Summary
Hier presenteren we een protocol om recombinant Drosophila caspases Dronc en Drice uit te drukken en te zuiveren, en hun gebruik in in vitro splitsingstests.
Abstract
Caspasen zijn zeer specifieke celdoodproteasen die betrokken zijn bij apoptotische en niet-apoptotische processen. Hoewel de rol van caspasen tijdens apoptose zeer goed is gedefinieerd en veel apoptotische proteolytische substraten van caspasen zijn geïdentificeerd en gekarakteriseerd, is de rol van caspasen voor niet-apoptotische processen niet goed begrepen. In het bijzonder zijn tot nu toe weinig niet-apoptotische substraten van caspasen geïdentificeerd. Hier, om de identificatie en karakterisering van potentiële caspase-substraten te vergemakkelijken, wordt een protocol beschreven dat het testen van kandidaat-substraten in caspase-splitsingstests in vitro mogelijk maakt. Dit protocol omvat de productie en zuivering van recombinante caspase-eiwitten, de productie van de kandidaat-substraten recombinant of in een celvrij expressiesysteem, en de feitelijke in vitro splitsingsreactie gevolgd door SDS-PAGE en immunoblotting. Dit protocol is op maat gemaakt voor de Drosophila caspases Dronc en Drice, maar kan eenvoudig worden aangepast voor caspasen van andere organismen, waaronder zoogdieren.
Introduction
Geprogrammeerde celdood of apoptose wordt uitgevoerd door een klasse van zeer gespecialiseerde celdoodproteasen genaamd caspasen (besproken in referentie1). Caspasen zijn Cys-proteasen die een Cys-residu op de katalytische plaats bevatten. Ze hebben consensussplitsingsplaatsen gedefinieerd en substraten proteolytisch splitsen na Asp-residuen (hoewel van de Drosophila caspase Dronc ook is gemeld dat het splijt na Glu-residuen2). Ze zijn onderverdeeld in initiator (ook bekend als apicale of upstream) en effector (beul of downstream) caspases. Initiator caspases activeren effector caspases. Bij zoogdieren splitst en activeert de initiator caspase Caspase-9 bijvoorbeeld de effector caspase Caspase-33. Ook in Drosophila melanogaster splijt en activeert de caspase-9-ortholoog Dronc de caspase-3-orthologe Drice 2,4. Tijdens apoptose splijten effector caspases honderden substraten die leiden tot de dood van de cel5.
Caspasen worden gesynthetiseerd als inactieve pro-enzymen (zymogenen) in de cel. In deze vorm bevatten ze een N-terminal prodomein, een grote subeenheid met de katalytische Cys in het centrale deel van het pro-enzym en een kleine subeenheid bij de C-terminus1 (figuur 1). Het activeringsmechanisme verschilt tussen initiator- en effector caspases. Initiator caspasen (Caspase-9, Dronc) vereisen dimerisatie voor activering, die optreedt door opname in een groot eiwitcomplex, het apoptosoom6 genoemd. Voor de integratie in het apoptosoom dragen Caspase-9 en Dronc een caspase activatie- en rekruteringsdomein (CARD) in het N-terminal prodomein (figuur 1). De apoptosoomcomponent Apaf-1 bevat ook een CARD en rekruteert Caspase-9 of Dronc via CARD/CARD interactie in het apoptosome 3,6,7. Hoewel Caspase-9 en Dronc proteolytisch kunnen worden verwerkt in het apoptosoom, is deze verwerking niet volledig vereist voor enzymatische activiteit 8,9.
Effector caspasen (Caspase-3, Drice) daarentegen dragen geen CARD in hun prodomeinen en worden niet opgenomen in grote eiwitcomplexen voor activering1. Ze zijn afhankelijk van proteolytische splitsing door respectievelijk actief Caspase-9 of Dronc1. De actieve effector caspase vormt een tetrameer dat bestaat uit twee grote en twee kleine subeenheden en bevat dus twee katalytische plaatsen (figuur 1). Belangrijk voor dit protocol is dat recombinante expressie van caspasen in E. coli automatische verwerking en activering van caspasen veroorzaakt, waaronder Drice10 en Dronc 2,8,9,11,12, zelfs in afwezigheid van Apaf-1. Deze automatische verwerking maakt het mogelijk om in vitro splitsingstests uit te voeren van kandidaat-substraten met recombinant caspase-eiwit.
Caspasen zijn niet alleen betrokken bij apoptose, maar ze kunnen ook veel niet-apoptotische functies hebben, waaronder proliferatie, differentiatie, celmigratie, neuronale snoei, aangeboren immuniteit en anderen 13,14,15. Het is momenteel onbekend hoe cellen kunnen overleven ondanks het bevatten van actieve caspasen tijdens niet-apoptotische processen. Het is mogelijk dat deze cellen caspasen alleen activeren bij subletale niveaus16 of dat ze actieve caspasen vastleggen in niet-apoptotische compartimenten van de cel, zoals het plasmamembraan17,18. Daarom zal de identificatie en verificatie van niet-apoptotische substraten niet alleen onthullen hoe caspasen niet-apoptotische processen bemiddelen, maar kan het ook helpen om te begrijpen hoe cellen kunnen overleven in de aanwezigheid van actieve caspasen.
