Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att uttrycka och rena rekombinanta Drosophila caspases Dronc och Drice, och deras användning i in vitro klyvningsanalyser.
Abstract
Kaspaser är mycket specifika celldödsproteaser som är involverade i apoptotiska och icke-apoptotiska processer. Medan caspases roll under apoptos har varit mycket väldefinierad och många apoptotiska proteolytiska substrat av caspaser har identifierats och karakteriserats, är caspasernas roll för icke-apoptotiska processer inte väl förstådd. I synnerhet har få icke-apoptotiska substrat av caspaser hittills identifierats. Här, för att underlätta identifiering och karakterisering av potentiella kaspassubstrat, beskrivs ett protokoll som möjliggör testning av kandidatsubstrat i caspasklyvningsanalyser in vitro . Detta protokoll inkluderar produktion och rening av rekombinanta caspasproteiner, produktion av kandidatsubstraten antingen rekombinant eller i ett cellfritt uttryckssystem och den faktiska klyvningsreaktionen in vitro följt av SDS-PAGE och immunoblotting. Detta protokoll är skräddarsytt för Drosophila caspases Dronc och Drice men kan enkelt anpassas för caspaser från andra organismer, inklusive däggdjur.
Introduction
Programmerad celldöd eller apoptos utförs av en klass av högspecialiserade celldödsproteaser som kallas caspaser (granskad i referens1). Caspaser är Cys-proteaser som innehåller en Cys-rest i det katalytiska stället. De har definierat konsensusklyvningsställen och klyver substrat proteolytiskt efter Asp-rester (även om Drosophila caspase Dronc också har rapporterats klyva efter Glu-rester2). De är indelade i initiator (även känd som apikal eller uppströms) och effektor (bödel eller nedströms) caspaser. Initiatorkaspaser aktiverar effektorkaspaser. Till exempel, hos däggdjur, klyver initiativtagaren caspase Caspase-9 och aktiverar effektorn caspase Caspase-33. På samma sätt, i Drosophila melanogaster, klyver caspase-9-ortholog Dronc och aktiverar caspase-3-ortholog Drice 2,4. Under apoptos klyver effektorkaspaser hundratals substrat som leder till cellens död5.
Kaspaser syntetiseras som inaktiva proenzymer (zymogener) i cellen. I denna form innehåller de en N-terminal prodomän, en stor underenhet med katalytisk Cys i den centrala delen av proenzymet och en liten underenhet vid C-terminalen 1 (Figur 1). Aktiveringsmekanismen skiljer sig mellan initiator- och effektorkaspaser. Initiatorkaspaser (Caspase-9, Dronc) kräver dimerisering för aktivering, vilket sker genom införlivande i ett stort proteinkomplex, kallat apoptosom6. För införlivandet i apoptosomen har Caspase-9 och Dronc en caspaseaktiverings- och rekryteringsdomän (CARD) i N-terminalprodomänen (figur 1). Apoptosomkomponenten Apaf-1 innehåller också ett CARD och rekryterar Caspase-9 eller Dronc via CARD/CARD-interaktion till apoptosomen 3,6,7. Medan Caspase-9 och Dronc kan bearbetas proteolytiskt i apoptosomen, är denna bearbetning inte helt nödvändig för enzymatisk aktivitet 8,9.
Däremot bär effektorkaspaser (Caspase-3, Drice) inte ett kort i sina prodomainer och införlivas inte i stora proteinkomplex för aktivering1. De är beroende av proteolytisk klyvning av aktiv Caspase-9 respektive Dronc1. Den aktiva effektorkaspasen bildar en tetramer bestående av två stora och två små underenheter och innehåller således två katalytiska platser (figur 1). Viktigt för detta protokoll är att rekombinant uttryck av caspaser i E. coli orsakar automatisk bearbetning och aktivering av caspaser, inklusive Drice 10 och Dronc 2,8,9,11,12, även i frånvaro av Apaf-1. Denna automatiska bearbetning gör det möjligt att utföra in vitro-klyvningsanalyser av kandidatsubstrat med rekombinant kaspasprotein.
Kaspaser är inte bara involverade i apoptos, men de kan också ha många icke-apoptotiska funktioner, inklusive proliferation, differentiering, cellmigration, neuronal beskärning, medfödd immunitet och andra13,14,15. Det är för närvarande okänt hur celler kan överleva trots att de innehåller aktiva kaspaser under icke-apoptotiska processer. Det är möjligt att dessa celler endast aktiverar kaspaser vid subletala nivåer16 eller att de binder aktiva caspaser i icke-apoptotiska fack i cellen, såsom plasmamembranet17,18. Därför kommer identifiering och verifiering av icke-apoptotiska substrat inte bara att avslöja hur kaspaser förmedlar icke-apoptotiska processer utan kan också hjälpa till att förstå hur celler kan överleva i närvaro av aktiva caspaser.
Kandidatproteiner som caspassubstrat kan identifieras med hjälp av genetiska och biokemiska metoder. Identifierade proteiner kan kontrolleras för närvaron av konsensus Dronc klyvningsställen. Detta kan göras genom att visuellt inspektera proteinsekvensen eller använda mer sofistikerade bioinformatiska verktyg online som CasCleave (https://sunflower.kuicr.kyoto-u.ac.jp/~sjn/Cascleave/)19,20. Dessa verktyg använder de kända konsensusklyvningsställena för kaspaser och strukturella överväganden för att förutsäga nya mål för caspaser. Medan CasCleave innehåller information om verifierade substrat från humana Caspases-1, -3, -6, -7 och -8, kan det ändå också vara användbart för de ändamål som beskrivs här eftersom dessa caspaser och deras konsensusklyvningsställen är välbevarade. Men eftersom Dronc-klyvningsstället inte är väldefinierat (två studier identifierade två olika optimala klyvningsställen, TATD/E2 och LALD9), undersöks kandidatsubstraten också för förekomst av andra kaspasklyvningsställen, inklusive Drice.
