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Bioengineering

इन विट्रो सब्सट्रेट स्क्रीनिंग के लिए शुद्ध पुनः संयोजक ड्रोसोफिला कैसपेस का उपयोग करके क्लीवेज परख

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/64392
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular, Cell and Cancer Biology, UMass Chan Medical School

Summary

यहां हम पुनः संयोजक ड्रोसोफिला कैसपेस ड्रोंक और ड्राइस को व्यक्त करने और शुद्ध करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, और इन विट्रो क्लीवेज परख में उनका उपयोग करते हैं।

Abstract

कैसपेस बहुत विशिष्ट कोशिका मृत्यु प्रोटीज हैं जो एपोप्टोटिक और गैर-एपोप्टोटिक प्रक्रियाओं में शामिल हैं। जबकि एपोप्टोसिस के दौरान कैसपेस की भूमिका को बहुत अच्छी तरह से परिभाषित किया गया है और कैसपेस के कई एपोप्टोटिक प्रोटियोलिटिक सब्सट्रेट्स की पहचान और विशेषता की गई है, गैर-एपोप्टोटिक प्रक्रियाओं के लिए कैसपेस की भूमिका को अच्छी तरह से समझा नहीं गया है। विशेष रूप से, कैसपेस के कुछ गैर-एपोप्टोटिक सब्सट्रेट्स की पहचान अब तक की गई है। यहां, संभावित कैसपेस सब्सट्रेट्स की पहचान और लक्षण वर्णन की सुविधा के लिए, एक प्रोटोकॉल जो विट्रो में कैसपेज़ क्लीवेज परख में उम्मीदवार सब्सट्रेट्स के परीक्षण की अनुमति देता है, का वर्णन किया गया है। इस प्रोटोकॉल में पुनः संयोजक कैसपेज़ प्रोटीन का उत्पादन और शुद्धिकरण, उम्मीदवार सब्सट्रेट्स का उत्पादन या तो पुनः संयोजक रूप से या सेल-मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली में, और एसडीएस-पेज और इम्यूनोब्लोटिंग के बाद वास्तविक इन विट्रो क्लीवेज प्रतिक्रिया शामिल है। यह प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला कैसपेस ड्रोंक और ड्राइस के लिए तैयार किया गया है, लेकिन स्तनधारियों सहित अन्य जीवों से कैसपेस के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

प्रोग्राम्ड सेल डेथ या एपोप्टोसिस को अत्यधिक विशिष्ट सेल डेथ प्रोटीज के एक वर्ग द्वारा निष्पादित किया जाता है जिसे कैसपेस कहा जाता है (संदर्भ1 में समीक्षा की गई)। कैसपेस सिस प्रोटीज हैं जिनमें उत्प्रेरक साइट में एक साइस अवशेष होता है। उन्होंने एएसपी अवशेषों के बाद आम सहमति दरार साइटों और क्लीवर सब्सट्रेट्स को प्रोटियोलिटिक रूप से परिभाषित किया है (हालांकि ड्रोसोफिला कैसपेस ड्रोंक को ग्लू अवशेषों2 के बाद छोड़ने की भी सूचना दी गई है)। उन्हें आरंभकर्ता (एपिकल या अपस्ट्रीम के रूप में भी जाना जाता है) और प्रभावकारक (निष्पादनकर्ता या डाउनस्ट्रीम) कैसपेस में विभाजित किया जाता है। आरंभकर्ता कैसपेस प्रभावकारक कैसपेस को सक्रिय करते हैं। उदाहरण के लिए, स्तनधारियों में, सर्जक कैसपेज़ -9 प्रभावक कैसपेज़ कैसपेज़ -3 3 को छोड़ देता है और सक्रिय करता है। इसी तरह, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में, कैसपेज़ -9-ऑर्थोलॉग ड्रोंक कैसपेज़ -3-ऑर्थोलॉग ड्राइस 2,4 को छोड़ देता है और सक्रिय करता है। एपोप्टोसिस के दौरान, प्रभावक कैसपेस सैकड़ों सब्सट्रेट्स को छोड़ देते हैं जिससे सेल 5 की मृत्यु होजाती है।

कैस्पेस को सेल में निष्क्रिय प्रोएंजाइम (ज़िमोजेन्स) के रूप में संश्लेषित किया जाता है। इस रूप में, उनमें एक एन-टर्मिनल प्रोडोमेन होता है, प्रोएंजाइम के मध्य भाग में उत्प्रेरक साइस के साथ एक बड़ा सबयूनिट, और सी-टर्मिनस1 (चित्रा 1) पर एक छोटा सबयूनिट होता है। सक्रियण का तंत्र आरंभकर्ता और प्रभावकारक कैसपेस के बीच भिन्न होता है। सर्जक कैसपेस (कैसपेज़ -9, ड्रोंक) को सक्रियण के लिए डिमराइजेशन की आवश्यकता होती है, जो एक बड़े प्रोटीन कॉम्प्लेक्स में शामिल होने से होता है, जिसे एपोप्टोसोम6 कहा जाता है। एपोप्टोसोम में शामिल होने के लिए, कैस्पेज़ -9 और ड्रोंक एन-टर्मिनल प्रोडोमेन (चित्रा 1) में एक कैसपेज़ सक्रियण और भर्ती डोमेन (CARD) लेते हैं। एपोप्टोसोम घटक Apaf-1 में एक CARD भी होता है और यह Cappase-9 या Dronc को CARD/CARD इंटरैक्शन के माध्यम से एपोप्टोसोम 3,6,7 में भर्ती करता है। जबकि कैस्पेज़ -9 और ड्रोंक को एपोप्टोसोम में प्रोटियोलिटिक रूप से संसाधित किया जा सकता है, यह प्रसंस्करण एंजाइमेटिक गतिविधि 8,9 के लिए पूरी तरह से आवश्यक नहीं है।

इसके विपरीत, प्रभावक कैसपेस (कैस्पेज़ -3, ड्राइस) अपने प्रोडोमेन में कार्ड नहीं लेते हैं और सक्रियण1 के लिए बड़े प्रोटीन परिसरों में शामिल नहीं होते हैं। वे क्रमशः सक्रिय कैस्पेज़ -9 या ड्रोंक1 द्वारा प्रोटियोलिटिक दरार पर निर्भर हैं। सक्रिय प्रभावक कैस्पेज़ दो बड़े और दो छोटे सबयूनिट्स से बना एक टेट्रामर बनाता है, और इस प्रकार इसमें दो उत्प्रेरक साइटें होती हैं (चित्रा 1)। महत्वपूर्ण रूप से इस प्रोटोकॉल के लिए, ई कोलाई में कैस्पेस की पुनः संयोजक अभिव्यक्ति कैसपेस के ऑटो-प्रोसेसिंग और सक्रियण का कारण बनती है, जिसमें ड्राइस10 और ड्रोंक 2,8,9,11,12 शामिल हैं, यहां तक कि एपफ -1 की अनुपस्थिति में भी। यह ऑटो-प्रोसेसिंग पुनः संयोजक कैसपेस प्रोटीन के साथ उम्मीदवार सब्सट्रेट्स के इन विट्रो क्लीवेज परख करने की अनुमति देता है।

