ile elde edilen doğrulanmış sonuçlarla in vitro deneylerin taleplerini karşılamak üzere tasarlanan PhotoACT, üniversiteler, okullar, endüstriler ve diğer araştırma merkezleri için önerilebilir. Bu cihaz, PDT'nin faydalarını, fotosensitizörlerin etki mekanizmasını ve klinik uygulamalarını araştıran bilimsel araştırmalara genişletmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Arthur Henrique Gomes de Oliveira ve Lucas Julian Cruz Gomes'e çekim sürecine yardımcı oldukları için teşekkür ederiz. Bu proje Brezilya Araştırma Konseyi (CNPq, hibe numaraları 400953/2016-1-404286/2021-6) ve Fundação Araucária-PPSUS 2020/2021 (SUS2020131000003) tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma kısmen Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001 tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | Mammalian cell culture dissociation reagent |
| 3D printer | Flashforge | Finder model | |
| 96-well plates | Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture | ||
| Arduino | |||
| Brightness sensor | TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface | ||
| Buttons | |||
| Buzzer | |||
| Cell culture Flasks | Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes) | ||
| Centrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay | ||
| CO2 Incubator | |||
| Controller board | ESP32 | ||
| Design Software | Trimble | SketchUp | |
| DMEM High Glucose | Gibco | 11965092 | DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540-500ML | Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% (GC), suitable for plant cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12657029 | FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages. |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Gibco | 15750060 | Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination |
| Hemocytometer | Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay | ||
| Inverted Laboratory Microscope | Leica | DM IL LED | |
| Laminar Flow Hood | Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures | ||
| LCD display | |||
| LED RGB WS2812 | 5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts | ||
| MDF fiberboards | 3mm thickness medium-density fiberboards | ||
| Microcentrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay | ||
| Microplate reader | ThermoFischer | Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation. | |
| MTT Reagent | Invitrogen | M6494 | 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays |
| Operational System | Real Time Engineers ltd. | FreeRTOS | |
| P10 micripipette | Non-electronic, single-channel, 1-10 μL capacity | ||
| P1000 micropipette | Non-electronic, single-channel, 10-1000 μL capacity | ||
| P200 micropipette | Non-electronic, single-channel, 20-200 μL capacity | ||
| PDT Equipment | LumaCare | Model LC-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 | Gibco | 10010031 | Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures |
| Potentiometers | |||
| Tips | Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 μL maximum volumes | ||
| Verteporfin | Sigma-Aldrich | SML0534-5MG | Verteporfin, ≥94% (HPLC) |
References
- Ferlay, J., et al. International agency for research on cancer. Global Cancer Observatory: Cancer Today. 23 (7), https://gco.iarc.fr/today/home 323-326 (2018).
- Gottesman, M. M., Fojo, T., Bates, S. E. Multidrug resistance in cancer: role of Atp-dependent transporters. Nature Reviews Cancer. 2 (1), 48-58 (2002).
- Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Boothe-Genthe, C., Gottesman, G. A. Targeting multidrug resistance in cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 219-234 (2006).
- Ackroyd, R., Kelty, C., Brown, N., Reed, M. The history of photodetection and photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 74 (5), 656-669 (2001).
- Hamblin, M. R. Photodynamic therapy for cancer: what's past is prologue. Photochemistry and Photobiology. 96 (3), 506-516 (2020).
- Barr, H., et al. The contrasting mechanisms of colonic collagen damage between photodynamic therapy and thermal injury. Photochem Photobiol. 46 (5), 795-800 (1987).
- Algorri, J. F., Ochoa, M., Roldán-Varona, P., Rodríguez-Cobo, L., López-Higuera, J. M. Photodynamic therapy: A compendium of latest reviews. Cancers. 13 (17), 4447 (2021).
- Aniogo, E. C., Plackal, B., George, B. P. A., Abrahamse, H. The role of photodynamic therapy on multidrug resistant breast cancer. Cancer Cell International. 19, 91 (2019).
- Spring, B. Q., Rizvi, I., Xu, N., Hasan, T. The role of photodynamic therapy in overcoming cancer drug resistance. Photochemical & Photobiological Sciences. 14 (8), 1476-1491 (2015).
- Dougherty, T. J., Grindey, G. B., Fiel, R., Weishaupt, K. R., Boyle, D. G. Photoradiation therapy. II. Cure of animal tumors with hematoporphyrin and light. Journal of the National Cancer Institute. 55 (1), 115-121 (1975).