Kandidaat-eiwitten als caspasesubstraten kunnen worden geïdentificeerd met behulp van genetische en biochemische methoden. Geïdentificeerde eiwitten kunnen worden gecontroleerd op de aanwezigheid van de consensus Dronc-splitsingsplaatsen. Dit kan worden gedaan door de eiwitsequentie visueel te inspecteren of door meer geavanceerde online bioinformatische hulpmiddelen zoals CasCleave (https://sunflower.kuicr.kyoto-u.ac.jp/~sjn/Cascleave/)19,20 te gebruiken. Deze tools gebruiken de bekende consensussplitsingsplaatsen van caspasen en structurele overwegingen om nieuwe doelen van caspasen te voorspellen. Hoewel CasCleave de informatie van geverifieerde substraten van menselijke Caspases-1, -3, -6, -7 en -8 bevat, kan het niettemin ook nuttig zijn voor de hier beschreven doeleinden, omdat deze caspasen en hun consensussplitsingsplaatsen goed bewaard zijn gebleven. Omdat de Dronc-splitsingsplaats echter niet goed is gedefinieerd (twee studies identificeerden twee verschillende optimale splitsingsplaatsen, TATD/E2 en LALD9), worden de kandidaat-substraten ook onderzocht op de aanwezigheid van andere caspase-splitsingsplaats, waaronder Drice.
Om de voorspelde substraten van caspasen te valideren, zijn aanvullende testen nodig. Een van deze testen is de demonstratie dat een gegeven caspase het kandidaat-eiwit in vitro kan splitsen. Hier bieden we een handig protocol voor in vitro caspase cleavage assays. Met behulp van dit protocol worden kandidaat-substraten getest met Dronc als caspase. Ze kunnen ook worden getest als substraten van Drice. Hoewel dit protocol is geschreven voor de Drosophila caspases Dronc en Drice, kan het ook worden aangepast voor caspasen van andere organismen.
De extractie en zuivering van Dronc en Drice samen met de in vitro splitsingstest moet op dezelfde dag worden uitgevoerd vanwege het verlies van katalytische activiteit door deze caspasen. Dit protocol is aangepast en geoptimaliseerd ten opzichte van eerdere publicaties 8,9,11,12,21,22. In dit protocol worden vier verschillende caspase-eiwitten recombinant tot expressie gebracht in de E. coli-stam BL21 (DE3) pLysS. Deze eiwitten zijn: 6xHis-Droncwt, 6xHis-DroncC318A, 6xHis-Dricewt en 6xHis-DriceC211A. Elk van deze eiwitten is gelabeld met 6 Histidine residuen (6xHis) op de N-terminus voor zuivering. Droncwt en Dricewt zijn de wild-type eiwitten en kunnen automatisch verwerken in de actieve caspase bij recombinante expressie. DroncC318A en DriceC211A coderen voor mutante vormen van Dronc en Drice die het katalytische Cys-residu veranderen in een Ala-residu. Deze constructies zijn katalytisch inactief en kunnen niet automatisch worden verwerkt (zie figuur 2A). Ze worden gebruikt als controles in de splitsingstest. Omdat DriceC211A niet automatisch kan verwerken, wordt het ook gebruikt als het modelsubstraat voor Droncwt in de hier beschreven in vitro splitsingstest.
Protocol
1. Recombinante caspase-expressie in bacteriën
- Kloon het gen van belang (Caspase of vermeend substraat) tot een bacteriële expressievector met N- en/of C-terminale tag(s) met behulp van standaardprotocollen23.
OPMERKING: Tags kunnen de oplosbaarheid van de recombinante eiwitten verhogen en worden gebruikt voor de zuivering van de recombinante eiwitten. Hier worden Dronc, Drice en hun katalytische mutanten gekloond in de vector pET28a, die een N-terminale 6xHis-tag biedt (pET28a-6xHis-Droncwt, pET28a-6xHis-DroncC318A, pET28a-6xHis-Dricewt, pET28a-6xHis-DriceC211A); (voor primer informatie zie Aanvullende tabel 1). - Transformeer de vectoren met de genen van belang in competente BL21 (DE3) pLysS E. coli-cellen met behulp van standaardprocedures23,24. Plaats het transformatiemengsel op LB-agarplaten met het juiste antibioticum (kanamycine in het geval van pET28a) om getransformeerde bacteriën te selecteren. (Zie aanvullende tabel 2.)
- Kies een kolonie van de plaat en ent in 5 ml LB-medium met het juiste antibioticum om 's nachts bij 37 °C bij 220 tpm op een schudplatform te groeien.
- Bereid de volgende dag 30-50 ml (per monster) LB-medium met antibioticum en voeg 1 ml van de 's nachts gekweekte cultuur toe. De optische dichtheid bij 600 nm (OD600) met behulp van een biofotometer/spectrofotometer moet tussen 0,1 en 0,2 liggen.
- Kweek de cultuur bij 37 °C bij 220 tpm op een schudplatform tot OD600 0,6 bereikt. Controleer de OD600 elk uur totdat deze 0,6 bereikt. Dit duurt ongeveer 2 tot 3 uur.
- Om eiwitexpressie (caspase) te induceren, voegt u IPTG toe aan een eindconcentratie van 0,1-0,2 mM (verdun 1:1.000-1:500 uit IPTG-voorraad, zie aanvullende tabel 2).
- Kweek de culturen gedurende 3 uur bij 30 °C bij 220 tpm.
OPMERKING: Tijd en temperatuur zijn afhankelijk van wat voor soort eiwit wordt uitgedrukt en de oplosbaarheid ervan. Deze omstandigheden moeten mogelijk worden aangepast als verschillende caspasen of substraten tot expressie komen. - Draai na 3 uur de culturen in centrifugebuizen van 50 ml gedurende 20 minuten bij 4 °C bij 2.000 x g. Gooi het supernatant weg en ga verder met de pellet.
OPMERKING: Het protocol kan op dit punt worden gestopt en later worden voortgezet. Bacteriële pellets kunnen worden ingevroren bij -80 °C.
2. Kleinschalige recombinante caspasen extractie
- Verwijder de bevroren buizen met de gepelletiseerde culturen uit -80 °C opslag en bewaar ze gedurende 10 minuten op ijs om de pellet zachter te maken.