कैसपेस न केवल एपोप्टोसिस में शामिल हैं, बल्कि उनके पास कई गैर-एपोप्टोटिक कार्य भी हो सकते हैं, जिनमें प्रसार, भेदभाव, सेल माइग्रेशन, न्यूरोनल छंटाई, जन्मजात प्रतिरक्षा और अन्य 13,14,15 शामिल हैं। वर्तमान में यह अज्ञात है कि गैर-एपोप्टोटिक प्रक्रियाओं के दौरान सक्रिय कैसपेस होने के बावजूद कोशिकाएं कैसे जीवित रह सकती हैं। यह संभव है कि ये कोशिकाएं केवल उप-घातक स्तर16 पर कैसपेस को सक्रिय करती हैं या वे कोशिका के गैर-एपोप्टोटिक डिब्बों जैसे प्लाज्मा झिल्ली17,18 में सक्रिय कैसपेस को अनुक्रमित करती हैं। इसलिए, गैर-एपोप्टोटिक सब्सट्रेट्स की पहचान और सत्यापन से न केवल यह पता चलेगा कि कैसपेस गैर-एपोप्टोटिक प्रक्रियाओं की मध्यस्थता कैसे करते हैं, बल्कि यह समझने में भी मदद कर सकते हैं कि सक्रिय कैसपेस की उपस्थिति में कोशिकाएं कैसे जीवित रह सकती हैं।

कैसपेस सब्सट्रेट के रूप में उम्मीदवार प्रोटीन को आनुवंशिक और जैव रासायनिक तरीकों का उपयोग करके पहचाना जा सकता है। आम सहमति से ड्रोंक दरार साइटों की उपस्थिति के लिए पहचाने गए प्रोटीन की जांच की जा सकती है। यह प्रोटीन अनुक्रम का नेत्रहीन निरीक्षण करके या कैसक्लेव (https://sunflower.kuicr.kyoto-u.ac.jp/~sjn/Cascleave/) 19,20 जैसे अधिक परिष्कृत ऑनलाइन जैव सूचना विज्ञान उपकरणों का उपयोग करके किया जा सकता है। ये उपकरण कैसपेस के नए लक्ष्यों की भविष्यवाणी करने के लिए कैसपेस और संरचनात्मक विचारों के ज्ञात आम सहमति दरार साइटों का उपयोग करते हैं। जबकि कैसक्लेव मानव कैसपेस -1, -3, -6, -7, और -8 से सत्यापित सब्सट्रेट्स की जानकारी को शामिल करता है, फिर भी यह यहां वर्णित उद्देश्यों के लिए भी उपयोगी हो सकता है क्योंकि ये कैसपेस और उनकी आम सहमति दरार साइटें अच्छी तरह से संरक्षित हैं। हालांकि, क्योंकि ड्रोंक क्लीवेज साइट को अच्छी तरह से परिभाषित नहीं किया गया है (दो अध्ययनों ने दो अलग-अलग इष्टतम दरार साइटों, टीएटीडी / ई2 और एलएएलडी9 की पहचान की है), उम्मीदवार सब्सट्रेट्स की जांच ड्राइस सहित अन्य कैसपेज़ क्लीवेज साइट की उपस्थिति के लिए भी की जाती है।

कैसपेस के अनुमानित सब्सट्रेट्स को मान्य करने के लिए, अतिरिक्त परख आवश्यक हैं। इनमें से एक परख यह प्रदर्शन है कि एक दिया गया कैसपेस वास्तव में विट्रो में उम्मीदवार प्रोटीन को छोड़ सकता है। यहां, हम इन विट्रो कैसपेज़ क्लीवेज परख के लिए एक सुविधाजनक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, उम्मीदवार सब्सट्रेट्स को कैस्पेज़ के रूप में ड्रोंक के साथ परीक्षण किया जाता है। उन्हें ड्राइस के सब्सट्रेट के रूप में भी परीक्षण किया जा सकता है। यद्यपि यह प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला कैसपेस ड्रोंक और ड्राइस के लिए लिखा गया है, इसे अन्य जीवों से कैसपेस के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है।

इन कैसपेस द्वारा उत्प्रेरक गतिविधि के नुकसान के कारण इन विट्रो क्लीवेज परख के साथ ड्रोंक और ड्राइस का निष्कर्षण और शुद्धिकरण उसी दिन किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल को पिछलेप्रकाशनों 8,9,11,12,21,22 से संशोधित और अनुकूलित किया गया है। इस प्रोटोकॉल में, चार अलग-अलग कैसपेज़ प्रोटीन को ई कोलाई स्ट्रेन बीएल 21 (डीई 3) पीएलआईएसएस में पुनः संयोजक रूप से व्यक्त किया जाता है। ये प्रोटीन हैं: 6xHis-Droncwt, 6xHis-DroncC318A, 6xHis-Dricewt, और 6xHis-DriceC211A। इन प्रोटीनों में से प्रत्येक को शुद्धिकरण के लिए एन-टर्मिनस पर 6 हिस्टिडाइन अवशेषों (6xHis) के साथ टैग किया गया है। ड्रोंकडब्ल्यूटी और ड्राइसडब्ल्यूटी जंगली प्रकार के प्रोटीन हैं और पुनः संयोजक अभिव्यक्ति पर सक्रिय कैसपेज़ में ऑटो-प्रोसेस कर सकते हैं। ड्रोंकसी 318 ए और ड्राइससी 211 ए ड्रोंक और ड्राइस के उत्परिवर्ती रूपों को एन्कोड करते हैं जो उत्प्रेरक साइस अवशेषों को अला अवशेषों में बदलते हैं। ये निर्माण उत्प्रेरक रूप से निष्क्रिय हैं और ऑटो-प्रोसेस नहीं कर सकते हैं (चित्रा 2 ए देखें)। उनका उपयोग क्लीवेज परख में नियंत्रण के रूप में किया जाता है। क्योंकि ड्राइससी 211 ए ऑटो-प्रोसेस नहीं कर सकता है, इसका उपयोग यहां वर्णित इन विट्रो क्लीवेज परख में ड्रोंकडब्ल्यूटी के लिए मॉडल सब्सट्रेट के रूप में भी किया जाता है।

