Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

במבחנה מבחני ביקוע באמצעות מפלי דרוזופילה רקומביננטיים מטוהרים לבדיקת מצעים

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/64392

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול לביטוי וטיהור של Drosophila caspases Dronc ו- Drice, והשימוש בהם במבחני מחשוף במבחנה .

Abstract

קספזות הן פרוטאזות מוות תאי ספציפיות מאוד המעורבות בתהליכים אפופטוטיים ולא אפופטוטיים. בעוד שתפקידם של הקספאזות במהלך אפופטוזיס הוגדר היטב ומצעים פרוטאוליטיים אפופטוטיים רבים של קספאזות זוהו ואופיינו, תפקידן של הקספאזות לתהליכים שאינם אפופטוטיים אינו מובן היטב. בפרט, מעט מצעים לא אפופטוטיים של קספאזות זוהו עד כה. כאן, על מנת להקל על זיהוי ואפיון של מצעי קספאזה פוטנציאליים, מתואר פרוטוקול המאפשר בדיקה של מצעים מועמדים במבחני ביקוע קספאזה במבחנה . פרוטוקול זה כולל ייצור וטיהור של חלבוני קספאז רקומביננטיים, ייצור המצעים המועמדים באופן רקומביננטי או במערכת ביטוי נטולת תאים, ותגובת המחשוף במבחנה בפועל ואחריה SDS-PAGE ואימונובלוטציה. פרוטוקול זה מותאם לדרוזופילה קספאזות דרונק ודריס, אך ניתן להתאים אותו בקלות לקספאזות מאורגניזמים אחרים, כולל יונקים.

Introduction

מוות תאי מתוכנת או אפופטוזיס מבוצע על ידי קבוצה של פרוטאזות מוות תאי מיוחדות ביותר המכונות קספאזות (נבדק בהתייחסות1). Caspases הם פרוטאזות Cys המכילות שאריות Cys באתר הקטליטי. הם הגדירו אתרי ביקוע קונצנזוס ומצעי שסעים באופן פרוטאוליטי לאחר שאריות Asp (אם כי דווח גם כי Dronc Drosophila caspase נבקע לאחר שאריות גלו2). הם מחולקים ליוזם (הידוע גם בשם apical או במעלה הזרם) ו אפקטים (תליין או במורד הזרם) caspases. caspases יוזם להפעיל caspases משפיע. לדוגמה, ביונקים, היוזם caspase Caspase-9 מבקע ומפעיל את המשפיע caspase Caspase-33. באופן דומה, בדרוזופילה מלנוגסטר, ה-caspase-9-ortholog Dronc מבקע ומפעיל את ה-caspase-3-orortholog Drice 2,4. במהלך אפופטוזיס, קספאזות משפיעות מבקעות מאות מצעים המובילים למותו של התא5.

קספאזות מסונתזות כפרו-אנזימים לא פעילים (זימוגנים) בתא. בצורה זו, הם מכילים פרודומיין N-terminal, תת-יחידה גדולה עם Cys הקטליטי בחלק המרכזי של הפרואנזים, ותת-יחידה קטנה ב-C-terminus 1 (איור 1). מנגנון ההפעלה שונה בין היזם לבין האפקטים caspases. קספאזות יוזמות (Caspase-9, Dronc) דורשות דימריזציה להפעלה, המתרחשת על ידי שילוב בקומפלקס חלבונים גדול, המכונה אפופטוזום6. עבור ההשתלבות באפופטוזום, Caspase-9 ו-Dronc נושאים תחום הפעלה וגיוס של קספאז (CARD) בפרודומיין N-terminal (איור 1). הרכיב האפופטוזום Apaf-1 מכיל גם כרטיס ומגייס את Caspase-9 או Dronc באמצעות אינטראקציה של CARD/CARD לתוך האפופטוזום 3,6,7. בעוד ש-Caspase-9 ו-Dronc ניתנים לעיבוד פרוטאוליטי באפופטוזום, עיבוד זה אינו נדרש באופן מלא לפעילות אנזימטית 8,9.

לעומת זאת, קספאזות אפקטיביות (Caspase-3, Drice) אינן נושאות כרטיס בפרודומיין שלהן ואינן משולבות בקומפלקסים חלבוניים גדולים להפעלה1. הם תלויים בביקוע פרוטאוליטי על ידי Caspase-9 פעיל או Dronc1, בהתאמה. האפקט הפעיל caspase יוצר טטרמר המורכב משתי יחידות משנה גדולות ושתי תת-יחידות קטנות, ולכן מכיל שני אתרים קטליטיים (איור 1). חשוב לציין כי עבור פרוטוקול זה, ביטוי רקומביננטי של caspases ב- E. coli גורם לעיבוד אוטומטי והפעלה של caspases, כולל Drice 10 ו- Dronc 2,8,9,11,12, גם בהיעדר Apaf-1. עיבוד אוטומטי זה מאפשר לבצע בדיקות מחשוף במבחנה של מצעים מועמדים עם חלבון קספאז רקומביננטי.

קספאזות לא רק מעורבות באפופטוזיס, אלא גם יכולות להיות להן פונקציות לא-אפופטוטיות רבות, כולל התפשטות, התמיינות תאים, נדידת תאים, גיזום עצבי, חסינות מולדת ואחרים13,14,15. כיום לא ידוע כיצד תאים יכולים לשרוד למרות שהם מכילים קספאזות פעילות במהלך תהליכים שאינם אפופטוטיים. ייתכן שתאים אלה מפעילים קספאזות רק ברמות תת-קטלניות16 או שהם מפרקים קספאזות פעילות בתאים שאינם אפופטוטיים של התא כגון קרום הפלזמה17,18. לכן, זיהוי ואימות של מצעים שאינם אפופטוטיים לא רק יגלו כיצד קספאזות מתווכות תהליכים לא-אפופטוטיים, אלא גם עשויות לסייע בהבנת האופן שבו תאים יכולים לשרוד בנוכחות קספאזות פעילות.