- Voeg na 10 minuten 0,6 ml bacteriële cellysebuffer (aanvullende tabel 2) aangevuld met vers toegevoegde proteaseremmers, 10 mg/ml lysozym en 50 E/ml benzonase toe aan de pelletbevattende buizen met behulp van een pipetregelaar met een serologische pipet van 1 ml.
- Los met dezelfde pipetpunt de pellet op door op en neer te pipetteren totdat een heldere lichtgele oplossing zonder pelletdeeltjes zichtbaar is. Incubeer gedurende 30 minuten op ijs.
- Breng het lysaat over in geschikte centrifugebuizen en centrifugeer de lysaten bij 17.000 x g gedurende 40 minuten bij 4 °C.
- Breng de supernatanten over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Dit is het ruwe extract dat de caspases bevat.
- Houd de buisjes op ijs en ga verder met de zuivering met Ni-NTA agarose.
3. Kleinschalige His-tagged caspases zuivering
- Voeg 0,2 ml van de 50% drijfmest van Ni-NTA agarose toe aan elke buis van de caspase-extracten uit stap 2.5. Draai de buizen op een end-on-end rotator gedurende 1 uur bij 4 °C.
- Voeg na 1 uur het extract met de Ni-NTA agarose toe aan 1 ml polypropyleenkolommen met de punt intact, geplaatst in een rek. Laat het 5 min staan.
- Verwijder na 5 minuten de dop van de kolommen en laat het supernatant door de zwaartekracht naar buiten stromen.
- Voeg voorzichtig 1 ml van de wasbuffer (aanvullende tabel 2) toe aan de kolommen zonder de verpakte hars van Ni-NTA agarose te verstoren en was deze door de zwaartekrachtstroom.
- Voer de wasstap drie keer uit.
- Plaats voor de elutie van de caspasen 1,5 ml microcentrifugebuizen onder het opvangmondstuk van de kolommen na volledige afvoer van de wasbuffer.
- Voeg 0,5 ml van de elutiebuffer (aangevuld met 1x proteaseremmers onmiddellijk voor gebruik) toe aan elke kolom en verzamel het eluaat in de microcentrifugebuizen van 1,5 ml.
OPMERKING: Het fijne gezuiverde eluaat zal transparant van kleur zijn. - Houd de eluaten op ijs en meet de concentratie van eiwitten door Bradford assay25. Bevestig de zuiverheid/homogeniteit van de gezuiverde caspasen door SDS-PAGE gevolgd door Coomassie Blue kleuring26.
OPMERKING: De opbrengst van een 50 ml LB-cultuur varieert tussen 0,5 en 1,5 mg caspase-eiwit. Aangezien voor de elutie 0,5 ml el elutibuffer wordt gebruikt, varieert de concentratie van 1 tot 3 mg/ml. Het is belangrijk om de gezuiverde caspase eluaten te gebruiken voor in vitro splitsingstests op dezelfde dag van lysis en zuivering, omdat deze caspasepreparaten 's nachts activiteit verliezen.
4. Expressie van het vermeende caspasesubstraat in celvrije expressiesystemen
OPMERKING: In dit protocol wordt Drice, het natuurlijke substraat van Dronc, bereid door zowel recombinante expressie in E. coli (zie sectie 3 hierboven) als door expressie in konijnenretticulocytenlysaat (RRL), een celvrij expressiesysteem voor zoogdieren (deze sectie, zie hieronder).
- Kloon het gen van het vermeende substraat tot een expressievector die een T7-, T3- of SP6-promotor bevat met behulp van standaardprocedures23.
OPMERKING: In dit protocol wordt DriceC211A gebruikt als het modelsubstraat en werd gekloond in de vector pT7CFE1-N-Myc, die een T7-promotor draagt voor genexpressie en het vermeende eiwitsubstraat labelt met een N-terminale Myc-tag voor detectie door immunoblotting. - In RRL kunnen kandidaat-substraten radioactief of niet-radioactief worden gesynthetiseerd.
- Niet-radioactieve synthese: Voeg in een microcentrifugebuis van 0,5 ml 25 μL RRL, 2 μL reactiebuffer, 0,5 μl aminozuurmengsel -Minus leucine (1 mM), 0,5 μl aminozuurmengsel-minus methionine (1 mM), 1 μl ribonucleaseremmer (40 U/μL), 2 μL DNA-sjabloon (0,5 μg/μL) en 1 μL T7-RNA-polymerase toe. Voeg nucleasevrij water toe om het uiteindelijke volume van de reactie aan te passen tot 50 μL. Meng de componenten voorzichtig door te pipetteren of te roeren met de pipetpunt en draai kort naar beneden.
OPMERKING: Het RRL-lysaat bevat 100-200 mg / ml van de endogene eiwitten. Voeg voor in vitro translatiereacties de RRL toe bij een concentratie van 50% (hier 25 μL/50 μL reactie). - Radioactieve synthese: Voeg in een microcentrifugebuis van 0,5 ml 25 μL RRL-lysaat, 2 μL reactiebuffer, 0,5 μl aminozuurmengsel-minus methionine (1 mM), 1 μl ribonucleaseremmer (40 U/μL), 2 μl DNA-sjabloon (0,5 μg/μL), 2 μL S 35-gelabelde methionine (1000 Ci/mmol bij 10 mCi/ml) en 1 μL T7-RNA-polymerase toe. Voeg nucleasevrij water toe om het uiteindelijke volume van de reactie aan te passen tot 50 μL. Meng de componenten voorzichtig door te pipetteren of te roeren met de pipetpunt en draai kort naar beneden. Gooi tips en buizen weg in een container met radioactief afval.
OPMERKING: Voeg het aminozuurmengsel niet toe zonder Leucine. De pT7CFE1-vector gebruikt een T7-promotor voor eiwitexpressie. Andere vectoren gebruiken T3- of SP6-promotors. In dat geval moeten T3- of SP6-RNA-polymerasen worden gebruikt in plaats van T7-RNA-polymerase. Zorg ervoor dat het DNA-sjabloon van hoge zuiverheid is.