- Etcheverry, M. E., Pasquale, M. A., Garavaglia, M. Photodynamic therapy of HeLa cell cultures by using LED or laser sources. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 160, 271-277 (2016).
- Guo, Q., Dong, B., Nan, F., Guan, D., Zhang, Y. 5-Aminolevulinic acid photodynamic therapy in human cervical cancer via the activation of microRNA-143 and suppression of the Bcl-2/Bax signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 14 (1), 544-550 (2016).
- Mroz, P., Yaroslavsky, A., Kharkwal, G. B., Hamblin, M. R. Cell death pathways in photodynamic therapy of cancer. Cancers. 3 (2), 2516-2539 (2011).
- Mahalingam, S. M., Ordaz, J. D., Low, P. S. Targeting of a photosensitizer to the mitochondrion enhances the potency of photodynamic therapy. ACS Omega. 3 (6), 6066-6074 (2018).
- Granville, D. J., Levy, J. G., Hunt, D. W. C. Photodynamic treatment with benzoporphyrin derivative monoacid ring A produces protein tyrosine phosphorylation events and DNA fragmentation in murine P815 cells. Photochemistry and Photobiology. 67 (3), 358-362 (1998).
- Castano, A. P., Demidova, T. N., Hamblin, M. R. Mechanisms in photodynamic therapy: part two - cellular signaling, cell metabolism and modes of cell death. Photodiagnosis Photodynamic Therapy. 2 (1), 1-23 (2014).
- Detty, M. R., Gibson, S. L., Wagner, S. J. Current clinical and preclinical photosensitizers for use in photodynamic therapy. Journal of Medicinal Chemistry. 47 (16), 3897-3915 (2004).
- Allison, R. R. Photodynamic therapy: oncologic horizons. Future Oncology. 10 (1), 123-142 (2014).
- Chepurna, O., et al. Photodynamic therapy with laser scanning mode of tumor irradiation. Optical Fibers and Their Applications 2015. 9816, 323-326 (2015).
- Huang, Z. A review of progress in clinical photodynamic therapy. Technology in Cancer Research and Treatment. 4 (3), 283-293 (2005).
- Chepurna, O., et al. LED-based portable light source for photodynamic therapy. Optics in Health Care and Biomedical Optics. 11190, 109-115 (2019).
- Hasson, O., Wishkerman, A. CultureLED: A 3D printer-based LED illumination cultivation system for multi-well culture plates. HardwareX. 12, 00323 (2022).
- Wu, X., et al. Localised light delivery on melanoma cells using optical microneedles. Biomedical Optics Express. 13 (2), 1045-1060 (2022).
- Erkiert-Polguj, A., Halbina, A., Polak-Pacholczyk, I., Rotsztejn, H. Light-emitting diodes in photodynamic therapy in non-melanoma skin cancers-own observations and literature review. Journal of Cosmetic and Laser Therapy. 18 (2), 105-110 (2016).
- Neupane, J., Ghimire, S., Shakya, S., Chaudhary, L., Shrivastava, V. P. Effect of light emitting diodes in the photodynamic therapy of rheumatoid arthritis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 7 (1), 44-49 (2010).
- Lins, E. C., et al. A novel 785-nm laser diode-based system for standardization of cell culture irradiation. Photomedicine and Laser Surgery. 31 (10), 466-473 (2013).
- Hopkins, S. L., et al. An In vitro cell irradiation protocol for testing photopharmaceuticals and the effect of blue, green, and red light on human cancer cell lines. Photochemical and Photobiological Sciences. 15 (5), 644-653 (2016).
- Zhang, K., Waguespack, M., Kercher, E. M., Spring, B. Q. An automated and stable LED array illumination system for multiwell plate cell culture photodynamic therapy experiments. Research Square. , 1-18 (2022).
- Gálvez, E. N., et al. Analysis and evaluation of the operational characteristics of a new photodynamic therapy device. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 37, 102719 (2022).
- Bretin, L., et al. Photodynamic therapy activity of new human colorectal cancer. Cancers. 11 (10), 1474 (2019).
- T. SketchUp. , Available from: https://www.sketchup.com/ (2022).
- LCDR PhotoDynamic Therapy (PDT) Equipment Repository. GitHub, Inc. , Available from: https://github.com/PhotoDynamicTherapy (2022).
- W3C CSS Color Module Level 3. W3C, Inc. , Available from: https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB (2022).