ניתן לזהות חלבונים מועמדים כמצעי קספאז בשיטות גנטיות וביוכימיות. חלבונים מזוהים ניתן לבדוק את נוכחותם של אתרי ביקוע Dronc קונצנזוס. ניתן לעשות זאת על ידי בדיקה חזותית של רצף החלבונים או שימוש בכלים ביואינפורמטיים מקוונים מתוחכמים יותר כגון CasCleave (https://sunflower.kuicr.kyoto-u.ac.jp/~sjn/Cascleave/)19,20. כלים אלה משתמשים באתרי ביקוע הקונצנזוס הידועים של קספאזות ושיקולים מבניים כדי לחזות מטרות חדשות של קספאזות. בעוד CasCleave משלב את המידע של מצעים מאומתים מ Caspases-1, -3, -6, -7, ו -8, זה עשוי בכל זאת להיות שימושי גם למטרות המתוארות כאן כמו caspases אלה ואת אתרי ביקוע קונצנזוס שלהם נשמרים היטב. עם זאת, מכיוון שאתר המחשוף של Dronc אינו מוגדר היטב (שני מחקרים זיהו שני אתרי ביקוע אופטימליים שונים, TATD/E2 ו-LALD9), המצעים המועמדים נבדקים גם לנוכחות של אתר ביקוע קספאזי אחר, כולל Drice.

כדי לאמת את המצעים החזויים של קספאזות, יש צורך במבחנים נוספים. אחד המבחנים האלה הוא ההדגמה לכך שקספאז נתון יכול למעשה לבקע את החלבון המועמד במבחנה. כאן, אנו מספקים פרוטוקול נוח עבור מבחני מחשוף in vitro caspase. באמצעות פרוטוקול זה, מצעים מועמדים נבדקים עם Dronc כמו caspase. הם יכולים גם להיבדק כמצעים של Drice. למרות שפרוטוקול זה נכתב עבור Drosophila caspases Dronc ו- Drice, הוא יכול להיות מותאם גם עבור caspases מאורגניזמים אחרים.

מיצוי וטיהור של Dronc ו Drice יחד עם בדיקת מחשוף במבחנה חייב להתבצע באותו יום בשל אובדן פעילות קטליטית על ידי caspases אלה. פרוטוקול זה שונה והותאם מפרסומים קודמים 8,9,11,12,21,22. בפרוטוקול זה, ארבעה חלבוני קספאז שונים באים לידי ביטוי רקומביננטי בזן E. coli BL21 (DE3) pLysS. חלבונים אלה הם: 6xHis-Dronc wt, 6xHis-DroncC318A, 6xHis-Dricewt, ו- 6xHis-DriceC211A. כל אחד מהחלבונים האלה מתויג עם 6 שאריות היסטידין (6xHis) ב-N-terminus לצורך טיהור. Dronc wt ו- Dricewt הם חלבונים מסוג בר ויכולים לעבד אוטומטית לתוך הקספאזה הפעילה עם ביטוי רקומביננטי. DroncC318A ו-DriceC211A מקודדים צורות מוטנטיות של Dronc ו-Drice שמשנות את שאריות Cys הקטליטיות לשאריות Ala. המבנים האלה אינם פעילים באופן קטליטי ואינם יכולים לעבד אותם באופן אוטומטי (ראו איור 2A). הם משמשים כבקרות בבדיקת המחשוף. מכיוון ש- DriceC211A אינו יכול לעבד באופן אוטומטי, הוא משמש גם כמצע המודל עבור Droncwt בבדיקת המחשוף במבחנה המתוארת כאן.

Protocol

1. ביטוי קספאז רקומביננטי בחיידקים

  1. שכפלו את הגן המעניין (Caspase או substrate putative) לווקטור ביטוי חיידקי עם תגי N- ו/או C-terminal באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים23.
    הערה: תגים יכולים להגדיל את המסיסות של החלבונים הרקומביננטיים ומשמשים לטיהור החלבונים הרקומביננטיים. כאן, Dronc, Drice, והמוטציות הקטליטיות שלהם משוכפלות לתוך הווקטור pET28a, המספק תג N-terminal 6xHis (pET28a-6xHis-Dronc wt, pET28a-6xHis-Dronc C318A, pET28a-6xHis-Dricewt, pET28a-6xHis-DriceC211A); (למידע ראשוני ראו טבלה משלימה 1).
  2. הפוך את הווקטורים עם הגנים המעניינים לתאי BL21 (DE3) pLysS E. coli מוסמכים באמצעות נהלים סטנדרטיים23,24. צלחת את תערובת הטרנספורמציה על צלחות אגר LB עם אנטיביוטיקה מתאימה (kanamycin במקרה של pET28a) כדי לבחור חיידקים מותמרים. (עיין בטבלה משלימה 2.)
  3. בחרו מושבה מהצלחת וחסנו ב-5 מ"ל של מדיום LB המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה כדי לגדול בן לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-220 סל"ד על פלטפורמת טלטול.
  4. למחרת, הכינו 30-50 מ"ל (לכל דגימה) של מדיום LB עם אנטיביוטיקה והוסיפו 1 מ"ל מהתרבית שגדלה בן לילה. הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר (OD600) באמצעות ביו-פוטומטר/ספקטרופוטומטר צריכה להיות בין 0.1 ל-0.2.
  5. הגדל את התרבית ב-37 מעלות צלזיוס ב-220 סל"ד על פלטפורמת רעידות עד ש-OD600 יגיע ל-0.6. בדוק את OD600 כל שעה עד שהוא מגיע 0.6. זה לוקח בערך 2 עד 3 שעות.
  6. כדי לגרום לביטוי חלבון (caspase), הוסף IPTG לריכוז סופי של 0.1-0.2 mM (יש לדלל 1:1,000-1:500 ממלאי IPTG, ראה טבלה משלימה 2).
  7. הגדל את התרביות במשך 3 שעות ב-30°C ב-220 סל"ד.
    הערה: הזמן והטמפרטורה תלויים בסוג החלבון המתבטא ובמסיסותו. ייתכן שיהיה צורך להתאים תנאים אלה אם באים לידי ביטוי קספאזות או מצעים שונים.
  8. לאחר 3 שעות, סובב את התרביות בצינורות צנטריפוגה של 50 מ"ל למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ב-2,000 x גרם. השליכו את הסופר-נטנט והמשיכו עם הכדור.
    הערה: ניתן לעצור את הפרוטוקול בשלב זה ולהמשיך מאוחר יותר. כדוריות חיידקים ניתן להקפיא ב -80 מעלות צלזיוס.