- Niet-radioactieve synthese: Voeg in een microcentrifugebuis van 0,5 ml 25 μL RRL, 2 μL reactiebuffer, 0,5 μl aminozuurmengsel -Minus leucine (1 mM), 0,5 μl aminozuurmengsel-minus methionine (1 mM), 1 μl ribonucleaseremmer (40 U/μL), 2 μL DNA-sjabloon (0,5 μg/μL) en 1 μL T7-RNA-polymerase toe. Voeg nucleasevrij water toe om het uiteindelijke volume van de reactie aan te passen tot 50 μL. Meng de componenten voorzichtig door te pipetteren of te roeren met de pipetpunt en draai kort naar beneden.
- Incubeer de reactie bij 30 °C gedurende 90 min.
- Draai kort gedurende 10 s en plaats de buizen op ijs. Controleer het expressieniveau van het vermeende substraat in RRL door SDS-PAGE en immunoblotting/autoradiografie.
OPMERKING: De hoeveelheid RRL-extract die aan de splitsingsreactie wordt toegevoegd, moet worden gebaseerd op de hoeveelheid eiwit die kan worden gedetecteerd met de detectiemethode (immunoblotting of S35-autoradiografie ). Ga verder met de in vitro splitsingstest (volgende sectie) of bewaar deze bij -80 °C.
5. In vitro splitsingstest met substraten gegenereerd met RRL
- Neem de vermeend substraat(en) dat(en) is (zijn) gegenereerd, zoals beschreven in rubriek 4. In dit protocol wordt N-Myc-DriceC211A gebruikt als modelsubstraat.
- Afhankelijk van het expressieniveau van het vermeende substraat (afzonderlijk te bepalen door immunoblot- of autoradiografieanalyse, zie stap 4.4), gebruikt u 1-10 μL van de RRL geprogrammeerd met het eiwit van belang in de splitsingstest.
- Voeg 10 μg gezuiverd caspase-eiwit toe dat is gegenereerd in secties 1, 2 en 3.
- Breng het totale reactievolume op 50 μL met caspase assay buffer.
- Incubeer de reacties in een waterbad bij 30 °C gedurende 3 uur. Zorg ervoor dat u de juiste controles opneemt in de splitsingstest. Hier wordt de katalytische mutant DroncC318A gebruikt als controlemiddel.
- Stop na 3 uur de reacties door de buizen op ijs over te brengen.
- Voeg één volume LDS-monsterbuffer toe dat 50 mM DTT bevat. De reactie wordt volledig gestopt met de toevoeging van LDS-monsterbuffer.
- Incubeer de monsters bij 75 °C in een warmteblok gedurende 10 minuten.
- Draai snel, meng door te vegen, laad 24 μL per monster en voer de SDS-PAGE uit (zie rubriek 7) of bewaar de monsters bij -20 °C.
6. In vitro splitsingstest met bacterieel tot expressie gebracht recombinant substraateiwit
- Voeg 10 μg gezuiverd kandidaatsubstraat (hier 6xHis-DriceC211A, gegenereerd in secties 1, 2 en 3) toe aan een microcentrifugebuis van 0,5 ml.
- Voeg 10 μg van de in de rubrieken 1 en 2 gegenereerde gezuiverde caspase-eiwitten toe. Breng het totale volume op 50 μL met behulp van caspase assay buffer.
- Volg de stappen 5.5 tot en met 5.9.
7. SDS-PAGE en immunoblotting
- Laad de splitsingsreacties (24 μL) op 4%-12% Tris-Glycine of Bis-Tris gradiëntgels (Tabel van Materialen) en voer eiwitelektroforese en immunoblotting uit (of autoradiografie bij gebruik van S35-gelabelde substraten) om resultaten te visualiseren met behulp van standaardprocedures27,28.
OPMERKING: Hier, in dit protocol, werden Bis-Tris gradiëntgels met Mops running buffer en LDS laadbuffer gebruikt. Over het algemeen werken de veelgebruikte PAGE-protocollen van Tris-Glycine-gels met behulp van de Tris-Glycine-SDS-loopbuffer en de SDS-laadbuffer goed.
Representative Results
Dit protocol geeft stapsgewijze instructies voor de inductie van caspase-eiwit in E. coli, zuivering van het recombinant Drosophila caspases Dronc en Drice, de synthese van kandidaatsubstraten en de in vitro splitsingsreactie met kandidaatsubstraten (hier DriceC211A) en de caspase Dronc. De katalytische mutant DriceC211A werd in deze test als modelsubstraat gebruikt omdat het geen auto-processing activiteit heeft (figuur 2A) en over de volle lengte blijft totdat het wordt gesplitst door Droncwt. DriceC211A moet altijd worden gebruikt als een positieve controle om te valideren dat het Droncwt-preparaat enzymatische activiteit heeft.
Figuur 2A geeft een representatief voorbeeld van de expressie en zuivering van recombinante caspasen. Vier verschillende recombinante caspasen werden geïnduceerd en gezuiverd: 6xHis-Droncwt, 6xHis-DroncC318A, 6xHis-Dricewt en 6xHis-DriceC211A. De gezuiverde caspasen werden uitgevoerd door SDS-PAGE, immunoblotted, en de vlek werd onderzocht met een anti-His-antilichaam (verdund 1:5.000; gevolgd door anti-muis IgG, HRP-gebonden antilichaam (1:10.000)). De onbewerkte 6xHis-Dronc (proDronc) heeft een relatief molecuulgewicht (MWr) van 55 kDa (baan 2) en onbewerkte 6xHis-Drice (proDrice) heeft een MWr van 35 kDa (baan 4). De automatische verwerking van de caspasen is zichtbaar door het verschijnen van banden van kleinere MWr die door de aanwezigheid van de His-tag op het N-terminus de grote subeenheden van de caspasen vertegenwoordigen (figuur 1). In het geval van 6x-Dronc heeft de grote subunit een MWr van 40 kDa (baan 1). De grote subunit van 6x-Drice loopt op 23 kDa (baan 3). De katalytische mutanten 6xHis-DroncC318A en 6xHis-DriceC211A kunnen niet automatisch worden verwerkt en zijn alleen detecteerbaar als eiwitten over de volledige lengte (lanes 2 en 4).