Protocol

1. बैक्टीरिया में पुनः संयोजक कैसपेस अभिव्यक्ति

  1. मानक प्रोटोकॉल23 का उपयोग करके एन- और / या सी-टर्मिनल टैग (एस) के साथ एक जीवाणु अभिव्यक्ति वेक्टर में रुचि के जीन (कैस्पेस या कथित सब्सट्रेट) को क्लोन करें।
    नोट: टैग पुनः संयोजक प्रोटीन की घुलनशीलता को बढ़ा सकते हैं और पुनः संयोजक प्रोटीन के शुद्धिकरण के लिए उपयोग किए जाते हैं। यहां, ड्रांक, ड्राइस और उनके उत्प्रेरक उत्परिवर्ती को वेक्टर पीईटी 28 ए में क्लोन किया जाता है, जो एक एन-टर्मिनल 6xHis टैग प्रदान करता है (pET28a-6xHis-Droncwt, pET28a-6xHis-DroncC318A, pET28a-6xHis-Dricewt, pET28a-6xHis-DriceC211A); (प्राइमर जानकारी के लिए पूरक तालिका 1 देखें)।
  2. मानक प्रक्रियाओं 23,24 का उपयोग करके रुचि के जीन वाले वैक्टर को सक्षम बीएल 21 (डीई3) पीलिस ई कोलाई कोशिकाओं में बदलें। रूपांतरित बैक्टीरिया का चयन करने के लिए उपयुक्त एंटीबायोटिक (पीईटी 28 ए के मामले में कनामाइसिन) के साथ एलबी एगर प्लेटों पर परिवर्तन मिश्रण को प्लेट करें। (अनुपूरक तालिका 2 देखें।
  3. प्लेट से एक कॉलोनी चुनें और एक हिलने वाले मंच पर 220 आरपीएम पर 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ने के लिए उपयुक्त एंटीबायोटिक युक्त एलबी माध्यम के 5 एमएल में टीका लगाएं।
  4. अगले दिन, एंटीबायोटिक के साथ एलबी माध्यम के 30-50 एमएल (प्रति नमूना) तैयार करें और रात भर विकसित संस्कृति के 1 एमएल जोड़ें। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके600 एनएम (ओडी 600) पर ऑप्टिकल घनत्व 0.1 और 0.2 के बीच होना चाहिए।
  5. एक हिलने वाले मंच पर 220 आरपीएम पर 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति को विकसित करें जब तककि ओडी 600 0.6 तक न पहुंच जाए। ओडी600 को हर घंटे जांचें जब तक कि यह 0.6 तक न पहुंच जाए। इसमें लगभग 2 से 3 घंटे लगते हैं।
  6. प्रोटीन (कैसपेज़) अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए, आईपीटीजी को 0.1-0.2 एमएम की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें (आईपीटीजी स्टॉक से पतला 1: 1,000-1: 500, पूरक तालिका 2 देखें)।
  7. 220 आरपीएम पर 30 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए संस्कृतियों को उगाएं।
    नोट: समय और तापमान इस बात पर निर्भर करते हैं कि किस तरह का प्रोटीन व्यक्त किया जा रहा है और इसकी घुलनशीलता। इन स्थितियों को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है यदि विभिन्न कैसपेस या सब्सट्रेट व्यक्त किए जाते हैं।
  8. 3 घंटे के बाद, 2,000 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में संस्कृतियों को घुमाएं। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें और गोली के साथ आगे बढ़ें।
    नोट: प्रोटोकॉल को इस बिंदु पर रोका जा सकता है और बाद में जारी रखा जा सकता है। बैक्टीरियल छर्रों को -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज किया जा सकता है।

2. छोटे पैमाने पर पुनः संयोजक कैसपेस निष्कर्षण

  1. -80 डिग्री सेल्सियस भंडारण से पेलेट संस्कृतियों के साथ जमे हुए ट्यूबों को हटा दें और गोली को नरम करने के लिए उन्हें 10 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।
  2. 10 मिनट के बाद, 1 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ पिपेट नियंत्रक का उपयोग करके पेलेट युक्त ट्यूबों में ताजा जोड़े गए प्रोटीज इनहिबिटर, 10 मिलीग्राम / एमएल लाइसोजाइम और 50 यू / एमएल बेंजोनेस के साथ पूरक 0.6 एमएल बैक्टीरियल सेल लाइसिस बफर (पूरक तालिका 2) जोड़ें।
  3. एक ही पिपेट टिप के साथ, गोली को ऊपर और नीचे करके तब तक घोलें जब तक कि किसी भी गोली कण के बिना एक स्पष्ट पीला-पीला समाधान दिखाई न दे। बर्फ पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. लाइसेट को उपयुक्त सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट के लिए 17,000 x g पर लाइसेट को सेंट्रीफ्यूज करें।
  5. सुपरनैटेंट को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। यह कैसपेस युक्त कच्चा अर्क है।
  6. ट्यूबों को बर्फ पर रखें और नी-एनटीए अगारोस के साथ शुद्धिकरण के लिए आगे बढ़ें।

3. छोटे पैमाने पर हिस-टैग किए गए कैसपेस शुद्धिकरण

  1. चरण 2.5 से कैसपेज़ अर्क की प्रत्येक ट्यूब में नी-एनटीए अगारोस के 50% घोल का 0.2 एमएल जोड़ें। ट्यूबों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एंड-ऑन-एंड रोटेटर पर घुमाएं।
  2. 1 घंटे के बाद, नी-एनटीए अगारोस के साथ अर्क को 1 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन कॉलम में जोड़ें, जिसमें नोक बरकरार है, जिसे एक रैक में रखा गया है। इसे 5 मिनट के लिए छोड़ दें।
  3. 5 मिनट के बाद, स्तंभों की टोपी को हटा दें और गुरुत्वाकर्षण प्रवाह द्वारा सतह पर तैरने वाले को बाहर निकलने दें।
  4. नी-एनटीए अगारोस के पैक किए गए राल को परेशान किए बिना कॉलम में वॉश बफर (पूरक तालिका 2) के 1 एमएल को सावधानीपूर्वक जोड़ें और इसे गुरुत्वाकर्षण प्रवाह के माध्यम से धोएं।
  5. धोने का चरण तीन बार करें।
  6. कैस्पेस के क्षालन के लिए, वॉश बफर के पूरी तरह से सूखने के बाद कॉलम के संग्रह नलिका के नीचे 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब रखें।
  7. प्रत्येक कॉलम में 0.5 एमएल क्षालन बफर (उपयोग से तुरंत पहले 1 एक्स प्रोटीज इनहिबिटर के साथ पूरक) जोड़ें और 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में एलुएट एकत्र करें।
    नोट: ठीक शुद्ध एलुएट रंग में पारदर्शी होगा।
  8. बर्फ पर एलुएट्स रखें और ब्रैडफोर्ड परख25 द्वारा प्रोटीन की एकाग्रता को मापें। एसडीएस-पेज द्वारा शुद्ध कैसपेस की शुद्धता / समरूपता की पुष्टि करें, इसके बाद कूमासी ब्लू स्टेनिंग26।
    नोट: 50 एमएल एलबी कल्चर की उपज कैस्पेस प्रोटीन के 0.5 और 1.5 मिलीग्राम के बीच होती है। यह देखते हुए कि क्षालन के लिए 0.5 एमएल क्षालन बफर का उपयोग किया जाता है, एकाग्रता 1 से 3 मिलीग्राम / एमएल तक होती है। लाइसिस और शुद्धिकरण के एक ही दिन में इन विट्रो क्लीवेज परख के लिए शुद्ध कैसपेज़ एलुएट्स का उपयोग करना महत्वपूर्ण है क्योंकि ये कैसपेज़ तैयारी रात में गतिविधि खो देती हैं।

4. सेल-मुक्त अभिव्यक्ति प्रणालियों में कथित कैसपेस सब्सट्रेट की अभिव्यक्ति

नोट: इस प्रोटोकॉल में, ड्राइस, ड्रांक का प्राकृतिक सब्सट्रेट, ई कोलाई में पुनः संयोजक अभिव्यक्ति (ऊपर अनुभाग 3 देखें) और खरगोश रेटिकुलोसाइट लाइसेट (आरआरएल), एक स्तनधारी कोशिका-मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली (यह खंड, नीचे देखें) दोनों में अभिव्यक्ति द्वारा तैयार किया जाता है।