2. מיצוי קספאזות רקומביננטיות בקנה מידה קטן

  1. הסר את הצינורות הקפואים עם תרביות הכדורים מאחסון של -80 מעלות צלזיוס ושמור אותם על קרח למשך 10 דקות כדי לרכך את הכדור.
  2. לאחר 10 דקות, הוסיפו 0.6 מ"ל של חיץ תזה של תאי חיידקים (טבלה משלימה 2) בתוספת מעכבי פרוטאז טריים שנוספו, 10 מ"ג/מ"ל של ליזוזים ו-50 U/mL של בנזונאז לתוך הצינורות המכילים גלולות באמצעות בקר פיפטה עם פיפטה סרולוגית של 1 מ"ל.
  3. בעזרת אותו קצה פיפטה, ממיסים את הכדור על ידי פיפטינג למעלה ולמטה עד שנראית תמיסה צלולה-צהובה-בהירה ללא חלקיקי גלולה. דגירה במשך 30 דקות על קרח.
  4. מעבירים את הליזאט לצינורות צנטריפוגה מתאימים ואת הצנטריפוגה בליזאטים ב-17,000 x גרם למשך 40 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  5. העבירו את הסופרנאטנטים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. זוהי התמצית הגולמית המכילה את הקספאזות.
  6. שמור את הצינורות על הקרח והמשך לטיהור עם Ni-NTA agarose.

3. טיהור קספאזות מתויגות בקנה מידה קטן

  1. הוסיפו 0.2 מ"ל מתוך 50% ה-50% של אגרוז Ni-NTA לכל שפופרת של תמציות הקספאז משלב 2.5. סובב את הצינורות על סיבוב מקצה לקצה במשך שעה אחת ב-4 מעלות צלזיוס.
  2. לאחר 1 שעות, להוסיף את התמצית עם Ni-NTA agarose ל 1 מ"ל פוליפרופילן עמודים עם קצה שלם, ממוקם במתלה. תן לזה לעמוד במשך 5 דקות.
  3. לאחר 5 דקות, הסר את מכסה העמודים ותן לסופר-נאטנט לזרום החוצה על ידי זרימת כוח הכבידה.
  4. הוסיפו בזהירות 1 מ"ל ממאגר הכביסה (טבלה משלימה 2) לעמודים מבלי להפריע לשרף הארוז הארוז של Ni-NTA ושטפו אותו בזרימת הכבידה.
  5. בצעו את שלב הכביסה שלוש פעמים.
  6. עבור elution של caspases, למקם 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge מתחת לזרבובית איסוף של העמודים לאחר ניקוז מלא של חיץ לשטוף.
  7. יש להוסיף 0.5 מ"ל של חיץ האלוציה (בתוספת מעכבי פרוטאז 1x מיד לפני השימוש) לכל עמודה ולאסוף את האלואט בצינורות המיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
    הערה: הצבע המטוהר העדין יהיה שקוף.
  8. שמור את האלואטים על הקרח ומדוד את ריכוז החלבונים על ידי מבחן ברדפורד25. אשר טוהר/הומוגניות של הקספאזות המטוהרות על ידי SDS-PAGE ואחריו כתם כחול של Coomassie26.
    הערה: התפוקה של תרבית LB של 50 מ"ל נעה בין 0.5 ל-1.5 מ"ג של חלבון קספאז. בהתחשב בכך 0.5 מ"ל של חיץ elution משמש elution, הריכוז נע בין 1 ל 3 מ"ג / מ"ל. חשוב להשתמש ב-caspase המטוהר eluates עבור מבחני ביקוע במבחנה באותו יום של תזה וטיהור, שכן תכשירי קספאזה אלה מאבדים פעילות במהלך הלילה.

4. ביטוי של מצע הקספאזה הפוטטיבי במערכות ביטוי נטולות תאים

הערה: בפרוטוקול זה, Drice, המצע הטבעי של Dronc, מוכן הן על ידי ביטוי רקומביננטי ב- E. coli (ראה סעיף 3 לעיל) והן על ידי ביטוי ב- reticulocyte lysate ארנב (RRL), מערכת ביטוי ללא תאים של יונקים (סעיף זה, ראה להלן).

  1. שכפלו את הגן של המצע הפוטטיבי לווקטור ביטוי המכיל מקדם T7, T3 או SP6 באמצעות פרוצדורות סטנדרטיות23.
    הערה: בפרוטוקול זה, DriceC211A משמש כמצע המודל ושוכפל לווקטור pT7CFE1-N-Myc, הנושא מקדם T7 לביטוי גנים ומתייג את מצע החלבון הפוטטיבי עם תג Myc מסוף N לזיהוי על ידי אימונובלוטציה.
  2. ב- RRL, מצעים מועמדים יכולים להיות מסונתזים באופן רדיואקטיבי או לא רדיואקטיבי.
    1. סינתזה לא רדיואקטיבית: בצינור מיקרוצנטריפוגה של 0.5 מ"ל, הוסף 25 μL של RRL, 2 μL של מאגר תגובה, 0.5 μL של תערובת חומצות אמינו - מינוס לאוצין (1 mM), 0.5 μL של תערובת חומצות אמינו - מינוס מתיונין (1 mM), 1 μL של מעכב ריבונוקלאז (40 U / μL), 2 μL של תבנית DNA (0.5 מיקרוגרם / μL), ו 1 μL של T7-RNA פולימראז. הוסיפו מים נטולי נוקלאז כדי להתאים את הנפח הסופי של התגובה ל-50 μL. ערבבו בעדינות את הרכיבים על ידי פיפטינג או ערבוב עם קצה הפיפטה, וסובבו מעט כלפי מטה.
      הערה: ליזאט RRL מכיל 100-200 מ"ג/מ"ל של החלבונים האנדוגניים. לתגובות תרגום חוץ-גופי , הוסף את ה-RRL בריכוז של 50% (כאן תגובת 25 μL/50 μL).
    2. סינתזה רדיואקטיבית: בצינור מיקרוצנטריפוגה של 0.5 מ"ל, הוסף 25 μL של ליזאט RRL, 2 μL של מאגר תגובה, 0.5 μL של תערובת חומצות אמינו-מינוס מתיונין (1 mM), 1 μL של מעכב ריבונוקלאז (40 U/μL), 2 μL של תבנית DNA (0.5 μg/μL), 2 μL של S35 שכותרתו מתיונין (1000 Ci/mmol ב-10 mCi/mL) ו-1 μL של T7-RNA פולימראז. הוסיפו מים נטולי נוקלאז כדי להתאים את הנפח הסופי של התגובה ל-50 μL. ערבבו בעדינות את הרכיבים על ידי פיפטינג או ערבוב עם קצה הפיפטה, וסובבו מעט כלפי מטה. יש להשליך טיפים וצינורות במיכל פסולת רדיואקטיבי.
      הערה: אין להוסיף את תערובת חומצות האמינו ללא לאוצין. וקטור pT7CFE1 משתמש במקדם T7 לביטוי חלבונים. וקטורים אחרים משתמשים במקדמי T3 או SP6. במקרה כזה, יש להשתמש בפולימראזות T3 או SP6 RNA במקום T7 RNA פולימראז. אנא וודאו שתבנית הדנ"א היא בעלת טוהר גבוה.
  3. לדגור את התגובה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות.
  4. סובבו לזמן קצר במשך 10 שניות והניחו את הצינורות על קרח. בדוק את רמת הביטוי של המצע הפוטטיבי ב- RRL על ידי SDS-PAGE ואימונובלוטינג / אוטורדיוגרפיה.
    הערה: כמות תמצית RRL שנוספה לתגובת המחשוף צריכה להתבסס על כמות החלבון שניתן לזהות בשיטת הגילוי (או אימונובלוטינג או אוטורדיוגרפיה S35 ). המשך לבדיקת המחשוף במבחנה (הקטע הבא) או אחסן אותה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