För att validera de förutsagda substraten av caspaser krävs ytterligare analyser. En av dessa analyser är demonstrationen att en given kaspas faktiskt kan klyva kandidatproteinet in vitro. Här tillhandahåller vi ett bekvämt protokoll för in vitro-kaspasklyvningsanalyser. Med hjälp av detta protokoll testas kandidatsubstrat med Dronc som caspase. De kan också testas som substrat av Drice. Även om detta protokoll är skrivet för Drosophila caspases Dronc och Drice, kan det också anpassas för caspaser från andra organismer.
Extraktionen och reningen av Dronc och Drice tillsammans med in vitro-klyvningsanalysen måste utföras samma dag på grund av förlusten av katalytisk aktivitet av dessa caspaser. Detta protokoll har modifierats och optimerats från tidigare publikationer 8,9,11,12,21,22. I detta protokoll uttrycks fyra olika kaspasproteiner rekombinant i E. coli-stammen BL21 (DE3) pLysS. Dessa proteiner är: 6xHis-Droncwt, 6xHis-DroncC318A, 6xHis-Dricewt och 6xHis-DriceC211A. Var och en av dessa proteiner är märkt med 6 histidinrester (6xHis) vid N-terminalen för rening. Dronc wt och Dricewt är proteiner av vild typ och kan automatiskt bearbetas till den aktiva caspasen vid rekombinant uttryck. DroncC318A och DriceC211A kodar för mutanta former av Dronc och Drice som förändrar den katalytiska Cys-återstoden till en Ala-rest. Dessa konstruktioner är katalytiskt inaktiva och kan inte bearbetas automatiskt (se figur 2A). De används som kontroller i klyvningsanalysen. Eftersom DriceC211A inte kan bearbeta automatiskt används den också som modellsubstrat för Droncwt i den in vitro-klyvningsanalys som beskrivs här.
Protocol
1. Rekombinant kaspasuttryck i bakterier
- Klona genen av intresse (Caspase eller förmodat substrat) till en bakteriell uttrycksvektor med N- och / eller C-terminala taggar med hjälp av standardprotokoll23.
OBS: Taggar kan öka lösligheten hos de rekombinanta proteinerna och används för rening av de rekombinanta proteinerna. Här klonas Dronc, Drice och deras katalytiska mutanter till vektorn pET28a, som ger en N-terminal 6xHis-tagg (pET28a-6xHis-Dronc wt, pET28a-6xHis-Dronc C318A, pET28a-6xHis-Dricewt, pET28a-6xHis-Drice C211A); (För primerinformation se tilläggstabell 1). - Omvandla vektorerna med generna av intresse till kompetenta BL21 (DE3) pLysS E. coli-celler med hjälp av standardprocedurer23,24. Platta transformationsblandningen på LB-agarplattor med lämpligt antibiotikum (kanamycin vid pET28a) för att välja transformerade bakterier. (Se tilläggstabell 2.)
- Välj en koloni från plattan och inokulera i 5 ml LB-medium som innehåller lämpligt antibiotikum för att växa över natten vid 37 ° C vid 220 rpm på en skakningsplattform.
- På nästa dag, förbered 30-50 ml (per prov) LB-medium med antibiotikum och tillsätt 1 ml av den odlade kulturen över natten. Den optiska densiteten vid 600 nm (OD600) med hjälp av en biofotometer/spektrofotometer bör ligga mellan 0,1 och 0,2.
- Odla kulturen vid 37 °C vid 220 rpm på en skakplattform tills OD600 når 0,6. Kontrollera OD600 varje timme tills den når 0,6. Detta tar cirka 2 till 3 timmar.
- För att inducera proteinuttryck (caspas), tillsätt IPTG till en slutlig koncentration på 0,1-0,2 mM (späd 1:1 000-1:500 från IPTG-stam, se tilläggstabell 2).
- Odla kulturerna i 3 timmar vid 30 °C vid 220 rpm.
OBS: Tid och temperatur är beroende av vilken typ av protein som uttrycks och dess löslighet. Dessa förhållanden kan behöva justeras om olika caspaser eller substrat uttrycks. - Efter 3 timmar snurrar du ner kulturerna i 50 ml centrifugrör i 20 minuter vid 4 °C vid 2 000 x g. Kassera supernatanten och fortsätt med pelleten.
OBS: Protokollet kan stoppas vid denna tidpunkt och fortsättas senare. Bakteriepellets kan frysas vid -80 °C.
2. Småskalig rekombinant kaspasextraktion
- Ta bort de frysta rören med de pelleterade kulturerna från -80 °C lagring och förvara dem på is i 10 minuter för att mjuka upp pelleten.
- Efter 10 min, tillsätt 0,6 ml bakteriell celllysbuffert (tilläggstabell 2) kompletterad med nyligen tillsatta proteashämmare, 10 mg/ml lysozym och 50 U/ml bensonas i de pelletsinnehållande rören med hjälp av en pipettregulator med en 1 ml serologisk pipett.