  1. मानक प्रक्रियाओं23 का उपयोग करके टी 7, टी 3, या एसपी 6 प्रमोटर युक्त अभिव्यक्ति वेक्टर में कथित सब्सट्रेट के जीन को क्लोन करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, ड्राइससी 211 ए को मॉडल सब्सट्रेट के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है और वेक्टर पीटी 7सीएफई 1-एन-माइक में क्लोन किया गया था, जो जीन अभिव्यक्ति के लिए एक टी 7 प्रमोटर को वहन करता है और इम्यूनोब्लोटिंग द्वारा पता लगाने के लिए एन-टर्मिनल माइक-टैग के साथ कथित प्रोटीन सब्सट्रेट को टैग करता है।
  2. आरआरएल में, उम्मीदवार सब्सट्रेट्स को रेडियोधर्मी या गैर-रेडियोधर्मी रूप से संश्लेषित किया जा सकता है।
    1. गैर-रेडियोधर्मी संश्लेषण: 0.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में, आरआरएल के 25 μL, प्रतिक्रिया बफर के 2 μL, एमिनो एसिड मिश्रण के 0.5 μL -माइनस ल्यूसीन (1 mM), अमीनो एसिड मिश्रण-माइनस मेथिओनिन (1 mM), 1 μL Ribonuclease इनहिबिटर (40 U/μL) जोड़ें, 2 μL of T7-RNA पोलीमरेज़ (0.5 μl of T7-RNA पोलीमरेज़)। प्रतिक्रिया की अंतिम मात्रा को 50 μL तक समायोजित करने के लिए न्यूक्लियस-मुक्त पानी जोड़ें। धीरे-धीरे पिपेट टिप के साथ पाइपिंग या हिलाकर घटकों को मिलाएं, और संक्षेप में नीचे घुमाएं।
      नोट: आरआरएल लाइसेट में अंतर्जात प्रोटीन के 100-200 मिलीग्राम / एमएल होते हैं। इन विट्रो अनुवाद प्रतिक्रियाओं के लिए, 50% एकाग्रता पर आरआरएल जोड़ें (यहां 25 μL / 50 μL प्रतिक्रिया)।
    2. रेडियोधर्मी संश्लेषण: 0.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में, आरआरएल लाइसेट का 25 μL, प्रतिक्रिया बफर का 2 μL, एमिनो एसिड मिश्रण का 0.5 μL- माइनस मेथिओनिन (1 mM), राइबोन्यूक्लिज़ इनहिबिटर का 1 μL (40 U/μL), डीएनए टेम्प्लेट का 2 μL (0.5 μL/ प्रतिक्रिया की अंतिम मात्रा को 50 μL तक समायोजित करने के लिए न्यूक्लियस-मुक्त पानी जोड़ें। धीरे-धीरे पिपेट टिप के साथ पाइपिंग या हिलाकर घटकों को मिलाएं, और संक्षेप में नीचे घुमाएं। रेडियोधर्मी अपशिष्ट कंटेनर में युक्तियों और ट्यूबों का निपटान करें।
      नोट: ल्यूसीन के बिना अमीनो एसिड मिश्रण न जोड़ें। pT7CFE1 वेक्टर प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए T7 प्रमोटर का उपयोग करता है। अन्य वैक्टर टी 3 या एसपी 6 प्रमोटरों का उपयोग करते हैं। उस स्थिति में, टी 7 आरएनए पोलीमरेज़ के बजाय टी 3 या एसपी 6 आरएनए पोलीमरेज़ का उपयोग किया जाना चाहिए। कृपया सुनिश्चित करें कि डीएनए टेम्पलेट उच्च शुद्धता का है।
  3. प्रतिक्रिया को 90 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  4. 10 सेकंड के लिए संक्षेप में स्पिन करें और ट्यूबों को बर्फ पर रखें। एसडीएस-पेज और इम्यूनोब्लोटिंग /ऑटोरेडियोग्राफी द्वारा आरआरएल में कथित सब्सट्रेट के अभिव्यक्ति स्तर की जांच करें।
    नोट: दरार प्रतिक्रिया में जोड़े गए आरआरएल अर्क की मात्रा प्रोटीन की मात्रा पर आधारित होनी चाहिए जिसे पहचान विधि (या तो इम्यूनोब्लोटिंग या एस35 ऑटोरेडियोग्राफी) द्वारा पता लगाया जा सकता है। इन विट्रो क्लीवेज परख (अगला खंड) पर आगे बढ़ें या इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

5. आरआरएल के साथ उत्पन्न सब्सट्रेट के साथ इन विट्रो क्लीवेज परख

  1. उत्पन्न कथित सब्सट्रेट (ओं) को लें, जैसा कि खंड 4 में वर्णित है। इस प्रोटोकॉल में, एन-माइक-ड्राइससी 211 ए का उपयोग मॉडल सब्सट्रेट के रूप में किया जाता है।
  2. कथित सब्सट्रेट के अभिव्यक्ति स्तर के आधार पर (इम्यूनोब्लॉट या ऑटोरेडियोग्राफी विश्लेषण द्वारा अलग से निर्धारित किया जाना है, चरण 4.4 देखें), दरार परख में रुचि के प्रोटीन के साथ प्रोग्राम किए गए आरआरएल के 1-10 μL का उपयोग करें।
  3. अनुभाग 1, 2 और 3 में उत्पन्न शुद्ध कैसपेज़ प्रोटीन के 10 μg जोड़ें।
  4. कैसपेज़ परख बफर के साथ कुल प्रतिक्रिया मात्रा को 50 μL तक लाएं।
  5. 3 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में प्रतिक्रियाओं को इनक्यूबेट करें। दरार परख में उपयुक्त नियंत्रण शामिल करना सुनिश्चित करें। यहां, उत्प्रेरक उत्परिवर्ती ड्रोनसी 318 ए का उपयोग नियंत्रण के रूप में किया जाता है।
  6. 3 घंटे के बाद, बर्फ पर ट्यूबों को स्थानांतरित करके प्रतिक्रियाओं को रोकें।
  7. 50 mM DTT युक्त LDS नमूना बफर की एक मात्रा जोड़ें। एलडीएस नमूना बफर को जोड़ने के साथ प्रतिक्रिया पूरी तरह से बंद हो जाती है।
  8. नमूनों को 10 मिनट के लिए गर्मी ब्लॉक में 75 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  9. जल्दी से स्पिन करें, फ्लिक करके मिलाएं, प्रति नमूना 24 μL लोड करें और SDS-PAGE चलाएं (अनुभाग 7 देखें) या नमूने को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

6. बैक्टीरियल रूप से व्यक्त पुनः संयोजक सब्सट्रेट प्रोटीन के साथ इन विट्रो क्लीवेज परख

  1. 0.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में शुद्ध उम्मीदवार सब्सट्रेट के 10 μg जोड़ें (यहां 6xHis-DriceC211A, खंड 1, 2 और 3 में उत्पन्न)।
  2. खंड 1 और 2 में उत्पन्न शुद्ध कैसपेज़ प्रोटीन के 10 μg जोड़ें। कैसपेज़ परख बफर का उपयोग करके कुल मात्रा को 50 μL तक लाएं।
  3. चरण 5.5 से 5.9 का पालन करें।