Figuur 2B Om aan te tonen dat het bacterieel geproduceerde en gezuiverde 6xHis-Droncwt-preparaat enzymatische activiteit heeft, werd een in vitro splitsingstest uitgevoerd zoals beschreven in dit protocol. Als negatieve controle werd de katalytische mutant 6xHis-DroncC318A gebruikt. Het substraat was RRL-gegenereerde N-Myc-DriceC211A, die is gelabeld met een Myc-tag op het N-eindpunt. Na de in vitro splitsingsreactie werden de eiwitten gescheiden door SDS-PAGE, immunoblotted en de vlekken werden geïncubeerd met een anti-Myc-antilichaam (verdund 1:1.000) gevolgd door anti-muis IgG, HRP-gebonden antilichaam (1:10.000)) om N-Myc-DriceC211A te detecteren. Succesvolle splitsing en dus enzymatische activiteit van de caspase kan worden aangetoond door het verschijnen van ten minste één band van kleinere MWr in vergelijking met de volledige, onbewerkte vorm van het substraat. Onbewerkte, volledige lengte N-Myc-DriceC211A heeft een MWr van 40 kDa (lanes 2 en 4), terwijl de grote subunit van verwerkte N-Myc-DriceC211A op 30 kDa (lane 3) draait. Baan 1 vertegenwoordigt het niet-geprogrammeerde RRL-lysaat (geen plasmide / transcript toegevoegd). Lane 2 demonstreert in vitro productie van DriceC211A door RRL-expressie. Baan 3 bevat de in vitro splitsingsreactie met 6xHis-Droncwt. Baan 4 bevat de in vitro splitsingsreactie met 6xHis-DroncC318A.
Figuur 2C Een in vitro splitsingsreactie die zowel recombinant als gezuiverd caspase (6xHis-Droncwt en 6x-His-DroncC318A) en substraat (6xHis-DriceC211A) gebruikt volgens dit protocol, werd geanalyseerd door SDS-PAGE en immunoblot. Voor de analyse van de splitsingsreactie werd in deze immunoblot het anti-gesplitste Drice-antilichaam (verdund 1:5.000; gevolgd door anti-konijn IgG, HRP-gebonden antilichaam (1:10.000)) gebruikt. Het anti-gesplitste Drice-antilichaam detecteert zijn neo-epitoop in de grote subeenheid (23 kDa) van 6xHis-DriceC211A pas na verwerking door 6xHis-Droncwt (baan 1). De katalytische mutant 6xHis-DroncC318A is niet in staat om 6xHis-DriceC211A in deze test te verwerken en volledige lengte 6xHis-DriceC211A verschijnt als zwakke onbewerkte band van 35 kDa (baan 2).
Figuur 1: Domeinstructuur van initiator caspases Caspase-9 en Dronc en effector caspases Caspase-3 en Drice. CARD - caspase activatie en rekrutering domein; Cys - relatieve locatie van het katalytische cysteïneresidu; L - grote subeenheid; S - kleine subeenheid. De locatie van de N-terminal prodomeinen wordt aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve resultaten. (A) Immunoblot analyse van gezuiverde recombinant 6xHis-Dronc en 6xHis-Drice preparaten, onderzocht met een anti-His antilichaam. Onbewerkte (proDronc en proDrice) en gesplitste 6xHis-Dronc en 6xHis-Drice worden aangegeven met pijlen. MW-markeringen worden aan de linkerkant aangegeven. (B) Immunoblotanalyse van de in vitro splitsingsreactie van RRL-gegenereerde N-Myc-Drice met caspasen 6xHis-Droncwt (baan 3) of 6x-His-DroncC318A (baan 4) gesondeerd met een anti-Myc-antilichaam. Niet-geprogrammeerde en geprogrammeerde (N-Myc-DriceC211A) RRL-reacties worden geladen en gescheiden in rijstroken 1 en 2. Onbewerkte (proDrice) en gespleten N-Myc-Drice worden aangegeven met pijlen. MW-markeringen worden aan de linkerkant aangegeven. (C) Immunoblotanalyse van de in vitro splitsingsreactie van bacterieel tot expressie gebracht en gezuiverd recombinant 6xHis-DriceC211A met caspases 6xHis-Droncwt (baan 1) of 6x-His-DroncC318A (baan 2), gesondeerd met een anti-gespleten Drice-antilichaam. Volledige lengte (proDrice) en gespleten 6xHis-DriceC211A worden aangegeven met pijlen. MW-markeringen worden aan de linkerkant aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende tabel 1: Deze tabel bevat primers die worden gebruikt voor het klonen in pET28a vector. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 2: Deze tabel bevat de samenstelling van buffers en media. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Het grootste deel van onze kennis over caspasen en caspase-functie is afgeleid van intensief werk in apoptose gedurende de laatste drie decennia. Het is zeer goed vastgesteld dat initiator caspases proteolytisch effector caspasen verwerken, en honderden eiwitten zijn geïdentificeerd als effector caspase substraten tijdens apoptose 5,29. Daarentegen is er veel minder bekend over de functie van caspasen voor niet-apoptotische processen en welke niet-apoptotische substraten ze verwerken. Het is denkbaar dat initiatiefnemers hier belangrijke beslissers zijn. Tijdens apoptose activeren ze effector caspasen die celdood veroorzaken. Om echter niet-apoptotische processen op gang te brengen, kunnen ze verschillende eiwitten activeren (anders dan effector caspasen), die het niet-apoptotische proces beheersen. Dit protocol test kandidaat-eiwitten als substraten van de initiator caspase Dronc in Drosophila 17,30.