- Lös upp pelleten med samma pipettspets genom att pipettera upp och ner tills en klar blekgul lösning utan pelletspartiklar är synlig. Inkubera i 30 min på is.
- Överför lysatet till lämpliga centrifugrör och centrifugera lysaterna vid 17 000 x g i 40 minuter vid 4 °C.
- Överför supernatanterna till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Detta är det råa extraktet som innehåller caspaserna.
- Håll rören på is och fortsätt för rening med Ni-NTA agaros.
3. Småskalig His-märkta caspasrening
- Tillsätt 0,2 ml av 50 % uppslamning av Ni-NTA-agaros till varje rör i kaspasextrakten från steg 2.5. Rotera rören på en end-on-end-rotator i 1 h vid 4 °C.
- Efter 1 h, tillsätt extraktet med Ni-NTA-agarosen till 1 ml polypropenkolonner med spetsen intakt, placerad i ett ställ. Låt det stå i 5 min.
- Efter 5 min, ta bort locket på kolumnerna och låt supernatanten strömma ut genom tyngdkraftsflödet.
- Tillsätt försiktigt 1 ml tvättbuffert (tilläggstabell 2) till kolonnerna utan att störa det packade hartset av Ni-NTA-agaros och tvätta det genom tyngdkraftsflödet.
- Utför tvättsteget tre gånger.
- För eluering av caspaserna, placera 1,5 ml mikrocentrifugrör under kolonnernas uppsamlingsmunstycke efter fullständig tömning av tvättbufferten.
- Tillsätt 0,5 ml av elueringsbufferten (kompletterad med 1x proteashämmare omedelbart före användning) till varje kolonn och samla upp eluatet i 1,5 ml mikrocentrifugrören.
OBS: Det finrenade eluatet kommer att vara transparent i färgen. - Håll eluaterna på is och mät koncentrationen av proteiner med Bradford-analys25. Bekräfta renheten/homogeniteten hos de renade caspaserna med SDS-PAGE följt av Coomassie Blue-färgning26.
OBS: Utbytet av en 50 ml LB-odling varierar mellan 0,5 och 1,5 mg kaspasprotein. Med tanke på att 0,5 ml elueringsbuffert används för eluering varierar koncentrationen från 1 till 3 mg / ml. Det är viktigt att använda de renade caspase-eluaten för in vitro-klyvningsanalyser samma dag som lysning och rening eftersom dessa kaspaspreparat förlorar aktivitet över natten.
4. Uttryck av det förmodade kaspassubstratet i cellfria uttryckssystem
OBS: I detta protokoll framställs Drice, det naturliga substratet för Dronc, genom både rekombinant uttryck i E. coli (se avsnitt 3 ovan) och genom uttryck i kaninretikulocytlysat (RRL), ett däggdjurscellfritt uttryckssystem (detta avsnitt, se nedan).
- Klona genen för det förmodade substratet till en uttrycksvektor som innehåller antingen en T7-, T3- eller SP6-promotor med hjälp av standardprocedurer23.
OBS: I detta protokoll används DriceC211A som modellsubstrat och klonades in i vektorn pT7CFE1-N-Myc, som bär en T7-promotor för genuttryck och taggar det förmodade proteinsubstratet med en N-terminal Myc-tagg för detektion genom immunoblotting. - I RRL kan kandidatsubstrat syntetiseras antingen radioaktivt eller icke-radioaktivt.
- Icke-radioaktiv syntes: I ett 0,5 ml mikrocentrifugrör, tillsätt 25 μL RRL, 2 μL reaktionsbuffert, 0,5 μL aminosyrablandning -minus leucin (1 mM), 0,5 μl aminosyrablandning-minus metionin (1 mM), 1 μl ribonukleashämmare (40 U / μL), 2 μL DNA-mall (0,5 μg / μl) och 1 μL T7-RNA-polymeras. Tillsätt nukleasfritt vatten för att justera reaktionens slutliga volym till 50 μl. Blanda försiktigt komponenterna genom pipettering eller omrörning med pipettspets och snurra ner en kort stund.
OBS: RRL-lysatet innehåller 100-200 mg / ml av de endogena proteinerna. För in vitro-translationsreaktioner, tillsätt RRL vid 50% koncentration (här 25 μL / 50 μL reaktion). - Radioaktiv syntes: I ett 0,5 ml mikrocentrifugrör, tillsätt 25 μL RRL-lysat, 2 μL reaktionsbuffert, 0,5 μL aminosyrablandning-minus metionin (1 mM), 1 μL ribonukleashämmare (40 U / μL), 2 μL DNA-mall (0,5 μg / μL), 2 μL S35-märkt metionin (1000 Ci / mmol vid 10 mCi / ml) och 1 μL T7-RNA-polymeras. Tillsätt nukleasfritt vatten för att justera reaktionens slutliga volym till 50 μl. Blanda försiktigt komponenterna genom pipettering eller omrörning med pipettspets och snurra ner en kort stund. Kassera spetsar och rör i en behållare för radioaktivt avfall.
OBS: Tillsätt inte aminosyrablandningen utan leucin. pT7CFE1-vektorn använder en T7-promotor för proteinuttryck. Andra vektorer använder T3- eller SP6-promotorer. I så fall bör T3- eller SP6-RNA-polymeraser användas istället för T7-RNA-polymeras. Se till att DNA-mallen har hög renhet.