7. एसडीएस-पेज और इम्यूनोब्लोटिंग

  1. क्लीवेज प्रतिक्रियाओं (24 μL) को 4% -12% ट्रिस-ग्लाइसिन या बिस-ट्रिस ग्रेडिएंट जैल (सामग्री की तालिका) पर लोड करें और मानक प्रक्रियाओं27,28 का उपयोग करके परिणामों की कल्पना करने के लिए प्रोटीन वैद्युतकणसंचलन और इम्यूनोब्लोटिंग (या एस35-लेबल सब्सट्रेट्स का उपयोग करके ऑटोरेडियोग्राफी) करें।
    नोट: यहां, इस प्रोटोकॉल में, मोप्स रनिंग बफर और एलडीएस लोडिंग बफर के साथ बिस-ट्रिस ग्रेडिएंट जैल का उपयोग किया गया था। सामान्य तौर पर, ट्रिस-ग्लाइसिन जैल के आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले पेज प्रोटोकॉल ट्राइस-ग्लाइसिन-एसडीएस रनिंग बफर और एसडीएस-लोडिंग बफर का उपयोग करके अच्छी तरह से काम करते हैं।

Representative Results

यह प्रोटोकॉल ई कोलाई में कैसपेज़ प्रोटीन प्रेरण, पुनः संयोजक ड्रोसोफिला कैसपेस ड्रोंक और ड्राइस के शुद्धिकरण, उम्मीदवार सब्सट्रेट्स के संश्लेषण, और उम्मीदवार सब्सट्रेट्स (यहां ड्राइससी 211 ए) और कैस्पेज़ ड्रोंक के साथ इन विट्रो क्लीवेज प्रतिक्रिया के लिए चरण-दर-चरण निर्देश प्रदान करता है। उत्प्रेरक उत्परिवर्ती ड्राइससी 211 ए को इस परख में मॉडल सब्सट्रेट के रूप में उपयोग किया गया था क्योंकि इसमें ऑटो-प्रोसेसिंग गतिविधि (चित्रा 2 ए) नहीं है और जब तक इसे ड्रोंकडब्ल्यूटी द्वारा नहीं किया जाता है तब तक इसकी लंबाई पूरी होती है। ड्राइससी 211 ए को हमेशा एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाना चाहिए ताकि यह सत्यापित किया जा सके कि ड्रोंकडब्ल्यूटी तैयारी में एंजाइमेटिक गतिविधि है।

चित्रा 2 ए पुनः संयोजक कैसपेस की अभिव्यक्ति और शुद्धि का एक प्रतिनिधि उदाहरण प्रदान करता है। चार अलग-अलग पुनः संयोजक कैसपेस को प्रेरित और शुद्ध किया गया था: 6xHis-Droncwt, 6xHis-DroncC318A, 6xHis-Dricewt, और 6xHis-DriceC211A। शुद्ध कैसपेस को एसडीएस-पेज, इम्यूनोब्लॉटेड द्वारा चलाया गया था, और धब्बा को एंटी-हिज एंटीबॉडी (पतला 1: 5,000; इसके बाद एंटी-माउस आईजीजी, एचआरपी-लिंक्ड एंटीबॉडी (1: 10,000)) के साथ जांच की गई थी। असंसाधित 6xHis-Dronc (proDronc) 55 kDA (लेन 2) के सापेक्ष आणविक भार (MWr) पर चलता है और असंसाधित 6xHis-Drice (proDrice) में 35 kDA (लेन 4) का MWR है। कैसपेस का ऑटो-प्रोसेसिंग छोटे मेगावाटआर के बैंड की उपस्थिति से दिखाई देता है जो एन-टर्मिनस पर हिस-टैग की उपस्थिति के कारण कैसपेस के बड़े सबयूनिट्स का प्रतिनिधित्व करता है (चित्रा 1)। 6x-Dronc के मामले में, बड़े सबयूनिट में 40 kDA (लेन 1) का MWR होता है। 6x-ड्राइस का बड़ा सबयूनिट 23 kDA (लेन 3) पर चलता है। उत्प्रेरक उत्परिवर्ती 6xHis-DroncC318A और 6xHis-DriceC211A स्वत: प्रक्रिया करने में विफल रहते हैं और केवल पूर्ण लंबाई वाले प्रोटीन (लेन 2 और 4) के रूप में पता लगाने योग्य होते हैं।

चित्र 2B यह प्रदर्शित करने के लिए कि बैक्टीरियल रूप से उत्पादित और शुद्ध 6xHis-Droncwt तैयारी में एंजाइमेटिक गतिविधि है, इस प्रोटोकॉल में वर्णित एक इन विट्रो क्लीवेज परख का प्रदर्शन किया गया था। नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, उत्प्रेरक उत्परिवर्ती 6xHis-DroncC318A का उपयोग किया गया था। सब्सट्रेट आरआरएल-जनित एन-माइक-ड्राइससी 211 ए था, जिसे एन-टर्मिनस पर माइक-टैग के साथ टैग किया गया है। इन विट्रो क्लीवेज प्रतिक्रिया के बाद, प्रोटीन को एसडीएस-पेज द्वारा अलग किया गया, इम्यूनोब्लॉट किया गया और धब्बों को एंटी-माइक एंटीबॉडी (पतला 1: 1,000) के साथ इनक्यूबेट किया गया, इसके बाद एंटी-माउस आईजीजी, एचआरपी-लिंक्ड एंटीबॉडी (1: 10,000)) के साथ एन-माइक-ड्राइससी 211 ए का पता लगाया गया। सब्सट्रेट के पूर्ण लंबाई, असंसाधित रूप की तुलना में कैसपेज़ की सफल दरार और इस प्रकार एंजाइमेटिक गतिविधि को छोटे मेगावाटआर के कम से कम एक बैंड की उपस्थिति से प्रदर्शित किया जा सकता है। असंसाधित, पूर्ण लंबाई वाले एन-माइक-ड्राइससी 211 ए में 40 केडीए (लेन 2 और 4) का मेगावाटआर है, जबकि संसाधित एन-माइक-ड्राइससी 211 ए का बड़ा सबयूनिट 30 केडीए (लेन 3) पर चलता है। लेन 1 अनप्रोग्राम्ड आरआरएल लाइसेट (कोई प्लास्मिड / ट्रांसक्रिप्ट नहीं जोड़ा गया) का प्रतिनिधित्व करता है। लेन 2 आरआरएल अभिव्यक्ति द्वारा ड्राइससी 211 ए के इन विट्रो उत्पादन को दर्शाता है। लेन 3 में 6xHis-Droncwt के साथ इन विट्रो क्लीवेज प्रतिक्रिया होती है। लेन 4 में 6xHis-DroncC318A के साथ इन विट्रो क्लीवेज प्रतिक्रिया होती है।