De substraten die in de splitsingstest moeten worden getest, kunnen worden geproduceerd in een in vitro celvrij expressiesysteem voor zoogdieren zoals RRL of door recombinante expressie in E. coli. Er zijn verschillende voordelen voor in vitro expressie met behulp van RRL ten opzichte van bacteriële expressie. Het RRL-expressieprotocol is eenvoudig en snel, waardoor veel verschillende substraten parallel kunnen worden voorbereid. In veel gevallen kan het RRL-extract dat het eiwit van belang bevat, vóór gebruik in de splitsingstest bij -80 °C worden bewaard (hoewel dit voor elk substraat afzonderlijk moet worden bepaald). Het vermeende substraat kan worden gelabeld met S35-Met, wat eenvoudige analyse door autoradiografie na SDS-PAGE mogelijk maakt. Dat is vooral handig als er geen substraatspecifiek antilichaam beschikbaar is. Als alternatief, als S35-Met-etikettering niet gewenst is, kan het vermeende substraat worden getagd met gemeenschappelijke tags zoals Flag-, HA- of Myc-tags, waarmee caspase-splitsing door immunoblotting kan worden gedetecteerd.
Er moet sterk worden benadrukt dat het succes van dit protocol afhangt van de zorgvuldige en consistente zuivering van de recombinante Dronc- en Drice-eiwitten. Helaas kunnen deze eiwitten niet worden bewaard - zelfs niet op korte termijn - noch in de koelkast, noch bevroren. Ze verliezen de enzymatische activiteit 's nachts in elke opgeslagen vorm. Daarom moeten ze vers worden bereid op de dag van de splitsingstest. Ongeacht de kandidaat-eiwit(en) die worden getest, moet DriceC211A altijd worden gebruikt als een positieve controle om de enzymatische activiteit van het Droncwt-preparaat te valideren (zie figuur 2B,C). Als alternatief kan de activiteit van de Dronc- en Drice-preparaten ook worden getest door in vitro splitsing van fluorogene synthetische tetrapeptidesubstraten 2,9,31.
Als antilichamen worden gebruikt om de kandidaat-substraten te detecteren, moeten deze worden gevalideerd door de gebruiker32,33. Dat geldt ook voor commercieel verkrijgbare antilichamen die epitooptags detecteren, zoals Flag, HA, Myc of anderen. Slechte antilichaamkwaliteit kan belangrijke resultaten verdoezelen. Dubbele epitoop-tagging van de kandidaatsubstraten op zowel de N- als C-terminus met verschillende tags wordt ook aanbevolen34. Als splitsing optreedt, helpt dubbele tagging om beide splitsingsproducten te traceren en kan het helpen om op te helderen als splitsing op een of meer locaties optreedt.
Hoewel dit protocol gemakkelijk het bekende biologische substraat van Dronc, Drice, valideert, zijn er ook beperkingen. Een beperking is dat dit een in vitro protocol is met recombinante eiwitten. In deze testen zijn de caspasen aanwezig in een onfysiologisch hoge concentratie, wat blijkt uit de waarneming dat ze spontaan auto-proces kunnen verwerken in E. coli. De spontane automatische verwerking vindt meestal niet plaats onder de fysiologische omstandigheden. Deze hoge caspaseconcentratie kan valse activiteit veroorzaken die resulteert in valse positieven. Fout-positieven kunnen worden geëlimineerd door de caspaseconcentratie in de in vitro splitsingsreactie te verlagen. Bovendien, zoals hieronder in meer detail wordt beschreven, zijn aanvullende testen nodig om echte substraten te bevestigen en valse positieven te elimineren.
De recombinante caspasen hebben mogelijk niet dezelfde specificiteit als in hun normale cellulaire omgeving in vivo. De activiteit van caspasen kan bijvoorbeeld worden gewijzigd door posttranslationele wijzigingen. Deze zijn niet aanwezig op de recombinante eiwitten. Bovendien worden in vivo initiator caspasen, waaronder Dronc, opgenomen in grote eiwitcomplexen zoals het apoptosoom. Onder de voorwaarden van dit protocol wordt de vorming van het apoptosoom niet bereikt. Dat zou recombinante expressie van Drosophila Apaf-1 (ook bekend als Dark of Hac-1) 35-37 vereisen, die zijn eigen uitdagingen heeft. Daarom heeft Dronc in vitro mogelijk niet dezelfde specificiteit als in vivo.
Het is ook denkbaar dat Dronc wordt opgenomen in een ander eiwitcomplex voor niet-apoptotische processen. Dit kan een andere splitsingsspecificiteit verlenen dan Dronc, wat ook zou kunnen verklaren waarom Dronc geen apoptose induceert onder niet-apoptotische omstandigheden. CasCleave gebruikt de bekende splitsingsconsensusplaatsen om nieuwe caspasesubstraten te voorspellen. Het is echter onbekend of dezelfde splitsingsconsensusplaatsen ook worden gebruikt voor niet-apoptotische processen. Onlangs werd zelfs aangetoond dat Caspase-3 zijn voorkeursconsensusplaats verandert tijdens een niet-apoptotisch proces in de zich ontwikkelende auditieve hersenstam in het kuikenembryo38. Evenzo, als initiator caspasen worden opgenomen in verschillende eiwitcomplexen, kunnen ze een verschillende specificiteit hebben en dus splitsen bij verschillende consensussequenties.