- Icke-radioaktiv syntes: I ett 0,5 ml mikrocentrifugrör, tillsätt 25 μL RRL, 2 μL reaktionsbuffert, 0,5 μL aminosyrablandning -minus leucin (1 mM), 0,5 μl aminosyrablandning-minus metionin (1 mM), 1 μl ribonukleashämmare (40 U / μL), 2 μL DNA-mall (0,5 μg / μl) och 1 μL T7-RNA-polymeras. Tillsätt nukleasfritt vatten för att justera reaktionens slutliga volym till 50 μl. Blanda försiktigt komponenterna genom pipettering eller omrörning med pipettspets och snurra ner en kort stund.
- Inkubera reaktionen vid 30 °C i 90 minuter.
- Snurra kort i 10 s och placera rören på is. Kontrollera uttrycksnivån för det förmodade substratet i RRL med SDS-PAGE och immunoblotting / autoradiografi.
OBS: Mängden RRL-extrakt som tillsätts till klyvningsreaktionen bör baseras på den mängd protein som kan detekteras med detektionsmetoden (antingen immunoblotting eller S35 autoradiografi). Fortsätt till klyvningsanalysen in vitro (nästa avsnitt) eller förvara den vid -80 °C.
5. In vitro-klyvningsanalys med substrat genererade med RRL
- Ta de förmodade substrat som genereras, enligt beskrivningen i avsnitt 4. I detta protokoll används N-Myc-DriceC211A som modellsubstrat.
- Beroende på uttrycksnivån för det förmodade substratet (som bestäms separat genom immunoblot- eller autoradiografianalys, se steg 4.4), använd 1-10 μL av RRL programmerad med proteinet av intresse i klyvningsanalysen.
- Tillsätt 10 μg renat caspasprotein som genereras i sektionerna 1, 2 och 3.
- Bringa den totala reaktionsvolymen till 50 μL med kaspasanalysbuffert.
- Inkubera reaktionerna i ett vattenbad vid 30 °C i 3 timmar. Se till att inkludera lämpliga kontroller i klyvningsanalysen. Här används den katalytiskamutanten Dronc C318A som kontroll.
- Efter 3 h, stoppa reaktionerna genom att överföra rören på is.
- Lägg till en volym LDS-provbuffert som innehåller 50 mM DTT. Reaktionen stoppas helt med tillsats av LDS-provbuffert.
- Inkubera proverna vid 75 °C i ett värmeblock i 10 minuter.
- Snurra snabbt, blanda genom att bläddra, ladda 24 μL per prov och kör SDS-PAGE (se avsnitt 7) eller förvara proverna vid -20 °C.
6. In vitro-klyvningsanalys med bakterieuttryckt rekombinant substratprotein
- Tillsätt 10 μg renat kandidatsubstrat (här 6xHis-DriceC211A, genererat i sektionerna 1, 2 och 3) till ett 0,5 ml mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 10 μg av de renade caspasproteinerna som genereras i sektionerna 1 och 2. Bringa den totala volymen till 50 μl med hjälp av caspaseanalysbuffert.
- Följ steg 5.5 till 5.9.
7. SDS-PAGE och immunoblotting
- Ladda klyvningsreaktionerna (24 μL) på 4% -12% Tris-glycin- eller Bis-Tris-gradientgeler (materialtabell) och utför proteinelektrofores och immunoblotting (eller autoradiografi om du använder S35-märkta substrat) för att visualisera resultat med standardprocedurer27,28.
OBS: Här, i detta protokoll, användes Bis-Tris gradientgeler med Mops som kör buffert och LDS-laddningsbuffert. I allmänhet körs de vanliga PAGE-protokollen för Tris-glycingeler med Tris-Glycine-SDS-körbufferten och SDS-laddningsbufferten fungerar bra.
Representative Results
Detta protokoll ger steg-för-steg-instruktioner för caspaseproteininduktionen i E. coli, rening av de rekombinanta Drosophila-caspaserna Dronc och Drice, syntesen av kandidatsubstrat och in vitro-klyvningsreaktionen med kandidatsubstrat (här DriceC211A) och caspase Dronc. Den katalytiska mutanten DriceC211A användes som modellsubstrat i denna analys eftersom den inte har automatisk bearbetningsaktivitet (figur 2A) och förblir i full längd tills den klyvs av Droncwt. DriceC211A bör alltid användas som en positiv kontroll för att validera att Droncwt-preparatet har enzymatisk aktivitet.
Figur 2A ger ett representativt exempel på uttryck och rening av rekombinanta kaspaser. Fyra olika rekombinanta caspaser inducerades och renades: 6xHis-Droncwt, 6xHis-DroncC318A, 6xHis-Dricewt och 6xHis-DriceC211A. De renade caspaserna drevs av SDS-PAGE, immunoblottades, och fläcken undersöktes med en anti-His-antikropp (utspädd 1:5 000; följt av antimus IgG, HRP-länkad antikropp (1:10 000)). Den obearbetade 6xHis-Dronc (proDronc) körs med en relativ molekylvikt (MW r) på 55 kDa (lane 2) och obearbetad 6xHis-Drice (proDrice) har en MWr på 35 kDa (lane 4). Automatisk bearbetning av caspaserna är synlig genom utseendet på band med mindre MWr som på grund av närvaron av His-taggen vid N-terminalen representerar de stora underenheterna i caspaserna (figur 1). När det gäller 6x-Dronc har den stora underenheten en MWr på 40 kDa (bana 1). Den stora underenheten 6x-Drice går på 23 kDa (bana 3). De katalytiska mutanterna 6xHis-DroncC318A och 6xHis-DriceC211A misslyckas med att bearbeta automatiskt och kan endast detekteras som proteiner i full längd (banorna 2 och 4).