चित्र 2C इस प्रोटोकॉल के अनुसार पुनः संयोजक और शुद्ध कैसपेज़ (6xHis-Droncwt और 6x-His-DroncC318A) और सब्सट्रेट (6xHis-DriceC211A) दोनों का उपयोग करने वाली एक इन विट्रो क्लीवेज प्रतिक्रिया का विश्लेषण SDS-PAGE और इम्यूनोब्लॉट द्वारा किया गया था। दरार प्रतिक्रिया के विश्लेषण के लिए, एंटी-क्लीवर ड्राइस एंटीबॉडी (पतला 1: 5,000; इसके बाद एंटी-खरगोश आईजीजी, एचआरपी-लिंक्ड एंटीबॉडी (1: 10,000)) का उपयोग इस इम्यूनोब्लोट में किया गया था। एंटी-क्लीवर ड्राइस एंटीबॉडी 6xHis-DriceC211A के बड़े सबयूनिट (23 kDA) में अपने नियो-एपिटोप का पता लगाता है, केवल 6xHis-Droncwt (लेन 1) द्वारा प्रसंस्करण के बाद। उत्प्रेरक उत्परिवर्ती 6xHis-DroncC318A इस परख में 6xHis-DriceC211A को संसाधित करने में असमर्थ है और पूर्ण लंबाई 6xHis-DriceC211A 35 kDA (लेन 2) के बेहोश असंसाधित बैंड के रूप में दिखाई देता है।

Figure 1
चित्र 1: आरंभकर्ता कैसपेज़ -9 और ड्रोंक और प्रभावक कैसपेस कैसपेज़ -3 और ड्राइस की डोमेन संरचना। CARD - कैसपेस सक्रियण और भर्ती डोमेन; साइस - उत्प्रेरक सिस्टीन अवशेषों का सापेक्ष स्थान; एल - बड़े सबयूनिट; एस - छोटा सबयूनिट। एन-टर्मिनल प्रोडोमेन का स्थान इंगित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
(ए) शुद्ध पुनः संयोजक 6xHis-Dronc और 6xHis-ड्राइस तैयारी का इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण, एंटी-हिज एंटीबॉडी के साथ जांच की गई। असंसाधित (प्रोड्रोनसी और प्रोड्रिस) और क्लीवर 6xHis-Dronc और 6xHis-ड्राइस तीरों द्वारा इंगित किए जाते हैं। एमडब्ल्यू मार्कर बाईं ओर इंगित किए गए हैं। (ख) आरआरएल-जनित एन-माइक-ड्राइस की इन विट्रो क्लीवेज अभिक्रिया का इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण कैसपेस 6xHis-Droncwt (लेन 3) या 6x-His-DroncC318A (लेन 4) के साथ एक एंटी-माइक एंटीबॉडी के साथ जांच की गई। अनप्रोग्राम्ड और प्रोग्राम्ड (एन-माइक-ड्राइससी 211 ए) आरआरएल प्रतिक्रियाओं को लेन 1 और 2 में लोड और अलग किया जाता है। असंसाधित (प्रोड्रिस) और क्लीवर एन-माइक-ड्राइस को तीर द्वारा इंगित किया जाता है। एमडब्ल्यू मार्कर बाईं ओर इंगित किए गए हैं। (ग) जीवाणु द्वारा व्यक्त और शुद्ध पुनः संयोजक 6xHis-DriceC211A के साथ कैसपेस 6xHis-Droncwt (लेन 1) या 6x-His-DroncC318A (लेन 2) की इन विट्रो क्लीवेज प्रतिक्रिया का इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण, एंटी-क्लीवर ड्राइस एंटीबॉडी के साथ जांच की गई। पूर्ण लंबाई (प्रोड्राइस) और क्लीवर 6xHis-ड्राइसC211A तीर द्वारा इंगित किए जाते हैं। एमडब्ल्यू मार्कर बाईं ओर इंगित किए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक तालिका 1: इस तालिका में पीईटी 28 ए वेक्टर में क्लोनिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमर शामिल हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक तालिका 2: इस तालिका में बफर और मीडिया की संरचना शामिल है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

कैस्पेस और कैसपेज़ फ़ंक्शन के बारे में हमारे ज्ञान का बड़ा हिस्सा पिछले तीन दशकों के दौरान एपोप्टोसिस में गहन काम से प्राप्त हुआ है। यह बहुत अच्छी तरह से स्थापित है कि सर्जक कैसपेस प्रोटियोलिटिक रूप से प्रभावक कैसपेस को संसाधित करते हैं, और एपोप्टोसिस 5,29 के दौरान सैकड़ों प्रोटीनों को प्रभावक कैस्पेस सब्सट्रेट के रूप में पहचाना गया है। इसके विपरीत, गैर-एपोप्टोटिक प्रक्रियाओं के लिए कैसपेस के कार्य के बारे में बहुत कम जाना जाता है और वे कौन से गैर-एपोप्टोटिक सब्सट्रेट्स संसाधित कर रहे हैं। यह कल्पनीय है कि आरंभकर्ता कैस्पेस यहां प्रमुख निर्णय निर्माता हैं। एपोप्टोसिस के दौरान, वे कोशिका मृत्यु के कारण प्रभावकारक कैसपेस को सक्रिय करते हैं। हालांकि, गैर-एपोप्टोटिक प्रक्रियाओं को ट्रिगर करने के लिए, वे विभिन्न प्रोटीनों (प्रभावकारक कैसपेस के अलावा) को सक्रिय कर सकते हैं, जो गैर-एपोप्टोटिक प्रक्रिया को नियंत्रित करते हैं। यह प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला 17,30 में सर्जक कैसपेज़ ड्रोंक के सब्सट्रेट के रूप में उम्मीदवार प्रोटीन का परीक्षण करता है।

दरार परख में परीक्षण किए जाने वाले सब्सट्रेट्स का उत्पादन या तो इन विट्रो स्तनधारी सेल-मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली जैसे आरआरएल या ई कोलाई में पुनः संयोजक अभिव्यक्ति द्वारा किया जा सकता है। बैक्टीरियल अभिव्यक्ति पर आरआरएल का उपयोग करके इन विट्रो अभिव्यक्ति के लिए कई फायदे हैं। आरआरएल अभिव्यक्ति प्रोटोकॉल सरल और तेज़ है, जिससे समानांतर में कई अलग-अलग सब्सट्रेट तैयार किए जा सकते हैं। कई मामलों में, रुचि के प्रोटीन वाले आरआरएल अर्क को क्लीवेज परख में उपयोग से पहले -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है (हालांकि इसे प्रत्येक सब्सट्रेट के लिए अलग से निर्धारित करने की आवश्यकता होती है)। कथित सब्सट्रेट को एस35-मेट के साथ लेबल किया जा सकता है, जो एसडीएस-पेज के बाद ऑटोरेडियोग्राफी द्वारा आसान विश्लेषण की अनुमति देता है। यह विशेष रूप से उपयोगी है, अगर कोई सब्सट्रेट-विशिष्ट एंटीबॉडी उपलब्ध नहीं है। वैकल्पिक रूप से, यदि एस35-मेट लेबलिंग वांछित नहीं है, तो कथित सब्सट्रेट को फ्लैग, एचए या माइक टैग जैसे सामान्य टैग के साथ टैग किया जा सकता है, जो इम्यूनोब्लोटिंग द्वारा कैसपेज़ दरार का पता लगाने की अनुमति देता है।