Deze beperkingen illustreren dat het niet voldoende is om alleen te vertrouwen op de in vitro splitsingstests die in dit protocol worden beschreven. Er moeten alternatieve benaderingen worden gebruikt om de resultaten die met behulp van dit protocol zijn verkregen, verder te valideren. Idealiter zouden in vivo assays moeten worden gebruikt om de volgende vragen te beantwoorden: Wordt het kandidaat-eiwit proteolytisch verwerkt tijdens het niet-apoptotische proces in vivo? Zo ja, wordt dezelfde splitsingsplaats in vivo en in vitro gebruikt? Wat is het gevolg als de splitsing wordt geblokkeerd door mutagenese van de splitsingsplaats? Is de verwerking van het kandidaat-substraat afhankelijk van caspasen, en zo ja, welke? Wat is de rol van de splitsingsfragmenten voor het niet-apoptotische proces? Deze vragen kunnen gemakkelijk worden beantwoord in de genetische modelorganismen zoals C. elegans en Drosophila met behulp van standaard genetische en transgene methoden.
Samenvattend beschrijft dit protocol een betrouwbare en consistente methode om enzymatisch actieve caspasen te produceren, met name de Drosophila caspases Dronc en Drice. Het uiteindelijke doel van dit protocol is om te onderzoeken of Dronc kandidaat-substraten in vitro kan splitsen, die werden geïdentificeerd door genetische, biochemische of bioinformatica-benaderingen. Zoals uitgelegd in de vorige paragraaf, zijn aanvullende testen nodig om deze eiwitten in vivo te valideren als caspase substraten. Gezien de mate van behoud van caspase-genen in metazoa, zou het mogelijk moeten zijn om dit protocol ook aan te passen aan caspasen van andere organismen.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
We willen Dr. Elif Kamber-Kaya bedanken voor haar hulp bij het opstellen van het protocol in het lab. Dr. Guy Salvesen was zo vriendelijk om de DriceC211A mutant9 te leveren. Dit werk werd gefinancierd door een MIRA-prijs van het National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) van de National Institutes of Health (NIH) onder subsidienummer 2R35GM118330. De financiers hadden geen rol in de studieopzet, gegevensverzameling en -analyse, beslissing om te publiceren of voorbereiding van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin | Fisher | BP1760-25 | |
| Anti-His antibody | Sigma-Aldrich | MA1-21315 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell signaling | 7076P2 | |
| Anti-Myc antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell signaling | 7074P2 | |
| Benchtop Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | |
| Benzonase | Sigma-Aldrich | E1014-5KU | |
| BioPhotometer | Eppendorf | #6131 | |
| BL21 (DE3) pLysS Competent Cells | Promega | L1195 | |
| Centrifuge rotor | Beckman Coulter | JA-25.50 | |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023-1G | |
| ChemiDoc with image software | Bio-Rad | Universal Hood II | For Chemiluminiscence imaging |
| Chemiluminiscence Substrate | Thermofisher Scientific | 34095 | For Chemiluminiscence imaging |
| Cleaved Drosophila ICE (drICE) (Asp230) Antibody | Cell Signaling Technology | 9478S | |
| Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14955128 | Used to measure bacterial growth and protein concentration |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | #1610610 | |
| Erlenmeyer flasks, 1000 mL | Millipore sigma | CLS49801L | For LB agar media preparation and autoclaving |
| Erlenmeyer flasks, 250 mL | Millipore sigma | CLS4980250 | For bacterial culture growth and induction. |
| Ethylene-diamine-tetra-acetic Acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Gel tank SDS-PAGE system | Thermofisher Scientific | STM1001 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Thermofisher scientific | 87786 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| His-Drice-pET28a | This study | N/A | Available from authors |
| His-DriceC211A-pET28a | This study | N/A | Available from authors |
| His-Dronc-pET28a | This study | N/A | Available from authors |
| His-DroncC318A-pET28a | This study | N/A | Available from authors |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-100G | |
| Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermofisher Scientific | FERR0392 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| LB Agar, Miller (Powder) | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Lysozyme | Thermofisher Scientific | 90082 | |
| Microbiological plate incubator | Fisher Scientific | 11-690-650D | For colony growth after transformation |
| Microcentrifuge tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 22363611 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Midiprep kit | Qiagen | 12243 | |
| Mini tube rotator | Fisher Scientific | 05-450-127 | for mixing bacterial lysates and Ni-NTA agarose |
| Miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
| Motorized Pipette Controller | Gilson | F110120 | For using serological pipettes |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | BP330-1 | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | |
| NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Midi Protein Gel, 20-well | Thermofisher Scientific | WG1402BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermofisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20x) | Thermofisher Scientific | NP0001 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Invitrogen | NP00061 | |
| Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick Scientific | C25 incubator shaker | |
| Petridish 100 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plating beads | Zymo research | S1001 | For spreading culture on AmpR/KanR plates |
| Polypropylene Columns (1 mL) | Qiagen | 34924 | For purification of His-tagged proteins |
| Precision Plus Protein Standards | Bio-Rad | #161-0374 | |
| Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | #5000006 | |
| pT7CFE1-NMyc | Thermofisher Scientific | 88863 | For cloning substrates for RRL expression |
| PVDF membrane | Invitrogen | LC2007 | |
| 14 mL Polypropylene round bottom tubes | Fisher Scientific | 352029 | For growing plasmid cultures |
| QiaRack | Qiagen | 19095 | For holding polypropylene columns during purification |
| Refrigerated High speed Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | |
| rRNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N251A | For RRL expression |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sterile Falcon tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| Sterile Falcon tubes, 50 mL | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S70903-250G | |
| 1 mL Serological Pipets, Sterile | celltreat | 229001B | For bacterial cell lysis in 50 mL tubes |
| TnT Coupled Reticulocyte Lysate -T7 | Promega | L4611 | |
| Tris-base | Fisher Scientific | BP154-1 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Waterbath | Fisher Scientific | 2340 | |
| Western wet transferring cassette | Thermofisher Scientific | STM2001 |
References
- Kumar, S. Caspase function in programmed cell death. Cell Death and Differentiation. 14 (1), 32-43 (2007).