Figur 2B För att visa att det bakteriellt producerade och renade 6xHis-Droncwt-preparatet har enzymatisk aktivitet utfördes en in vitro-klyvningsanalys som beskrivs i detta protokoll. Som negativ kontroll användes den katalytiska mutanten 6xHis-DroncC318A. Substratet var RRL-genererat N-Myc-DriceC211A, som är märkt med en Myc-tagg vid N-ändhållplatsen. Efter klyvningsreaktionen in vitro separerades proteinerna med SDS-PAGE, immunoblottades och fläckarna inkuberades med en anti-Myc-antikropp (utspädd 1:1 000) följt av antimus-IgG, HRP-länkad antikropp (1:10 000)) för att detektera N-Myc-DriceC211A. Framgångsrik klyvning och därmed enzymatisk aktivitet hos caspasen kan demonstreras genom utseendet av minst ett band med mindre MWr jämfört med substratets fulllängds, obearbetade form. Obearbetad N-Myc-Drice C211A i full längd har en MWr på 40 kDa (körfält 2 och 4), medan den stora underenheten av bearbetad N-Myc-DriceC211A körs vid 30 kDa (körfält 3). Bana 1 representerar det oprogrammerade RRL-lysatet (ingen plasmid/transkript tillsatt). Lane 2 visar in vitro-produktion av DriceC211A genom RRL-uttryck. Lane 3 innehåller in vitro-klyvningsreaktionen med 6xHis-Droncwt. Lane 4 innehåller in vitro-klyvningsreaktionen med 6xHis-DroncC318A.
Figur 2C En in vitro-klyvningsreaktion som använder både rekombinant och renat kaspase (6xHis-Dronc wt och 6x-His-Dronc C318A) och substrat (6xHis-DriceC211A) enligt detta protokoll, analyserades av SDS-PAGE och immunoblot. För analys av klyvningsreaktionen användes den antiklyvda Drice-antikroppen (utspädd 1:5 000; följt av anti-kanin IgG, HRP-länkad antikropp (1:10 000)) i denna immunoblot. Den antiklyvda Drice-antikroppen detekterar sin neo-epitop i den stora underenheten (23 kDa) av 6xHis-DriceC211A först efter bearbetning av 6xHis-Droncwt (bana 1). Den katalytiska mutanten 6xHis-DroncC318A kan inte bearbeta 6xHis-Drice C211A i denna analys och fullängdaren 6xHis-DriceC211A visas som svagt obearbetat band på 35 kDa (bana 2).
Figur 1: Domänstruktur för initiatorkaspaser Caspase-9 och Dronc och effektor caspases Caspase-3 och Drice. CARD - caspase aktivering och rekrytering domän; Cys - relativ plats för den katalytiska cysteinresten; L - stor underenhet; S - liten underenhet. Placeringen av N-terminalprodomänerna anges. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativa resultat. (A) Immunoblotanalys av renade rekombinanta 6xHis-Dronc och 6xHis-Drice-preparat, undersökta med en anti-His-antikropp. Obearbetad (proDronc och proDrice) och klyvd 6xHis-Dronc och 6xHis-Drice indikeras med pilar. MW-markörer anges till vänster. (B) Immunoblotanalys av in vitro-klyvningsreaktionen av RRL-genererad N-Myc-Drice med caspaser 6xHis-Droncwt (bana 3) eller 6x-His-DroncC318A (bana 4) sonderad med en anti-Myc-antikropp. Oprogrammerade och programmerade (N-Myc-DriceC211A) RRL-reaktioner laddas och separeras i körfält 1 och 2. Obearbetad (proDrice) och klyvd N-Myc-Drice indikeras med pilar. MW-markörer anges till vänster. (C) Immunoblotanalys av in vitro-klyvningsreaktionen av bakteriellt uttryckt och renat rekombinant 6xHis-Drice C211A med caspaser 6xHis-Droncwt (bana 1) eller 6x-His-Dronc C318A (körfält 2), sonderad med en antiklyvd Drice-antikropp. Fullängdare (proDrice) och klyvda 6xHis-DriceC211A indikeras med pilar. MW-markörer anges till vänster. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande tabell 1: Denna tabell innehåller primers som används för kloning i pET28a-vektorn. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande tabell 2: Denna tabell innehåller sammansättningen av buffertar och media. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Huvuddelen av vår kunskap om kaspaser och kaspasfunktion har härletts från intensivt arbete inom apoptos under de senaste tre decennierna. Det är mycket väl etablerat att initiatorkaspaser proteolytiskt bearbetar effektorkaspaser, och hundratals proteiner har identifierats som effektorkaspassubstrat under apoptos 5,29. Däremot är mycket mindre känt om funktionen av caspaser för icke-apoptotiska processer och vilka icke-apoptotiska substrat de bearbetar. Det är tänkbart att initiativtagare är viktiga beslutsfattare här. Under apoptos aktiverar de effektorkaspaser som orsakar celldöd. För att utlösa icke-apoptotiska processer kan de emellertid aktivera olika proteiner (andra än effektorkaspaser), som styr den icke-apoptotiska processen. Detta protokoll testar kandidatproteiner som substrat av initiatorkaspaset Dronc i Drosophila 17,30.