5. בדיקת מחשוף במבחנה עם מצעים שנוצרו עם RRL

  1. קח את המצע(ים) הפוטטיביים שנוצרו, כמתואר בסעיף 4. בפרוטוקול זה, N-Myc-DriceC211A משמש כמצע מודל.
  2. בהתאם לרמת הביטוי של המצע הפוטטיבי (שייקבע בנפרד על ידי ניתוח אימונובלוט או אוטורדיוגרפיה, ראה שלב 4.4), השתמש ב- 1-10 μL של RRL המתוכנת עם החלבון המעניין בבדיקת המחשוף.
  3. הוסיפו 10 מיקרוגרם של חלבון קספאז מטוהר שנוצר בסעיפים 1, 2 ו-3.
  4. הבא את נפח התגובה הכולל ל-50 μL באמצעות מאגר בדיקת קספאז.
  5. לדגור את התגובות באמבט מים ב 30 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות. הקפד לכלול את הפקדים המתאימים בבדיקת המחשוף. כאן, המוטציה הקטליטית DroncC318A משמשת כבקרה.
  6. לאחר 3 שעות, להפסיק את התגובות על ידי העברת צינורות על קרח.
  7. הוסף אמצעי אחסון אחד של מאגר דגימת LDS המכיל DTT של 50 mM. התגובה נעצרת לחלוטין עם תוספת של מאגר מדגם LDS.
  8. דגירה של הדגימות ב-75 מעלות צלזיוס בבלוק חום למשך 10 דקות.
  9. סובב במהירות, ערבב על ידי הבהוב, טען 24 μL לכל דגימה והפעל את ה- SDS-PAGE (ראה סעיף 7) או אחסן את הדגימות ב- -20 °C.

6. בדיקת מחשוף במבחנה עם חלבון מצע רקומביננטי המתבטא באופן חיידקי

  1. הוסף 10 מיקרוגרם של מצע מועמד מטוהר (כאן 6xHis-DriceC211A, שנוצר בסעיפים 1, 2 ו -3) לצינור מיקרוצנטריפוגה של 0.5 מ"ל.
  2. הוסיפו 10 מיקרוגרם של חלבוני הקספאז המטוהרים שנוצרו בסעיפים 1 ו-2. הבא את הנפח הכולל ל- 50 μL באמצעות מאגר בדיקת קספאז.
  3. בצע את שלבים 5.5 עד 5.9.

7. SDS-PAGE ואימונובלוטינג

  1. טען את תגובות המחשוף (24 μL) על 4%-12% טריס-גליצין או ביס-טריס ג'ל הדרגתי (טבלת חומרים) ובצע אלקטרופורזה של חלבונים ואימונובלוטינג (או אוטורדיוגרפיה אם משתמשים במצעים בעלי תוויתS 35) כדי להמחיש את התוצאות באמצעות נהלים סטנדרטיים27,28.
    הערה: כאן, בפרוטוקול זה, נעשה שימוש בג'לים הדרגתיים של Bis-Tris עם מאגר פועל של Mops ומאגר טעינה של LDS. באופן כללי, פרוטוקולי PAGE הנפוצים של ג'ל Tris-Glycine פועלים באמצעות מאגר הריצה Tris-Glycine-SDS ומאגר טעינת ה-SDS פועלים היטב.

Representative Results

פרוטוקול זה מספק הוראות שלב אחר שלב להשראת חלבון הקספאזה ב- E. coli, טיהור של Drosophila caspases Dronc ו- Drice הרקומביננטי, סינתזה של מצעים מועמדים, ותגובת המחשוף במבחנה עם מצעים מועמדים (כאן DriceC211A) ו- caspase Dronc. המוטציה הקטליטית DriceC211A שימשה כמצע מודל בבדיקה זו מאחר שאין לה פעילות עיבוד אוטומטי (איור 2A) והיא נשארת באורך מלא עד שהיא נבקעת על-ידי Droncwt. DriceC211A צריך תמיד לשמש כבקרה חיובית כדי לאמת כי תכשירDronc wt יש פעילות אנזימטית.

איור 2A מספק דוגמה מייצגת לביטוי ולטיהור של קספאזות רקומביננטיות. ארבעה קספאזות רקומביננטיות שונות הושרו וטוהרו: 6xHis-Droncwt, 6xHis-DroncC318A, 6xHis-Dricewt ו-6xHis-DriceC211A. הקספאזות המטוהרות נוהלו על ידי SDS-PAGE, שעברו אימונובלוטציה, והכתם נבדק עם נוגדן אנטי-His (מדולל 1:5,000; ואחריו IgG נגד עכבר, נוגדן המקושר ל-HRP (1:10,000)). ה-6xHis-Dronc הלא מעובד (proDronc) פועל במשקל מולקולרי יחסי (MWr) של 55 kDa (נתיב 2) ו-6xHis-Drice (proDrice) הלא מעובד הוא בעל MWr של 35 kDa (נתיב 4). עיבוד אוטומטי של הקספאזות נראה לעין על-ידי הופעתן של להקות של MWr קטנות יותר, אשר בשל נוכחותו של תג ה-His-ter ב-N-terminus מייצגות את יחידות המשנה הגדולות של הקספאזות (איור 1). במקרה של 6x-Dronc, ליחידת המשנה הגדולה ישMW r של 40 kDa (נתיב 1). יחידת המשנה הגדולה של 6x-Drice פועלת במהירות של 23 kDa (נתיב 3). המוטנטים הקטליטיים 6xHis-DroncC318A ו-6xHis-DriceC211A אינם מצליחים לעבור עיבוד אוטומטי וניתנים לזיהוי רק כחלבונים באורך מלא (נתיבים 2 ו-4).