इस बात पर दृढ़ता से जोर देने की आवश्यकता है कि इस प्रोटोकॉल की सफलता पुनः संयोजक ड्रोंक और ड्राइस प्रोटीन के सावधानीपूर्वक और सुसंगत शुद्धिकरण पर निर्भर करती है। दुर्भाग्य से, इन प्रोटीनों को संग्रहीत नहीं किया जा सकता है - यहां तक कि अल्पकालिक भी नहीं - न तो फ्रिज में और न ही जमे हुए। वे किसी भी संग्रहीत रूप में रात भर एंजाइमेटिक गतिविधि खो देते हैं। इसलिए, उन्हें क्लीवेज परख के दिन ताजा तैयार करने की आवश्यकता है। परीक्षण किए जा रहे उम्मीदवार प्रोटीन (ओं) के बावजूद, ड्राइससी 211 ए को हमेशा ड्रोंकडब्ल्यूटी तैयारी की एंजाइमेटिक गतिविधि को मान्य करने के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाना चाहिए (चित्रा 2 बी, सी देखें)। वैकल्पिक रूप से, ड्रोंक और ड्राइस तैयारी की गतिविधि का परीक्षण फ्लोरोजेनिक सिंथेटिक टेट्रापेप्टाइड सब्सट्रेट्स 2,9,31 के इन विट्रो क्लीवेज द्वारा भी किया जा सकता है।

यदि एंटीबॉडी का उपयोग उम्मीदवार सब्सट्रेट्स का पता लगाने के लिए किया जाता है, तो उन्हें उपयोगकर्ता32,33 द्वारा मान्य करने की आवश्यकता होती है। यह व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी पर भी लागू होता है जो फ्लैग, एचए, माइक या अन्य जैसे एपिटोप टैग का पता लगाते हैं। खराब एंटीबॉडी गुणवत्ता महत्वपूर्ण परिणामों को अस्पष्ट कर सकती है। अलग-अलग टैग के साथ एन- और सी-टर्मिनस दोनों पर उम्मीदवार सब्सट्रेट्स की डबल-एपिटोप-टैगिंगकी भी सिफारिश की जाती है। यदि दरार होती है, तो डबल टैगिंग दोनों क्लीवेज उत्पादों का पता लगाने में मदद करती है और यह स्पष्ट करने में मदद कर सकती है कि दरार एक या अधिक साइटों पर होती है या नहीं।

जबकि यह प्रोटोकॉल आसानी से ड्रोंक, ड्राइस के ज्ञात जैविक सब्सट्रेट को मान्य करता है, सीमाएं भी हैं। एक सीमा यह है कि यह पुनः संयोजक प्रोटीन के साथ एक इन विट्रो प्रोटोकॉल है। इन परखों में, कैसपेस एक गैर-शारीरिक रूप से उच्च सांद्रता पर मौजूद होते हैं, जो इस अवलोकन से स्पष्ट है कि वे ई कोलाई में अनायास ऑटो-प्रोसेस कर सकते हैं। सहज ऑटो-प्रोसेसिंग आमतौर पर शारीरिक स्थितियों के तहत नहीं होती है। यह उच्च कैसपेस एकाग्रता नकली गतिविधि का कारण बन सकती है जिसके परिणामस्वरूप गलत सकारात्मक हो सकते हैं। इन विट्रो क्लीवेज प्रतिक्रिया में कैसपेज़ एकाग्रता को कम करके झूठी सकारात्मकता को समाप्त किया जा सकता है। इसके अलावा, जैसा कि नीचे अधिक विस्तार से उल्लिखित है, वास्तविक सब्सट्रेट्स की पुष्टि करने और झूठे सकारात्मक को खत्म करने के लिए अतिरिक्त परख आवश्यक हैं।

पुनः संयोजक कैसपेस में वैसी विशिष्टता नहीं हो सकती है जितनी विवो में उनके सामान्य सेलुलर वातावरण में होती है। उदाहरण के लिए, कैस्पेस की गतिविधि को पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों द्वारा संशोधित किया जा सकता है। ये पुनः संयोजक प्रोटीन पर मौजूद नहीं हैं। इसके अलावा, विवो में, ड्रोंक सहित सर्जक कैसपेस को एपोप्टोसोम जैसे बड़े प्रोटीन परिसरों में शामिल किया जाता है। इस प्रोटोकॉल की शर्तों के तहत, एपोप्टोसोम का गठन हासिल नहीं किया जाता है। इसके लिए ड्रोसोफिला अपाफ -1 (उर्फ डार्क या एचएसी -1) 35-37 की पुनः संयोजक अभिव्यक्ति की आवश्यकता होगी, जिसकी अपनी चुनौतियां हैं। इसलिए, इन विट्रो में, ड्रोंक में वही विशिष्टता नहीं हो सकती है जो विवो में है।

यह भी कल्पनीय है कि ड्रोंक को गैर-एपोप्टोटिक प्रक्रियाओं के लिए एक अलग प्रोटीन कॉम्प्लेक्स में शामिल किया गया है। यह ड्रोंक को एक अलग दरार विशिष्टता प्रदान कर सकता है, जो यह भी समझा सकता है कि ड्रोंक गैर-एपोप्टोटिक स्थितियों के तहत एपोप्टोसिस को प्रेरित क्यों नहीं करता है। इससे संबंधित, CasCleave नए कैसपेज़ सब्सट्रेट्स की भविष्यवाणी करने के लिए ज्ञात दरार आम सहमति साइटों का उपयोग करता है। हालांकि, यह अज्ञात है कि क्या गैर-एपोप्टोटिक प्रक्रियाओं के लिए एक ही दरार आम सहमति साइटों का भी उपयोग किया जाता है। वास्तव में, हाल ही में, यह दिखाया गया था कि कैस्पेज़ -3 चूजा भ्रूण38 में विकासशील श्रवण ब्रेनस्टेम में एक गैर-एपोप्टोटिक प्रक्रिया के दौरान अपनी पसंदीदा आम सहमति साइट को बदलता है। इसी तरह, यदि सर्जक कैसपेस को विभिन्न प्रोटीन परिसरों में शामिल किया जाता है, तो उनकी एक अलग विशिष्टता हो सकती है और इस प्रकार विभिन्न आम सहमति अनुक्रमों पर छोड़ सकते हैं।

ये सीमाएं बताती हैं कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित इन विट्रो क्लीवेज परख पर पूरी तरह से भरोसा करना पर्याप्त नहीं है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त परिणामों को और मान्य करने के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण नियोजित किए जाने चाहिए। आदर्श रूप से, विवो परख में निम्नलिखित प्रश्नों को संबोधित करने के लिए उपयोग किया जाना चाहिए: क्या विवो में गैर-एपोप्टोटिक प्रक्रिया के दौरान उम्मीदवार प्रोटीन प्रोटियोलिटिक रूप से संसाधित होता है? यदि हां, तो क्या विवो और इन विट्रो में एक ही क्लीवेज साइट का उपयोग किया जाता है? यदि दरार साइट के म्यूटेनेसिस द्वारा दरार अवरुद्ध हो जाती है तो परिणाम क्या होगा? क्या उम्मीदवार सब्सट्रेट का प्रसंस्करण कैसपेस पर निर्भर है, और यदि हां, तो कौन सा? गैर-एपोप्टोटिक प्रक्रिया के लिए दरार के टुकड़ों की भूमिका क्या है? इन सवालों को मानक आनुवंशिक और ट्रांसजेनिक तरीकों का उपयोग करके सी एलिगेंस और ड्रोसोफिला जैसे आनुवंशिक मॉडल जीवों में आसानी से संबोधित किया जा सकता है।