De substrat som ska testas i klyvningsanalysen kan produceras antingen i ett in vitro-system för cellfritt uttryck hos däggdjur, såsom RRL, eller genom rekombinant uttryck i E. coli. Det finns flera fördelar med in vitro-uttryck med RRL jämfört med bakteriellt uttryck. RRL-uttrycksprotokollet är enkelt och snabbt, vilket gör att många olika substrat kan beredas parallellt. I många fall kan RRL-extraktet som innehåller proteinet av intresse lagras vid -80 °C före användning i klyvningsanalysen (även om detta måste bestämmas separat för varje substrat). Det förmodade substratet kan märkas med S35-Met, vilket möjliggör enkel analys genom autoradiografi efter SDS-PAGE. Det är särskilt användbart om ingen substratspecifik antikropp finns tillgänglig. Alternativt, om S35-Met-märkning inte önskas, kan det förmodade substratet märkas med vanliga taggar som flagg-, ha- eller Myc-taggar, vilket möjliggör detektering av caspas-klyvning genom immunoblotting.
Det måste starkt betonas att framgången för detta protokoll beror på noggrann och konsekvent rening av de rekombinanta Dronic- och Drice-proteinerna. Tyvärr kan dessa proteiner inte förvaras - inte ens på kort sikt - varken i kylen eller frysas. De förlorar den enzymatiska aktiviteten över natten i någon lagrad form. Därför måste de förberedas nyligen på dagen för klyvningsanalysen. Oavsett vilket eller vilka kandidatproteiner som testas bör DriceC211A alltid användas som en positiv kontroll för att validera den enzymatiska aktiviteten hos Droncwt-preparatet (se figur 2B,C). Alternativt kan aktiviteten hos Dronic- och Drice-preparaten också testas genom in vitro-klyvning av fluorogena syntetiska tetrapeptidsubstrat 2,9,31.
Om antikroppar används för att detektera kandidatsubstraten måste de valideras av användaren32,33. Det gäller även kommersiellt tillgängliga antikroppar som upptäcker epitoptaggar som Flag, HA, Myc eller andra. Dålig antikroppskvalitet kan skymma viktiga resultat. Dubbel-epitop-taggning av kandidatsubstraten på både N- och C-änden med olika taggar rekommenderas också34. Om klyvning sker hjälper dubbelmärkning till att spåra båda klyvningsprodukterna och kan hjälpa till att belysa om klyvning sker på en eller flera platser.
Även om detta protokoll enkelt validerar det kända biologiska substratet för Dronc, Drice, finns det också begränsningar. En begränsning är att detta är ett in vitro-protokoll med rekombinanta proteiner. I dessa analyser är caspaserna närvarande i en ofysiologiskt hög koncentration, vilket framgår av observationen att de spontant kan auto-bearbeta i E. coli. Den spontana autobehandlingen sker vanligtvis inte under de fysiologiska förhållandena. Denna höga kaspaskoncentration kan orsaka falsk aktivitet som resulterar i falska positiva resultat. Falska positiva resultat kan elimineras genom att sänka kaspaskoncentrationen i in vitro-klyvningsreaktionen. Dessutom, som beskrivs mer detaljerat nedan, är ytterligare analyser nödvändiga för att bekräfta äkta substrat och för att eliminera falska positiva resultat.
De rekombinanta kaspaserna kanske inte har samma specificitet som de har i sin normala cellulära miljö in vivo. Till exempel kan aktiviteten hos caspaser modifieras genom post-translationella modifieringar. Dessa finns inte på de rekombinanta proteinerna. Vidare införlivas initiatorkaspaser in vivo, inklusive Dronc, i stora proteinkomplex såsom apoptosomen. Under villkoren i detta protokoll uppnås inte bildandet av apoptosomen. Det skulle kräva rekombinant uttryck av Drosophila Apaf-1 (aka Dark eller Hac-1)35-37 som har egna utmaningar. Därför kan Dronc in vitro inte ha samma specificitet som den har in vivo.
Det är också tänkbart att Dronc införlivas i ett annat proteinkomplex för icke-apoptotiska processer. Detta kan ge en annan klyvningsspecificitet än Dronc, vilket också kan förklara varför Dronc inte inducerar apoptos under icke-apoptotiska förhållanden. I samband med detta använder CasCleave de kända klyvningskonsensusplatserna för att förutsäga nya kaspassubstrat. Det är emellertid okänt om samma klyvningskonsensusplatser också används för icke-apoptotiska processer. Faktum är att det nyligen visades att Caspase-3 ändrar sin föredragna konsensusplats under en icke-apoptotisk process i den utvecklande auditiva hjärnstammen i kycklingembryot38. På samma sätt, om initiatorkaspaser införlivas i olika proteinkomplex, kan de ha en annan specificitet och kan därmed klyva vid olika konsensussekvenser.
Dessa begränsningar visar att det inte är tillräckligt att enbart förlita sig på de in vitro-klyvningsanalyser som beskrivs i detta protokoll. Alternativa metoder bör användas för att ytterligare validera de resultat som erhållits med hjälp av detta protokoll. Helst bör in vivo-analyser användas för att ta itu med följande frågor: Behandlas kandidatproteinet proteolytiskt under den icke-apoptotiska processen in vivo? Om så är fallet, används samma klyvningsställe in vivo och in vitro? Vad är konsekvensen om klyvningen blockeras av mutagenes på klyvningsstället? Är bearbetningen av kandidatsubstratet beroende av caspaser, och i så fall vilken? Vilken roll har klyvningsfragmenten för den icke-apoptotiska processen? Dessa frågor kan enkelt hanteras i de genetiska modellorganismerna som C. elegans och Drosophila med hjälp av vanliga genetiska och transgena metoder.