- Hawkins, C. J., et al. The Drosophila caspase DRONC cleaves following glutamate or aspartate and is regulated by DIAP1, HID, and GRIM. Journal of Biological Chemistry. 275 (35), 27084-27093 (2000).
- Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell. 91 (4), 479-489 (1997).
- Meier, P., Silke, J., Leevers, S. J., Evan, G. I. The Drosophila caspase DRONC is regulated by DIAP1. EMBO Journal. 19 (4), 598-611 (2000).
- Timmer, J. C., Salvesen, G. S. Caspase substrates. Cell Death and Differentiation. 14 (1), 66-72 (2007).
- Zou, H., Li, Y., Liu, X., Wang, X. An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11549-11556 (1999).
- Zou, H., Henzel, W. J., Liu, X., Lutschg, A., Wang, X. Apaf-1, a human protein homologous to C. elegans CED-4, participates in cytochrome c-dependent activation of caspase-3. Cell. 90 (3), 405-413 (1997).
- Stennicke, H. R., et al. Caspase-9 can be activated without proteolytic processing. Journal of Biological Chemistry. 274 (13), 8359-8362 (1999).
- Snipas, S. J., Drag, M., Stennicke, H. R., Salvesen, G. S. Activation mechanism and substrate specificity of the Drosophila initiator caspase DRONC. Cell Death and Differentiation. 15 (5), 938-945 (2008).
- Fraser, A. G., Evan, G. I. Identification of a Drosophila melanogaster ICE/CED-3-related protease, drICE. EMBO Journal. 16 (10), 2805-2813 (1997).
- Denton, D., Mills, K., Kumar, S. Methods and protocols for studying cell death in Drosophila. Methods in Enzymology. 446, 17-37 (2008).
- Dorstyn, L., Kumar, S. A biochemical analysis of the activation of the Drosophila caspase DRONC. Cell Death and Differentiation. 15 (3), 461-470 (2008).
- Aram, L., Yacobi-Sharon, K., Arama, E. CDPs: caspase-dependent non-lethal cellular processes. Cell Death and Differentiation. 24 (8), 1307-1310 (2017).
- Arama, E., Baena-Lopez, L. A., Fearnhead, H. O. Non-lethal message from the Holy Land: The first international conference on nonapoptotic roles of apoptotic proteins. FEBS Journal. 288 (7), 2166-2183 (2021).
- Baena-Lopez, L. A. All about the caspase-dependent functions without cell death. Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 77-78 (2018).
- Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. Journal of Cell Biology. 196 (4), 513-527 (2012).
- Amcheslavsky, A., et al. Plasma membrane localization of apoptotic caspases for non-apoptotic functions. Developmental Cell. 45 (4), 450-464 (2018).
- Bergmann, A. Are membranes non-apoptotic compartments for apoptotic caspases. Oncotarget. 9 (60), 31566-31567 (2018).
- Song, J., et al. Cascleave: towards more accurate prediction of caspase substrate cleavage sites. Bioinformatics. 26 (6), 752-760 (2010).
- Wang, M., et al. Cascleave 2.0, a new approach for predicting caspase and granzyme cleavage targets. Bioinformatics. 30 (1), 71-80 (2014).
- Kamber Kaya, H. E., Ditzel, M., Meier, P., Bergmann, A. An inhibitory mono-ubiquitylation of the Drosophila initiator caspase Dronc functions in both apoptotic and non-apoptotic pathways. PLoS Genetics. 13 (2), 1006438 (2017).
- Stennicke, H. R., Salvesen, G. S. Caspases: preparation and characterization. Methods. 17 (4), 313-319 (1999).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th edition). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), e253 (2007).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
- Hirano, S. Western blot analysis. Methods in Molecular Biology. 926, 87-97 (2012).
- Kim, B. Western blot techniques. Methods in Molecular Biology. 1606, 133-139 (2017).
- Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death and Differentiation. 14 (4), 641-650 (2007).
- Fogarty, C. E., et al. Extracellular reactive oxygen species drive apoptosis-induced proliferation via Drosophila macrophages. Current Biology. 26 (5), 575-584 (2016).
- Song, Z., et al. Biochemical and genetic interactions between Drosophila caspases and the proapoptotic genes rpr, hid, and grim. Molecular and Cellular Biology. 20 (8), 2907-2914 (2000).
- Edfors, F., et al. Enhanced validation of antibodies for research applications. Nature Communications. 9 (1), 4130 (2018).
- Uhlen, M., et al. A proposal for validation of antibodies. Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).
- Brizzard, B. Epitope tagging. Biotechniques. 44 (5), 693-695 (2008).
- Kanuka, H., et al. Control of the cell death pathway by Dapaf-1, a Drosophila Apaf-1/CED-4-related caspase activator. Molecular Cell. 4 (5), 757-769 (1999).
- Rodriguez, A., et al. Dark is a Drosophila homologue of Apaf-1/CED-4 and functions in an evolutionarily conserved death pathway. Nature Cell Biology. 1 (5), 272-279 (1999).
- Zhou, L., Song, Z., Tittel, J., Steller, H. HAC-1, a Drosophila homolog of APAF-1 and CED-4 functions in developmental and radiation-induced apoptosis. Molecular Cell. 4 (5), 745-755 (1999).
- Weghorst, F., Mirzakhanyan, Y., Hernandez, K. L., Gershon, P. D., Cramer, K. S. Non-Apoptotic caspase activity preferentially targets a novel consensus sequence associated with cytoskeletal proteins in the developing auditory brainstem. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 844844 (2022).