תרשים 2B כדי להדגים כי לתכשיר 6xHis-Droncwt המיוצר באופן חיידקי ומטוהר יש פעילות אנזימטית, בוצעה בדיקת מחשוף במבחנה כמתואר בפרוטוקול זה. כבקרה שלילית, נעשה שימוש במוטציה הקטליטית 6xHis-DroncC318A. המצע היה N-Myc-DriceC211A שנוצר על ידי RRL, אשר מתויג עם תג Myc ב-N-terminus. לאחר תגובת המחשוף במבחנה, החלבונים הופרדו על ידי SDS-PAGE, חיסוניים והכתמים דוגרו עם נוגדן אנטי-Myc (מדולל 1:1,000) ואחריו IgG נגד עכבר, נוגדן המקושר ל-HRP (1:10,000)) כדי לזהות N-Myc-DriceC211A. ניתן להדגים ביקוע מוצלח ולכן פעילות אנזימטית של הקספאז על ידי הופעתו של לפחות פס אחד שלMW r קטן יותר בהשוואה לצורה המלאה והלא מעובדת של המצע. N-Myc-Drice C211A לא מעובד באורך מלא הוא בעל MWr של 40 kDa (נתיבים 2 ו-4), ואילו יחידת המשנה הגדולה של N-Myc-DriceC211A המעובד פועלת במהירות של 30 kDa (נתיב 3). נתיב 1 מייצג את ליזאט RRL לא מתוכנת (לא נוסף פלסמיד/תמליל). נתיב 2 מדגים ייצור במבחנה של DriceC211A על ידי ביטוי RRL. נתיב 3 מכיל את תגובת המחשוף במבחנה עם 6xHis-Droncwt. נתיב 4 מכיל את תגובת המחשוף במבחנה עם 6xHis-DroncC318A.

תרשים 2C תגובת ביקוע במבחנה המשתמשת הן בקספאז רקומביננטי והן במסוע מטוהר (6xHis-Droncwt ו-6x-His-DroncC318A) ובמצע (6xHis-DriceC211A) על פי פרוטוקול זה, נותחה על ידי SDS-PAGE ואימונובלוט. לצורך ניתוח תגובת הבקיעה, נעשה שימוש בנוגדן Drice נגד שסעים (מדולל 1:5,000; ואחריו IgG נגד ארנב, נוגדן המקושר ל-HRP (1:10,000)) באימונובלוט זה. הנוגדן Drice נגד שסעים מזהה את הניאו-אפיטופ שלו בתת-היחידה הגדולה (23 kDa) של 6xHis-DriceC211A רק לאחר עיבוד על ידי 6xHis-Droncwt (נתיב 1). המוטציה הקטליטית 6xHis-DroncC318A אינה מסוגלת לעבד את 6xHis-Drice C211A בבדיקה זו ובאורך מלא 6xHis-DriceC211A מופיע כפס קלוש לא מעובד של 35 kDa (נתיב 2).

Figure 1
איור 1: מבנה התחום של הקספאזות היוזמות Caspase-9 ו-Dronc ו-effector caspases Caspase-3 ו-Drice. CARD - תחום הפעלה וגיוס caspase; Cys - מיקום יחסי של שאריות ציסטאין קטליטי; L - יחידת משנה גדולה; S - יחידת משנה קטנה. המיקום של פרודומיינים N-terminal מצוין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: תוצאות מייצגות. (A) ניתוח אימונובלוט של תכשירי רקומביננט מטוהרים 6xHis-Dronc ו-6xHis-Drice, עם נוגדן אנטי-היס. לא מעובד (proDronc ו- proDrice) ו 6xHis-Dronc ו- 6xHis-Drice מסומנים על ידי חצים. סמני MW מסומנים בצד שמאל. (B) ניתוח אימונובלוט של תגובת המחשוף במבחנה של N-Myc-Drice שנוצר על ידי RRL עם קספאזות 6xHis-Droncwt (נתיב 3) או 6x-His-DroncC318A (נתיב 4) נבדק עם נוגדן אנטי-Myc. תגובות RRL לא מתוכנתות ומתוכנתות (N-Myc-DriceC211A) נטענות ומופרדות בנתיבים 1 ו-2. לא מעובד (proDrice) ו N-Myc-Drice מפוצל מסומנים על ידי חצים. סמני MW מסומנים בצד שמאל. (C) ניתוח אימונובלוט של תגובת המחשוף במבחנה של רקומביננטי 6xHis-Drice C211A עם קספאזות 6xHis-Droncwt (נתיב 1) או 6x-His-DroncC318A (נתיב 2), נבדק עם נוגדן Drice נגד שקועים. אורך מלא (proDrice) ו 6xHis-DriceC211A קרוע מסומנים על ידי חצים. סמני MW מסומנים בצד שמאל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה משלימה 1: טבלה זו מכילה פריימרים המשמשים לשיבוט בווקטור pET28a. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה 2: טבלה זו מכילה את הרכב המאגרים והמדיה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

עיקר הידע שלנו על קספאזות ותפקוד קספאז נגזר מעבודה אינטנסיבית באפופטוזיס בשלושת העשורים האחרונים. זה מבוסס היטב כי caspases יוזם לעבד באופן פרוטאוליטי אפקטים caspases, ומאות חלבונים זוהו כמו מצעי caspase effector במהלך אפופטוזיס 5,29. לעומת זאת, הרבה פחות ידוע על הפונקציה של caspases עבור תהליכים שאינם אפופטוטיים ואילו מצעים לא אפופטוטיים הם מעבדים. ניתן להעלות על הדעת כי היוזמים הם מקבלי ההחלטות המרכזיים כאן. במהלך אפופטוזיס, הם מפעילים קספאזות משפיעות הגורמות למוות תאי. עם זאת, כדי להפעיל תהליכים שאינם אפופטוטיים, הם עשויים להפעיל חלבונים שונים (מלבד קספאזות אפקטור), השולטים בתהליך הלא-אפופטוטי. פרוטוקול זה בודק חלבונים מועמדים כמצעים של היוזם קספאז דרונק בדרוזופילה 17,30.