सारांश में, यह प्रोटोकॉल एंजाइमेटिक रूप से सक्रिय कैसपेस का उत्पादन करने के लिए एक विश्वसनीय और सुसंगत विधि का वर्णन करता है, विशेष रूप से ड्रोसोफिला कैसपेस ड्रोंक और ड्राइस। इस प्रोटोकॉल का अंतिम लक्ष्य यह जांचना है कि क्या ड्रोंक विट्रो में उम्मीदवार सब्सट्रेट्स को छोड़ सकता है, जिन्हें आनुवंशिक, जैव रासायनिक या जैव सूचना विज्ञान दृष्टिकोण द्वारा पहचाना गया था। जैसा कि पिछले पैराग्राफ में बताया गया है, विवो में कैसपेज़ सब्सट्रेट के रूप में इन प्रोटीनों को मान्य करने के लिए अतिरिक्त परख की आवश्यकता होती है। मेटाज़ोआ में कैसपेज़ जीन के संरक्षण की डिग्री को देखते हुए, इस प्रोटोकॉल को अन्य जीवों से कैसपेस के लिए भी अनुकूलित करना संभव होना चाहिए।

Disclosures

लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी हित घोषित नहीं किया है।

Acknowledgments

हम प्रयोगशाला में प्रोटोकॉल स्थापित करने में मदद के लिए डॉ एलिफ कंबर-काया को धन्यवाद देना चाहते हैं। गाइ साल्वेसेन ने कृपया ड्राइससी 211 ए उत्परिवर्ती9 प्रदान किया। इस काम को अनुदान संख्या 2R35GM118330 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) के राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान (NIGMS) से MIRA पुरस्कार द्वारा वित्त पोषित किया गया था। अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में फंडर्स की कोई भूमिका नहीं थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ampicillin Fisher BP1760-25
Anti-His antibody Sigma-Aldrich MA1-21315
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell signaling 7076P2
Anti-Myc antibody Santa Cruz Biotechnology sc-40
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell signaling 7074P2
Benchtop Centrifuge Eppendorf 5415 R
Benzonase Sigma-Aldrich E1014-5KU
BioPhotometer Eppendorf #6131
BL21 (DE3) pLysS Competent Cells Promega L1195
Centrifuge rotor Beckman Coulter JA-25.50
CHAPS  Sigma-Aldrich C3023-1G
ChemiDoc with image software Bio-Rad Universal Hood II For Chemiluminiscence imaging
Chemiluminiscence Substrate Thermofisher Scientific 34095 For Chemiluminiscence imaging
Cleaved Drosophila ICE (drICE) (Asp230) Antibody Cell Signaling Technology 9478S
Disposable cuvettes Fisher Scientific 14955128 Used to measure bacterial growth and protein concentration
Dithiothreitol (DTT) Bio-Rad #1610610
Erlenmeyer flasks, 1000 mL Millipore sigma CLS49801L For LB agar media preparation and autoclaving
Erlenmeyer flasks, 250 mL Millipore sigma CLS4980250 For bacterial culture growth and induction.
Ethylene-diamine-tetra-acetic Acid (EDTA) Sigma-Aldrich E5134
Gel extraction kit Qiagen 28704
Gel tank SDS-PAGE system Thermofisher Scientific STM1001
Glycine Sigma-Aldrich G8898
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) Thermofisher scientific 87786
HEPES Sigma-Aldrich H3375
His-Drice-pET28a  This study N/A Available from authors
His-DriceC211A-pET28a  This study N/A Available from authors
His-Dronc-pET28a  This study N/A Available from authors
His-DroncC318A-pET28a  This study N/A Available from authors
Imidazole Sigma-Aldrich I2399-100G
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Thermofisher Scientific FERR0392
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5
LB Agar, Miller (Powder) Fisher Scientific BP1425-500
LB Broth, Miller Fisher Scientific BP1426-500
Lysozyme Thermofisher Scientific 90082
Microbiological plate incubator Fisher Scientific 11-690-650D For colony growth after transformation
Microcentrifuge tubes, 0.5 mL Eppendorf 22363611
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL Eppendorf 22363204
Midiprep kit Qiagen 12243
Mini tube rotator Fisher Scientific 05-450-127 for mixing bacterial lysates and Ni-NTA agarose
Miniprep kit Qiagen 27106
Motorized Pipette Controller Gilson F110120 For using serological pipettes
NaH2PO4 Fisher Scientific BP330-1
Ni-NTA Agarose Qiagen 30210
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Midi Protein Gel, 20-well Thermofisher Scientific WG1402BOX
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) Thermofisher Scientific NP0007
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20x) Thermofisher Scientific NP0001
NuPAGE Transfer Buffer (20x) Invitrogen NP00061
Orbital shaking incubator with temperature control New Brunswick Scientific C25 incubator shaker
Petridish 100 mm x 15 mm Fisher Scientific FB0875712
Plating beads Zymo research S1001 For spreading culture on AmpR/KanR plates
Polypropylene Columns (1 mL) Qiagen 34924 For purification of His-tagged proteins
Precision Plus Protein Standards Bio-Rad #161-0374
Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad #5000006
pT7CFE1-NMyc Thermofisher Scientific 88863 For cloning substrates for RRL expression
PVDF membrane Invitrogen LC2007
14 mL Polypropylene round bottom tubes Fisher Scientific 352029 For growing plasmid cultures
QiaRack Qiagen 19095 For holding polypropylene columns during purification
Refrigerated High speed Centrifuge Beckman Coulter Avanti J-25
rRNasin Ribonuclease Inhibitor Promega N251A For RRL expression
Sodium chloride Fisher Scientific BP358-212
Sodium Hydroxide Fisher Scientific BP359-500
Sterile Falcon tubes, 15 mL Fisher Scientific 05-527-90
Sterile Falcon tubes, 50 mL Fisher Scientific 14-959-49A
Sucrose Sigma-Aldrich S70903-250G
1 mL Serological Pipets, Sterile celltreat 229001B For bacterial cell lysis in 50 mL tubes
TnT Coupled Reticulocyte Lysate -T7 Promega L4611
Tris-base Fisher Scientific BP154-1
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Waterbath Fisher Scientific 2340
Western wet transferring cassette Thermofisher Scientific STM2001

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बायोइंजीनियरिंग अंक 188
<em>इन विट्रो</em> सब्सट्रेट स्क्रीनिंग के लिए शुद्ध पुनः संयोजक <em>ड्रोसोफिला</em> कैसपेस का उपयोग करके क्लीवेज परख
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Yarikipati, P., Bergmann, A. In… More

Yarikipati, P., Bergmann, A. In Vitro Cleavage Assays using Purified Recombinant Drosophila Caspases for Substrate Screening. J. Vis. Exp. (188), e64392, doi:10.3791/64392 (2022).

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