Sammanfattningsvis beskriver detta protokoll en tillförlitlig och konsekvent metod för att producera enzymatiskt aktiva caspaser, särskilt Drosophila caspases Dronc och Drice. Det slutliga målet med detta protokoll är att undersöka om Dronc kan klyva kandidatsubstrat in vitro, som identifierades med genetiska, biokemiska eller bioinformatiska metoder. Som förklarats i föregående stycke krävs ytterligare analyser för att validera dessa proteiner som kaspassubstrat in vivo. Med tanke på graden av bevarande av kaspasgener över metazoer bör det vara möjligt att anpassa detta protokoll till kaspaser från andra organismer också.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Vi vill tacka Dr. Elif Kamber-Kaya för hennes hjälp med att upprätta protokollet i labbet. Dr Guy Salvesen gav vänligt DriceC211A mutant9. Detta arbete finansierades av en MIRA-utmärkelse från National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) vid National Institutes of Health (NIH) under bidragsnummer 2R35GM118330. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesignen, datainsamlingen och analysen, beslutet att publicera eller förberedelsen av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin | Fisher | BP1760-25 | |
| Anti-His antibody | Sigma-Aldrich | MA1-21315 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell signaling | 7076P2 | |
| Anti-Myc antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell signaling | 7074P2 | |
| Benchtop Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | |
| Benzonase | Sigma-Aldrich | E1014-5KU | |
| BioPhotometer | Eppendorf | #6131 | |
| BL21 (DE3) pLysS Competent Cells | Promega | L1195 | |
| Centrifuge rotor | Beckman Coulter | JA-25.50 | |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023-1G | |
| ChemiDoc with image software | Bio-Rad | Universal Hood II | For Chemiluminiscence imaging |
| Chemiluminiscence Substrate | Thermofisher Scientific | 34095 | For Chemiluminiscence imaging |
| Cleaved Drosophila ICE (drICE) (Asp230) Antibody | Cell Signaling Technology | 9478S | |
| Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14955128 | Used to measure bacterial growth and protein concentration |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | #1610610 | |
| Erlenmeyer flasks, 1000 mL | Millipore sigma | CLS49801L | For LB agar media preparation and autoclaving |
| Erlenmeyer flasks, 250 mL | Millipore sigma | CLS4980250 | For bacterial culture growth and induction. |
| Ethylene-diamine-tetra-acetic Acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Gel tank SDS-PAGE system | Thermofisher Scientific | STM1001 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Thermofisher scientific | 87786 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| His-Drice-pET28a | This study | N/A | Available from authors |
| His-DriceC211A-pET28a | This study | N/A | Available from authors |
| His-Dronc-pET28a | This study | N/A | Available from authors |
| His-DroncC318A-pET28a | This study | N/A | Available from authors |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-100G | |
| Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermofisher Scientific | FERR0392 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| LB Agar, Miller (Powder) | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Lysozyme | Thermofisher Scientific | 90082 | |
| Microbiological plate incubator | Fisher Scientific | 11-690-650D | For colony growth after transformation |
| Microcentrifuge tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 22363611 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Midiprep kit | Qiagen | 12243 | |
| Mini tube rotator | Fisher Scientific | 05-450-127 | for mixing bacterial lysates and Ni-NTA agarose |
| Miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
| Motorized Pipette Controller | Gilson | F110120 | For using serological pipettes |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | BP330-1 | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | |
| NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Midi Protein Gel, 20-well | Thermofisher Scientific | WG1402BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermofisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20x) | Thermofisher Scientific | NP0001 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Invitrogen | NP00061 | |
| Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick Scientific | C25 incubator shaker | |
| Petridish 100 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plating beads | Zymo research | S1001 | For spreading culture on AmpR/KanR plates |
| Polypropylene Columns (1 mL) | Qiagen | 34924 | For purification of His-tagged proteins |
| Precision Plus Protein Standards | Bio-Rad | #161-0374 | |
| Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | #5000006 | |
| pT7CFE1-NMyc | Thermofisher Scientific | 88863 | For cloning substrates for RRL expression |
| PVDF membrane | Invitrogen | LC2007 | |
| 14 mL Polypropylene round bottom tubes | Fisher Scientific | 352029 | For growing plasmid cultures |
| QiaRack | Qiagen | 19095 | For holding polypropylene columns during purification |
| Refrigerated High speed Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | |
| rRNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N251A | For RRL expression |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sterile Falcon tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| Sterile Falcon tubes, 50 mL | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S70903-250G | |
| 1 mL Serological Pipets, Sterile | celltreat | 229001B | For bacterial cell lysis in 50 mL tubes |
| TnT Coupled Reticulocyte Lysate -T7 | Promega | L4611 | |
| Tris-base | Fisher Scientific | BP154-1 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Waterbath | Fisher Scientific | 2340 | |
| Western wet transferring cassette | Thermofisher Scientific | STM2001 |
References
- Kumar, S. Caspase function in programmed cell death. Cell Death and Differentiation. 14 (1), 32-43 (2007).
- Hawkins, C. J., et al. The Drosophila caspase DRONC cleaves following glutamate or aspartate and is regulated by DIAP1, HID, and GRIM. Journal of Biological Chemistry. 275 (35), 27084-27093 (2000).
- Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell. 91 (4), 479-489 (1997).
- Meier, P., Silke, J., Leevers, S. J., Evan, G. I. The Drosophila caspase DRONC is regulated by DIAP1. EMBO Journal. 19 (4), 598-611 (2000).
- Timmer, J. C., Salvesen, G. S. Caspase substrates. Cell Death and Differentiation. 14 (1), 66-72 (2007).
- Zou, H., Li, Y., Liu, X., Wang, X. An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11549-11556 (1999).
- Zou, H., Henzel, W. J., Liu, X., Lutschg, A., Wang, X. Apaf-1, a human protein homologous to C. elegans CED-4, participates in cytochrome c-dependent activation of caspase-3. Cell. 90 (3), 405-413 (1997).
- Stennicke, H. R., et al. Caspase-9 can be activated without proteolytic processing. Journal of Biological Chemistry. 274 (13), 8359-8362 (1999).
- Snipas, S. J., Drag, M., Stennicke, H. R., Salvesen, G. S. Activation mechanism and substrate specificity of the Drosophila initiator caspase DRONC. Cell Death and Differentiation. 15 (5), 938-945 (2008).
- Fraser, A. G., Evan, G. I. Identification of a Drosophila melanogaster ICE/CED-3-related protease, drICE. EMBO Journal. 16 (10), 2805-2813 (1997).
- Denton, D., Mills, K., Kumar, S. Methods and protocols for studying cell death in Drosophila. Methods in Enzymology. 446, 17-37 (2008).
- Dorstyn, L., Kumar, S. A biochemical analysis of the activation of the Drosophila caspase DRONC. Cell Death and Differentiation. 15 (3), 461-470 (2008).
- Aram, L., Yacobi-Sharon, K., Arama, E. CDPs: caspase-dependent non-lethal cellular processes. Cell Death and Differentiation. 24 (8), 1307-1310 (2017).
- Arama, E., Baena-Lopez, L. A., Fearnhead, H. O. Non-lethal message from the Holy Land: The first international conference on nonapoptotic roles of apoptotic proteins. FEBS Journal. 288 (7), 2166-2183 (2021).
- Baena-Lopez, L. A. All about the caspase-dependent functions without cell death. Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 77-78 (2018).
- Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. Journal of Cell Biology. 196 (4), 513-527 (2012).
- Amcheslavsky, A., et al. Plasma membrane localization of apoptotic caspases for non-apoptotic functions. Developmental Cell. 45 (4), 450-464 (2018).
- Bergmann, A. Are membranes non-apoptotic compartments for apoptotic caspases. Oncotarget. 9 (60), 31566-31567 (2018).
- Song, J., et al. Cascleave: towards more accurate prediction of caspase substrate cleavage sites. Bioinformatics. 26 (6), 752-760 (2010).
- Wang, M., et al. Cascleave 2.0, a new approach for predicting caspase and granzyme cleavage targets. Bioinformatics. 30 (1), 71-80 (2014).
- Kamber Kaya, H. E., Ditzel, M., Meier, P., Bergmann, A. An inhibitory mono-ubiquitylation of the Drosophila initiator caspase Dronc functions in both apoptotic and non-apoptotic pathways. PLoS Genetics. 13 (2), 1006438 (2017).
- Stennicke, H. R., Salvesen, G. S. Caspases: preparation and characterization. Methods. 17 (4), 313-319 (1999).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th edition). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), e253 (2007).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
- Hirano, S. Western blot analysis. Methods in Molecular Biology. 926, 87-97 (2012).
- Kim, B. Western blot techniques. Methods in Molecular Biology. 1606, 133-139 (2017).
- Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death and Differentiation. 14 (4), 641-650 (2007).
- Fogarty, C. E., et al. Extracellular reactive oxygen species drive apoptosis-induced proliferation via Drosophila macrophages. Current Biology. 26 (5), 575-584 (2016).
- Song, Z., et al. Biochemical and genetic interactions between Drosophila caspases and the proapoptotic genes rpr, hid, and grim. Molecular and Cellular Biology. 20 (8), 2907-2914 (2000).
- Edfors, F., et al. Enhanced validation of antibodies for research applications. Nature Communications. 9 (1), 4130 (2018).
- Uhlen, M., et al. A proposal for validation of antibodies. Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).
- Brizzard, B. Epitope tagging. Biotechniques. 44 (5), 693-695 (2008).
- Kanuka, H., et al. Control of the cell death pathway by Dapaf-1, a Drosophila Apaf-1/CED-4-related caspase activator. Molecular Cell. 4 (5), 757-769 (1999).
- Rodriguez, A., et al. Dark is a Drosophila homologue of Apaf-1/CED-4 and functions in an evolutionarily conserved death pathway. Nature Cell Biology. 1 (5), 272-279 (1999).
- Zhou, L., Song, Z., Tittel, J., Steller, H. HAC-1, a Drosophila homolog of APAF-1 and CED-4 functions in developmental and radiation-induced apoptosis. Molecular Cell. 4 (5), 745-755 (1999).
- Weghorst, F., Mirzakhanyan, Y., Hernandez, K. L., Gershon, P. D., Cramer, K. S. Non-Apoptotic caspase activity preferentially targets a novel consensus sequence associated with cytoskeletal proteins in the developing auditory brainstem. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 844844 (2022).