המצעים שייבחנו בבדיקת הבקיעה יכולים להיות מיוצרים במערכת ביטוי ללא תאים של יונקים במבחנה כגון RRL או על ידי ביטוי רקומביננטי ב - E. coli. ישנם מספר יתרונות לביטוי במבחנה באמצעות RRL על פני ביטוי חיידקי. פרוטוקול הביטוי RRL הוא פשוט ומהיר, ומאפשר להכין מצעים רבים ושונים במקביל. במקרים רבים, תמצית RRL המכילה את החלבון המעניין יכולה להיות מאוחסנת ב -80 מעלות צלזיוס לפני השימוש בבדיקת המחשוף (אם כי יש לקבוע זאת בנפרד עבור כל מצע). ניתן לסמן את המצע הפוטטיבי עם S35-Met, המאפשר ניתוח קל על ידי אוטורדיוגרפיה לאחר SDS-PAGE. זה שימושי במיוחד, אם אין נוגדן ספציפי לסובסטרט זמין. לחלופין, אם אין צורך בתיוג S35-Met, ניתן לתייג את המצע הפוטטיבי באמצעות תגים נפוצים כגון תגי דגל, HA או Myc, המאפשרים זיהוי של ביקוע קספאז על ידי אימונובלוטציה.

יש להדגיש מאוד כי הצלחתו של פרוטוקול זה תלויה בטיהור זהיר ועקבי של חלבוני Dronc ו- Drice הרקומביננטיים. למרבה הצער, לא ניתן לאחסן את החלבונים האלה – אפילו לא לטווח קצר – לא במקרר ולא בהקפאה. הם מאבדים את הפעילות האנזימטית בן לילה בכל צורה מאוחסנת. לכן, הם צריכים להיות מוכנים טריים ביום של בדיקת המחשוף. ללא קשר לחלבונים המועמדים שנבדקים, DriceC211A תמיד צריך לשמש כבקרה חיובית כדי לאמת את הפעילות האנזימטית של תכשירDronc wt (ראו איור 2B,C). לחלופין, ניתן לבדוק את הפעילות של תכשירי Dronc ו- Drice גם על ידי ביקוע חוץ גופי של מצעי טטרפפטיד סינתטיים פלואורוגניים 2,9,31.

אם משתמשים בנוגדנים כדי לזהות את המצעים המועמדים, הם צריכים להיות מאומתים על ידי המשתמש32,33. זה חל גם על נוגדנים זמינים מסחרית המזהים תגי אפיטופ כגון דגל, HA, Myc או אחרים. איכות נוגדנים ירודה עלולה לטשטש תוצאות חשובות. תיוג אפיטופי כפול של מצעי המועמדים הן על מסוף N והן על C-terminus עם תגים שונים מומלץ גם34. אם מתרחש מחשוף, תיוג כפול עוזר להתחקות אחר שני מוצרי המחשוף ועשוי לעזור להבהיר אם הבקיעה מתרחשת באתר אחד או יותר.

בעוד פרוטוקול זה מאמת בקלות את המצע הביולוגי הידוע של Dronc, Drice, יש גם מגבלות. מגבלה אחת היא שמדובר בפרוטוקול במבחנה עם חלבונים רקומביננטיים. במבחנים אלה, הקספאזות נמצאות בריכוז גבוה באופן לא פיזיולוגי, מה שניכר מהתצפית שהן יכולות לעבד אוטומטית באופן ספונטני ב - E. coli. העיבוד האוטומטי הספונטני בדרך כלל אינו מתרחש בתנאים הפיזיולוגיים. ריכוז קספאז גבוה זה עלול לגרום לפעילות מופרכת וכתוצאה מכך לתוצאות חיוביות שגויות. ניתן לבטל תוצאות חיוביות כוזבות על ידי הורדת ריכוז הקספאזה בתגובת המחשוף במבחנה . יתר על כן, כפי שמתואר ביתר פירוט להלן, יש צורך בבדיקות נוספות כדי לאשר מצעים מקוריים ולמנוע תוצאות חיוביות כוזבות.

ייתכן שלקספאזות הרקומביננטיות אין את אותה הספציפיות שיש להן בסביבה התאית הרגילה שלהן in vivo. לדוגמה, ניתן לשנות את הפעילות של caspases על ידי שינויים לאחר תרגום. אלה אינם קיימים על החלבונים הרקומביננטיים. יתר על כן, in vivo, קספאזות יוזמות, כולל Dronc משולבות בקומפלקסים חלבוניים גדולים כמו האפופטוזום. בתנאים של פרוטוקול זה, היווצרות של apoptosome אינו מושגת. זה ידרוש ביטוי רקומביננטי של Drosophila Apaf-1 (aka Dark או Hac-1)35-37 שיש לו אתגרים משלו. לכן, במבחנה, Dronc לא יכול להיות את אותה ספציפיות שיש לו in vivo.

כמו כן, ניתן להעלות על הדעת כי Dronc משולב בקומפלקס חלבונים אחר עבור תהליכים שאינם אפופטוטיים. זה עשוי להעניק ספציפיות מחשוף שונה לדרונק, מה שיכול גם להסביר מדוע Dronc אינו גורם לאפופטוזיס בתנאים שאינם אפופטוטיים. בהקשר זה, CasCleave משתמש באתרי קונצנזוס המחשוף הידועים כדי לחזות מצעים קספאזיים חדשים. עם זאת, לא ידוע אם אותם אתרי קונצנזוס מחשוף משמשים גם לתהליכים שאינם אפופטוטיים. למעשה, לאחרונה, הוכח כי Caspase-3 משנה את אתר הקונצנזוס המועדף עליו במהלך תהליך לא אפופטוטי בגזע המוח השמיעתי המתפתח בעובר האפרוח38. באופן דומה, אם קספאזות יוזמות משולבות בקומפלקסים שונים של חלבונים, הן עשויות להיות בעלות ספציפיות שונה ולכן עשויות להיבקע ברצפי קונצנזוס שונים.

מגבלות אלה ממחישות כי אין די להסתמך אך ורק על מבחני המחשוף במבחנה המתוארים בפרוטוקול זה. יש להשתמש בגישות חלופיות כדי לאמת עוד יותר את התוצאות המתקבלות באמצעות פרוטוקול זה. באופן אידיאלי, יש להשתמש במבחני in vivo כדי לענות על השאלות הבאות: האם החלבון המועמד מעובד באופן פרוטאוליטי במהלך התהליך הלא-אפופטוטי in vivo? אם כן, האם אותו אתר מחשוף משמש in vivo ו - in vitro? מה התוצאה אם המחשוף נחסם על ידי מוטגנזה של אתר המחשוף? האם עיבוד המצע המועמד תלוי בקספסות, ואם כן, איזה מהם? מה תפקידם של שברי המחשוף בתהליך הלא-אפופטוטי? ניתן לטפל בשאלות אלה בקלות באורגניזמי המודל הגנטי כגון C. elegans ו - Drosophila באמצעות שיטות גנטיות וטרנסגניות סטנדרטיות.

לסיכום, פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה ועקבית לייצור קספאזות פעילות אנזימטית, במיוחד Drosophila caspases Dronc ו- Drice. המטרה הסופית של פרוטוקול זה היא לבחון אם Dronc יכול לבקע מצעים מועמדים במבחנה, שזוהו על ידי גישות גנטיות, ביוכימיות או ביואינפורמטיות. כפי שהוסבר בפסקה הקודמת, נדרשים מבחנים נוספים כדי לאמת חלבונים אלה כמצעי קספאז in vivo. בהתחשב במידת השימור של גנים קספאזיים על פני מטזואה, זה אמור להיות אפשרי להתאים את הפרוטוקול הזה לקספאזות גם מאורגניזמים אחרים.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

ברצוננו להודות לד"ר אליף קמבר-קאיה על עזרתה בגיבוש הפרוטוקול במעבדה. ד"ר גיא סלבסן סיפק בחביבות את המוטציהDrice C211A 9. עבודה זו מומנה על ידי פרס MIRA מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (NIGMS) של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) תחת מענק מספר 2R35GM118330. למממנים לא היה כל תפקיד בתכנון המחקר, באיסוף הנתונים ובניתוחם, בהחלטה על פרסומו או בהכנת כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ampicillin Fisher BP1760-25
Anti-His antibody Sigma-Aldrich MA1-21315
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell signaling 7076P2
Anti-Myc antibody Santa Cruz Biotechnology sc-40
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell signaling 7074P2
Benchtop Centrifuge Eppendorf 5415 R
Benzonase Sigma-Aldrich E1014-5KU
BioPhotometer Eppendorf #6131
BL21 (DE3) pLysS Competent Cells Promega L1195
Centrifuge rotor Beckman Coulter JA-25.50
CHAPS  Sigma-Aldrich C3023-1G
ChemiDoc with image software Bio-Rad Universal Hood II For Chemiluminiscence imaging
Chemiluminiscence Substrate Thermofisher Scientific 34095 For Chemiluminiscence imaging
Cleaved Drosophila ICE (drICE) (Asp230) Antibody Cell Signaling Technology 9478S
Disposable cuvettes Fisher Scientific 14955128 Used to measure bacterial growth and protein concentration
Dithiothreitol (DTT) Bio-Rad #1610610
Erlenmeyer flasks, 1000 mL Millipore sigma CLS49801L For LB agar media preparation and autoclaving
Erlenmeyer flasks, 250 mL Millipore sigma CLS4980250 For bacterial culture growth and induction.
Ethylene-diamine-tetra-acetic Acid (EDTA) Sigma-Aldrich E5134
Gel extraction kit Qiagen 28704
Gel tank SDS-PAGE system Thermofisher Scientific STM1001
Glycine Sigma-Aldrich G8898
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) Thermofisher scientific 87786
HEPES Sigma-Aldrich H3375
His-Drice-pET28a  This study N/A Available from authors
His-DriceC211A-pET28a  This study N/A Available from authors
His-Dronc-pET28a  This study N/A Available from authors
His-DroncC318A-pET28a  This study N/A Available from authors
Imidazole Sigma-Aldrich I2399-100G
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Thermofisher Scientific FERR0392
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5
LB Agar, Miller (Powder) Fisher Scientific BP1425-500
LB Broth, Miller Fisher Scientific BP1426-500
Lysozyme Thermofisher Scientific 90082
Microbiological plate incubator Fisher Scientific 11-690-650D For colony growth after transformation
Microcentrifuge tubes, 0.5 mL Eppendorf 22363611
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL Eppendorf 22363204
Midiprep kit Qiagen 12243
Mini tube rotator Fisher Scientific 05-450-127 for mixing bacterial lysates and Ni-NTA agarose
Miniprep kit Qiagen 27106
Motorized Pipette Controller Gilson F110120 For using serological pipettes
NaH2PO4 Fisher Scientific BP330-1
Ni-NTA Agarose Qiagen 30210
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Midi Protein Gel, 20-well Thermofisher Scientific WG1402BOX
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) Thermofisher Scientific NP0007
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20x) Thermofisher Scientific NP0001
NuPAGE Transfer Buffer (20x) Invitrogen NP00061
Orbital shaking incubator with temperature control New Brunswick Scientific C25 incubator shaker
Petridish 100 mm x 15 mm Fisher Scientific FB0875712
Plating beads Zymo research S1001 For spreading culture on AmpR/KanR plates
Polypropylene Columns (1 mL) Qiagen 34924 For purification of His-tagged proteins
Precision Plus Protein Standards Bio-Rad #161-0374
Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad #5000006
pT7CFE1-NMyc Thermofisher Scientific 88863 For cloning substrates for RRL expression
PVDF membrane Invitrogen LC2007
14 mL Polypropylene round bottom tubes Fisher Scientific 352029 For growing plasmid cultures
QiaRack Qiagen 19095 For holding polypropylene columns during purification
Refrigerated High speed Centrifuge Beckman Coulter Avanti J-25
rRNasin Ribonuclease Inhibitor Promega N251A For RRL expression
Sodium chloride Fisher Scientific BP358-212
Sodium Hydroxide Fisher Scientific BP359-500
Sterile Falcon tubes, 15 mL Fisher Scientific 05-527-90
Sterile Falcon tubes, 50 mL Fisher Scientific 14-959-49A
Sucrose Sigma-Aldrich S70903-250G
1 mL Serological Pipets, Sterile celltreat 229001B For bacterial cell lysis in 50 mL tubes
TnT Coupled Reticulocyte Lysate -T7 Promega L4611
Tris-base Fisher Scientific BP154-1
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Waterbath Fisher Scientific 2340
Western wet transferring cassette Thermofisher Scientific STM2001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kumar, S. Caspase function in programmed cell death. Cell Death and Differentiation. 14 (1), 32-43 (2007).
  2. Hawkins, C. J., et al. The Drosophila caspase DRONC cleaves following glutamate or aspartate and is regulated by DIAP1, HID, and GRIM. Journal of Biological Chemistry. 275 (35), 27084-27093 (2000).
  3. Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell. 91 (4), 479-489 (1997).
  4. Meier, P., Silke, J., Leevers, S. J., Evan, G. I. The Drosophila caspase DRONC is regulated by DIAP1. EMBO Journal. 19 (4), 598-611 (2000).
  5. Timmer, J. C., Salvesen, G. S. Caspase substrates. Cell Death and Differentiation. 14 (1), 66-72 (2007).
  6. Zou, H., Li, Y., Liu, X., Wang, X. An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11549-11556 (1999).
  7. Zou, H., Henzel, W. J., Liu, X., Lutschg, A., Wang, X. Apaf-1, a human protein homologous to C. elegans CED-4, participates in cytochrome c-dependent activation of caspase-3. Cell. 90 (3), 405-413 (1997).
  8. Stennicke, H. R., et al. Caspase-9 can be activated without proteolytic processing. Journal of Biological Chemistry. 274 (13), 8359-8362 (1999).
  9. Snipas, S. J., Drag, M., Stennicke, H. R., Salvesen, G. S. Activation mechanism and substrate specificity of the Drosophila initiator caspase DRONC. Cell Death and Differentiation. 15 (5), 938-945 (2008).
  10. Fraser, A. G., Evan, G. I. Identification of a Drosophila melanogaster ICE/CED-3-related protease, drICE. EMBO Journal. 16 (10), 2805-2813 (1997).
  11. Denton, D., Mills, K., Kumar, S. Methods and protocols for studying cell death in Drosophila. Methods in Enzymology. 446, 17-37 (2008).
  12. Dorstyn, L., Kumar, S. A biochemical analysis of the activation of the Drosophila caspase DRONC. Cell Death and Differentiation. 15 (3), 461-470 (2008).
  13. Aram, L., Yacobi-Sharon, K., Arama, E. CDPs: caspase-dependent non-lethal cellular processes. Cell Death and Differentiation. 24 (8), 1307-1310 (2017).
  14. Arama, E., Baena-Lopez, L. A., Fearnhead, H. O. Non-lethal message from the Holy Land: The first international conference on nonapoptotic roles of apoptotic proteins. FEBS Journal. 288 (7), 2166-2183 (2021).
  15. Baena-Lopez, L. A. All about the caspase-dependent functions without cell death. Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 77-78 (2018).
  16. Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. Journal of Cell Biology. 196 (4), 513-527 (2012).
  17. Amcheslavsky, A., et al. Plasma membrane localization of apoptotic caspases for non-apoptotic functions. Developmental Cell. 45 (4), 450-464 (2018).
  18. Bergmann, A. Are membranes non-apoptotic compartments for apoptotic caspases. Oncotarget. 9 (60), 31566-31567 (2018).
  19. Song, J., et al. Cascleave: towards more accurate prediction of caspase substrate cleavage sites. Bioinformatics. 26 (6), 752-760 (2010).
  20. Wang, M., et al. Cascleave 2.0, a new approach for predicting caspase and granzyme cleavage targets. Bioinformatics. 30 (1), 71-80 (2014).
  21. Kamber Kaya, H. E., Ditzel, M., Meier, P., Bergmann, A. An inhibitory mono-ubiquitylation of the Drosophila initiator caspase Dronc functions in both apoptotic and non-apoptotic pathways. PLoS Genetics. 13 (2), 1006438 (2017).
  22. Stennicke, H. R., Salvesen, G. S. Caspases: preparation and characterization. Methods. 17 (4), 313-319 (1999).
  23. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th edition). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).
  24. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), e253 (2007).
  25. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  26. Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
  27. Hirano, S. Western blot analysis. Methods in Molecular Biology. 926, 87-97 (2012).
  28. Kim, B. Western blot techniques. Methods in Molecular Biology. 1606, 133-139 (2017).
  29. Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death and Differentiation. 14 (4), 641-650 (2007).
  30. Fogarty, C. E., et al. Extracellular reactive oxygen species drive apoptosis-induced proliferation via Drosophila macrophages. Current Biology. 26 (5), 575-584 (2016).
  31. Song, Z., et al. Biochemical and genetic interactions between Drosophila caspases and the proapoptotic genes rpr, hid, and grim. Molecular and Cellular Biology. 20 (8), 2907-2914 (2000).
  32. Edfors, F., et al. Enhanced validation of antibodies for research applications. Nature Communications. 9 (1), 4130 (2018).
  33. Uhlen, M., et al. A proposal for validation of antibodies. Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).
  34. Brizzard, B. Epitope tagging. Biotechniques. 44 (5), 693-695 (2008).
  35. Kanuka, H., et al. Control of the cell death pathway by Dapaf-1, a Drosophila Apaf-1/CED-4-related caspase activator. Molecular Cell. 4 (5), 757-769 (1999).
  36. Rodriguez, A., et al. Dark is a Drosophila homologue of Apaf-1/CED-4 and functions in an evolutionarily conserved death pathway. Nature Cell Biology. 1 (5), 272-279 (1999).
  37. Zhou, L., Song, Z., Tittel, J., Steller, H. HAC-1, a Drosophila homolog of APAF-1 and CED-4 functions in developmental and radiation-induced apoptosis. Molecular Cell. 4 (5), 745-755 (1999).
  38. Weghorst, F., Mirzakhanyan, Y., Hernandez, K. L., Gershon, P. D., Cramer, K. S. Non-Apoptotic caspase activity preferentially targets a novel consensus sequence associated with cytoskeletal proteins in the developing auditory brainstem. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 844844 (2022).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 188
<em>במבחנה</em> מבחני ביקוע באמצעות מפלי <em>דרוזופילה</em> רקומביננטיים מטוהרים לבדיקת מצעים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yarikipati, P., Bergmann, A. InMore

Yarikipati, P., Bergmann, A. In Vitro Cleavage Assays using Purified Recombinant Drosophila Caspases for Substrate Screening. J. Vis. Exp. (188), e64392, doi:10.3791/64392 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter